Date post: | 24-Jan-2016 |
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ESCLEROSIS MULTIPLEBANDAS OLIGOCLONALES EN LCR
Bioq. María Josefina Boero
Hospital Italiano de Buenos Aires
“Es una enfermedad inflamatoria, desmielinizante, neurodegenerativa
de curso crónico del SNC”
Esclerosis Múltiple
INFLAMACIÓN
DESMIELINIZACION GLIOSIS
…………
DOCTOR, ¿ CUÁL ES LA CAUSA DE LA EM?
Esclerosis Múltiple (EM) • Se piensa en un mecanismo autoinmune: “Debido a la destrucción selectiva de la capa de mielina y de las fibras nerviosas, y secundariamente un daño neuronal progresivo”
• Se caracteriza por la ocurrencia sucesiva de focos de desmielinización diseminados en tiempo y espacio en varias áreas del SNC, incluidos la región periventricular, la médula espinal, el tronco encefálico, el cerebro y el nervio óptico.
EM: Epidemiología
• La enfermedad suele comenzar entre los 20 y 40 años, con un pico máximo a los 30 años
• Es más frecuente en mujeres (2:1) y en caucásicos
• No se conoce las razones de la variación de prevalencia en el mundo, pero piensan que los factores genéticos y ambientales podrían ser la causa
EM: Distribución mundial
The New England Journal of Medicine 2000;938:952-Vol. 343-Núm 13.
En el Mundo….
• Argentina es un país con una prevalencia de 18/100000, lo que significa que hay 5500-6500 casos. Con 2.24 nuevos casos /año.
• La prevalencia más alta de la enfermedad (30 /100000) se encuentra en el norte de Europa, sur de Australia y centro de Norte América.
En Argentina….
EM: Factores de riesgo
Se asocia a pacientes que presentan ciertos antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad HLA-DR2
En estos individuos la exposición a ciertos factores (infecciones virales, polisacáridos bacterianos, súper antígenos, toxinas) resultarían en la activación y proliferación del sistema inmune.
Factor genético…
Factor ambientales…
Fisiopatología
EM: Fisiopatología
EM: Fisiopatología
The New England Journal of Medicine 2000;938:952-Vol. 343-Núm 13.
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Factores genéticos y ambientales
Factores locales: infección viral, stress metabólico
Citoquinas proinflamatorias pueden aumentar la
expresión de moléculas en la superficie de LT y CPA
MBP, MOG, glicoproteína asociada a mielina, proteína proteolipídica,β- cristalina, fosfodiesterasas y S-100
Down-regulation
Injuria inmunológica mediada por Ac y activación del complementoInjuria mediada por células
Up-regulation
Injuria mediada por citoquinas
Digestión de Ag de superficie de mielina por macrófagos
Injuria directa de oligodendrocitos por CD8+ y CD4+
Axones desnudos
•Resolución de la rta inflamatoria
•Remielinización espontanea
•Propagación de los canales de Na de los nódulos de Ranvier
En algunas lesiones la presencia de inmunoglobulinas y activación del complemento sugieren que los Ac tienen un rol en el desarrollo de la lesión.
Se observa una distrofia primaria de los oligodendrocitos.
Finalmente, en otras lesiones un borde de oligodendrocitos necróticos se ven adyacentes al borde de la placa activa.
EM: Fisiopatología
The New England Journal of Medicine 2000;938:952-Vol. 343-Núm 13.
EM: Fisiopatología
La placa es una zona bien demarcada caracterizada por la pérdida de mielina, con preservación del axón y formación de cicatrices astrociticas.
La injuria irreversible axonal y la escasa población de oligodendrocitos progenitores resulta en la pérdida progresiva de la función neurológica.
El marco patológico de la enfermedad es la PLACA DESMIELINIZADA
Manifestaciones clínicas
Debilidad de las extremidades
• Pérdida de fuerza• Fatiga• Descoordinación en los movimientos• Espasticidad
Neuritis óptica
• Disminución de la agudeza visual• Visión borrosa
Síntomas sensitivos
• Parestesias• Hiperestesia
Alteraciones cognitivas
• Pérdida de memoria a corto plazo, depresión• Falta de atención• Dificultad para resolver problemas • Lentificación del procesamiento de la información• Alteración del juicio• Labilidad emocional
Otros síntomas• Disfagia• Disartria• Disnea• Espasticidad • Disfunción sexual• Estreñimiento
EM: Patrones clínicos
Tiempo
Dis
capaci
dad
EM RECURRENTE-REMITENTE: 85%
EM SECUNDARIAMENTE PROGRESIVA: 50%
EM PRIMARIAMENTE PROGRESIVA: 10%
EM PROGRESIVA RECURRENTE: 5%
Diagnóstico
• Nuevos criterios para el diagnóstico de EM se han publicado como resultado de la formación de un comité internacional
• Objetivo: simplificar la clasificación y acortar el intervalo entre presentación y diagnóstico
• Se requiere la presencia de hallazgos clínicos y paraclínicos ( RMN, potenciales evocados y análisis del LCR)
EM: Diagnóstico
Arch Neurol. 2005;62:865-870
La RMN es sensible pero no específica para el diagnóstico de EM una cantidad de otras enfermedades pueden mimetizar con EM, ya sea clínicamente como a través de neuroimágenes.
Los Potenciales evocados no son específicos, ya que las anomalías en las respuestas provocadas ocurren en un gran número de enfermedades neurológicas que tienen alteradas las vías que se estudian (vías visuales, auditivas, somato sensitivas o motoras).
Los estudios en LCR tienen la ventaja de una mayor especificidad puesto que en población normal, no es frecuente hallar anormalidades de las inmunoglobulinas en este líquido biológico.
EM: Diagnóstico
Diagnóstico Diferencial de EM
INFECCIOSAS • Enfermedad de lyme• Sífilis meningovascular• Mielopatías por HIV o HTLV-1
AUTOINMUNES • LES • Sjögren• Sarcoidosis• Wegener
VASCULARES • Malformaciones vasculares de la espina dorsal• Vasculitis primaria
NEOPLASIAS • Linfomas o gliomas• Tumores de la espina dorsal• Síndrome paraneoplásicos
DEGENERATIVAS • Ataxia espinocerebelar
ENDOCRINAS/METABÓLICAS • Hipotiroidismo• Deficiencia de vit. E o B12
GENÉTICAS • Leuecodistrofia metacromática
Laboratorio
• Las proteínas totales en LCR es el indicador más sensible de patología en el SNC
• El rango normal de proteínas es de 15-45 mg/dl. Niños y añosos pueden tener rangos mayores
• Muchas enfermedades pueden aumentar la permeabilidad de la BHE llevando a un aumento de las proteínas
Estudio del LCR: Proteínas
Arch Neurol. 2005;62:865-870
Estas enfermedades incluyen:
Bacterianas, virales y otras formas de meningitis
Infiltración neoplásica de meninges
Tumores cerebrales y espinales
Polineuropatías
Hernia de disco
Infarto cerebral, hemorragias
La albúmina, al no ser sintetizada en el SNC, sirve como un indicador de referencia para monitorear permeabilidad.
La concentración de IgG debe tomar en consideración el
estado de la barrera, para poder distinguir entre aumentos por síntesis intratecal y pasaje de proteínas plasmáticas.
Arch Neurol. 2005;62:865-870
Estudio del LCR: Proteínas
Se recomienda el uso del cosciente Alb LCR/ Alb suero, en lugar de PT, para evaluar disfunción de la BHE.
Aspecto: Cristal de roca Leucocitos: normales ( Pleocitosis leve con predominio linfocitario) Glucosa: Normal Proteínas totales: Normal o liger. aumentado IgG LCR/IgG suero: elevada en el 90% de los casos
La respuesta inmune humoral a los antígenos de mielina se refleja en un aumento de la concentración de IgG y la síntesis de bandas oligoclonales(BO)
EM: Estudio del LCR
EM: Bandas oligoclonales (BOC) en LCR
Presencia de BOC en LCR y no en suero, indica síntesis intratecal de IgG
No es exclusiva de la EM sino que también puede estar presente en enfermedades infecciosas o inflamatorias del SNC
Existen fórmulas matemáticas para intentar cuantificar la producción intratecal de IgG.
El consenso establece que la prueba cualitativa esencial es el IEF seguido de inmunofijación, y que no es equivalente a ningún dato cuantitativo utilizado
Condiciones que presentan BOC (+) en LCR:
Enfermedad Incidencia de BOC % Pruebas sugeridas
EM 98 RMN
PESS 100 Acs anti-sarampión
Neurosifilis 95 Acs anti-treponémica
Neuro-SIDA 80 Acs anti-HIV
Neuro-Lyme 80 Acs anti-borrelia
Neuro-LES 50 Factor antinuclear
Neuro-Behçet 20 C’3 PMN en LCR
Ataxia-telangiectasia 60 IgA sérica
Meningitis-uveítis de Harada 60 PCR sérica
Adrenoleucodistrofia 100 Ácidos grasos de cadena larga
Neuro-sarcoidosis < 5 Test de Kveim
Encefalitis aguda (<7 días) <5 Acs antivirales
Meningitis aguda (<7 días) <5 Lactato en LCR, PCR
Neoplasias <5 TAC
E. J. Thompsom, The National Hospital for Neurology y Nerusurgery Queen Square.
EM: Bandas oligoclonales (BOC) en LCR
Presencia de BOC en LCR y no en suero, índica síntesis intratecal de IgG
No es exclusiva de la EM sino que también puede estar presente en enfermedades infecciosas o inflamatorias del SNC
Existen fórmulas matemáticas para intentar cuantificar la producción intratecal de IgG
El consenso establece que la prueba cualitativa esencial es el IEF seguido de inmunofijación, y que no es equivalente a ningún dato cuantitativo utilizado
El valor de este cosciente en un LCR normal es 0.5
IgG LCR/ IgG suero Alb LCR/ Alb suero
Estudio del LCR: Indice IgG
EM: Bandas oligoclonales (BOC) en LCR
Presencia de BOC en LCR y no en suero, índica síntesis intratecal de IgG
No es exclusiva de la EM sino que también puede estar presente en enfermedades infecciosas o inflamatorias del SNC
Existen fórmulas matemáticas para intentar cuantificar la producción intratecal de IgG
El consenso establece que la prueba cualitativa esencial es el IEF seguido de inmunofijación, y que no es equivalente a ningún dato cuantitativo utilizado
EM: Toma de muestra
Se deben extraer 3-5 ml de LCR
Se debe tomar al mismo tiempo una muestra de sangre
Conservación de la muestra:
1 semana: 2 a 8 °C -20 °C
Las proteínas son separadas de acuerdo a su pI en un gradiente estable y continuo de pH
La carga de superficie de la molécula (anfotérica) se mantiene cambiando de acuerdo a su curva de titulación, hasta alcanzar una posición de equilibrio a lo largo del gradiente de pH
Esa posición de equilibrio la alcanza donde el pH es igual al pI de la molécula
Es decir, que en IEF las proteínas son continuamente desaceleradas hacia una zona de equilibrio donde la carga neta es cero( pH=pI)
Esta técnica requiere crear y mantener en el gel un gradiente continuo de pH, lo que se logra por el pasaje de la corriente eléctrica a través de una solución de compuestos anfotéricos, cuya característica principal es que tienen pI muy cercanos, abarcando un dado rango de pH
EM: Isoelectroenfoque e Inmunofijación
Medir la concentración de IgG en suero y LCR por nefelometría. La concentración de IgG debe ser la misma en ambas
NO se debe concentrar el LCR
Se realiza la corrida en paralelo del suero y LCR en gel de agarosa para separar las proteínas
Se realiza la inmunofijación con un antisuero anti-IgG marcado con peroxidasa para detectar BOC de IgG
EM: Isoelectroenfoque e Inmunofijación
Concentración de IgG en LCR
LCR SUERO
> 20 mg/L Diluir para obtener una conc. de 20 mg/L de
IgG
Diluir para obtener una conc. de 20 mg/L de IgG
10-20 mg/L Sin diluir Diluir para obtener una conc. de IgG identica a la
del LCR
< 10 mg/L Diluir para obtener una conc. de IgG identica a la
del LCR
Similares concentraciones de IgG para suero y LCR nos aseguran corridas óptimas
EM: Preparación de las muestras
Medir la concentración de IgG en suero y LCR por nefelometría. La concentración de IgG debe ser la misma en ambas
NO se debe concentrar el LCR
Se realiza la corrida en paralelo del suero y LCR en gel de agarosa para separar las proteínas
Se realiza la inmunofijación con un antisuero anti-IgG marcado con peroxidasa para detectar BOC de IgG
EM: Isoelectroenfoque e Inmunofijación
• Es una técnica de equilibrio y por lo tanto los resultados no dependen del modo de aplicación o del tiempo de operación
• Se mide un parámetro intrínseco fisicoquímico de la proteína (pI)
• Permite la resolución excelente de proteínas que difieren en 0.02 unidades de pH en sus pI, que pueden ser excelentemente separadas en bandas muy finas debido al efecto de focalizado
Ventajas
EM: Isoelectroenfoque
• Sólo sustancias anfotéricas pueden ser separadas
• Los anfolitos y los péptidos son reactivos a los mismos colorantes, por ello se deben usar coloraciones específicas
• Péptidos cortos no focalizan ya que son isoeléctricos en casi todo el rango de pH(4-8)
Limitaciones
EM: Isoelectroenfoque
Clin Chem 2000;48:1578
IEF/PAGE Tinción con plata vs IEF/Inmunofijación
Resultado PAGE/IEF con Tinción
Ag
IEF con Inmunofijación
Positivo verdadero 14 33
Falso positivo 12 2
Sensibilidad y especificidad de IEF para EM
Origen N° total de pacientes
N° total de pacientes con EM
Sensibilidad,%
Kostulas et al 1114 58 100
McLean et al 1007 82 95
Ohman et al 558 112 96
Especificidad %
Beer et al 189 98 87
Paolino et al 44 26 86
La presencia de BOC está fuertemente Relacionada (>95%) con EM
Clin Chem 2000;48:1578
Patrón 1: Normal (no BO en LCR ni en suero)
Patrón 2: Esclerosis Múltiple (si BO en LCR, no en suero)
Patrón 3: Enfermedad sistémica (algunas bandas en LCR y adicionales en concordancia con suero)
Patrón 4: Inflamación sistémica (patrón de bandas idéntico en LCR y suero)
Patrón 5: Gammopatía monoclonal (patrón monoclonal en espejo en LCR y suero)
Interpretación de IEF
Normal
IgG síntesis local
IgG síntesis local
Síntesis no local
Síntesis no localBanda monoclonal “splitted” en varias bandas en IEF
Interpretación de IEF5 PATRONES
La presencia de una banda solitaria en LCR debe ser interpretada en conjunto con hallazgos clínicos y en suero.
Su presencia está asociada a linfoma, pero también es observada en sujetos normales y no excluyen el diagnóstico de EM.
En series de pacientes seguidos por 6 años las dos terceras partes de los pacientes revertían el patrón, pero aproximadamente 1/3 desarrollaban una respuesta intratecal con diagnóstico de EM o síndromes desmielinizantes. Sin embargo, en la mayoría de los series la banda única es poco común.
Interpretación de una única banda en LCR
Ejemplos de los perfiles
Patrón 1
Patron 2
Síntesis localEM
Ejemplos de los perfiles
Monoclonalcomponente
Ejemplos de los perfiles
Patron 3
Síntesis sistémica+localPatrón « mayor que »
bandas adicionales
bandas adicionales
Patron 4
Bandas Idénticas« En espejo »
Ejemplos de los perfiles
Ejemplos de los perfiles
PATRON 5
Bandas Monoclonales
LCRSUERO
1 2 3 4 5 6 97 8
CN CPLCR SUERO
HYDRAGEL 9 ISOFOCUSING sebia
LCRSUERO
CONTROL DE CALIDAD
Control externo
Control interno
• Hay controles externos de calidad (CAP)
• Se utilizan como controles internos de calidad, las muestras mandadas por el CAP, también pueden ser usadas muestras de pacientes validadas clínicamente por un médico
CONTROL DE CALIDAD
Control externo
Control interno
• Hay controles externos de calidad (CAP)
• Se utilizan como controles internos de calidad, las muestras mandadas por el CAP, también pueden ser usadas muestras de pacientes validadas clínicamente por un médico
Conclusión
Nuevos Criterios diagnósticos para Esclerosis Múltiple
1- El análisis del LCR es una parte integral del diagnóstico de EM
2- El único análisis informativo es el establecimiento cualitativo de IgG en LCR, utilizando IEF seguido de una técnica de detección inmune( fijación o blotting). Esta es la técnica declarada “gold-standard” por la FDA
3- El análisis cualitativo debe ser realizado en LCR sin concentrar y debe ser comparado directamente con un suero corrido simultáneamente en el mismo ensayo
Arch Neurol. 2005;62:865-870
4- Corridas óptimas usan similares concentraciones de
IgG para suero y LCR
5- Controles positivos y negativos deben ser corridos en cada set de muestras y el gel debe ser desechado si no se ven bien las bandas en los controles
6- El informe del LCR debe ser realizado en términos de los 5 patrones reconocidos
Nuevos Criterios diagnósticos para Esclerosis Múltiple
Arch Neurol. 2005;62:865-870
7- La interpretación debe ser realizada por una persona experta en la técnica utilizada
8- Considerar una nueva punción en el caso de una alta sospecha clínica pero resultados negativos del LCR, o solo mostrando una banda
9- El análisis cuantitativo de IgG es un buen complemento informativo, pero no se considera un substituto al análisis cualitativo, el cual posee la más alta especificidad y sensibilidad
Nuevos Criterios diagnósticos para Esclerosis Múltiple
Arch Neurol. 2005;62:865-870
10- Cuando se realice el dosaje de IgG en LCR, fórmulas no lineales deben ser usadas para medir integridad de la BEH, midiendo la relación de albúmina en LCR/Albúmina en suero
11- Los laboratorios que realicen de rutina la búsqueda de Bandas Oligoclonales en LCR deben poseer controles internos y externos de calidad para asegurar un alto standard de confiabilidad y desempeño
Nuevos Criterios diagnósticos para Esclerosis Múltiple
Arch Neurol. 2005;62:865-870
BIBLIOGRAFIA
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Multiple sclerosis.Noseworthy JH, Lucchinetti C, Rodriguez M, Weinshenker BG. N Engl J Med 2000;343:938-52.
Multiple Sclerosis — The Plaque and Its PathogenesisElliot M. Frohman, M.D., Ph.D., Michael K. Racke, M.D., and Cedric S. Raine, Ph.D., D.Sc. The new england journal o f medicine2006;354:942-55.
E. J. Thompson. Líquido cefalorraquídeo en la Esclerosis Múltiple. The National hospital for Neurology and Neurosurgery Queen Square. London.
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Stephen L. Hauser, Donald E. Goodkin. Esclerosis Múltiple. Principios de medicina interna. Harrison.
Esclerosis Múltiple en la infancia. Silvia N. Tenembaum. Revista Española de Esclerosis Múltiple N°3:2007.
El estudio de laboratorio en el diagnóstico diferencial de la Esclerosis Múltiple.Francisco Coret Ferrer, Bonaventura Casanova Estruch. Hospital Clínico Universitario; Hospital Universitario La Fe, Valencia.
Recomendación para el estudio de las proteínas del líquido cefalorraquídeoSociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular. Química Clínica 2002;83-90.
BIBLIOGRAFIA
MUCHAS GRACIAS….