INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGIA AGROPECUARIA
Karina Trono
Instituto de Virologia
INTA Castelar
APROCAL 19 / 09 /2019 Rafaela
Estrategia de control de la LeucosisBovina a través de la vacunación
INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGIA AGROPECUARIA
Leucosis Bovina: No todo está perdido
Karina Trono
Instituto de Virologia
INTA Castelar
APROCAL 23 / 09 /2010 Rafaela
Infectada de por vidaAnticuerpos/ Provirus / Sin detección de virus
Linfocito B Provirus integrado
Linfocito B
BLV
Sana / Susceptible
EL BLV GENERA UNA INFECCIÓN PERSISTENTE
ASINTOMATICASSerología / PCR
Semen
LINFOSARCOMAS
INFECTADAS
EL BLV CAUSA LA LEUCOSIS BOVINA
0,5-1 %
33.9%
45%
40.6%
30-70 %
26 %
37 %1
36.5%
54.6 %2
35.6 %
29%
45%
32.85 %
34.7 %
25 %
Argentina Trono y col. 2001
Alejo y col. 2000
Maradei com. Per.
Bolivia Lopez y col. 2010
Brasil Fernandez y col. 2009
Camargos y col. 2002
Molnár y col. 1999
Moraes y col. 1996
Andrade y col. 1991
Alencar Filho y col. 1979
Chile Grau y Monti, 2010
Colombia Hernandez-Herrera, 2011
Ecuador World animal Health, 2004
Paraguay Rodriguez y col. 2010
Perú Guinnet, 2010
S. Ortiz com.per.
Uruguay Rama y col. 2012
Venezuela Nava y col. 2011
≥ 30 %
EL BLV es de distribución mundial
EN 40 AÑOS EL BLV SE EXPANDIO EN ARGENTINA
1970 19901980 2000 2010
Primer Reporte1973
5% Rodeos10-28% Individual
80-90% Rodeos25-32% Individual
100% Rodeos90% Individual
Año En Argentina
1973 Primer hallazgo, linfosarcoma por VLB
1987 5 % rodeos lecheros infectados – 10-28 % animales infectados
2001 80-86 % rodeos lecheros infectados – 25-32 % animales infectados
Actualidad 100 % rodeos lecheros infectados - 90 % animales infectados
1. Conocer la progresión desde el nacimiento para identificar puntos de control
2. Evaluar infección natural para identificar fuentes de transmisión
3. Avanzar con una estrategia para interrumpir el ciclo de transmisión
Manejo preventivo
Selección genética
Cepa viral atenuada
Que podemos hacer ?
APROCAL 23 / 09 /2010
cría recría preñez lactanciaparto
IA semen
calostroLeche
Contacto con animales
infectados
Contacto con vacas secas
adultas
8Prevalencia de animales infectados con virus de la leucosis bovina en tambos de la zona de Rafaela, provincia de Santa Fe. Datos 2010-2016.
Alta carga proviral
Baja carga proviral
100ul
1ml
infectados
infectados
8/8
7/7
Transmisión por sangre asociadoAl nivel de infección
Gutiérrez y col. 2017
Donante Receptor
Mad
res
Leches
indiv
idual
es
Leches
de
tanque
Terner
os
0
20
40
60
80
100
90%96% 100% 95%
Prevalencia de anticuerposa)
Fre
cu
en
cia
Mad
res
Leches
indiv
idual
es
Leches
de
tanque
Terner
os
0
20
40
60
80
100
82% 59% 90% 13%
Prevalencia de provirusb)
Fre
cu
en
cia
Calostro 67,8%Jaworski y col. 2015, Porta y col. 2019Lomonao y col, 2019
Gutiérrez et al., 2011
El nivel de infección circulante es heterogéneo
Leche y calostro tienen anticuerpos y virus
La reactivación viral puede ser espontánea
Spontaneous virus reactivation during chronic BLV infection in cattle. The BLV proviral load (black), BLV pol RNA expression (red), level of BLV-sp antibodies (blue dotted line) and the absolute counts of lymphocytes (blue solid line) were followed-up in a single Holstein cow chronically infected with BLV. BLV DNA and RNA levels are expressed as Log10 of copies per μg of total DNA and per ml of plasma, respectively (left axis).
Jaworski et al 2018, Alvarez et al 2019
Time point
10998 11218 11226 10189 11181 11265 11266
Tax Pol Tax Pol Tax Pol Tax Pol Tax Pol Tax Pol Tax Pol
5BD + - - - - - - - - - - - - -
D - - + + - - - - + - ND ND - -
5AD ND ND + - - - - - - - - - - -
2M - - - - - - - - - - - - - -
4M + - - + - - - - - - - - - -
6M - - - - - - - - - - - - - -
8M - - + + - - ND ND - - - - - -
10M - - - - - - ND ND - - - - - -
5BD2 - - - - ND ND ND ND - - - - ND ND
D2 + - + - + + ND ND - - - - ND ND
BLV RNA detection by RT-nested PCR in bloodsamples of naturally infected animals. tax and pol genes were used.
La carga proviral correlaciona con el recuento total de glóbulos blancos y es reflejada por el nivel de anticuerpos circulantes
Gutiérrez et al., 2012, Alvarez et al., 2013
BLV ES DETECTABLE EN SEMEN
In the period 2005-2006, 685 frozen semen samples from seropositive bulls were remited to the laboratory by Artificial Insemination Centers.They were analyzed by gag-PCR. The BLV status of the bulls was determinated by two diferent ELISAs (VMRD and an assay using p24 asantigen, developed in our laboratory) and by PCR from whole blood. It was possible to detect BLV genome in 22 out of 23 bulls and 55 out of685 samples.Pinksquares: BLV positive (PCR), Blue squares: BLV negative (PCR)
El patrón de detección es intermitente Rossich y col 2007
Lucro cesante por animal (USD) por
muerte por linfosarcomaValores de referencia (promedio)
1. Leche no producida 2940 Prevalencia individual 40 %
2. Reposición post-muerte 1800 Mortalidad 5 %
3. Ausencia de ingresos por
comercialización en matadero
al fin del ciclo de lactancia
520 Lactancias (n.º ciclos) 3,7
4. Falta de nacimientos de
nuevos terneros120
Producción de leche por ciclo
(litros/año)5000
Total 5380 Tasa de reposición 27 %
Impacto económico directo x linfosarcoma
Castellano y Goyzueta, 2014
13
Impacto económico en la comercialización
Intervenir lo antes posible = reducir el contagio
Un gran desafío para terneros jóvenes
Vacas adultas
Rec
ién n
acid
os
Prim
er p
arto
Vac
as a
dultas
0
20
40
60
80
100
10%
50%
90%
Pre
vale
ncia
(%
)
• Índices de infección extremos
• No hay políticas de control interno
• Estrategia de prevención de iatrogenia que parece no funcionar
• Necesidad de sanear los rodeos para impedir las pérdidas
- Segregación por carga proviral
- Selección genética de animales
-Vacuna / Premunición
LAS ESTRATEGIAS CLÁSICAS NO SON SUSTENTABLES EN NUESTRO CONTEXTO PRODUCTIVO
- Eliminación de positivos
- Segregación de positivos
- Modificación de maniobras zootécnicas
INTERRUMPIR EL CICLO DE TRANSMISION
Virus naturalVirus atenuado
COMPETENCIA
VACUNA O PREMUNICION: INFECTAR PARA PROTEGER
‐ Cepa atenuada de BLV
‐ Competencia con la cepa de campo
‐ Generar infecciones de CPV baja
‐ Interrumpir el ciclo de transmisión
‐ Sin modificaciones extra manejo, infraestructura, reproductores
CEPA BLV DX6073
PCR
Serología
Ensayo 1 Expediente506979/07 ResoluciónSAGyP 151/08.
Ovinos y
Bovinos en
Box
Ensayo 2 Expediente227352/10 ResoluciónSAGyP 03/11
Bovinos
Campo
INTA
Ensayo 3 Expediente562943/2013,Resolución SAGYP83/2014
Bovinos
Campo
INTA
Demostrar la infectividad de la cepa modificada BLV DX-6073 en la especie bovina
Demostrar la capacidad de la cepa BLV DX-6073 de inducir respuesta inmune humoral
Analizar la carga proviral inducida por la infección con la cepa BLV DX-6073
Estimar la capacidad de transmisión por contacto a centinelas no infectados
Demostrar la resistencia al desafío experimental y natural
Financiacion: CONICET, FNRS, MINCYT, INTA, FUNDACION ARGENINTA, INTEA
ENSAYOS PREVIOS
La cepa atenuada replica a bajos nivelesN
um
be
r o
f p
rovi
ralc
op
ies
per
10
0
PB
MC
s
0,00
0,01
0,10
1,00
10,00
100,00
1000,00
0 50 100 150 200 250 300
WT 21
WT 23
WT 31
WT 492
WT 535
D 3
D 28
D 30
D 35
D 42
D 43
D 45
D 47
D 55
D 57
ArgWT 6
ArgWT 46
wild-type
attenuated
lymphocytotic
Time (days)
En presencia de anticuerpos con niveles comparables a la cepa WT
3 28 30 35 42
43 45 47 55 57
Vacunadas
21
23 31
492535
BLV natural Rodeo
(n = 78)
Protege frente al desafío natural y no se transmite
tumores: 0/10
3 28 30 35 42 43 45 47 55 57
84 87
98 102
21 23 31 492 535
88
100104
113 114109
257 259 261 269 263 262 270 268272
112
Año 1
Año 2
Año 3
Año 4
Año 5 294 288286300293292297291298
BLV natural Vacunadas
Ausencia de provirus en leche
No infectivas
Presencia de anticuerpos pasivos
infected
10ml de sangre no alcanzan para transmitir la infección vacunal
High proviral load
Low proviral load
INFECCION NATURAL
VACUNADA
100ul
1ml
10ml
infectados
infectados
No infectados
8/8
7/7
0/5
Desafío experimental1013 copias WT
4 años
vacunación PCR
Vacunados Controles- + NT1 NT2
Controles PCR
M
Wt 610 bpVacuna 230 bp
La cepa atenuada protege frente al desafio experimental
Wt 610 bpVacuna230 bp
La cepa atenuada no esta presente en carne de consumo
Ruiz y col., 2019
• es infecciosa
• replica a bajos niveles
• genera respuesta inmune similar a la natural
• protege frente al desafío experimental y natural
• es segura: no se transmite / no es patogénica
• provee inmunidad pasiva
LA CEPA ATENUADA CUMPLE CON LOS REQUISITOS
• es trazable
• los terneros y la leche no evidencian infectividad
• protege frente al desafío natural en contexto productivo
2008-2015
Ensayo 1 Expediente 506979/07Resolución SAGyP151/08.
Ovinos y
Bovinos en
Box
Ensayo 2 Expediente 227352/10Resolución SAGyP 03/11
Bovinos
Campo
INTA
Ensayo 3 Expediente562943/2013,Resolución SAGYP83/2014
Bovinos
Campo
INTA
Ensayo 4 Expediente 11591/14
Resolucion SAGYP
288/2015
Bovinos
Campo
INTA
Rafaela
Tambo
comercial
Objetivos
Demostrar la infectividad de la cepa modificada BLV DX-6073 en la especie bovina
Demostrar la capacidad de la cepa BLV DX-6073 de inducir respuesta inmune humoral
Analizar la carga proviral inducida por la infección con la cepa BLV DX-6073
Estimar la capacidad de transmisión por contacto a centinelas no infectados
Demostrar la resistencia al desafío experimental y natural
Demostrar la resistencia al desafío natural en condiciones productivas
EVALUACIÓN DE LA EFICACIA PARA
PREVENIR LA INFECCIÓN NATURAL EN UN
RODEO LECHERO
Expediente SENASA SO1-0011591/2014Resolución 288/2015 Ministerio de Agroindustria
PASO SIGUIENTE y NECESARIO
Estación Experimental Agropecuaria Rafaela
Guillermo SUAREZ ARCHILLA
1. Evaluar la protección contra la cepa de campo.
2. Confirmar que genera infecciones de carga proviral baja.
3. Comprobar que no se trasmite a otros animales.
4. Analizar la inocuidad de la leche.
OBJETIVOS DEL EXPERIMENTO
Establecimiento Lechero TAMBO INTA RAFAELA Prevalencia >80%
Grupo Vacunado y Grupo Control
Cohortes según disponibilidad
Seguimiento de la infección Anticuerpos y Provirus
DISEÑO DEL EXPERIMENTO
VACUNACIÓN
Terneras Vaquillonas VacasFin de Ciclo
Carne conserva
ANÁLISIS de los CONVIVIENTES
ANÁLISIS de los Animales del ENSAYO
ANALISIS de LECHE
ESQUEMA DEL EXPERIMENTO
RESULTADOS2015-2019
1 6 12 18 24 30 36 42
Vacunación
Tiempo de Vida(meses)
Pre
vale
nci
a (%
)
45
Parto
AnticuerposCalostrales
Prevalencia Vacas Totales
2015 2016 2017 2018 201995 % 88 % 92 % 84 % 91,5%
Existe una intensa DINÁMICA DE INFECCIÓN NATURAL
2015 2019
13 11 14 1722 25
33
45
55
69 71 717264
93 93
Cohorte 1 Cohorte 2 Cohorte 3 Cohorte 4 TOTAL
Fecha de Inicio Feb 2016 Sept 2016 Feb 2017 Jul 2017
Edad vacunación (meses)
5-7 6-8 5-9 8-15
Vacunadas 6 5 14 4 29Control 25 21 22 5 73Total 31 26 36 9 102
4 COHORTES EN ESTUDIO
LO VAMOS A VER EN DOS CONJUNTOS
Control no Infectado
Tratado no Infectado
Infección cepa WT
Vacunado
Control con cepa Vacunal
Vacunado WT
Cohortes 1 y 2
REACTIVIDAD SEROLOGICA SIMILAR
% d
e R
eac
tivi
dad
0 6 12 18 24 30 36 39
Vacunación
Tiempo post Vacunación (meses)
Parto
NINGUNA DE LAS VACUNADAS SE INFECTO CON LA CEPA DE CAMPO
% d
e R
eac
tivi
dad
120 6 18 24 27
Vacunación
Tiempo post Vacunación (meses)
Parto
Control no Infectado
Tratado no Infectado
Infección cepa WT
Vacunado
Control con cepa Vacunal
Vacunado WT
Cohortes 3 y 4
NINGUNA DE LAS VACUNADAS SE INFECTO CON LA CEPA DE CAMPO
REACTIVIDAD SEROLOGICA SIMILAR
Tiempo post Vacunación (meses)
CP
V (
cop
ias/
ugA
DN
)
120-6 18 24 306
0
1000
100000
10000000
>70%
Alta CPV
NINGUNA VACUNADA PRESENTA CARGA PROVIRAL ALTA
CPV de vacunadas e infecciones de campo
Infección cepa WT
Vacunado
Control con cepa Vacunal
Vacunado WT
Vacunación
Pre PostEGRESO
PCRNested Diferencial
Nº
de
An
imal
es
Serología ( + )Serología ( -- ) Serología ( + ) PCR( -- )
Serología ( + ) PCR( + ) WT
Serología ( + ) PCR( + ) DM
37%34%
SeropositivosSeropositivos
87%
Análisis de los machos la recría
NO SE TRANSMITIO A LOS CONVIVIENTES
1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 1310 12 50 vacasal azar
% d
e R
eac
tivi
dad
Meses post Parto
NO HAY DETECCIÓN DE PROVIRUS EN LECHE
Leche de Vacunadas
Leche de 50 vacas al
azar
ANTICUERPOS en LECHE similar a la infección natural Deteccion WT
Vacunada Sin PCR
Vacunada Sin deteccion de Provirus
Sin deteccion
20%
14 % Madre Madre
Ternero Ternero
Análisis de Filogenia
No Infectado
Infección cepa WT
Infección cepa Vacunal
Crías del rodeo general
Crías de las Vacunadas
NO SE TRANSMITIO A LA DESCENDENCIA
ANTICUERPOS en TERNEROS inferior a la infección natural
NO HAY LINFOSARCOMAS CONFIRMADOS
Presuntivos de Muerte y Descarte
-Sin diagnostico-Neumonía
-Ingreso a Lactancia
2
7
2
64
3
3
2
Total de Perdidas: 29
EN RESUMEN
Grupo C1 C2 C3 C4 Total
Fecha inicio ago-15 feb-16 feb-17 jul-17
Tiempo de experiencia transcurrido 4 años 3 años y medio 2 años y medio 2 años
Edad actual 33 meses 27 meses 24 meses 24 meses
Edad vacunación 0 y 6 mesesB 0 y 6 mesesB 6-8 mesesC 6-8 mesesC
Número total de animales (n)A 20 17 29 5 71
Vacunados (n)A 4 4 10 2 20Control (n)A 16 13 19 3 51
Prevalencia infección natural al inicio 11.7% 12,80% 2,80% 22.2% 12,37
Prevalencia infección natural (Junio 2019)
81.2% 92% 84.2% 100% 89,35%
Vacunados protegidos a la infección natural
4 4 10 2 20
Vacunados con carga proviral alta 0/4 0/4 0/10 0/2 0
EN RESUMEN
1. Protege contra la cepa de campo.
2. Genera infecciones de carga proviral baja e indetectable.
3. No se trasmitió a los convivientes ni a la descendencia.
4. No hay detección de provirus en leche.
Fin del ensayo 2021……….
Proyecto FONTAGRO APROBADO Junio 2019 = formulación PILOTO
Ensayos clínicos: etapas de investigación y desarrollo de vacunas (humanas)
Infectividad
Inmunogenicidad
Diagnostico
Carga proviral
Respuesta inmune
InmunogenicidadSeguridad
Prototipo
Piloto
Esquema previsto
N=100
Fase I Fase II Fase IIIPruebas de concepto
Fase IV
Seguridad
Prueba inicial en contexto real
EficaciaSeguridad
REGISTRO POSTREGISTRO
Ensayo piloto 2020• Propósito: disminuir la prevalencia de infección con la cepa de campo en rodeos lecheros
• Objetivo: Evaluar la eficacia de la vacunación en los establecimientos seleccionados
• Requisitos de los establecimientos para su inclusión en el estudio
– Que tengan una clara percepción de la enfermedad y los perjuicios que le ocasiona al rodeo lechero.
– Voluntad y compromiso de cooperación en las tareas que involucren las actividades del ensayo: muestreos de animales, vacunaciones.
– Cercanía a la EEA Rafaela. Los establecimientos no deberán estar en un radio superior a los 20 km de la misma
– Que el rodeo tenga una prevalencia de infección mayor o igual al 80% en las vacas en lactancia
– Que sea un tambo cerrado o con estricto control de movimientos
INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGIA AGROPECUARIA
GRACIAS!!!
Proyecto vacuna:GUILLERMO SUÁREZ ARCHILLA; GERÓNIMO GUTIÉRREZ, MARCOS PETERSEN, IRENE ALVAREZ, ROMINA POLITZKI, NATALIA PORTA, LUCIANA CAVIGLIA, CINTIA GONZALEZ, CECILIA MARTINEZ, VANESA RUIZ, HUGO CARIGNANO, LUIS CALVINHO, ALEJANDRO ABDALA, KARINA TRONO, DIEGO FRANCO, CLAUDIO FIORONI, LUCAS VAGNONI, VERONICA MALDONADO MAY, AGUSTIN VILOR, LAUTARO FRANCO, LUC WILLEMS, NICOLAS GILLET, SABRINA RODRIGUEZ, ALIX DE BROGNIEZ, ARNAUD FLORINS, FANNY BOULANGER, CLAIRE MUZYKA; SOPHIA TAJRIC