Date post: | 16-Apr-2015 |
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ESTUDIO DE CASO DE UNA POBLACIÓN ESTUDIO DE CASO DE UNA POBLACIÓN EXPUESTA A PAH EN MÉXICOEXPUESTA A PAH EN MÉXICO
Dra. Ania Mendoza CantúDra. Ania Mendoza Cantú
Determinación del genotipo y fenotipo del CYP1A2 Determinación del genotipo y fenotipo del CYP1A2 en una población expuesta a Hidrocarburos en una población expuesta a Hidrocarburos
Aromáticos Policíclicos Aromáticos Policíclicos
CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS DEL IPN
Q.F.B. Fabiola Castorena TorresQ.F.B. Fabiola Castorena Torres
Sección Externa de Toxicología
* Sólidos a temperatura ambiente
* Altos puntos de fusión
* Lipofílicos
Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (PAH)Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (PAH)
NaftalenoNaftaleno AntracenoAntraceno FluorenoFluoreno
PirenoPireno
Benzo[a]pirenoBenzo[a]pireno
CrisenoCriseno
Efectos Tóxicos de los PAH en el HumanoEfectos Tóxicos de los PAH en el Humano
Dosis letal oral (mg)
5000-15000 adulto
2000 niño
* Toxicidad aguda Se requieren altas concentracionesSe requieren altas concentracionesde PAH para presentar toxicidadde PAH para presentar toxicidadagudaaguda
*Toxicidad crónica Efectos degenerativos, principalmente Efectos degenerativos, principalmente procesos cancerígenos entre procesos cancerígenos entre los que selos que se encuentran cáncer de pulmón, piel, encuentran cáncer de pulmón, piel, vejiga, esófago, laringe y lengua, entre vejiga, esófago, laringe y lengua, entre otros otros
Biomarcadores a PAH Biomarcadores a PAH
DañoDaño
CáncerCáncer
EfectoEfectoTempranoTemprano
InducciónInducciónde CYP1A2de CYP1A2
ExposiciónExposición
BaseBaseGenéticaGenética
FenotipoFenotipo
GenotipoGenotipo
Polimorfismo Genético del Polimorfismo Genético del CYP1A2 CYP1A2
MutaciónMutación FrecuenciaFrecuencia
%%
Efecto Efecto ReferenciaReferencia
Región del promotor -2964 ( n=116)
77 G/G
18 G/A
5 A/A
Actividad
Nakajima y cols.,1999.
Intrón 1 734 (n=216)
10 C/C
44 C/A
46 A/A
Actividad
Sachse y cols.,1999.
5´ 1 2 3 4 5 6 73´
P1f P4fR2
R3Bsp120I
15q15q
BslI
Evaluar en una población la relación entre Evaluar en una población la relación entre fenotipo y el genotipo del CYP1A2 con la fenotipo y el genotipo del CYP1A2 con la
exposición a PAH exposición a PAH
Objetivo GeneralObjetivo General
2. Evaluar el fenotipo del CYP1A2 (indicador de efecto temprano)
Actividad enzimática mediante el CMR
Contenido de mRNA
Objetivos Particulares
1. Evaluar la exposición a PAH mediante la cuantificación de 1-OH pireno 1. Evaluar la exposición a PAH mediante la cuantificación de 1-OH pireno
en orina (indicador de exposición)en orina (indicador de exposición)
3. Determinar el genotipo del CYP1A2 (indicador de susceptibilidad)3. Determinar el genotipo del CYP1A2 (indicador de susceptibilidad)
4. Determinar la relación estadística entre los parámetros evaluados 4. Determinar la relación estadística entre los parámetros evaluados
REGIÓN CARBONÍFERAREGIÓN CARBONÍFERA(Hornos de Coquizado)(Hornos de Coquizado)
-BARROTERAN, Muz.BARROTERAN, Muz.-CLOETE, Sab.CLOETE, Sab.-JUÁREZ, Jua.JUÁREZ, Jua.
Diseño del estudioDiseño del estudio
Cuestionario Toma de muestraCuestionario Toma de muestra
Contempló: Estilo de vida, hábitos alimenticiosContempló: Estilo de vida, hábitos alimenticios
historia clínica, historia laboral historia clínica, historia laboral
Participaron 46 individuosParticiparon 46 individuos
14 individuos de Barroterán 14 individuos de Barroterán
Muestreo 13 individuos de Cloete Muestreo 13 individuos de Cloete
19 individuos de Juárez 19 individuos de Juárez
Individuos sanos, mayores de 18 años, Individuos sanos, mayores de 18 años,
Criterios de inclusión de sexo masculino, que firmaran el Criterios de inclusión de sexo masculino, que firmaran el
consentimiento informadoconsentimiento informado
que pertenecieran a la zona de estudioque pertenecieran a la zona de estudio
Diseño de corte transversal, muestreo por convenienciaDiseño de corte transversal, muestreo por conveniencia
Estrategia del EstudioEstrategia del Estudio
Cuestionario Cuestionario MuestreoMuestreo
Sangre –EDTASangre –EDTA
Sangre Sangre SueroSuero
DNADNA mRNA mRNA
Polimorfismo Polimorfismo CYP1A2CYP1A2
Cuantificación Cuantificación mRNAmRNA
Pruebas de Pruebas de
funcionamientofuncionamiento hepático y renalhepático y renal
OrinaOrina
Metabolitos Metabolitos cafeínacafeína
1-OHP1-OHP
Determinación del 1-hidroxipirenoDeterminación del 1-hidroxipireno (Jongeneelen y cols., 1986)(Jongeneelen y cols., 1986)
Niveles de 1- Hidroxipireno por poblado Niveles de 1- Hidroxipireno por poblado
1414
1313
1919
4646
2.3 2.3 ± 1.53± 1.53
(n.d – 6.38) (n.d – 6.38)
0.452 ± 0.980.452 ± 0.98
(n.d -2.80)(n.d -2.80)
0.038 ±0.0760.038 ±0.076
(n.d – 0.453)(n.d – 0.453)
0.083 ± 1.660.083 ± 1.66
Barroterán (trabajadores)Barroterán (trabajadores)
IntervaloIntervalo
Cloete (ex-trabajadores)Cloete (ex-trabajadores)
IntervaloIntervalo
Juárez Juárez
IntervaloIntervalo
TotalTotal
nn1-OHP 1-OHP
((mol/mol creatinina)mol/mol creatinina)
media media ± D.S± D.S
PobladoPoblado
n.d-. Niveles que están por debajo de 1 nmol/L. n.d-. Niveles que están por debajo de 1 nmol/L. El Limite de Evaluación Biológica para la TRK (Guía Técnica Alemana) es de 4.2-5.8 El Limite de Evaluación Biológica para la TRK (Guía Técnica Alemana) es de 4.2-5.8 mol/mol mol/mol de creatinina de creatinina
Determinación del polimorfismo del CYP1A2Determinación del polimorfismo del CYP1A2
Polimorfismo en la RegiónPolimorfismo en la Región
del promotordel promotor
((Nakajima y cols., 1999Nakajima y cols., 1999))
Polimorfismo en elPolimorfismo en el
Intron IIntron I(Sachse y cols., 1999)(Sachse y cols., 1999)
8501500
650pb
M C/C A/A C/A
1500 500
PCR-RFLP del gen PCR-RFLP del gen CYP1A2CYP1A2
TGGGCCCAGGATGGGCCCAGGA
AA
734734
Enzima de restricción Enzima de restricción Bsp120IBsp120I
Frecuencia del Polimorfismo del Frecuencia del Polimorfismo del CYP1A2CYP1A2
Polimorfismo genético Polimorfismo genético CYP1A2CYP1A2
GenotipoGenotipo n n FrecuenciaFrecuencia%%
Total Total (n)(n)
Región del promotor(-2964) Intrón I (734)
G/G G/G G/AG/AA/AA/A
C/C C/C C/AC/AA/AA/A
181817171111 00
212125 25
37.537.539.539.52323 00
45455555
4646
4646
Evaluar el fenotipo del CYP1A2Evaluar el fenotipo del CYP1A2
Determinación de la actividad enzimática Determinación de la actividad enzimática del CYP 1A2 (CMR) del CYP 1A2 (CMR) (Extracción por el método modificado de Grand y cols., 1983 y la (Extracción por el método modificado de Grand y cols., 1983 y la determinación por HPLC por el método de Berthou y cols., 1989)determinación por HPLC por el método de Berthou y cols., 1989)
Relación de los Metabolitos de la Cafeína en OrinaRelación de los Metabolitos de la Cafeína en Orina
Índice de la actividad enzimática del CYP1A2 (CMR)Índice de la actividad enzimática del CYP1A2 (CMR)
CYP1A2 = (AFMU+1-MU+1-MX) 1,7-DMU
(Campbell y cols., 1987)(Campbell y cols., 1987)
Análisis semicuantitativo del mRNAAnálisis semicuantitativo del mRNA(Gilliland y cols., 1990 modificado por Vanden Hiuvel y cols., 1993 )(Gilliland y cols., 1990 modificado por Vanden Hiuvel y cols., 1993 )
Muestras de sangre
Extracción de RNA total
PCR con oligos CYP1A2
Purificación de Linfocitos
646
738
Ensayos de RT-PCR semicuantitativoEnsayos de RT-PCR semicuantitativo
cDNA- Kit comercialcDNA- Kit comercial cDNA estándarcDNA estándarGAPDHGAPDH
El índice de la actividad enzimática del CYP1A2 se expresa como el CMR ( caffeine metabolic ratio), El índice de la actividad enzimática del CYP1A2 se expresa como el CMR ( caffeine metabolic ratio), n.d niveles no detectablesn.d niveles no detectables
(1.11 -12.7)
(n.d - 3.65)
2.51 ± 1.77
0.83 ± 0.33
Actividad enzimática
Niveles de mRNA del CYP1A2
IntervaloNivel PromedioPromedio
Variable
Fenotipo del CYP1A2 en la Población EstudiadaFenotipo del CYP1A2 en la Población Estudiada
Resultados de la población Resultados de la población
Características Generales de la Población
22-8422-84
60-11060-110
1.56-1.861.56-1.86
20.04-38.6220.04-38.62
25-47.525-47.5
31-4531-45
80.9-12780.9-127
49.14 49.14 ± 15.07± 15.07
80.13 ± 80.13 ±
1.69 ± 1.69 ±
27.64 ±27.64 ±
27 ± 27 ±
35.06 ± 35.06 ±
86.84 ± 19 86.84 ± 19
Edad (años)Edad (años)
Peso (kg)Peso (kg)
Talla (m)Talla (m)
IMC*IMC*
TGO (U/L)TGO (U/L)
TGP (U/L)TGP (U/L)
Depuración de Depuración de creatinina (ml/min)creatinina (ml/min)++
IntervaloPromedio ± D.SCaracterísticas de la población
14
0.307.60
17.6
6.0
Análisis de EstadísticoAnálisis de Estadístico
Variables Evaluadas Estratificadas por GenotipoVariables Evaluadas Estratificadas por Genotipo
Nativon=18
Heterocigoton=17
Homocigoto mutado n=11
IMC +
Media ± S.DIntervalo 1-OHP †
Media ± S.DIntervalo
Actividad CYP1A2∞
Media ± S.DIntervalo
mRNAMedia ± S.Dintervalo
28.77 ±1.25(22.04-24.36) 0.765 ± 0.9939(0.008-6.38) 1.31 ± 2.932(1.11-12.70)
0.8092 ± 2.067(0.097-3.21)
27.71 ± 5.67(24-39.03) 0.7803 ± 0.84(0.055-3.85) 1.45 ± 2.66(1.2 -7.93)
0.9937 ± 0.6032(0.45 ± 0.9194)
26.98 ± 3.50(22.54-32.56) 0.571 ± 0.723(0 -1.79) 0.774 ± 3.26(1.12 -6.00)
0.642 ± 2.77(0.051- 1.7)
VariableVariable
PromotorPromotor
IMC +
Media ± S.DIntervalo 1-OHP †
Media ± S.DIntervalo
mRNAMedia ± D.SIntervalo
Actividad CYP1A2♣
Media ± S.DIntervalo
*Expresado como la media geométrica, + Índice de masa corporal expresado como Kg/m2, † Expresado en mol/mol de creatinina, ∞ actividad enzimática dada por la relación de [(AFMU+1MX+1MU)/17DMU], ♣ aplicando la prueba estadística de ANOVA, ☼ ☼ (p<0.001)(p<0.001), valores similares a , valores similares a los detectados por Sachse, y cols., 1999 (C/A 0.82, A/A 1.37)los detectados por Sachse, y cols., 1999 (C/A 0.82, A/A 1.37)
VariableIntrón I
Heterocigoton=20
Homocigoto mutadon=26
27.00 ± 4.86(21.0 – 27.02) 1.08 ± 1.35(0.087 – 3.30) 0.8101 ± 1.001(0.051-3.65)
0.7446 ± 2.860.7446 ± 2.86(1.11 – 4.76)(1.11 – 4.76)
28.65 ± 5.63(20.54 ± 39.06) 0.466 ± 2.40(0.009 – 6.38) 0.864 ± 0.536(0.097 -2.153)
1.99±2.531.99±2.53☼☼(1.32 – 12.70)(1.32 – 12.70)
Tabaquismo, consumo de alimento con cierta carga de PAH, Tabaquismo, consumo de alimento con cierta carga de PAH, consumo de bebidas, alimentos y golosinas con cierta carga de consumo de bebidas, alimentos y golosinas con cierta carga de
cafeína, consumo de alcoholcafeína, consumo de alcohol
Aplicando la prueba estadística de ANOVA, con una p>0.05Aplicando la prueba estadística de ANOVA, con una p>0.05
Posibles factores que nos pudieran dar un cambio en la actividad Posibles factores que nos pudieran dar un cambio en la actividad enzimática del CYP1A2 o en los niveles de 1-OHPenzimática del CYP1A2 o en los niveles de 1-OHP
Relación entre la actividad enzimática el nivel de 1-OHP y Relación entre la actividad enzimática el nivel de 1-OHP y el polimorfismo en el intrón I del CYP1A2el polimorfismo en el intrón I del CYP1A2
Aplicando una regresión lineal, Aplicando una regresión lineal, A/AA/A ( (= 0.0730, = 0.0730,
rr2 2 =0.096 p=0.50 ), C/A (b= 0.059, rb= 0.059, r22 =0.049 p=0.50)
Aplicando una regresión lineal, Aplicando una regresión lineal, = 0.8755, = 0.8755,
rr22= 0.18, p<0.001
C/C Nativo, C/A Heterocigoto, C/C Nativo, C/A Heterocigoto, A/A Homocigoto mutado/A Homocigoto mutado
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
C/C C/A A/AC/C C/A A/A
(P<0.001)(P<0.001)
CM
R U
rin
aria
(L
og)
C/A
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2
CM
R U
rin
aria
(L
og
)
1- OHP (mol/mol de creatinina)
A/A
C/A
ConclusionesConclusiones
1.1. La mutación localizada en el intrón ILa mutación localizada en el intrón I
Para el alelo mutado (A/A) observó una frecuencia de 76%, Para el alelo mutado (A/A) observó una frecuencia de 76%, el cual está relacionado con un incremento en la actividad el cual está relacionado con un incremento en la actividad enzimática CYP1A2 y puede ser un factor de riesgo en enzimática CYP1A2 y puede ser un factor de riesgo en algunas alteraciones asociadas con la exposición PAH algunas alteraciones asociadas con la exposición PAH (cáncer)(cáncer)
2. 2. La variabilidad fenotípica observada en los individuos La variabilidad fenotípica observada en los individuos mutados con respecto a los heterocigotos para el mutados con respecto a los heterocigotos para el polimorfismo en el intrón I fue estadísticamente significativa polimorfismo en el intrón I fue estadísticamente significativa ((pp<<0.001) 0.001)
3. Para la mutación en el promotor (-2964) la frecuencia del alelo mutado fue del 58% y para el aleo nativo fue del 42%. No se observó una diferencia entre este polimorfismo y la actividad del CYP1A2
4. Existe una tendencia a presentarse mayor actividad enzimática del CYP1A2 respecto a los niveles de exposición.
5. No existe relación entre los niveles de exposición y los niveles del mRNA para esta isoforma
ConclusionesConclusiones