VICENTE RUIZ VIROGA 1
Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA)- Biología
Sub-área Neurociencias
Tesis de Maestría en Ciencias Biológicas
Estudios in vivo de la internalización de la
hormona concentradora de melanina (MCH) y su
receptor MCHR1 en el Sistema Nervioso Central de
rata
Lic. Vicente Ruiz Viroga
Directora de Tesis: Dra. Patricia Lagos
Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina, Universidad de la República
Tribunal evaluador:
Dra. Ana Silva
Dra. Silvia Olivera
Dra. Alejandra Kun
Junio 2017. Montevideo, Uruguay
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ÍNDICE
Contenido 1- INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 7
1.1- Neuropéptidos .............................................................................................................. 7
1.1.1- Comparación entre neuropéptidos y neurotransmisores clásicos ......................... 7
1.1.2- Receptores ............................................................................................................. 9
1.1.3- Inactivación ......................................................................................................... 10
1.1.4- Efectos celulares .................................................................................................. 10
1.1.5- Métodos de estudio de la internalización de neuropéptidos .............................. 11
1.2- Hormona Concentradora de Melanina ...................................................................... 13
1.2.1- Estructura .................................................................................................................. 13
1.2.2- Síntesis y anatomía de núcleos MCHérgicos en el SNC ............................................. 14
1.2.3- Receptores ................................................................................................................. 16
1.2.4- Núcleos inervados por fibras MCHérgicas ................................................................ 20
2- ANTECEDENTES PARTICULARES ......................................................................................... 24
2.1- Efectos funcionales de la MCH en el NDR ...................................................................... 24
2.1.1. Modulación del ciclo sueño-vigilia ............................................................................ 24
2.1.2. Efectos pro-depresivos .............................................................................................. 25
2.2- Estudios in vitro ............................................................................................................... 26
3- HIPOTESIS ............................................................................................................................ 29
4- OBJETIVO GENERAL ............................................................................................................ 30
5- OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................................... 30
6- METODOLOGÍA ................................................................................................................... 31
6.1- Animales y grupos experimentales ................................................................................. 31
6.1.1- Animales .................................................................................................................... 31
6.1.2- Grupos experimentales ............................................................................................. 31
6.2- Drogas y vías de administración ..................................................................................... 32
6.3- Experimentos “in vivo” ................................................................................................... 32
6.3.1- Microinyección local intra-NDR ................................................................................. 33
6.3.2- Microinyecciones intracerebroventriculares ............................................................. 34
6.3.3- Pre-tratamiento i.c.v. de un antagonista de MCHR1 y de un inhibidor de la
endocitosis mediada por clatrina + MCH-ROD en T20 ........................................................ 35
6.4- Procesamiento de los tejidos .......................................................................................... 37
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6.4.1- Procesamiento y obtención de cortes coronales ....................................................... 37
6.4.2- Cuantificación de marcas MCH-ROD (+) ................................................................... 38
6.5- Ensayos de inmunofluorescencia.................................................................................... 41
6.5.1- Protocolo general ...................................................................................................... 41
6.6- Análisis de datos .............................................................................................................. 42
7- RESULTADOS ....................................................................................................................... 43
7.1- Microinyección de MCH-ROD ......................................................................................... 43
7.1.1- Microinyección intra-NDR de MCH-ROD ................................................................... 43
7.1.2- Ensayos de inmunofluorescencia .............................................................................. 44
7.2- Microinyección de MCH-ROD i.c.v. ................................................................................. 45
7.2.1- Cuantificación de marcas MCH-ROD (+) a T20.......................................................... 51
7.3- Ensayos de inmunofluorescencia.................................................................................... 52
7.3.1- Detección de GFAP .................................................................................................... 52
7.3.2- Detección de NeuN .................................................................................................... 53
7.3.3- Detección de MCH ..................................................................................................... 55
7.3.4- Detección de 5-HT ..................................................................................................... 56
7.3.5- Detección de GAD67 .................................................................................................. 58
7.3.6- Detección de la enzima tirosina hidroxilasa (TH) ...................................................... 60
7.4- Microinyección de ATC o PAO y MCH-ROD a T20 .......................................................... 62
7.4.1- Microinyección de un antagonista de los MCHR1, el ATC-175 ................................. 62
7.4.2- Microinyección de un inhibidor de la endocitosis mediada por clatrina, el óxido de
fenilarsina (PAO) ................................................................................................................. 66
8- DISCUSIÓN .......................................................................................................................... 71
8.1- Microinyección local intra-NDR ...................................................................................... 71
8.2- Microinyección i.c.v. de MCH-ROD ................................................................................. 73
8.3- Transporte de MCH-ROD a través del LCR ...................................................................... 78
8.4- Comparación entre la microinyección de MCH-ROD intra-NDR y la i.c.v...................... 80
8.5- Identificación de fenotipos neuroquímicos MCH-ROD (+) ............................................. 81
8.5.1- Las neuronas GABAergicas en todos los núcleos estudiados son capaces de
internalizar la MCH-ROD ..................................................................................................... 83
8.5.2- Las neuronas serotoninérgicas en el Núcleo Dorsal del Rafe son capaces de
internalizar la MCH-ROD ..................................................................................................... 85
8.5.3- Las señales MCH-ROD colocalizaron con neuronas TH (+) del Núcleo Dorsal del Rafe
............................................................................................................................................. 87
8.6- Evidencias de la dependencia de MCHR1 y de clatrina para la internalización de MCH-
ROD ......................................................................................................................................... 88
8.6.1- La internalización de MCH-ROD es dependiente del receptor MCHR1 ..................... 88
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8.6.2- La internalización de MCHR1 exhibe un proceso típico de receptor GPCR ............... 90
9- CONCLUSIONES GENERALES ............................................................................................... 92
10- PERSPECTIVAS ................................................................................................................. 93
11- CONTRIBUCIONES ........................................................................................................... 94
12- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................... 95
13- ABREVIATURAS ............................................................................................................. 104
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RESUMEN
La hormona concentradora de melanina (MCH) es un neuropéptido hipotalámico que cumple
diversas funciones, entre las que se encuentran el aumento de la ingesta y la modulación del
ciclo sueño-vigilia. Las neuronas MCHérgicas inervan diversas regiones del sistema nervioso
central (SNC). Los mecanismos celulares desencadenados al activar el único receptor funcional
en roedores, el MCHR1, y el proceso de la internalización del receptor junto al ligando, se han
estudiado en modelos in vitro no neuronales en los cuales se sobre-expresó dicho receptor.
Escasos estudios han analizado dicho proceso en modelos in vivo que endógenamente expresan
dicho receptor.
En la presente Tesis de Maestría se realizó el estudio del curso temporal de la internalización in
vivo del conjugado MCH-rodamina (MCH-ROD) en células MCH-receptivas presentes en el SNC
de rata luego de su administración intracerebroventricular (i.c.v.) y se comparó con la
administración local en el núcleo dorsal del rafe (NDR) ; se determinó qué tipo celular es capaz
de internalizarlo y se identificó su fenotipo neuroquímico; y por último, se determinó que dicho
proceso es antagonizado por un antagonista de los MCHR1 y es dependiente de un mecanismo
de endocitosis mediado por clatrina.
Las señales MCH-ROD (+) se cuantificaron en cortes coronales de cerebro de rata a 10, 20 y 60
minutos post-microinyección (T10, T20 y T60). Se identificaron los fenotipos neuroquímicos
capaces de internalizar el conjugado por inmunofluorescencia. Un grupo de ratas a T20 fue pre-
tratado con ATC-0175 (antagonista del MCHR1) y otro grupo con óxido de fenilarsina (PAO), un
inhibidor de la endocitosis mediada por clatrina, previo a la administración de MCH-ROD.
Se obtuvieron mejores resultados con la administración i.c.v. Se detectó una mayor densidad de
marcas MCH-ROD (+) en el núcleo septolateral, núcleo accumbens, hipocampo y núcleo dorsal
del rafe (NDR) en los tres tiempos empleados. El pre-tratamiento con ATC-0175 y PAO redujo la
internalización del conjugado en células presentes en todas estas estructuras. Los elementos
celulares capaces de internalizar dicho conjugado eran neuronas y se pudo determinar que en
su gran mayoría eran GABAérgicas y en el NDR también algunas serotoninérgicas y
catecolaminérgicas (tirosina hidroxilasa (+).
Con este abordaje experimental se demostró que la internalización de MCH-ROD in vivo se
produjo en neuronas presentes en núcleos del SNC de rata descritos como densamente
inervados por fibras MCHérgicas. Nuestros resultados sugieren que endógenamente este
proceso depende de la interacción de la MCH con su receptor, y que es dependiente de clatrina.
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En el presente trabajo de Tesis se obtuvieron resultados originales, siendo uno de los primeros
estudios que demuestran la interacción entre la MCH y su receptor MCHR1 en un sistema
endógeno de expresión del MCHR1 in vivo en el SNC de la rata, utilizando una herramienta
novedosa que permite evidenciar la presencia de células MCH-receptivas.
Presentación de la Tesis
El presente trabajo de Tesis se realizó en el Laboratorio de Neurotransmisión Peptídica
del Departamento de Fisiología de la Facultad de Medicina, UdelaR, en el marco del
proyecto “Estudios in vivo e in vitro de internalización de la hormona concentradora de
melanina (MCH) a través de sus receptores en el núcleo dorsal del rafe: modulación sobre el
sistema serotoninérgico y su relación con la depresión” financiado por la Comisión Sectorial de
Investigación Científica (CSIC; n° de proyecto ID 218) y por una beca de posgrado financiada por
la Agencia Nacional de Investigación e Innovación (ANII, POS_NAC_2013_1_11751).
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1- INTRODUCCIÓN
1.1- Neuropéptidos
David De Wied (1987) definió a los neuropéptidos o péptidos neurogénicos como
pequeñas sustancias endógenas presentes en las neuronas, las cuales se encuentran
vinculadas a funciones del sistema nervioso (de Wied 1987; Burbach 2010). Dicho
concepto surgió de los estudios de De Wied sobre la hormona adrenocorticotrópica
(ACTH), vasopresina y la hormona estimulante de melanocitos (MSH), en los cuales
descubrió que dichos péptidos se encontraban presentes en el tejido nervioso y
producían efectos fisiológicos en éste (de Wied 1987). En su trabajo, De Wied afirma
que, además de sus funciones como hormonas, estos péptidos actúan como
neuromoduladores de las funciones nerviosas. Estas funciones incluyen la motivación,
atención, comportamiento social, agresión, comportamiento sexual, el dolor, la
alimentación, el estado de ánimo, el aprendizaje y memoria, desarrollo de adicciones y
comportamiento maternal y control de la temperatura (de Wied 1987).
1.1.1- Comparación entre neuropéptidos y neurotransmisores clásicos
A continuación se muestra una tabla comparativa describiendo generalidades de
neuropéptidos y diferencias de éstos con los neurontransmisores clásicos.
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NEUROPEPTIDOS NEUROTRANSMISORES CLÁSICOS
Síntesis
Se sintetizan en el soma neuronal como precursores peptídicos (Zhang et al. 2010;
Fricker 2012)
Se sintetizan en las terminales sinápticas dentro de las vesículas de secreción (Merighi et
al. 2011)
Almacenamiento
Una vez sintetizados se almacenan en vesículas en el aparato de Golgi (Salio et al.
2006; Zhang et al. 2010; Merighi et al. 2011)
Un transportador específico introduce al neurotransmisor en su vesícula sináptica (Salio et al. 2006)
Liberación
Las vesículas no se fusionan con la membrana de la presinápsis. Liberación dependiente de clatrina
Liberación rápida (Merighi et al. 2011)
La liberación requiere estímulos de alta frecuencia (gran aumento de [Ca2+] intracelular)(Xu and Xu 2008;
Trueta and De-Miguel 2012)
Estímulos de baja frecuencia son suficientes para su liberación (solo se requiere un aumento local de [Ca2+] intracelular) (Xu and
Xu 2008; Trueta and De-Miguel 2012)
La liberación se da en sitios específicos de la neurona, no solo en la presinápsis. Transmisión por volumen (Merighi et al. 2011)
Se liberan en la zona activa del terminal presináptica (Salio et al. 2006; Merighi et al. 2011)
Farmacología
Presentan mayor afinidad por su receptor, debido al gran tamaño y presencia de múltiples sitios de interacción con éste (Merighi et
al. 2011)
Pequeño tamaño, afinidad moderada dependiendo del neurotransmisor (Merighi et
al. 2011)
Debido al gran tamaño, difunden lentamente; vida media mayor a neurotransmisores de menor peso molecular(Merighi
et al. 2011)
Unión a receptor y reciclaje o degradación rápida (Merighi et al. 2011)
Transmisión por volumen: acción parácrina y/o autócrina(Merighi et al. 2011)
Los neurotransmisores actúan sobre la postsinapsis(Merighi et al. 2011)
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1.1.2- Receptores
Debido a la existencia de una baja concentración de neuropéptidos en el tejido nervioso,
es necesario que sus receptores presenten una alta afinidad por ellos (Strand, 1999).
Dicha afinidad puede ser alterada por mecanismos regulatorios (por ejemplo,
fosforilación o cambios conformacionales). Esta capacidad de reducir o incrementar la
afinidad del receptor, le confiere reversibilidad a la unión del neuropéptido con su
receptor correspondiente (Ferguson 2001; Evron et al. 2012). Una alta especificidad de
parte del receptor impide también la unión de otros péptidos de estructura similar al
péptido específico para dicho receptor.
De acuerdo a la concentración extracelular de su ligando, la expresión del receptor
puede verse modificada, moderando así la respuesta de la célula ante la exposición a su
ligando (Gao and Jacobson 2013). Un mecanismo de retroalimentación negativa es la
desensibilización, donde altas concentraciones del ligando desencadenan una
disminución de la afinidad de su receptor por cambios conformacionales, o una
reducción de su expresión a nivel de la membrana plasmática, mediante su secuestro
debido a la activación de cascadas de señalización intracelular específicas (Mantyh et al.
1995b; Wolfe and Trejo 2007; Evron et al. 2012). Por lo general, este fenómeno
desencadena la internalización del receptor junto con su ligando. Dicho mecanismo
requiere la interacción de sus dominios intracelulares con elementos intracelulares que
asisten a la internalización del receptor dentro de un endosoma (Tsao et al. 2001).
El 80% de los receptores para neuropéptidos son de tipo metabotrópicos acoplados a
proteína G (GPCRs, del inglés G Protein-Coupled Receptors)(Dong et al. 2007; Zhang et
al. 2010). Estos receptores presentan un dominio extracelular ubicado en su extremo N-
terminal, sitio que también es blanco de reacciones de glicosilación y de unión de
hormonas glicoproteicas (Rosenbaum et al. 2009), y cuentan con 7 segmentos
transmembrana compuestos mayoritariamente por aminoácidos hidrofóbicos
conectados por bucles citoplasmáticos y extracelulares. Expuesto a la superficie
extracelular, se presenta un poro central contenedor de varios residuos aminoacídicos
que participan en la unión del ligando al receptor. El extremo C-terminal intracelular
contiene residuos aminoacídicos que participan en la inserción del receptor a la
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membrana celular o en la desensibilización, así como también participa en la interacción
del receptor con elementos de cascadas de señalización intracelular, quinasas o clatrina
para favorecer su endocitosis (Ferguson 2001; Evron et al. 2012).
Los GPCRs al activarse, activan proteínas G acopladas a la membrana plasmática, las
cuales desencadenan cascadas de señalización intracelular (Wolfe and Trejo 2007). La
activación de estos receptores es capaz de influir sobre la concentración de segundos
mensajeros como el Ca2+ , AMPc, o PIP2 actuando sobre las enzimas que los sintetizan y
produciendo la inhibición o activación de sus células blanco (Rosenbaum et al. 2009; Lin
2013).
1.1.3- Inactivación
Los neuropéptidos pueden ser inactivados antes de ser liberados o una vez que
interactúan con su receptor específico. La inactivación intracelular de los neuropéptidos,
ocurre a nivel del retículo endoplásmico rugoso o el aparato de Golgi minutos después
de la síntesis de su precursor. También es posible que éstos sean inactivados dentro de
las vesículas de almacenamiento días después de haber sido sintetizados. Al ser
internalizado junto con su receptor, el neuropéptido puede ser degradado dentro del
endosoma y dejando libre al receptor para ser reciclado si éste no fue degradado junto
con su ligando. A nivel extracelular, la inactivación o degradación peptídica ocurre
rápidamente tanto en el plasma como por acción de células gliales debido a la presencia
de una alta variedad de peptidasas (Fricker 2012). Debido a la presencia de peptidasas
capaces de clivar a los neuropéptidos, éstos son capaces de ejercer sus efectos en bajas
concentraciones (Merighi et al. 2011).
1.1.4- Efectos celulares
Los neuropéptidos presentan numerosas funciones en la totalidad de las funciones
nerviosas yendo desde niveles celulares hasta comportamentales. Por este motivo, es
válido hablar del carácter pleiotrópico de muchos neuropéptidos, dado el amplio
espectro de blancos celulares y moleculares de éstos y de los posibles efectos que son
capaces de inducir (Burbach 2010). Debido a lo mencionado anteriormente, también
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suele referirse a los neuropéptidos como neuromoduladores (Strand, 1999; Merighi et
al., 2011). La principal diferencia que presentan dichas funciones en comparación con
aquellas descritas para los neurotransmisores clásicos es la lenta velocidad de acción de
los neuropéptidos, un rasgo que es atribuido a las condiciones de almacenamiento en
las células, las altas concentraciones intracelulares de Ca2+ necesarias para su secreción,
y la lenta activación de los receptores metabotrópicos tras su unión a sus
correspondientes ligandos (Burbach 2010; Merighi et al. 2011).
Dentro de las funciones descritas para los neuropéptidos, está incluida la influencia
sobre patrones de disparo de la neurona, la modulación de la producción de segundos
mensajeros intracelulares, modificación de la permeabilidad iónica y por tanto, la
excitabilidad neuronal. También se han descrito efectos de los neuropéptidos sobre
patrones de expresión génica, sinaptogénesis, entre otras (Strand, 1999; Burbach, 2010;
Merighi et al., 2011)
1.1.5- Métodos de estudio de la internalización de neuropéptidos
Distintas metodologías han sido utilizadas para estudiar el mecanismo de internalización
de los GPCR. Numerosos autores han destacado la utilidad de los neuropéptidos
conjugados con fluorocromos para estudiar tanto in vitro como in vivo su interacción
con sus respectivos receptores (Bunnett 1995; Grady et al. 1995; Hubbard et al. 2009;
Ionescu et al. 2012). Hubbard et al. (2009) desarrollaron un conjugado del factor de
liberación de corticotropina (Corticotropin Releasing factor, CRF) con un análogo de
rodamina (TAMRA-X) para localizar las neuronas blanco capaces de internalizar dicho
péptido en el tronco encefálico de salamandras. Esta herramienta no solo demostró ser
útil para detectar neuronas blanco del CRF sino que también reprodujo los efectos
comportamentales descritos para el péptido nativo (Hubbard et al. 2009). Ionescu et al.
(2012) emplearon una estrategia similar mediante la administración intranasal e
intracerebroventricular (i.c.v.) de un conjugado del neuropéptido S (NPS) con Cy3,
pudiendo determinar cuáles regiones del sistema nervioso de ratón se encuentran
inervadas por fibras de NPS (Ionescu et al. 2012). El seguimiento de la localización de los
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receptores en la membrana o en el citoplasma en la célula luego de su internalización,
también fue estudiado por Mantyh et al. (1995) realizando ensayos de
inmunohistoquímica utilizando anticuerpos contra el receptor para sustancia P (SPR)
luego de la inyección intraestriatal de sustancia P en ratas (Mantyh et al. 1995a).
También se han realizado estudios de neuropéptidos in vitro empleando receptores
marcados con fluoróforos (Gicquiaux et al. 2002; Moden et al. 2013). Gicquiaux et al.
(2002) estudiaron el proceso de internalización y tráfico intracelular de los receptores
para el neuropéptido Y (NPY Y1 y Y2) expresándolos en células HEK293 conjugados a la
proteína verde fluorescente (EGFP, del inglés, Enhanced Green Fluorescent Protein).
Midiendo la disminución de la fluorescencia de EGFP al exponer las células a agonistas
de los receptores, los autores demostraron que la internalización de éstos es
dependiente de clatrina, y que dichas señales del receptor colocalizaron con marcadores
de vías de reciclaje de los receptores. De esta manera, demuestran que luego del
proceso de desensibilización de las células a un ligando específico, los receptores son
reciclados (Gicquiaux et al. 2002). Debido a que el uso de receptores marcados implica
en algunos casos la fijación de las células, una alternativa experimental para poder
observar en tiempo real el tráfico del complejo ligando-receptor, es la utilización de
ligandos marcados con fluorocromos, como fue expuesto anteriormente (Beaudet et al.
1998; Arttamangkul et al. 2000; Fabry et al. 2000). Arttamangkul et al. (2000) utilizaron
ligandos opioides fluorescentes para los receptores opioides µ y δ, con el objetivo de
superar los obstáculos que implicaba el uso de receptores marcados con FLAG.
Expresando dichos receptores en células CHO (del inglés, Chinese Hamster Ovary), los
autores no solo pudieron rastrear en tiempo real la ubicación de los péptidos marcados
una vez internalizados en células vivas, sino que también demostraron que el marcado
de los péptidos opioides no interfirió con su actividad biológica (Arttamangkul et al.
2000).
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1.2- Hormona Concentradora de Melanina
La hormona concentradora de melanina (MCH, del inglés Melanin Concentrating
Hormone) es un neuropéptido cíclico inicialmente descrito como uno de los factores
responsables del cambio de color en peces teleósteos debido a su acción de inducir la
agregación de gránulos de melanina, lo cual aclara el color de los peces, sirviendo como
mecanismo básico de camuflaje con su entorno. De esta observación proviene su
nombre (Kawauchi and Baker 2004). Vaughan et al. (1989) describieron la presencia de
dicho neuropéptido en neuronas del hipotálamo (Hp) de la rata, lo cual permitió estudiar
las funciones de la MCH actuando como un neuromodulador en el SNC de mamíferos,
incluyendo a los humanos (Vaughan et al. 1989).
1.2.1- Estructura
La MCH en mamíferos presenta una estructura cíclica constituida por una secuencia de
19 aminoácidos altamente conservada entre mamíferos y peces teleósteos (siendo en
los últimos una secuencia de 17 aminoácidos). La estructura cíclica del péptido está
determinada por la formación de un puente disulfuro entre dos residuos de cisteína
presentes en las posiciones 7 y 16 (Vaughan et al. 1989)
Fig. 1. A. Secuencia aminoacídica de MCH de rata y salmón. Los aminoácidos en recuadros
corresponden a aminoácidos conservados entre ambas moléculas. Las líneas gruesas representan
puentes disulfuro B. Estructura cíclica de MCH de mamífero. (A, extraído y modificado de Presse
&Nahon, 2013; B: extraído de Presse et al. 2014)
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1.2.2- Síntesis y anatomía de núcleos MCHérgicos en el SNC
La MCH se origina a partir del clivaje por endoproteasas de su precursor de 165
aminoácidos denominado prepro-MCH (ppMCH), que contiene además de la MCH a los
neuropéptidos EI (NEI) y GE (NGE) ambos activos en el SNC (Bittencourt et al. 1992;
Bittencourt and Elias 1998; Bittencourt 2011; Presse et al. 2014).
La síntesis de la MCH en el SNC está limitada a neuronas presentes en el Hp,
específicamente en el hipotálamo lateral (HL) y la zona incertohipotalámica
(ZI)(Bittencourt et al. 1992; Nambu et al. 1999; Kawauchi and Baker 2004). Por técnicas
de hibridación in situ e inmunohistoquímica se demostró que las neuronas MCHérgicas
se distribuyen de forma continua a lo largo del eje rostro-caudal desde ZI hasta la región
postero-lateral del Hp (fig. 2) (Bittencourt et al. 1992; Risold et al. 2009; Bittencourt
2011). Aparte de los ya mencionados núcleos MCHérgicos, se ha detectado la
localización de neuronas MCHérgicas en estructuras extra-hipotalámicas como el bulbo
olfatorio, la formación reticulopontina y también en el área preóptica media en hembras
lactantes (Bittencourt et al. 1992; Bittencourt 2011).
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A partir de los núcleos mencionados, las neuronas MCHérgicas envían proyecciones a
todo el SNC, con la excepción del cerebelo (fig. 3)(Bittencourt 2011; Presse and Nahon
2013; Presse et al. 2014). Dentro de la diversidad de núcleos inervados por fibras
MCHérgicas se encuentran la ccx, NAc, Hc, Am, tálamo, y el NDR, entre otros
(Bittencourt 2011; Torterolo et al. 2011; Lima et al. 2013; Monti et al. 2013; Yoon and
Lee 2013; Haemmerle et al. 2015). Aparte de estos núcleos, el propio Hp también
presenta una considerable densidad de fibras MCHérgicas (Bittencourt et al. 1992;
Bittencourt 2011).
Fig. 2. Distribución de las neuronas MCHérgicas en el hipotálamo de la rata en el eje rostro-caudal
marcadas por técnicas de inmunohistoquímica. A. Corte coronal de la zona incerto-hipotalámica; las
neuronas se ubican en el eje horizontal desde el extremo dorsal del 3V hasta el fornix. B. Región
anterior del Hp lateral; se destaca un grupo de neuronas MCH (+) en el área dorsomedial del Hp. C.
Neuronas MCH (+) a nivel del hipotálamo lateral tuberal ubicadas entre la cápsula interna y el fornix.
D. Hipotálamo lateral posterior; se observan tres grupos de neuronas MCH (+): un grupo medial, otro
dorsal en la cápsula interna y un tercer grupo en la zona perifornical. Abreviaciones: 3V: tercer
ventrículo; f: fornix; ic: cápsula interna; mt: tracto mamilotalámico; opt: tracto óptico. Barra de
calibración A: 150 µm, B-D: 200 µm (Tomado y modificado de Bittencourt, 2011)
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1.2.3- Receptores
Se han descrito dos tipos de receptores metabotrópicos del tipo GPCR, a través de los
cuales la MCH ejerce sus efectos: el MCHR1 y MCHR2 (Hill et al. 2001; Saito et al. 1999).
En roedores, debido a procesos de splicing alternativo, es frecuente la expresión de
receptores MCH2R truncos, por lo que éste se describe como un seudogen, mientras
que en humanos se presenta como un receptor funcional (Hill et al. 2001; Wang 2001).
Por este motivo, la gran mayoría de los estudios sobre la MCH y los mecanismos de
internalización de ésta junto con su receptor, se han realizado con el MCHR1.
Por técnicas de farmacología reversa, el previamente denominado receptor huérfano
SLC-1, fue descrito por Bächner et al. (1999) como el receptor capaz de responder a la
MCH, denominándolo desde entonces MCHR1 (Bächner et al. 1999; Lembo et al. 1999).
Dicho receptor cuenta con 7 dominios transmembrana, un domino extracelular N-
terminal con 3 sitios blancos de glicosilación y múltiples sitios de fosforilación presentes
Fig. 3. Esquema sagital de cerebro de rata indicando la localización de neuronas MCHérgicas (puntos
negros) y sus proyecciones. Abreviaciones: Amyg: amígdala; AON: núcleo olfatorio anterior; BST:
núcleo basolateral de la amígdala; CG: sustancia gris central; CP: caudado-putamen; CTX: corteza
cerebral; Hab: habenula; HF: formación hipocampal; HYP: hipotálamo; IC: colículo inferior; IP: núcleo
interpeduncular; LDT: núcleo laterodorsal tegmental; ME: eminencia media; MidThal: núcleo talámico
medial; Mam: complejo mamilar; NTS: núcleo del tracto solitario; OB: bulbo olfatorio; OT: tubérculo
olfatorio; PB: núcleo parabranquial; POA: área preóptica; PP: pituitaria posterior; PPN: núcleo
pedunculopontino; PreCBL: núcleo pre-cerebelar; SEP: complejo nuclear septal; SN: Substancia nigra;
Sp. V: núcleo vestibuloespinal; Sp. Cd: médula espinal; SubThal: región subtalámica; Vest: núcleo
vestibular; VTA: área tegmental ventral. (Tomado de Bittencourt et al. 1992)
VICENTE RUIZ VIROGA 17
en los bucles intracelulares y en el extremo C-terminal, siendo este último clave para el
proceso de internalización del receptor (fig. 4; (Hawes et al., 2000a; Saito et al., 2003;
Chung et al., 2009b; Presse et al., 2014).
Utilizando técnicas de hibridación in situ fue posible mapear los sitios de expresión del
ARNm codificante para MCHR1 (Lembo et al. 1999; Saito et al. 1999). Estos estudios
revelaron la amplia distribución del receptor a lo largo del SNC de la rata (Lembo et al.
1999; Saito et al. 1999; Hervieu et al. 2000). Aquellos núcleos que presentaron la mayor
expresión del receptor coinciden con aquellos núcleos descritos como densamente
inervados por fibras MCHérgicas, entre los que se destacan el Hc, NAc y NDR (fig. 5;
Hervieu et al., 2000; Chung et al., 2009b; Presse et al., 2014).
Fig. 4. Estructura de MCHR1 y vías de señalización asociadas. Sitios de relevancia funcional para
MCHR1 están indicados con círculos. Círculos verdes (N13, N16 y N23) representan sitios de
glicosilación. Círculo rojo (D123) es el sitio de unión de la MCH y activación del receptor. R155 (círculo
púrpura) es un sitio de regulador de la transducción de señales. T255 (círculo azul) regula la expresión
de MCHR1 en la superficie celular. El extremo C-terminal está vinculado a la función de señalización a
través del dominio helicoidal (Helix 8). El dominio DRY cumple un papel fundamental en el
mantenimiento de la conformación y la interacción del receptor con proteínas G. (Tomado y
modificado de Chung et al. 2009)
VICENTE RUIZ VIROGA 18
Estudios in vitro han demostrado que al unirse la MCH a su receptor MCHR1, éste es
activado tras la fosforilación de su dominio intracelular ubicado en el extremo C-
terminal y el complejo MCH-MCHR1 es internalizado en la célula por reclutamiento de
la β-arrestina (Saito et al. 2004; Chung et al. 2009b). Está reportado para la gran mayoría
de los GPCRs, que para que ocurra la internalización se requiere un complejo de
proteínas encargadas de dicho proceso. Entre estas proteínas se encuentran la clatrina,
la β-arrestina y la dinamina. Éstas y otras proteínas adaptadoras son reclutadas a
regiones de la membrana plasmática enriquecidas con fosfatidilinositol-(4,5)-bifosfato
(PIP2) y colaboran con la invaginación de la membrana (Ferguson 2001). Estas proteínas
interactúan con un complejo adaptador que permite la unión entre la clatrina y los
fosfolípidos de la membrana tras reconocer sitios fosforilados en la clatrina, lo cual
revela un mecanismo de regulación de su actividad (Wolfe and Trejo 2007).
Fig. 5. Detección por hibridación in situ de expresión de ARNm para MCHR1 en el cerebro de rata.
A – C, cortes coronales representativos de la expresión del ARNm para MCHR1 a distintos niveles
en el eje rostrocaudal. D, corte sagital exhibiendo la distribución del ARNm para MCHR1 en el
cerebro de rata. AcbSh: Núcleo accumbens Shell; Am: Amígdala; AO: núcleo olfatorio anterior; CA1-
3: regiones de Asta de Ammon; CB: cerebelo; CPu: Caudado-Putamen; Ent: corteza entorrinal;
Hippo: hipocampo; Hypo: hipotálamo; IG: indusium griseum; iTH: Núcleo talámico interlaminar;
MM: Núcleo mamilar; Pir: corteza piriforme; SuG: capa gris superficial del colículo superior; Tu:
tubérculo olfatorio. (Tomado y modificado de Lembo et al. 1999)
VICENTE RUIZ VIROGA 19
Como consecuencia de la activación de MCHR1, se estimulan distintas vías de
señalización intracelular a través de proteínas G del tipo Gi, Go y Gq (Hawes et al. 2000a;
Saito et al. 2004; Hamamoto et al. 2011, 2015). Utilizando cultivos de células CHO se
describieron otros efectos intracelulares producidos por la internalización del complejo
MCH-MCHR1, entre los que se encuentran la inhibición de la adenilato ciclasa tras la
activación de la proteína Gi, el cual reduce los niveles intracelulares de AMPc, la
activación de las vías MAPK/ERK (MAPK, mitogen-activated protein kinase; ERK,
extracelular signal-regulated kinase), y un aumento de la concentración intracelular de
Ca2+ por activación del tipo Gq (fig.4; Hawes et al., 2000a; Hamamoto et al., 2015). A
pesar de que el receptor MCHR1 es un GPCR y en general para éstos se ha descrito que
su internalización es mediada por clatrina, no se sabe con certeza si esa proteína estaría
implicada en la internalización de dicho receptor.
Se ha reportado que la MCH ejerce un efecto inhibitorio sobre la actividad sináptica de
las neuronas (Gao and Pol 2001). Estudios in vitro realizados por Gao y Pol (2002)
evidenciaron un efecto inhibitorio de la MCH sobre las corrientes de calcio registradas
en neuronas presentes en rebanadas de Hp de embriones de rata (Gao and Pol 2002).
Debido a la rápida acción inhibitoria de dicho neuropéptido, los autores asumen que el
efecto modulador de la MCH fue a nivel de la membrana de las neuronas, por lo cual la
activación del MCHR1 presente en neuronas del Hp produciría un efecto directo sobre
los canales de calcio L, N y P/Q, afectando principalmente la corriente de tipo N,
importantes en la liberación del neurotransmisor a nivel presináptico (Gao and Pol
2002). Estas observaciones podrían explicar el efecto inhibitorio de la MCH sobre la
función sináptica neuronal.
Estos estudios son los únicos que ponen en evidencia los efectos de la MCH a nivel
celular en un sistema endógeno donde están presentes neuronas MCH-receptivas. Sin
embargo, dichos autores no utilizan un modelo in vivo que permita describir el mismo
proceso.
VICENTE RUIZ VIROGA 20
1.2.4- Núcleos inervados por fibras MCHérgicas
Como se mencionó previamente, desde el HL y el ZI, se envían proyecciones a todo el
SNC, exceptuando al cerebelo (Bittencourt et al. 1992; Bittencourt and Elias 1998;
Bittencourt 2011). Es importante resaltar que estos núcleos también fueron reportados
como sitios del SNC donde hay una importante expresión del MCHR1 (Lembo et al. 1999;
Saito et al. 2001; Chung et al. 2009b; Presse et al. 2014). Como se mencionó
anteriormente, entre los núcleos inervados con mayor densidad se encuentran el NSL,
NAc, Hc, y NDR, entre otros (Risold and Swanson 1997a; Kilduff and de Lecea 2001;
Monti 2010a; Bittencourt 2011; Lima et al. 2013; Haemmerle et al. 2015). La MCH puede
ser transportada a núcleos distantes al HL y ZI por la vía clásica que implica la liberación
de la MCH desde fibras que inervan dichas estructuras nerviosas o a través de una vía
neurohumoral, siendo dicho neuropéptido vertido hacia el sistema ventricular y
transportado por el LCR hacia sus núcleos blanco localizados el lugares distantes
(Torterolo et al. 2008; Conductier et al. 2013b).
Resulta importante destacar características anatómicas y funcionales de algunos de
estos núcleos mencionados y su relación con la MCH, como el NSL, NAc, Hc y NDR.
a) Uno de los núcleos con una densa inervación MCHérgica es la región septal, la
cual es una región interventricular también conocida como septum pellucidum
conectado estrechamente con el hipocampo a través de la región
septohipocampal. Dicha región puede dividirse en 2 grupos de núcleos basados
en su ubicación anatómica: el complejo septomedial (que incluye el núcleo
septomedial y el Núcleo de la Banda Diagonal) y el grupo lateral que contiene al
Núcleo Septolateral (NSL), el septofimbrial y núcleo septohipocampal (Risold,
2004). De los núcleos mencionados, el NSL es el de mayor tamaño (Risold and
Swanson 1997b). Dicho núcleo presenta una división dorsoventral en tres
regiones: porción dorsal, intermedia y ventral. Histológicamente, dichas
regiones no son fácilmente distinguibles, aunque se ha podido identificar los
tipos neuronales presentes en cada porción y las aferencias que reciben de otros
núcleos (Swanson and Cowan 1979; Risold and Swanson 1997a, 1997b). Las
neuronas que abundan en todas las regiones del NSL son principalmente
VICENTE RUIZ VIROGA 21
GABAérgicas y glutamatérgicas (Jakab and Leranth 1990; Gallagher et al. 1995;
Bredewold et al. 2015). Es importante destacar que dentro del NSL se han
localizado alrededor de 15 neuropéptidos entre los que se encuentran la
encefalina, neurotensina y somatostatina (tanto aferencias como neuronas que
los sintetizan; Risold and Swanson, 1997a, 1997b). El NSL ha sido descrito por
Luo et al. (2011) como un centro de relevo entre el hipocampo (CA3
específicamente) y ATV (Luo et al. 2011). Además, se han logrado revelar otras
funciones del NSL en el comportamiento social en roedores, motivación y
recompensa (Luo et al. 2011; Bredewold et al. 2015).
b) El NAc forma parte del estriado ventral y se encuentra vinculado estrechamente
a mecanismos de procesamiento de la motivación, control motor, y aprendizaje
(Gutiérrez-García et al. 2003; Shirayama and Chaki 2006). Dicho núcleo se ha
visto implicado también en trastornos en la etiología y fisiopatología de
enfermedades como la depresión mayor, estrés crónico y adicción a las drogas
(Gutiérrez-García et al. 2003; Shirayama and Chaki 2006; Haemmerle et al. 2015).
Este núcleo comparte una notoria conectividad con la CPF, Hc, Am, ATV, NDR, y
LC, muchos de los cuales integran el sistema límbico. El NAc está
anatómicamente dividido en dos sectores: el core, y el shell. Ambas
subestructuras del NAc, presentan tanto tipos neuronales como funciones
nerviosas bien diferenciadas, al igual que aferencias provenientes de otros
núcleos presentes en el SNC. Los principales tipos neuronales descritos
presentes en NAc son interneuronas GABAérgicas y colinérgicas, además del tipo
de neuronas GABAérgicas denominadas Medium Spiny Neurons
(MSN)(Shirayama and Chaki 2006). La actividad de las MSN es regulada por
aferencias glutamatérgicas provenientes de CPF, Hc y Am, dopaminérgicas del
ATV, serotoninérgicas del NDR, noradrenérgicas del LC (Shirayama and Chaki
2006; Haemmerle et al. 2015). Estas aferencias convergen a las MSN, las cuales
también son reguladas por interneuronas GABAérgicas y colinérgicas presentes
dentro del mismo núcleo. Aparte de receptores para neurotransmisores clásicos,
las neuronas del NAc expresan receptores para neuropéptidos como la
encefalina, dinorfina y también MCH (DiLeone et al. 2003). El NAc es uno de los
núcleos con mayor expresión de ARNm del MCHR1 (Hervieu et al. 2000; Chung
VICENTE RUIZ VIROGA 22
et al. 2009b). Una de las funciones descritas para la MCH en dicho núcleo es la
regulación de la transmisión dopaminérgica puesta en evidencia por Pissios et al.
(2008)(Pissios et al. 2008; Chung et al. 2009a; Liu and Borgland 2015).
c) La formación hipocampal puede dividirse en cuatro regiones corticales: el giro
dentado, el hipocampo propiamente dicho (subdividido en CA1, CA2 y CA3),
corteza entorrinal, y el complejo subicular (Amaral and Witter 1989). Cada una
de estas regiones puede ser identificada por el tipo celular que la constituye. Las
células que forman el hipocampo son de tipo piramidal (Chronister and White Jr.
1975; Kobayashi and Amaral 1999). La capa CA3 recibe aferencias del giro
dentado y la corteza entorrinal a través de la vía perforante, y envía proyecciones
hacia dentro de CA3 y hacia CA1, dando origen a las conocidas colaterales de
Schaffer (Amaral and Witter 1989). El hipocampo recibe aferencias de otros
sectores del SNC como por ejemplo la Am, hipotálamo, región septal, NDR, ATV,
entre otras. Entre los tipos neuronales más abundantes presentes en el
hipocampo, se destacan las neuronas glutamatérgicas y GABAérgicas (Kobayashi
and Amaral 1999; Pachoud et al. 2010). Ambos fenotipos neuroquímicos
corresponden a las neuronas piramidales que constituyen a CA1, CA2 y CA3
(Kobayashi and Amaral 1999). Está reportado que estas regiones hipocampales
reciben densa inervación de fibras glutamatérgicas y GABAérgicas (provenientes
tanto desde adentro como desde afuera del hipocampo), colinérgicas,
monoaminérgicas, serotoninérgicas, así como también recibe aferencias de
neuropéptidos como la somatostatina, neuropéptido Y, sustancia P, entre otros
(Chronister and White Jr. 1975; Jakab and Leranth 1990; Kobayashi and Amaral
1999). Aparte de tener una importante expresión de receptores para cada uno
de los neurotransmisores y neuropéptidos mencionados, se destaca la expresión
del receptor MCHR1 así como también la presencia de fibras MCHérgicas
(Bittencourt et al. 1992; Saito et al. 2001; Chung et al. 2009a). En el hipocampo,
se le ha adjudicado a la MCH un rol regulador de la transmisión glutamatérgica y
en los procesos de formación de memorias, influyendo en la expresión de
receptores glutamatérgicos (Varas et al. 2002, 2003; Pachoud et al. 2010).
d) El NDR es una porción de los Núcleos del Rafe, ubicado a nivel del tronco
encefálico. Ubicado ventral respecto a la sustancia gris periacueductal central del
VICENTE RUIZ VIROGA 23
mesencéfalo, este núcleo puede subdividirse en una parte ventral y otra
interfascicular (Hornung 2012). El principal fenotipo neuroquímico presente en
el NDR corresponde a neuronas serotoninérgicas, seguidas por una importante
población de neuronas GABAérgicas (Charara and Parent 1998; Harsing Jr. 2006;
Fu et al. 2010). Aparte de estos fenotipos, se ha descrito la presencia de otros
tipos neuronales como neuronas dopaminérgicas y colinérgicas, al igual que una
gran cantidad de neuropéptidos (Charara and Parent 1998; Fu et al. 2010). Se ha
reportado la presencia de aferencias glutamatérgicas y GABAérgicas las cuales
actuarían como agentes intrínsecos y extrínsecos reguladores de la actividad de
las neuronas serotoninérgicas que constituyen el NDR (McDevitt and Neumaier
2011; Soiza-Reilly and Commons 2014; Weissbourd et al. 2014). Dichas
aferencias provienen de diversas regiones del SNC entre las que se encuentran
la corteza cerebral (cx), los ganglios basales y el hipotálamo (Peyron et al. 1998;
Hornung 2012; Yoon and Lee 2013; Pollak Dorocic et al. 2014). Las eferencias
serotoninérgicas y GABAérgicas que se proyectan desde el NDR alcanzan
regiones como la amígdala, Hc, NSL, cx, médula espinal, ATV, sustancia nigra,
etc. (Halberstadt and Balaban 2008; Hornung 2012). Este núcleo ha demostrado
tener importante influencia en funciones como la regulación del estado de
ánimo y el ciclo sueño-vigilia (Monti 2010b; Matthews and Harrison 2012; Spiacci
et al. 2012). Se ha demostrado que la MCH presenta un importante papel
modulador de dichas funciones en el NDR, induciendo comportamientos pro-
depresivos y alteraciones en el ciclo sueño-vigilia cuando la MCH es
microinyectada en este núcleo (Lagos et al. 2009; Torterolo et al. 2011; Devera
et al. 2015; Urbanavicius et al. 2016).
VICENTE RUIZ VIROGA 24
2- ANTECEDENTES PARTICULARES
2.1- Efectos funcionales de la MCH en el NDR
2.1.1. Modulación del ciclo sueño-vigilia
Se sabe que este núcleo contiene una importante población de neuronas con un perfil
neuroquímico y electrofisiológico típico de neuronas serotoninérgicas (Fu et al. 2010;
Monti 2010a; Hornung 2012). La activación de las neuronas serotoninérgicas presentes
en el NDR ha sido descrita como un factor importante en la generación del sueño REM
(del inglés, Rapid Eye Movement) (Monti et al. 2013). Lagos et al. pusieron en evidencia
los efectos promotores de la MCH sobre el sueño, aplicando localmente dicho
neuropéptido en el NDR, lo cual indujo un aumento en la duración del sueño REM,
acompañado de una disminución en la duración del estado de vigilia (Lagos et al. 2009).
Dichos efectos pudieron ser revertidos a través de la inmunoneutralización aplicando
anticuerpos anti-MCH, los que indujeron una disminución en la duración y el número de
episodios de sueño REM y un aumento en la duración del estado de vigilia (Lagos et al.
2011a). Considerando que las neuronas serotoninérgicas del NDR son de tipo “REM-off”,
se propuso que la MCH estaba ejerciendo un efecto inhibitorio sobre las neuronas
serotoninérgicas del NDR, pudiendo así explicar los efectos de la MCH sobre el sueño
REM. Para evidenciar el efecto de la MCH sobre la generación del sueño REM, Devera et
al. (2015) realizaron registros electrofisiológicos de unidades en el NDR al inyectar MCH
i.c.v. o al aplicarla de forma yuxtacelular (Devera et al. 2015). Estos experimentos
pusieron en evidencia una reducción en la descarga de las neuronas del NDR al inyectar
la MCH i.c.v. (59%), y al inyectar la MCH yuxtacelular (80%) (Devera et al. 2015). Así
también, se realizó la microinyección i.c.v. de un conjugado de MCH con rodamina
(MCH-ROD) con el objetivo de localizar dicha marca fluorescente intracelularmente e
identificar los fenotipos neuronales presentes en el NDR sobre las que la MCH actuaba
(MCH-receptivos). Tanto por sus características electrofisiológicas como por ensayos de
inmunofluorescencia se demostró que las neuronas blanco de la MCH dentro del NDR
eran neuronas tanto serotoninérgicas como no-serotoninérgicas. Es importante
VICENTE RUIZ VIROGA 25
destacar el empleo de esta herramienta experimental, pues fue utilizada en el desarrollo
de este trabajo de tesis.
2.1.2. Efectos pro-depresivos
Otro de los efectos de la MCH sobre el NDR que han sido puestos en evidencia es la
generación de comportamientos tipo-depresivos (Lagos et al. 2011b). Lagos et al.
(2011b) evidenciaron que mediante el test de nado forzado (TNF), la microinyección de
la MCH en el NDR de la rata indujo un comportamiento tipo-depresivo, debido a un
aumento significativo del tiempo de inmovilidad y una importante disminución en el
tiempo de escalamiento al utilizar el TNF (Lagos et al., 2011b). El aumento en el tiempo
de inmovilidad se considera como una respuesta pro-depresiva, la cual se vio disminuida
en animales pre-tratados con fluoxetina, un conocido inhibidor selectivo de la
recaptación de serotonina (ISRS) y muy utilizado en la clínica para el tratamiento de la
depresión (Lagos et al. 2011b). Este resultado puso en evidencia la relación existente
entre la MCH y el sistema de neurotransmisión serotoninérgico (Lagos et al. 2011b). Roy
et al. (2007) por otro lado, mediante un modelo de ratones knock-out para MCHR1
habían demostrado previamente que dicho comportamiento tipo-depresivo se veía
revertido ante la ausencia del receptor MCHR1, y que la expresión de dicho receptor
aumentaba bajo condiciones de estrés crónico (Roy et al. 2007). Este conjunto de
evidencias comportamentales pueden relacionarse con la inhibición de la descarga de
neuronas serotoninérgicas del NDR cuando se aplicó MCH de forma yuxtacelular
(Devera et al. 2015). Así también, Urbanavicius et al. (2016) lograron demostrar por
perfusión intra-NDR de MCH un efecto dosis-dependiente sobre la liberación de
serotonina, detectando una disminución en la liberación de serotonina al perfundir una
dosis baja de dicho neuropéptido por la cánula de microdiálisis, mientras que una dosis
mayor indujo el efecto opuesto. Es así que se sugiere un efecto de la MCH indirecto
sobre la neurotransmisión serotoninérgica a través de la regulación de la
neurotransmisión GABAérgica presente en el NDR (Urbanavicius et al. 2016).
Los efectos de la MCH sobre el ciclo sueño-vigilia y la aparición de comportamientos pro-
depresivos puede ser asociados considerando que el trastorno del sueño es uno de los
VICENTE RUIZ VIROGA 26
síntomas que se presentan los pacientes con depresión mayor. En pacientes afectados
por dicha patología, se observa una disminución de la latencia del primer período de
sueño REM y un aumento en la duración de éste. Esto puede afirmar la conexión entre
el síntoma y la enfermedad a través de estudios que describen la disminución del sueño
REM en pacientes tratados con antidepresivos (Palagini et al. 2013). Estas evidencias
sugieren una correlación entre la aparición de trastornos en el sueño REM y la
modulación de la transmisión serotoninérgica.
En ese sentido, los resultados de Devera et al. (2015) mostraron que 60 minutos luego
de la microinyección i.c.v. de MCH-ROD, ésta es observada en neuronas
serotoninérgicas así como no-serotoninérgicas, lo cual pone en evidencia que el
conjugado fue internalizado como está descrito para el receptor in vitro en sistemas de
sobre-expresión, y que dichas neuronas estarían expresando el MCHR1 (o serían MCH-
receptivas) y que la acción inhibitoria de la MCH se generaría a través de la
internalización del receptor con su ligando (Hawes et al., 2000a; Devera et al. 2015).
Como se mencionó anteriormente, la MCH indujo una disminución en la descarga de
neuronas con un perfil electrofisiológico propio de neuronas serotoninérgicas. Dicho
efecto inhibitorio se puede relacionar con los efectos pro-depresivos de la MCH y su
efecto promotor del sueño REM al ser microinyectada en el NDR (Lagos et al. 2009;
García-Fuster et al. 2012; Urbanavicius et al. 2014).
2.2- Estudios in vitro
Diversos abordajes in vitro han sido empleados para el estudio de la interacción entre la
MCH y MCHR1, y los efectos que tiene la activación de dicho receptor a nivel celular.
Una estrategia aplicada con frecuencia es la utilización de radioligandos de la MCH o
conjugados de la MCH con un isótopo de yodo (125I-MCH) pero dicha técnica requiere
una correcta purificación del radioligando antes de su utilización, debido a su alta
hidrofobicidad (Eberle et al. 2010). Otros ensayos biológicos permitieron detectar la
formación de complejos entre proteínas G y GPCRs, la activación de fosfolipasas,
movilización intracelular de Ca2+ en células cargadas con Fura2AM o modulación de
producción de segundos mensajeros (Hawes et al. 2000a; Gao and Pol 2002; Eberle et
VICENTE RUIZ VIROGA 27
al. 2010). Hawes et al. (2000) evidenciaron la interacción de MCHR1 (sobre-expresado
en células CHO) tras su activación y proteínas Go/Gi y Gq. Al activarse la proteína Gi se
induce la inhibición de la adenilato ciclasa, provocando una disminución de la
concentración intracelular de AMPc (Hawes et al. 2000a). Esta proteína G presenta una
subunidad βγ que al activarse, estimula la actividad de la vía MAP-quinasa y la
producción de inositol trifosfato (IP3). Por otro lado, la activación de la proteína Go fue
responsable de incrementar la concentración intracelular de Ca2+, efecto también
observado al activarse Gq (Hawes et al. 2000a). Sin embargo, Hamamoto et al. (2015)
lograron identificar no solo los aminoácidos del extremo C-terminal claves para la
interacción con estas proteínas, sino también la afinidad de cada proteína G al MCHR1,
siendo Gq la que presentó menor afinidad por el receptor (Hamamoto et al. 2015).
Algunas líneas celulares capaces de expresar MCHR1 como por ejemplo las células de
neuroblastoma humano, no fueron capaces de responder al estímulo con MCH o
presentaron una activación parcial de las quinasas MAPK/ERK, mientras que otras líneas
celulares como células de melanoma o melanocitos a pesar de expresar el receptor, al
ser estimuladas por la MCH fallaron en evocar los cambios en la concentración
intracelular de Ca2+ (Eberle et al. 2010). Esto puede ser debido a la baja concentración
de los MCHR1 presentes en dichas células. Por dicho motivo, se han seleccionado líneas
celulares capaces de sobre-expresar el MCHR1 que en su gran mayoría no son líneas
provenientes de sistemas neuronales, por lo cual su habilidad de expresar el receptor
no refleja las mismas condiciones que se encontrarían en un sistema endógeno de
expresión de MCHR1.
Dentro de las líneas capaces de sobre-expresar MCHR1, los cultivos de células HEK293 y
células CHO a las que se les indujo la sobre-expresión de éste de forma estable, han
demostrado que la activación e internalización del MCHR1 tiene como consecuencia la
reducción de los niveles intracelulares de AMPc a través de la inhibición de la adenilato
ciclasa, además de la activación de proteína quinasa C (PKC) y las quinasas MAP/ERK
gracias a la activación de las vías de señalización Gi/Go y Gq (Hawes et al. 2000a; Saito et
al. 2000, 2004; Moden et al. 2013). En estas líneas celulares fue posible revelar que el
estímulo de las células por parte de la MCH, provoca un aumento de [Ca2+]i y de IP3,
efectos que pudieron ser revertidos por aplicación de PTX (Pertussis Toxin), la cual
VICENTE RUIZ VIROGA 28
interfiere con una subunidad de Gi/Go (Hawes et al. 2000a). Por otro lado, en cultivos de
células HEK293 que sobreexpresan el receptor MCHR1 marcado con FLAG que se
encuentran presentes en la membrana plasmática en situación basal, Saito et al.
observaron que luego de 40 minutos de exponerse a la MCH, se modificaba su
localización, internalizándose en dichas células en vesículas, reflejando un mecanismo
de desensibilización a la MCH por parte de las células (Saito et al. 2004).
Si bien se han empleado numerosos modelos in vitro con líneas celulares capaces de
sobre-expresar MCHR1, escasos modelos experimentales utilizados ofrecen un sistema
neuronal que exprese de forma endógena el receptor y que éste sea capaz también de
activar las vías de señalización descritas hasta la fecha. Por otra parte, también es
importante destacar la ausencia de modelos in vivo que ofrezcan un sistema que permita
poner en evidencia el proceso de internalización del complejo MCH/MCHR1 a nivel
celular y los mecanismos intracelulares que se desencadenan al activarse el receptor
ante la MCH endógena de dichos tejidos.
En resumen y de acuerdo a los antecedentes especificados anteriormente, se sabe que:
1) el sistema MCHérgico inerva de forma amplia una variedad de estructuras del
SNC, destacándose por su notoria densidad, núcleos como el NAc, NSL, Hc y NDR.
2) existe una concordancia entre dicha inervación y la alta expresión del ARNm
codificante para el MCHR1.
3) se conocen los efectos funcionales de la MCH en los núcleos densamente
inervados por sus fibras, y particularmente se ha descrito el papel de dicho
neuropéptido en la regulación de la neurotransmisión de sistemas particulares
como el de serotonina a nivel del NDR, o glutamatérgico en el Hc.
4) con respecto al MCHR1, se han puesto en evidencia los efectos celulares de la
interacción MCH-MCHR1 in vitro en sistemas celulares no-neuronales y con
sobre-expresión de los MCHR1, así como las cascadas de señalización que se
activan consecuentemente.
5) si bien MCHR1 es un GPCR y para este tipo de receptores la endocitosis mediada
por clatrina es el proceso de internalización descrito, no se ha demostrado que
VICENTE RUIZ VIROGA 29
sea dicho proceso el que esté modulando la internalización de MCHR1 in vitro o
in vivo.
Es así que a pesar de los numerosos trabajos que describen estos procesos, ninguno de
éstos demuestra la activación de las vías de señalización celular que están presentes en
un sistema endógeno in vivo que exprese dicho receptor. Por otra parte, si bien los
efectos de la MCH están descritos para varias de las estructuras inervadas, y se han
identificado los núcleos donde está presente el ARNm de los MCHR1, no se han logrado
identificar los fenotipos neuronales capaces de expresar los MCHR1.
De esta forma, el presente trabajo de tesis propone responder las interrogantes acerca
de la internalización del receptor MCHR1 junto a su ligando en un sistema in vivo,
utilizando a la MCH-ROD, evidenciando la especificidad de dicho proceso e identificando
uno de los factores que influye en el proceso intracelular de su endocitosis. Así también,
propone, a través del empleo de esta herramienta, identificar células MCH-receptivas
presentes en algunos de los circuitos sobre los que la MCH tiene efectos y así asociarlos
a los efectos funcionales ampliamente descritos para dicho neuropéptido.
3- HIPOTESIS
En base a las evidencias in vivo sobre el curso temporal de los efectos funcionales de la
MCH y evidencias in vitro de la internalización de la MCH junto a su receptor MCHR1,
nuestra hipótesis es que, mediante el empleo de la MCH-ROD, se constatará un curso
temporal en la internalización in vivo de la MCH en células presentes en estructuras del
SNC inervadas por fibras de dicho neuropéptido, que dicho proceso será dependiente
del MCHR1 y de la endocitosis mediada por clatrina.
VICENTE RUIZ VIROGA 30
4- OBJETIVO GENERAL
Estudiar la dinámica temporal de la internalización in vivo del complejo MCH/MCHR1 en
células presentes en distintas estructuras del SNC de rata, su dependencia de la
presencia del MCHR1 y uno de los mecanismos celulares subyacentes a tal proceso.
5- OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Seleccionar la vía de administración intracerebral de MCH-ROD más adecuada
para responder las interrogantes planteadas por este trabajo
2. Estudiar in vivo la dinámica temporal de internalización del conjugado MCH-
ROD en NAc, NSL, Hc y NDR a distintos tiempos luego de su administración
i.c.v.
3. Dilucidar si el proceso de internalización in vivo depende de la presencia del
receptor y describir si está mediado por endocitosis mediada por clatrina.
4. Identificar en los núcleos mencionados aquellos fenotipos neuroquímicos
capaces de internalizar el conjugado MCH-ROD a través de MCHR1 y asociar
su presencia con la inervación por fibras MCHérgicas.
VICENTE RUIZ VIROGA 31
6- METODOLOGÍA
6.1- Animales y grupos experimentales
6.1.1- Animales
Se utilizaron ratas macho adultas de la cepa Sprague-Dawley de 280 – 300 gr criados en
la Unidad de Reactivos y Biomodelos de Experimentación (URBE) de la Facultad de
Medicina. Los animales fueron criados y alojados con comida y agua ad libitum, y
mantenidos en condiciones de temperatura y luz controladas (22 ± 2°C; 12 horas de ciclo
luz-oscuridad). Todos los procedimientos fueron aprobados por la Comisión Ética en el
Uso de Animales (CEUA; Nº de expediente: 070153-00515-13).
6.1.2- Grupos experimentales
Con el objetivo de estudiar la dinámica de internalización in vivo del conjugado MCH-
ROD en el SNC de la rata, se realizaron dos tipos de aproximaciones experimentales:
1. Microinyección local de MCH-ROD en el NDR y estudio a tres tiempos post-
microinyección: 10 minutos (T10), 20 minutos (T20) y 60 minutos (T60).
2. Microinyección intracerebroventricular (i.c.v.) de MCH-ROD y estudio de la
dinámica de internalización a T10, T20 y T60, y en segunda instancia, pre-
tratamiento farmacológico con un antagonista de los MCHR1 o un inhibidor
de la endocitosis mediada por clatrina previamente a la microinyección i.c.v.
de MCH-ROD únicamente en el grupo de T20.
VICENTE RUIZ VIROGA 32
6.2- Drogas y vías de administración
MCH-ROD fue obtenida de Phoenix Pharmaceuticals (CA, USA) y fue diluida en 12 µL de
DMSO puro y 48 µL de H2Od para llevar a una concentración de 1,2 µg/µL. El antagonista
de MCHR1 [N-[cis-4-[[4-(Dimetilamino)-2-quinazolinil]amino]ciclohexil]-3-4-
difuorobenzamida clorhidrato (ATC-0175) fue obtenido en Tocris Bioscience (Bristol, UK)
y fue diluido en Tween 80 y H2Od y llevada a una concentración de 1 mM. El óxido de
fenilarsina (PAO, del inglés phenylarsine oxide) fue obtenida de Sigma-Aldrich (MI, USA)
y diluida en DMSO 3% y H2Od hasta alcanzar las concentraciones finales de 10 y 30 mM.
La rodamina B también fue obtenida de Sigma-Aldrich y diluida en agua y llevada a una
concentración de 0,1 mg/mL.
Los distintos tipos de anestesia, uretano (1,2 g/kg) o ketamina (90 mg/kg) y xilacina (5
mg/kg) fueron administradas por vía intraperitoneal (i.p.).
6.3- Experimentos “in vivo”
Como fue mencionado anteriormente, realizamos dos aproximaciones
experimentales in vivo, cada una con varios grupos experimentales:
1. Microinyecciones locales de MCH-ROD en NDR:
a) grupo control absoluto
b) grupos tratados: evaluados a tres tiempos posteriores a la microinyección
de MCH-ROD: T10, T20 y T60.
2. Microinyecciones i.c.v. de MCH-ROD
a) grupo control (rodamina)
b) grupos tratados con MCH-ROD: T10, T20 y T60
c) grupo T20: ATC +MCHROD
d) grupo T20: PAO + MCHROD
VICENTE RUIZ VIROGA 33
Los animales fueron anestesiados con uretano (1,2 g/Kg) por vía i.p. y posteriormente
colocados en un aparato estereotáxico para la implantación de la cánula guía en los sitios
de inyección. Las cánulas fueron fijadas al cráneo utilizando un tornillo y acrílico dental,
2,0 mm por encima del sitio de inyección en el eje dorsoventral. Las coordenadas de
implantación y los calibres de las cánulas guía y de administración se especificarán en el
siguiente ítem 3.1 y 3.2. Las coordenadas utilizadas para la microinyección fueron
determinadas a partir de Bregma de acuerdo al Atlas de Paxinos y Watson (2005).
Una vez implantada la cánula guía, se procedió a la microinyección del conjugado MCH-
ROD a través de una cánula de administración conectada a una bomba de
microinyección (Harvard Apparatus, Elite P11, Holliston, MA, USA).
6.3.1- Microinyección local intra-NDR
Este procedimiento se realizó mediante implante de cánula guía con posterior
microinyección de MCH-ROD 5 días después. Se realizaron tres grupos experimentales
T10 (n = 8), T20 (n = 15), T60 (n = 17).
El día 1, los animales fueron anestesiados con una mezcla de ketamina (90 mg/kg) y
xilacina (5 mg/kg) administrada por vía i.p. y colocados en un aparato estereotáxico
(David Kopf Instruments; CA, USA). Las coordenadas empleadas para la implantación de
la cánula guía en el Núcleo Dorsal del Rafe fueron: AP: -7,8; L: -3,2; -5,0 mm desde la
duramadre en ángulo de 30° según el atlas de Paxinos y Watson (2005). La cánula guía
(24G, 20 mm de longitud) se colocó y se fijó utilizando un implante de acrílico dental
anclado a la superficie del cráneo con tres tornillos. Luego de su implante, los animales
fueron devueltos a sus respectivas cajas, donde se recuperaron de la anestesia y
permanecieron hasta el día de la microinyección en el día 5.
Cinco días después de la implantación de la cánula, se realizó la microinyección de MCH-
ROD mediante una cánula de administración. Se anestesió al animal con uretano (1,2
g/mL) por vía i.p. y se microinyectaron 0,1 µL de MCH-ROD (1,2 µg/µL) a un flujo de 0,1
µL/min a través de una cánula de administración (27G y 22 mm de longitud) colocada
dentro de la cánula guía. Luego de la microinyección y transcurrido el tiempo post-
VICENTE RUIZ VIROGA 34
inyección (10, 20 o 60 minutos, T10, T20 y T60, respectivamente), las ratas fueron
perfundidas intracardíacamente por gravedad como se detalla en el ítem 4 y
posteriormente procesado el tejido.
Los tiempos post-inyección empleados para los experimentos in vivo, están basados en
los estudios realizados por Saito et al. (2004), Lagos et al. (2009), Urbanavicius et al.
(2014) y Devera et al. (2015), donde describen tiempos específicos en los que la MCH
ejerce sus efectos tanto a nivel del receptor, neurontransmisión y comportamentales
(Saito et al. 2004; Lagos et al. 2009; Urbanavicius et al. 2014; Devera et al. 2015)
6.3.2- Microinyecciones intracerebroventriculares
Procedimiento general
A diferencia de los grupos microinyectados intra-NDR, en los grupos i.c.v. la implantación
de la cánula, la microinyección y la posterior perfusión y disección de los cerebros, se
realizaron en el mismo día.
Los animales fueron anestesiados con uretano (1,2 g/Kg) por vía i.p. y colocados en un
aparato estereotáxico para la implantación de cánulas guía en el ventrículo izquierdo
(VLi). Las cánulas se fijaron al cráneo utilizando un tornillo y acrílico dental, 2,0 mm por
encima del sitio de inyección en el eje dorso-ventral. Las coordenadas de implantación
Implante de cánulas guía
1 5 10
Microinyección MCH-ROD +
Perfusión NaCl + PFA 4%
Observación de cortes MCH-ROD (+) y procesamiento de
tejidos para ensayos de inmunofluorescencia
Tiempo (días)
Fig. 6. Protocolo experimental empleado para microinyecciones locales intra-NDR.
VICENTE RUIZ VIROGA 35
de cánulas guía en el Vli fueron: AP: -0,92; L: +1,6; DV: -3,4 mm según el atlas Paxinos y
Watson (2005). Las cánulas utilizadas eran de calibre 21G y 20 mm de largo. Las cánulas
fueron implantadas en el cráneo utilizando acrílico dental y un tornillo para su anclaje.
Una vez implantada la cánula guía, se procedió a la inyección del conjugado MCH-ROD a
través de una cánula de administración conectada a una bomba de microinyección
(Harvard Apparatus, Elite P11, Holliston, MA, USA). Para la microinyección i.c.v. se
inyectaron 10 µL de MCH-ROD a través de una cánula de administración 24G de 22 mm
de largo. El flujo de administración fue de 1,0 µL/min. Este mismo protocolo fue
empleado para realizar la microinyección de rodamina (10 µL, [0,1 mg/mL]).
Las ratas sometidas a este procedimiento fueron separadas en los siguientes grupos
experimentales:
a) grupo control rodamina (0,1 mg/mL, 10 µL) T10 (n = 4), T20 (n = 4) y T60 (n = 4).
b) grupos MCH-ROD (1,2 µg/µL, 10 µL): T10 (n = 4), T20 (n = 8) y T60 (n = 9).
Una vez que se identificaron marcas MCH-ROD positivas en las estructuras de interés
luego de procesados estos grupos experimentales, se eligió el tiempo T20 para los
experimentos con el antagonista ATC-0175 y PAO dado que las ratas del grupo T20
presentaron numerosas marcas MCH-ROD (+) bien definidas en dichos núcleos.
c) Grupo T20 controles MCH-ROD (5 µL)
d) Grupo ATC + MCH-ROD
e) Grupo PAO + MCH-ROD
6.3.3- Pre-tratamiento i.c.v. de un antagonista de MCHR1 y de un inhibidor de la
endocitosis mediada por clatrina + MCH-ROD en T20
Con el objetivo de dilucidar las características de la activación e internalización del
receptor MCHR1, se realizó un pre-tratamiento i.c.v. con el antagonista de dicho
VICENTE RUIZ VIROGA 36
receptor, el ATC-0175, con posterior microinyección de MCH-ROD, para evidenciar la
competencia por los sitios receptoriales.
Para demostrar la dependencia de la clatrina en el proceso de endocitosis del receptor,
se pre-trató por vía i.c.v. con el inhibidor de la endocitosis mediada por clatrina, el óxido
de fenilarsina (PAO) antes de la MCH-ROD.
Para llevar a cabo estos experimentos, se realizaron tres grupos experimentales a T20,
como fue especificado en el ítem 1.2: ATC 1 mM, PAO 10 mM y PAO 30 mM. Estos grupos
se procesaron a los 20 minutos de culminado el procedimiento quirúrgico. Los tres
grupos presentaron controles a los que solamente se les microinyectaron 5,0 µL de MCH-
ROD.
Para el pre-tratamiento con ATC o PAO, se realizó el mismo procedimiento quirúrgico
detallado en el ítem 6.3.2. Previo a la inyección de MCH-ROD, se procedió a inyectar por
vía i.c.v. 5,0 µL de ATC-0175 1 mM, o PAO 10 mM o 30 mM. Al finalizar la microinyección,
la cánula de administración fue retirada suavemente, se colocó otra cánula de
administración y se procedió a microinyectar 5,0 µL de MCH-ROD (1,2 µg/µL). De esta
forma, se realizó la microinyección de un total de 10 µL como se había realizado en los
grupos anteriormente descritos. Al iniciar la microinyección del conjugado, se empezó la
contabilización de los 20 minutos. Al finalizar este tiempo, los animales fueron
perfundidos como se describirá en el ítem 4.
Para los controles correspondientes, se microinyectaron 5 µL de los respectivos vehículos
de ATC y PAO, seguido de la microinyección del mismo volumen de MCH-ROD descrito
anteriormente.
VICENTE RUIZ VIROGA 37
6.4- Procesamiento de los tejidos
6.4.1- Procesamiento y obtención de cortes coronales
Una vez transcurrido el tiempo post-inyección estipulado para cada grupo experimental,
los animales ya anestesiados con uretano fueron perfundidos por vía transcardíaca con
250 mL de NaCl 0,9% y 400 mL de solución fijadora (paraformaldehído, PFA 4%) bajo
campana utilizando una bomba de perfusión a un flujo de 25 mL/min. Los cerebros
fueron disecados y fijados por inmersión en una solución de PFA 4% en buffer fosfato 0,2
M durante 24 horas. Posteriormente, fueron inmersos en una solución de crioprotección
(sacarosa 30% en PBS 0,2M) durante 48 horas. Pasado ese tiempo, los cerebros fueron
incluidos en bloques en el montante CryO-Z-T (Ted Pella, Inc) y congelados en hielo seco
y mantenidos a -80°C hasta ser cortados. Se obtuvieron cortes coronales (30 µm de
espesor) en un crióstato (Leica, Alemania) a -22°C. Para cada animal, se colectaron
aproximadamente 30 cortes que contenían el NAc y NSL entre las coordenadas desde
Bregma 0,20 y 1,00 mm. Para el hipocampo se obtuvieron 20 cortes colectados entre
Bregma -3,30 hasta -2,30. Los cortes de NDR se obtuvieron entre las coordenadas -8,30
y -7,04 de Bregma, obteniéndose aproximadamente 40 cortes por cerebro. También se
colectaron cortes coronales de la región donde fue insertada la cánula guía para verificar
su correcta localización (Bregma -0,92 mm). Los cortes obtenidos conteniendo NDR, Hc,
-5 0 5 10 15 20 min
ATC o PAO MCH-ROD
PERFUSIÓN Y PROCESAMIENTO DE CEREBROS
Fig. 7. Protocolo experimental de pre-tratamiento con ATC o PAO + MCH-ROD a T20.
VICENTE RUIZ VIROGA 38
NAc y NSL fueron guardados en oscuridad en solución de conservación de tejidos
(solución de Olmos) y mantenidos a -20°C hasta su observación en microscopio de
epifluorescencia y/o procesamiento para inmunofluorescencia.
6.4.2- Cuantificación de marcas MCH-ROD (+)
Se cuantificaron las marcas MCHROD (+) en los grupos experimentales i.c.v. T20 y T60, y
en los T20 pre-tratados con ATC, y PAO 10 y 30 mM.
En cada animal, la cuantificación de marcas MCH-ROD (+) se realizó en seis cortes
coronales conteniendo los núcleos de interés, seleccionados al azar, entre coordenadas
específicas tomadas del atlas de Paxinos y Watson (2005). Para su observación y
detección de la presencia de marcas positivas, los cortes fueron montados de forma
transitoria en PBS-T 0,3% en un portaobjetos y cubiertos con cubreobjetos y observados
en un microscopio de epifluorescencia (Nikon Eclipse 50i).
En primera instancia, se observaron todos los cortes obtenidos en sentido antero-
posterior de los cerebros ensayados, para localizar las marcas MCH-ROD (+) con el filtro
adecuado, y así determinar en qué núcleos se enfocaría posteriormente el estudio de
internalización y cuantificación de las marcas. Luego de realizada esta selección, se
obtuvieron imágenes a 10x utilizando un microscopio de epifluorescencia (Nikon Eclipse
50i).
Para el NSL, Hc y NDR, las señales se cuantificaron en tres campos en fotos obtenidas a
10x, mientras que para NAc y NDR, solo se cuantificaron las señales positivas en un
campo de una imagen a 10x.
Las señales (+) cuantificadas correspondieron solo a las visualizadas en elementos
presentes en el parénquima. Las señales (+) detectadas en el epéndimo no fueron
cuantificadas debido a dificultades para reconocer elementos celulares individuales.
Luego de su obtención, las imágenes fueron procesadas utilizando el software Adobe
Photoshop CS6 para un análisis más preciso. La cuantificación de señales se realizó
utilizando el software Image J. Para esto, se trazaron ROIs (region of interest) de distinta
área dependiendo del núcleo y de las marcas positivas encontradas. En la fig. 8 A-D, se
VICENTE RUIZ VIROGA 39
especifican las áreas utilizadas para cuantificar las marcas en las distintas estructuras
analizadas. Solamente se cuantificaron aquellas marcas que se encontraron en las áreas
de interés y se calculó el número de marcas presentes en el área del/los ROI utilizado
para cada núcleo. Se promedió el número de marcas presentes en cada campo para cada
núcleo cuantificado por animal.
Área de ROIs (mm2) Área total analizada (mm2)
0,13 0,26
Área de ROIs (mm2) Área total analizada (mm2)
0,10 0,30
A2)
A1)
VICENTE RUIZ VIROGA 40
Área de ROIs (mm2) Área total analizada (mm2)
0,10 0,30
Área de ROIs (mm2) Área total analizada (mm2)
0,22 0,22
B1)
B2)
Fig. 8. Esquemas de cortes coronales de especificando los campos analizados para la cuantificación.
Los cuadrados rojos enmarcan los campos fotografiados y cuantificados en los cortes correspondientes
a cada núcleo en esquemas del atlas de Paxinos…. Las fotografías de tinción de Nissl son
representativas de los campos analizados para la cuantificación. Los cuadrados negros representan las
ROI utilizadas y sus áreas se especifican en las tablas adjuntas. A1, Núcleo Accumbens; A2, Núcleo
Septolateral; B1, Hipocampo; B2, Núcleo Dorsal del Rafe. Abreviaciones: AqS: acueducto de Silvio; CA2-
3, capas de Astas de Ammon; cc, corpus callosum; NAc, Núcleo Accumbens; NDR, Núcleo Dorsal del
Rafe; NSL, Núcleo Septolateral; VL, ventrículo lateral. Barra de calibración: 100 µm. (Esquemas
coronales tomados y modificados de Paxinos y Watson, 2005)
VICENTE RUIZ VIROGA 41
6.5- Ensayos de inmunofluorescencia
6.5.1- Protocolo general
Los cortes para los ensayos fueron seleccionados en base a su observación en un
microscopio de epifluorescencia para verificar previamente que éstos presentaran
marcas MCH-ROD (+) en los núcleos de interés. Los cortes se montaron en PBS-T 0,3%
en un portaobjetos y fueron cubiertos por un cubreobjetos para ser observados en el
microscopio. Luego de confirmarse la presencia de señales MCH-ROD en los cortes, el
cubreobjetos era retirado con cuidado y los cortes colocados en PBS en una placa de
cultivo de 12 pocillos, donde fueron conservados a 4°C hasta iniciado el ensayo. Para
proteger de la luz a las marcas de rodamina en los tejidos, la placa fue cubierta con papel
de aluminio. Para todos los ensayos de inmunofluorescencia, los cortes fueron
procesados en libre flotación, en agitación constante y mantenidos en oscuridad durante
el ensayo. Previamente los cortes fueron lavados 3 veces con buffer fosfato salino (PBS,
0,1 M) para remover la solución anticongelante. Luego, los cortes fueron sometidos a un
bloqueo con una solución de borhidruro de sodio (0,5%) durante 25 min. Una vez
culminada esta etapa, los cortes fueron lavados nuevamente 3 veces con PBS e
incubados con una solución de glicina (50 mM) y albúmina de suero bovino (0,1%)
durante 60 min. Tras ser lavados con PBS, los cortes se sometieron a un bloqueo con
suero normal de burro (NDS; 3%) en PBS durante 60 min. Estas etapas previas a la
incubación del anticuerpo primario se realizaron para disminuir las uniones inespecíficas
en el tejido y reducir la autofluorescencia que presentan las soluciones fijadoras que
contienen grupos aldehídos. Los anticuerpos primarios fueron diluidos en una solución
conteniendo Triton X-100 (0,3%) y NDS (3%) en PBS.
Una vez cumplido el tiempo de incubación del anticuerpo primario durante toda la
noche (overnight, ON) en agitación constante a temperatura ambiente o 48 hrs. a 4°C,
los cortes fueron lavados con PBS e incubados con sus respectivos anticuerpos
secundarios durante 90 min. a temperatura ambiente en agitación constante. Los
anticuerpos secundarios fueron diluidos en Triton X-100 (0,3%) en PBS. Luego de
finalizada la incubación con este anticuerpo, los cortes fueron lavados en PBS y
montados en láminas (Superfrost plus, Ted Pella, Inc) y cubiertos con cubreobjetos en
VICENTE RUIZ VIROGA 42
medio de montaje Vectashield (Vectorlabs, CA, US). Todos los lavados, bloqueos e
incubaciones a temperatura ambiente fueron realizados en agitación constante.
Tabla 2. Lista de anticuerpos primarios y secundarios utilizados
6.6- Análisis de datos
Para el NAc, se seleccionaron 6 cortes. Se cuantificaron las marcas MCH-ROD (+) en cada
ROI y se sumaron las cantidades cuantificadas por corte. Luego se promediaron las
sumas de ambos ROI para cada corte y se obtuvo la media de las regiones analizadas de
NAc para cada rata. Luego se calculó la media para todas las ratas para NAc.
Para NSL y Hc, se cuantificaron 3 campos utilizando 3 ROI en cada uno. Para cada campo
se realizó la suma del número de marcas MCH-ROD (+) presentes en cada ROI. Luego se
promedió el total de marcas MCH-ROD (+) en cada campo cuantificado. Posteriormente,
el promedio para cada campo se utilizó para calcular la media de cada campo para cada
rata.
ANTICUERPO PRIMARIO ANTICUERPO SECUNDARIO
ANTÍGENO TIPO HUÉSPED Y
CONCENTRACIÓN FABRICANTE
ANTICUERPO Y CONCENTRACIÓN
FLUORÓFORO FABRICANTE
GFAP Monoclonal Ratón 1:1000 Thermo
Scientific (CA, USA)
Burro anti-ratón (1:1500)
Alexa Fluor 488
Jackson ImmunoResearch
(PA, USA)
GAD-67 Monoclonal Ratón 1:2000 Millipore (CA,
USA) Burro anti-ratón
(1:1000)
NeuN Monoclonal Ratón 1:500 Millipore (CA,
USA) Burro anti-ratón
(1:1500)
Jackson ImmunoResearch
(PA, USA)
MCH Policlonal Conejo 1:5000 Phoenix
Pharmaceuticals (CA, USA)
Burro anti-conejo (1:1500)
Jackson ImmunoResearch
(PA, USA)
5-HT Policlonal Cabra 1:1000 Immunostar
(WI, USA) Burro anti-cabra
(1:1500)
TH Monoclonal Ratón 1:1000 Millipore (CA,
USA) Burro anti-ratón
(1:1000)
Jackson ImmunoResearch
(PA, USA)
VICENTE RUIZ VIROGA 43
Para el NDR, se cuantificó un solo campo en 6 cortes, y se promedió el número de marcas
MCH-ROD (+) cuantificadas en el ROI que abarcó el NDR en cada corte cuantificado.
Los valores finales se expresaron como la Media ± Error Estándar de la media. Los datos
fueron procesados y graficados utilizando el software GraphPad Prism.
7- RESULTADOS
7.1- Microinyección de MCH-ROD
7.1.1- Microinyección intra-NDR de MCH-ROD
Para los grupos que recibieron una microinyección intra-NDR, los resultados positivos se
obtuvieron principalmente con el grupo T60. Tanto los controles como los grupos en los
que se evaluó a T10 y T20, no presentaron señales visibles de MCH-ROD en el sitio de
inyección. Es importante destacar que en esos grupos, el número de animales fue bajo.
En los tejidos de los animales pertenecientes al grupo T60, fue posible observar una
intensa marca MCH-ROD (+) en el sitio de la microinyección. Como lo muestra la foto
representativa de la figura 9, rodeando esta marca intensa es posible observar señales
MCH-ROD (+) de menor tamaño e intensidad, las cuales correspondían a elementos
celulares del parénquima y que se confirmó al utilizar el marcador nuclear DAPI (fig. 9).
Debido a la fuerte intensidad de la señal en el sitio de inyección, la cuantificación de las
señales de menor tamaño se vio dificultada ya que la señal más intensa y de mayor
tamaño opacó las señales más pequeñas y menos intensas de alrededor. Los controles
intra-NDR para este grupo experimental de T60 no presentaron señales intensas como
las observadas en los grupos T60 con MCH-ROD.
VICENTE RUIZ VIROGA 44
Fig. 9. Co-localización de señales de MCH-ROD con DAPI a T60. A. Las flechas indican componentes
celulares del NDR que internalizaron la MCH-ROD. B. Marcado de núcleos con DAPI. C. Detección
combinada de MCH-ROD y DAPI. Las flechas blancas indican señales de DAPI que colocalizaron con señales
de MCH-ROD. A y C: La flecha vacía señala una marca intensa de MCH-ROD en el sitio de inyección. Barra
de calibración: 50 µm.
7.1.2- Ensayos de inmunofluorescencia
Las imágenes de inmunofluorescencia revelan que la marca MCH-ROD (+) no colocalizó
con el marcador de astrocitos, GFAP (fig. 10).
Fig. 10. Presencias de marcas positivas de MCH-ROD a 60 minutos post-inyección en NDR e
inmunofluorescencia para detección de GFAP. A: Las flechas indican componentes celulares del NDR que
internalizaron la MCH-ROD; las flechas punteadas indican el sitio de la microinyección. B: Las flechas
indican marcas positivas para GFAP en el NDR. C: detección combinada de MCH-ROD y GFAP. Barra de
calibración: 50 µm.
A B C
VICENTE RUIZ VIROGA 45
Los resultados demostraron que las marcas MCH-ROD (+) no fueron detectadas en las
neuronas serotoninérgicas dado que no hubo colocalización entre dicha marca y la
detección de serotonina (fig. 11). La presencia de la señal intensa de MCH-ROD en el
sitio de microinyección dificultó el análisis de las imágenes para detectar colocalización
entre las marcas (+) observadas en elementos celulares y la de serotonina. Aparte de
dicho fenotipo, otros tipos neuroquímicos presentes en el NDR pueden considerarse
para estudiar si la marca MCH-ROD (+) está presente en ellos. Dentro de ellos están los
GABAérgicos y catecolaminérgicos. Debido a lo expresado anteriormente, por la
presencia de esa intensa marca MCH-ROD (+) en el sitio de microinyección, no fueron
realizados ensayos de inmunofluorescencia para detectar dichos fenotipos en estos
tejidos del grupo T60.
Fig. 11. Presencia de marcas positivas de MCH-ROD a 60 minutos post-inyección en NDR e
inmunofluorescencia para detección de serotonina (5-HT). A: Las flechas indican componentes celulares
del NDR que internalizaron la MCH-ROD; las flechas punteadas indican el sitio de la microinyección. B: Las
flechas indican marcas positivas para 5-HT en el NDR. C: detección combinada de MCH-ROD y 5-HT. Barra
de calibración: 20 µm.
7.2- Microinyección de MCH-ROD i.c.v.
Mediante la microinyección de MCH-ROD i.c.v. y la evaluación de la internalización de
dicho marcador a los tres tiempos elegidos, T10, T20 y T60, fue posible observar que las
marcas positivas se encontraron localizadas en células presentes en el parénquima, en
su mayoría contiguas a los VLs y AqS. En T10 se observaron señales positivas para MCH-
ROD en NAc y NSL, siendo escasas en el NDR e inexistentes a nivel del Hc. En los grupos
T20 y T60 se observaron marcas MCH-ROD (+) en el parénquima de todas las regiones
mencionadas.
VICENTE RUIZ VIROGA 46
La mayor densidad de señales MCH-ROD (+) tanto en T20 como en T60 se observaron
en células presentes en el NSL, NAc, Hc y NDR. Es importante destacar que estas
estructuras del SNC están descritas en la bibliografía como densamente inervadas por
fibras MCHérgicas provenientes del hipotálamo. También se observaron marcas MCH-
ROD (+) en otras estructuras o regiones que no fueron tomadas en cuenta en el análisis
de cuantificación ni de identificación de fenotipos neuroquímicos en este trabajo de
Tesis. Estas regiones incluyeron a los colículos superiores (SuC), núcleos circundantes al
3V y Sustancia gris periacueductal (región lateroventral, dorsomedial y dorsolateral).
En el NSL, NAc y en el Hc a T20 y T60, las marcas se ubicaron en el parénquima cercano
a los VLs. Es importante resaltar que las células del epéndimo presentaron una
intensidad mayor de la marca a la observada en elementos celulares presentes en
regiones parenquimatosas más alejadas de las cavidades ventriculares (fig. 12 y 13). Esto
podría deberse a la difusión del conjugado desde el LCR desde los VLs hacia el
parénquima.
Fig. 12. Señales MCH-ROD (+) en NSL. Señales positivas a nivel del NSL a T20 y T60 (A y B,
respectivamente). Las flechas señalan elementos celulares del NSL que internalizaron la MCH-ROD. Barra
de calibración: 100 µm.
A nivel de NAc en T20 y T60, las marcas MCH-ROD (+) se ubicaron concentradas en el
extremo ventral del VL en que se realizó la inyección (fig. 13). En general, no se
observaron marcas MCH-ROD (+) en estructuras circundantes como el estriado o núcleo
VICENTE RUIZ VIROGA 47
septomedial. Debido a la dificultad para delimitar core y shell del NAc, no se realizó
distinción entre estas dos regiones al analizar los resultados.
Fig. 13. Señales MCH-ROD (+) en NAc. Señales positivas a nivel de NAc a T20 y T60 (A y B,
respectivamente). Las flechas señalan elementos celulares de NAc que internalizaron la MCH-ROD. Barra
de calibración: 100 µm.
Al igual que en el NSL, a nivel del Hc también se observaron marcas de MCH-ROD
definidas e intensas rodeando el VL izquierdo a T20 y T60, siendo imposible observar
marcas a T10 (fig. 14).
Fig. 14. Señales MCH-ROD (+) en hipocampo (CA2/CA3). Señales positivas a nivel del hipocampo, en el
límite entre CA2 y CA3 a T20 y T60 (A y B, respectivamente). Las flechas señalan elementos celulares del
hipocampo que internalizaron la MCH-ROD. Barra de calibración: 100 µm.
VICENTE RUIZ VIROGA 48
A nivel del NDR a T20 y T60, se detectaron marcas (+) rodeando el AqS tanto a nivel de
dicho núcleo como también en la PAG (fig. 15). Las marcas en el NDR se distribuyeron
desde el epéndimo hacia el parénquima y resultaron menos intensas que las observadas
en núcleos más anteriores y cercanos al sitio de microinyección como el NSL, NAc y Hc.
Fig. 15. Señales MCH-ROD (+) en NDR. Señales positivas a nivel de NDR a T20 y T60 (A y B,
respectivamente). Las flechas señalan elementos celulares de NDR que internalizaron la MCH-ROD. Barra
de calibración: 100 µm.
Fue posible observar una disminución en el número de marcas (+) presentes en dichas
estructuras a T20 en comparación con T60. Esto puede deberse a que la MCH-ROD
difundió por el LCR hacia estos sectores más posteriores al sitio de microinyección y que,
debido al tiempo transcurrido, la marca (+) no permaneció en las células en que fue
internalizada o fue degradada dentro de la célula.
Debido a que con la administración i.c.v. de MCH-ROD a T20 y T60 se observaron marcas
positivas a la altura del NDR, un núcleo de nuestro particular interés, se exploraron
dichos cortes con mayor atención y se muestran los resultados obtenidos a dos de los
tres tiempos ensayados (T20 y T60; fig. 15).
A T10, se observaron marcas positivas de MCH-ROD a nivel del epéndimo del AqS. Dichas
células presentaron una mayor intensidad en comparación con marcas en el parénquima
VICENTE RUIZ VIROGA 49
circundante, lo cual sugeriría que el conjugado es capaz de ser transportado desde el
LCR y luego captado por elementos ependimales para luego ser transportado al
parénquima (fig. 16).
Tanto a T20 como a T60, el borde del acueducto presentó marcas positivas con
moderada intensidad, la cual decae gradualmente a medida que estas se ubican más
lejos del acueducto hacia el parénquima circundante donde se observaron marcas
positivas tenues y difusas en elementos celulares (fig. 16).
A T60, se observaron varios elementos celulares positivos en el parénquima en el NDR y
sectores más laterales a AqS y colículos superiores. En este caso las marcas fueron
difusas pero de una intensidad suficiente para diferenciarlas del background.
VICENTE RUIZ VIROGA 50
Fig. 16. Señales MCH-ROD (+) en NDR a T10, T20 y T60. Señales positivas a nivel de NDR a T10, T20 y T60
(A, B y C, respectivamente). Las flechas blancas señalan elementos celulares de NDR que internalizaron la
MCH-ROD. Las flechas vacías señalan elementos del epéndimo MCH-ROD (+) Barra de calibración: 100
µm.
T10
T20
T60
VICENTE RUIZ VIROGA 51
7.2.1- Cuantificación de marcas MCH-ROD (+) a T20
Se realizó la cuantificación de las marcas MCH-ROD (+) en los grupos T20 y T60 en los
núcleos antedichos.
A nivel del NSL, se cuantificaron un total de 24 células MCH-ROD (+) en el área escogida
en base a la presencia de marcas (+) (0,3 mm2 por corte coronal, ver esquemas de Figura
8B de materiales y métodos).
A nivel del NAc se detectaron un total de 41 células en un área de 0,26 mm2 analizada.
En el Hc se cuantificaron 52 células en un área analizada de 0,3 mm2. En el NDR se
cuantificaron 6 células en un área de 0,22 mm2 analizada. Los valores de cuantificación
de dichas marcas MCH-ROD (+) por núcleo y por área analizada se presentan en la tabla
2.
Tabla 2. Cuantificación del número de marcas MCHROD (+) en todos los núcleos analizados a T20. Los
valores están expresados como la Media ± S.E.M (del inglés, Standard Error of the Mean).
Núcleos analizados Área por secciones/campo
cuantificado (mm2)
Nº de señales MCHROD (+)
Área total y Nº de señales MCHROD
(+)
Núcleo septolateral
Campo 1: 0,1 mm2 11± 4 0,3 mm2 24 cels.
Campo 2: 0,1 mm2 11 ± 6
Campo 3: 0,1 mm2 3 ± 1
Núcleo Accumbens
Campo 1: 0,26 mm2
41 ± 10
0,26 mm2
41 cels.
Hipocampo
Campo 1: 0,1 mm2 19 ± 3 0,3 mm2
52 cels. Campo 2: 0,1 mm2 20 ± 4
Campo 3: 0,1 mm2 3 ± 2
Núcleo Dorsal del Rafe
Campo 1: 0,22 mm2 6 ± 2 0,22 mm2
6 cels.
VICENTE RUIZ VIROGA 52
A T60 se cuantificaron 135 células en la misma área del NSL que para T20. Un total de
88 células se cuantificaron en el NAc, mientras que en Hc se cuantificaron 41 células. A
nivel del NDR se observaron 9 células MCH-ROD (+). Los valores de la cuantificación de
elementos MCH-ROD (+) en T60 por campo elegido y por área de todos los núcleos
mencionados, se muestran en la tabla 3.
Tabla 3. Cuantificación del número de marcas MCHROD (+) en todos los núcleos analizados a T60. Los
valores están expresados como la Media ± S.E.M (del inglés, Standard Error of the Mean).
7.3- Ensayos de inmunofluorescencia
7.3.1- Detección de GFAP
A pesar de que la morfología de los elementos celulares MCH-ROD (+) observados, tanto
a T20 como a T60, daba la pauta de que eran neuronas y no elementos gliales, así como
ya se había demostrado con las microinyecciones intra-NDR de MCH-ROD (fig. 10)
igualmente se realizaron ensayos de inmunofluorescencia para detectar GFAP y
descartar una posible co-localización de dichas marcas. Los resultados de dicho ensayo
permitieron observar que no existió colocalización entre las marcas MCH-ROD (+) y las
GFAP (+) presentes en ninguna de las estructuras estudiadas (fig. 17). En la figura 16 se
observan microfotografías representativas de tales ensayos en tejido de Hc a T20 (fig.
Núcleos analizados Área por secciones/campo
cuantificado (mm2)
Nº de señales MCHROD (+)
Área total y Nº de señales MCHROD
(+)
Núcleo septolateral
Campo 1: 0,1 mm2 35 ± 22 0,3 mm2 135 cels.
Campo 2: 0,1 mm2 40± 23
Campo 3: 0,1 mm2 60 ± 32
Núcleo Accumbens
Campo 1: 0,26 mm2
88 ± 33
0,26 mm2
88 cels.
Hipocampo
Campo 1: 0,1 mm2 13 ± 3 0,3 mm2
41 cels. Campo 2: 0,1 mm2 16 ± 2
Campo 3: 0,1 mm2 11± 1
Núcleo Dorsal del Rafe
Campo 1: 0,22 mm2 9 ± 3 0,22 mm2
9 cels.
VICENTE RUIZ VIROGA 53
17). Estos resultados permiten concluir que los astrocitos no son capaces de internalizar
el conjugado de MCH-ROD en las condiciones establecidas en nuestros ensayos.
Fig. 17. Micrografías representativas de señales MCH-ROD (+) detectadas a T20 en Hc (A – C; CA2
específicamente) y NSL (D – F) con inmunolocalización de GFAP en astrocitos. Las flechas marcan
elementos celulares del Hc y NSL que internalizaron la MCH-ROD. A – C: barra de calibración, 100 µm. D
– F: barra de calibración, 50 µm.
7.3.2- Detección de NeuN
Con el objetivo de determinar y confirmar si los elementos celulares que fueron capaces
de internalizar la MCH-ROD eran neuronas, se realizó un ensayo de inmunofluorescencia
para la detección de NeuN en tejidos MCH-ROD (+) obtenidos de ratas del grupo T20.
Los resultados demostraron co-localización entre las señales de MCH-ROD y NeuN,
permitiendo concluir que las neuronas son los elementos celulares capaces de
internalizar el conjugado. La figura 18 muestra micrografías representativas del NSL y
NDR a T20 (fig. 18). Este resultado fue observable en todas las estructuras estudiadas.
A B C
D E F
100 µm
VICENTE RUIZ VIROGA 54
Fig. 18. Micrografías representativas de señales MCH-ROD (+) detectadas a T20 en NSL (A - C) y NDR (D
– F) con inmunolocalización de NeuN en neuronas. Las flechas marcan elementos celulares del NSL y NDR
que internalizaron la MCH-ROD. A – C: barra de calibración, 100 µm. D – F: barra de calibración, 50 µm.
100 µm
50 µm
VICENTE RUIZ VIROGA 55
7.3.3- Detección de MCH
Con el objetivo de evidenciar si era posible detectar a la MCH que estaba presente en
el conjugado internalizado y además, demostrar la presencia de fibras MCHérgicas en
las estructuras analizadas, se realizaron ensayos de inmunofluorescencia para MCH. Los
resultados obtenidos lograron evidenciar la presencia de fibras MCHérgicas cercanas a
señales MCH-ROD (+) observadas en las regiones de interés (fig. 18). La
inmunodetección para MCH no puso en evidencia a la MCH presente en el conjugado
MCH-ROD. En la figura 19 se muestran microfotografías representativas de tales ensayos
en Hc y NAc a T20 (fig. 19). Estos resultados mostraron que existiría una correlación
anatómica entre la presencia de fibras MCHérgicas y la distribución de MCH-ROD (+) en
las estructuras analizadas, lo cual reforzaría la idea de que la MCH, al ser liberada desde
las fibras MCHérgicas, actúa en neuronas MCH-receptivas cercanas.
Fig. 19. Micrografías representativas de señales MCH-ROD (+) detectadas a T20 en Hc (A – C) y NAc (D –
F) con inmunodetección de fibras MCHérgicas. Las flechas marcan elementos celulares del Hc y NAc que
internalizaron la MCH-ROD. Las flechas vacías señalan fibras MCHérgicas. A – C: barra de calibración, 50
µm. D – F: barra de calibración, 100 µm.
A B C
50 µm
VICENTE RUIZ VIROGA 56
7.3.4- Detección de 5-HT
Considerando que el NDR se destaca por tener la mayor densidad de neuronas
serotoninérgicas del SNC, como ya fue mencionado anteriormente, se realizaron
ensayos de inmunofluorescencia para evaluar si la MCH-ROD era internalizada por
neuronas serotoninérgicas. Los resultados muestran la internalización del conjugado por
parte de alguna de las neuronas serotoninérgicas presentes en el NDR, en las cuales se
observa co-localización de ambas marcas (fig. 20). Este resultado es consistente con los
reportados por Devera et al. (2015), quienes observaron que neuronas positivas para la
serotonina en el NDR fueron capaces de internalizar MCH-ROD administrada por vía
i.c.v. (Devera et al. 2015). También se observó la presencia del conjugado en neuronas
no-serotoninérgicas.
VICENTE RUIZ VIROGA 57
Fig. 20. Micrografías representativas de señales MCH-ROD (+) detectadas a T20 en NDR con
inmunolocalización de neuronas positivas para serotonina (+). A. Las flechas marcan elementos celulares
del NDR que internalizaron la MCH-ROD. B. Las flechas señalan neuronas 5-HT (+) en el NDR. C. A y B
superpuestas. Barra de calibración, 100 µm.
A
B
C
VICENTE RUIZ VIROGA 58
7.3.5- Detección de GAD67
Debido a que en el SNC, las neuronas GABAérgicas están presentes en la gran mayoría
de los núcleos y estructuras, inclusive en los núcleos en que detectamos y cuantificamos
las marcas MCH-ROD (+), se realizaron ensayos de inmunofluorescencia contra la GAD-
67, una de las enzimas de síntesis del GABA a nivel del SNC. Es así que se detectó una
co-localización entre las señales de MCH-ROD (+) y las señales GAD67 (+) en todas las
estructuras analizadas. En la figura 21 se observan microfotografías representativas de
Hc y NSL del grupo T20 (fig. 21).
VICENTE RUIZ VIROGA 59
Fig. 21. Micrografías representativas de señales MCH-ROD (+) detectadas a T20 en Hc (A – C) y NSL (D –
F) con inmunolocalización de células GAD-67 (+). Las flechas marcan elementos celulares del Hc y NSL
que internalizaron la MCH-ROD.A – C: barra de calibración, 100 µm. D – F: barra de calibración, 50 µm.
VICENTE RUIZ VIROGA 60
7.3.6- Detección de la enzima tirosina hidroxilasa (TH)
Otro fenotipo neuroquímico dentro del NDR que podría ser un candidato capaz de
internalizar la MCH-ROD son las neuronas dopaminérgicas. Para identificarlas se realizó
un ensayo de inmunofluorescencia contra la TH, la enzima responsable de la síntesis de
la dopamina, noradrenalina y adrenalina. Los resultados demuestran colocalización
entre la señal de MCH-ROD (+) y la señal TH (+), permitiendo considerar a las neuronas
dopaminérgicas o TH (+) como un fenotipo capaz de internalizar la MCH-ROD en el NDR
y ser MCH-receptivas(fig. 22).
VICENTE RUIZ VIROGA 61
Fig. 22. Micrografías representativas de señales MCH-ROD (+) detectadas a T20 en NDR con
inmunolocalización de neuronas TH (+). A. Las flechas marcan elementos celulares del NDR que
internalizaron la MCH-ROD. B. Las flechas señalan neuronas TH-positivas en el NDR. C. A y B superpuestas
Barra de calibración, 100 µm
A
B
C
100 µm
VICENTE RUIZ VIROGA 62
7.4- Microinyección de ATC o PAO y MCH-ROD a T20
7.4.1- Microinyección de un antagonista de los MCHR1, el ATC-175
El pre-tratamiento i.c.v. con ATC-0175 previo a la administración i.c.v. de MCH-ROD a
T20, produjo un bloqueo de la internalización de la MCH-ROD en una mayor cantidad de
elementos celulares que el efecto producido por el pre-tratamiento con PAO.
Mientras que para el NSL, NAc y Hc, se pudo observar una gran disminución en el
número de marcas MCH-ROD (+) presentes en el parénquima, a nivel del NDR no se
lograron visualizaron marcas MCH-ROD (+) con dicho pre-tratamiento. La figura 23
muestra fotos representativas de dichos resultados obtenidos en NSL y NAc. Además de
una disminución en el número de marcas (+), también fue posible detectar que las
marcas (+) observadas, presentaron una intensidad menor a las observadas solo con la
administración de MCH-ROD. Al igual que lo observado en los experimentos previos sin
pre-tratamientos en los grupos T20, las marcas MCH-ROD (+) en el parénquima se
ubicaron rodeando las cavidades ventriculares y AqS.
VICENTE RUIZ VIROGA 63
Fig. 23. Señales MCH-ROD (+) en NSL y NAc luego de tratamiento con ATC-0175. Señales
positivas a nivel de NSL (A y B) y NAc (C y D) a 20 minutos post inyección. Las flechas señalan
elementos celulares de NSL y NAc que internalizaron la MCH-ROD. A y C, controles de MCH-ROD
(5 µL), B y D, tratados: ATC-0175 + MCH-ROD (5 µL ambos). Barra de calibración: 100 µm.
Se cuantificaron las señales MCH-ROD (+) observadas en todos los núcleos
previamente analizados, en controles (solo MCH-ROD) y grupo pre-tratados con
ATC-175, considerando las mismas áreas de tejido utilizadas para la
cuantificación en T20 anteriormente descrita.
En el NSL se cuantificaron 10 ± 2 células MCH-ROD (+) en los controles y 2 ± 0
células MCH-ROD (+) en los grupos pre-tratados; mientras que en el NAc se
cuantificaron 50 ± 19 células MCH-ROD (+) en los controles y 8 ± 5 células en los
grupos pre-tratados. Para ambos núcleos, hubieron diferencias estadísticamente
significativas al comparar controles y pre-tratados de p<0,05. La figura 24
muestra estos resultados en forma gráfica. Estos resultados pusieron en
evidencia el efecto específico del antagonista de los MCHR1, compitiendo con la
MCH-ROD a nivel del receptor e impidiendo que la MCH-ROD sea internalizada
en las neuronas (fig. 24).
C D
A B
CONTROL
CONTROL
ATC-0175
ATC-0175
VICENTE RUIZ VIROGA 64
Fig. 24. Efectos del pre-tratamiento con ATC-0175 1 mM y MCH-ROD a T20 a nivel de NSL (A) y
NAc (B). Las barras representan la media ± Error Estándar. Control: n=3; ATC: n=5. * P<0,05, test
t de Student.
A nivel de Hc también se observaron menos marcas en los grupos pre-tratados
con ATC-0175 que en los controles (fig. 25).
Fig. 25. Señales MCH-ROD (+) en Hc luego de tratamiento con ATC-0175. Señales positivas a
nivel de Hc a 20 minutos post inyección. Las flechas señalan elementos celulares de Hc que
internalizaron la MCH-ROD. A, controles de MCH-ROD (5 µL), B, tratados: ATC-0175 + MCH-ROD
(5 µL ambos). Control: n=3; ATC: n=5. Barra de calibración: 100 µm.
A B
CONTROL ATC-0175
VICENTE RUIZ VIROGA 65
Como lo muestra la figura 26, si bien se observó una tendencia a la disminución
de la presencia de señales MCH-ROD (+) en el Hc luego del pre-tratamiento con
ATC-0175, ésta no fue estadísticamente significativa en comparación con los
controles (4 ± 2 (pre-tratados) versus 12 ± 2,8 (controles).
Fig. 26. Efectos del pre-tratamiento con ATC-0175 1 mM y MCH-ROD a T20 a nivel del Hc. Las
barras representan la media ± Error Estándar. Control: n=3; ATC: n=5. test t de Student.
Fig. 27. Señales MCH-ROD (+) en NDR luego de tratamiento con ATC-0175. Señales positivas a
nivel de NDR a 20 minutos post inyección. Las flechas señalan elementos celulares de NDR que
internalizaron la MCH-ROD. A, controles de MCH-ROD (5 µL), B, tratados: ATC-0175 + MCH-ROD
(5 µL ambos). Barra de calibración: 100 µm.
A B
VICENTE RUIZ VIROGA 66
Al igual que en Hc, con el pre-tratamiento con ATC-0175 se observó una
tendencia a un bloqueo total de la internalización de MCH-ROD en el NDR,
aunque no se detectaron diferencias significativas entre controles (7 ± 3) y
grupos pre-tratados (1 ± 1, fig. 28) debido al reducido número de células MCH-
ROD (+) (Fig. 27 y 28)
Fig. 28. Efectos del pre-tratamiento con ATC-0175 1 mM y MCH-ROD a T20 a nivel del NDR. Las
barras representan la media ± Error Estándar. Control: n=3; ATC: n=5. test t de Student.
7.4.2- Microinyección de un inhibidor de la endocitosis mediada por clatrina, el óxido de
fenilarsina (PAO)
En el grupo pre-tratado con PAO 10 mM y luego MCH-ROD a T20 se observa una
disminución tanto en número como en la intensidad de las marcas MCH-ROD (+)
presentes en las estructuras analizadas. Aparte de observar una disminución de marcas
en el parénquima del NSL y NAc pre-tratados con PAO, pudo observarse una disminución
en la intensidad de dichas marcas, dándoles una apariencia más difusa (fig. 29).
VICENTE RUIZ VIROGA 67
Fig. 29. Señales MCH-ROD (+) en NSL y NAc luego de tratamiento con PAO 10 mM. Señales
positivas a nivel de NAc (A y B) y NSL (C y D) a 20 minutos post inyección. Las flechas señalan
elementos celulares de NSL y NAc que internalizaron la MCH-ROD. A y C, controles de MCH-ROD
(5 µL), B y D, tratados: PAO 10 mM + MCH-ROD (5 µL ambos). Barra de calibración: 100 µm.
Tanto en el NSL como en NAc, se observó una reducción de las señales MCH-ROD
(+) en los grupos pre-tratados con PAO 10 mM. Para el NSL se detectaron 5 ± 2
marcas MCH-ROD (+) y 5 ± 2 para NAc. La cuantificación de los grupos pre-
tratados presentó diferencias significativas con el grupo control (10 ± 1 y 15 ± 3,
respectivamente; fig. 30).
VICENTE RUIZ VIROGA 68
Fig. 30. Efectos del pre-tratamiento con PAO 10 mM y MCH-ROD a T20 a nivel de NSL (A) y NAc
(B). Las barras representan la media ± Error Estándar. * P<0,05, test t de Student.
El pre-tratamiento con PAO 10 mM a nivel del Hc produjo un bloqueo
significativo de la internalización de MCH-ROD observándose una menor
intensidad en las señales MCH-ROD (+) que permanecieron (fig. 31) asi como
también, generando diferencias significativas entre los controles (15 ± 3) y los
grupos tratados (5 ± 1) (Tabla 5 y fig. 32).
Fig. 31. Señales MCH-ROD (+) en Hc luego de tratamiento con PAO 10 mM. Señales positivas a
nivel de Hc a 20 minutos post inyección. Las flechas señalan elementos celulares de Hc que
internalizaron la MCH-ROD. A, controles de MCH-ROD (5 µL), B, tratados: PAO 10 mM + MCH-
ROD (5 µL ambos). Barra de calibración: 100 µm.
VICENTE RUIZ VIROGA 69
Fig. 32. Efectos del pre-tratamiento con PAO 10 mM y MCH-ROD a T20 a nivel de Hc. Las barras
representan la media ± Error Estándar. * P<0,05, test t de Student.
Al igual que lo observado a nivel del NDR en el grupo pre-tratado con ATC-0175,
el pre-tratamiento con PAO 10 mM logró inhibir casi totalmente la
internalización de MCH-ROD por parte de células del NDR, impidiendo detectar
células MCH-ROD (+), como lo muestra la fig. 33.
Fig. 33. Señales MCH-ROD (+) en NDR luego de tratamiento con PAO 10 mM. Señales positivas
a nivel de NDR a 20 minutos post inyección. Las flechas señalan elementos celulares de NDR que
internalizaron la MCH-ROD. A, controles de MCH-ROD (5 µL), B, tratados: PAO 10 mM + MCH-
ROD (5 µL ambos). Barra de calibración: 100 µm.
VICENTE RUIZ VIROGA 70
A pesar de lo observado, los resultados de la cuantificación de señales MCH-ROD
(+) no presentaron diferencias significativas entre los controles (6 ± 4,27) y los
grupos tratados (1 ± 0,56; fig.34).
Fig. 34. Efectos del pre-tratamiento con PAO 10 mM y MCH-ROD a T20 a nivel de NDR. Las
barras representan la media ± Error Estándar. test t de Student.
VICENTE RUIZ VIROGA 71
8- DISCUSIÓN
8.1- Microinyección local intra-NDR
El protocolo empleado para esta serie de experimentos ofrece la ventaja de estudiar el
proceso de internalización de la MCH-ROD restringido al NDR sin tomar en cuenta otras
estructuras presentes en el cerebro de la rata. El proceso de microinyección intra-NDR
implica la administración de un fluido directamente en el parénquima, lo cual requiere
tiempos de espera prolongados para que éste difunda a través del parénquima. De los
tres tiempos post-microinyección analizados, solamente T60 mostró señales ROD (+) en
el parénquima. Por el contrario, tanto T10 y T20, al igual que sus respectivos controles,
no exhibieron señales MCH-ROD (+). Estos resultados podrían indicar que el tiempo que
se dejó transcurrir en estos últimos grupos experimentales no fue suficiente para que la
MCH-ROD pudiera difundir por el parénquima del NDR, a diferencia de T60, y por lo
tanto, no se detectó ningún tipo de señal positiva (específica o inespecífica). Este patrón
observado puede ser producto de la estructura reticular que presenta la matriz
extracelular en el tejido nervioso, la cual puede afectar la difusión de la MCH-ROD a
través de dicha matriz, considerando también el tamaño de la molécula del conjugado
(Nicholson and Sykova 1998; Syková and Nicholson 2008).
Los resultados obtenidos de los experimentos de microinyección local de MCH-ROD
intra-NDR no fueron suficientes para poder responder las preguntas que planteó
inicialmente el presente trabajo. La microinyección intra-NDR de MCH-ROD produjo una
marca ROD (+) de gran tamaño que dificultó diferenciar y detectar células MCH-ROD (+).
Este abordaje experimental fue planteado inicialmente en base a numerosos estudios
en los que se realizó la inyección intraparenquimatosa de neuropéptidos (entre ellos la
MCH), con las cuales se lograron ejercer los efectos fisiológicos esperados al inyectar en
núcleos específicos (Höistad et al. 2005; Dine et al. 2013; Urbanavicius et al. 2014).
Höistad et al. (2005) concentraron su atención en los detalles técnicos de la
microinyección de β-endorfina directamente en el estriado (Höistad et al. 2005). Los
autores destacan la elección del estriado como sitio de inyección debido a la ausencia
de fibras de β-endorfina en esta estructura y su proximidad a los ventrículos laterales.
VICENTE RUIZ VIROGA 72
Este trabajo toma en consideración el pasaje de la β-endorfina del parénquima al LCR
circulando por los ventrículos laterales, y la internalización por células presentes en el
estriado. Luego de la microinyección intraestriatal, se detectó un aumento en los niveles
de β-endorfina en el LCR en la cisterna magna 30-45 minutos después. Los autores
describen que el tiempo en que se detectó el aumento se debió al tiempo del transporte
de la β-endorfina desde el estriado por el LCR hasta la cisterna magna (Höistad et al.
2005). También resaltan la mayor degradación que sufrió la β-endorfina al
microinyectarse en el parénquima comparada con la microinyección i.c.v. Lo observado
en el presente trabajo en cuanto a la microinyección intra-NDR no nos permite llegar a
las mismas conclusiones dado que la marca de rodamina en el parénquima persistió
luego de 60 minutos, presentando una intensidad suficiente para dificultar la
identificación de elementos celulares marcados y la cuantificación de células MCH-ROD
(+). Siguiendo esta observación realizada por Höistad et al. podemos suponer que la
marca ROD (+) observadas en el NDR correspondería a la rodamina solamente, ya que
la MCH debería haber sido degradada por peptidasas contenidas en la matriz
extracelular del tejido (Merighi et al. 2011). La naturaleza hidrofóbica de la rodamina
pudo haber afectado la difusión de ésta a través de la matriz extracelular, causando la
acumulación de la rodamina y la internalización de la MCH-ROD solamente en
elementos celulares próximos al sitio de inyección.
Si bien la microinyección de MCH-ROD intra-NDR permite estudiar el proceso de
internalización en el NDR específicamente, y numerosos estudios han descrito efectos
funcionales de la MCH en dicho núcleo, el abordaje experimental empleado en el
presente trabajo no fue apropiado o requiere ser refinado para su aplicación. Teniendo
en cuenta las características de la matriz extracelular, emplear tiempos post-inyección
más prolongados que los utilizados en este trabajo para permitir la difusión del volumen
de MCH-ROD inyectado en el parénquima podría ser una estrategia plausible para
obtener resultados adecuados para la cuantificación.
VICENTE RUIZ VIROGA 73
8.2- Microinyección i.c.v. de MCH-ROD
El empleo de neuropéptidos marcados con fluoróforos ha demostrado ser una
herramienta útil para el estudio de la especificidad de la interacción ligando receptor
tanto in vivo como in vitro (Beaudet et al. 1998; Hubbard et al. 2009; Ionescu et al. 2012).
La microinyección de MCH-ROD i.c.v. permitió observar, a distintos tiempos post-
administración, una distribución localizada y específica de marcas MCH-ROD (+) en
estructuras del SNC descritas como densamente inervadas por fibras MCHérgicas
provenientes de las neuronas MCHérgicas del HL y ZI (Bittencourt et al. 1992). En
concordancia con lo descrito por Saito et al. (2001), y Lembo et al. (1999), las regiones
densamente inervadas por fibras MCHérgicas, coincidían con aquellas donde la
expresión del ARNm del receptor MCHR1 era mayor (Lembo et al. 1999; Hervieu et al.
2000; Saito et al. 2001). Los resultados obtenidos con este abordaje experimental in vivo,
nos demostraron que la MCH-ROD fue capaz de ser transportada a través del LCR y
captada desde éste por elementos del epéndimo para ser transportada posteriormente
al parénquima y ser internalizada por elementos celulares claramente identificados
(Scott and Sladek 1981).
A pesar de que los estudios de expresión del MCHR1 han permitido localizar los núcleos
con mayores niveles de expresión del ARNm codificante para el receptor a nivel del SNC
de la rata, escasos trabajos han confirmado la presencia de la proteína expresada por
dicho ARNm en dichas regiones y a nivel celular (Conductier et al. 2013a). A su vez, las
marcas (+) para MCH-ROD observadas en los elementos celulares presentes en todas las
estructuras analizadas, coinciden con estructuras y núcleos donde ya habían sido
descritas las fibras MCHérgicas así como la presencia del ARNm del MCHR1. Tomando
esto en consideración, además de que en los animales controles microinyectados solo
con rodamina no se observaron marcas ROD (+) en elementos celulares definidos, los
resultados obtenidos sugieren que la internalización de MCH-ROD se produjo a través
de la interacción específica con el receptor MCHR1 presente en dichas células, ya que el
receptor MCHR2 no se expresa en roedores (Hill et al. 2001; Presse et al. 2014). Por lo
tanto, el empleo de esta herramienta no ha permitido detectar neuronas MCH-
receptivas.
VICENTE RUIZ VIROGA 74
Estudios centrados en los efectos de la MCH a nivel de distintas estructuras del sistema
nervioso apuestan a la interacción específica de la MCH y su receptor MCHR1 a pesar de
no haberse evidenciado la presencia de la proteína del receptor en los núcleos de
interés. Muchos estudios han descrito los efectos funcionales de la MCH al ser
administrada en determinadas estructuras y en algunos casos, el antagonismo de dichos
efectos mediante el empleo de antagonistas específicos de los MCHR1.
La administración i.c.v. de MCH-ROD tuvo como consecuencia la aparición de señales
MCH-ROD (+) en el NAc. Si bien no hubieron diferencias significativas en el número de
marcas MCH-ROD (+) observadas en el NAc entre T20 y T60, existen diversos estudios
capaces de justificar la presencia de la MCH-ROD en neuronas de dicho núcleo. A nivel
del NAc, muchos estudios han evidenciado el rol de la MCH en comportamientos
inducidos por drogas como la cocaína, la regulación de la alimentación, así como
también en la asignación del valor hedónico del alimento (Saper et al. 2002; DiLeone et
al. 2003; Chung et al. 2009a). Chung et al. (2009a) demostraron que en el shell del NAc,
MCHR1 se encuentra co-expresado en neuronas junto con receptores dopaminérgicos
(Chung et al. 2009a). En este mismo trabajo, se puso en evidencia que la MCH al ser
administrada i.c.v., es capaz de aumentar la actividad locomotora inducida por una dosis
de cocaína administrada i.p. Estos efectos se vieron revertidos en ratones knock-out
para MCHR1, para los cuales también se describió una disminución en la sensibilización
a la cocaína (Chung et al. 2009a). De estos resultados se desprende la idea de que el
bloqueo del circuito MCHérgico operando a nivel del NAc puede servir como un abordaje
terapéutico para el tratamiento de la adicción a la cocaína. Otros estudios describieron
la importancia de la MCH en el NAc y los efectos que tiene ésta en el (Saper et al. 2002;
Liu and Borgland 2015). Ratones knock-out para MCHR1 exhibieron un comportamiento
hipofágico en contrapartida con la obesidad y sobrealimentación observada cuando la
MCH es administrada i.c.v. (Saper et al. 2002). Los resultados descritos sugieren un papel
determinante de la MCH en la asignación del valor hedónico del alimento, función que
se le ha descrito a varios neuropéptidos hipotalámicos (DiLeone et al. 2003).
El NSL fue uno de los núcleos que presentó gran cantidad de marcas MCH-ROD (+). La
inyección del conjugado permitió que éste sea captado por elementos del epéndimo
ubicado en los ventrículos laterales, haciendo posible que la MCH-ROD sea captada del
VICENTE RUIZ VIROGA 75
LCR y sea transportada al parénquima donde entraría en contacto con neuronas
receptivas para la MCH. Como se mencionó previamente, poco se sabe de las funciones
que la MCH podría modular a nivel del NSL. Entre las funciones descritas para este
núcleo se encuentra el control del comportamiento social y la asociación de un estímulo
a un contexto o ambiente específico actuando también como un centro de relevo entre
el hipocampo y la ATV (Luo et al. 2011; Bredewold et al. 2015). Bredewold et al. (2015)
describieron diferencias en la modulación del juego social en hembras y machos. El
GABA y el glutamato (los neurotransmisores más abundantes en el NSL) probaron ser
cruciales para dicho comportamiento; al bloquear los receptores GABA-A, el juego social
se vio reducido en ambos sexos, mientras que al bloquear receptores NMDA y AMPA,
se exhibió una disminución dosis-dependiente en el juego social exclusivamente en
hembras, revelando así diferencias en el control de dicho comportamiento entre ambos
sexos (Bredewold et al. 2015). Chee et al. (2015) describieron por primera vez procesos
de comunicación entre el sistema MCHérgico y neuronas del NSL (Chee et al. 2015).
Trabajos anteriores habían descrito la densa inervación de dicho núcleo por parte de
fibras MCHérgicas, pero ninguno de ellos describió los efectos de la MCH en él
(Bittencourt et al. 1992; Risold and Swanson 1997a). Chee et al. no solo describieron los
efectos de la MCH a nivel neuronal en el NSL sino también demostraron que las
neuronas MCHérgicas también co-expresan glutamato (Chee et al. 2015). En dicho
trabajo, se demostró que la estimulación de las fibras MCHérgicas en el NSL induce la
liberación de glutamato, lo cual favoreció la liberación de GABA, llevando a una
disminución en el disparo de potenciales de acción de las neuronas presentes en rodajas
del NSL. Estas observaciones demostraron el papel de la MCH en la regulación de la
neurotransmisión del NSL. El trabajo realizado por Chee et al. (2015) junto con el de
Bredewold et al. (2015), dan un indicio del papel de la MCH en la regulación del
comportamiento social en ratas. La MCH al modular la liberación de glutamato y/o GABA
en el NSL podría estar indirectamente influyendo en el juego social de los animales,
operando en distintos modos dependiendo del sexo de estos (Bredewold et al. 2015;
Chee et al. 2015).
El Hc es otra de las estructuras para la cual se describió no solo una densa inervación
MCHérgica sino también una alta expresión del ARNm del receptor MCHR1 (Bittencourt
VICENTE RUIZ VIROGA 76
et al. 1992; Saito et al. 2001; Chung et al. 2009b). La administración intra-hipocampal de
MCH ha demostrado tener efectos notorios en la neurotransmisión glutamatérgica y, a
nivel funcional, sobre la memoria espacial y el comportamiento de búsqueda del
alimento (Varas et al. 2003; Sita et al. 2016). Varas et al. (2003) evidenciaron que la
administración de MCH directamente en CA1 indujo una disminución en el umbral para
generar LTP, efecto que se vio reflejado en un aumento de la latencia observada en el
test de tarea de esquiva inhibitoria (Varas et al. 2003). Este proceso de facilitación del
LTP está asociado a la activación de los receptores NMDA. Se cree que la corriente de
calcio que fluye a través de los receptores NMDA es suficiente para inducir el LTP. Varas
et al. sugieren que el aumento de [Ca2+]i luego de la administración de la MCH es el
responsable de facilitar la inducción del LTP (Varas et al. 2003). Este mismo trabajo
mostró que se producía un aumento de la expresión de las subunidades NR2A y NR2B
de los receptores NMDA con la administración de MCH en el Hc. Está descrito que dichas
subunidades son capaces de modular las corrientes iónicas a través de los receptores
NMDA incidiendo en los umbrales para generar LTP y modular los procesos de
aprendizaje (Varas et al. 2003). Lu et al. (2013) demostraron cómo la administración de
MCH en el núcleo septomedial induce la liberación de acetilcolina proponiendo un
efecto de dicho neuropéptido sobre la memoria (Lu et al. 2013). En contrapartida con lo
observado al administrar MCH en el Hc, Pachoud et al. (2010) observaron en ratones
knock-out para el receptor MCHR1, la generación de LTP se vio fuertemente afectada al
aumentar el umbral de generación. Los autores proponen que este fenómeno es
producto de una reducción de la transmisión sináptica mediada por los receptores
glutamatérgicos NMDA (Pachoud et al. 2010). Los efectos descritos para la MCH sobre
circuitos neuronales en el hipocampo pueden ser puestos en evidencia por los
resultados obtenidos en esta Tesis de Maestría. Considerando que el Hc fue una de las
regiones con gran cantidad de señales MCH-ROD (+), la presencia de éstas a los 20 y 60
minutos luego de la microinyección i.c.v. demuestra la receptividad de las neuronas del
Hc ante la MCH y por ende un probable efecto directo de la MCH, lo cual estaría
subyaciendo a los efectos funcionales ya evidenciados en trabajos anteriores.
La MCH sobre el NDR ha demostrado ejercer sus efectos en funciones como el ciclo
sueño-vigilia y el estado de ánimo (Monti 2010a; Matthews and Harrison 2012; Spiacci
VICENTE RUIZ VIROGA 77
et al. 2012). Numerosos estudios basados en la microinyección intra-NDR de MCH han
evidenciado los efectos moduladores del neuropéptido en dichas funciones. Lagos et al.
(2009) evidenciaron que la microinyección intra-NDR de MCH provocó un aumento en
la duración del sueño REM al actuar sobre las neuronas presentes en el NDR (Lagos et
al. 2009). Las neuronas serotoninérgicas presentes en el NDR son activas durante la
vigilia y se vuelven inactivas durante el sueño REM (neuronas REM-off). Durante el sueño
REM, la liberación de serotonina disminuye en diversas áreas del cerebro, posiblemente
por acción de la MCH, la cual como neuropéptido inhibitorio podría facilitar la
generación del sueño REM a través de la inhibición de las neuronas serotoninérgicas
(Lagos et al. 2009). Las teorías propuestas a raíz de este estudio fueron puestas a prueba
en el trabajo realizado por Lagos et al. (2011), donde a través de la inmunoneutralización
utilizando anticuerpos anti-MCH, se pudo observar una reducción del tiempo que los
animales permanecía en sueño REM (Lagos et al. 2011a). Este estudio sirvió para
complementar los resultados de Lagos (2009) evidenciando nuevamente el rol de la
MCH en el control del ciclo sueño-vigilia y la inducción del sueño REM (Lagos et al.
2011a). Si bien estos estudios ponen en evidencia los efectos de la MCH sobre el ciclo
sueño-vigilia, ninguno de ellos confirma que la MCH actúa directamente sobre las
neuronas serotoninérgicas, o sobre otros tipos celulares presentes en el NDR o
aferencias de otros núcleos.
Devera et al. (2015) demostraron, utilizando el mismo conjugado de MCH-ROD utilizado
en este trabajo, que al administrarlo i.c.v., este era internalizado por neuronas
serotoninérgicas y no-serotoninérgicas (posiblemente GABAérgicas) del NDR (Devera et
al. 2015). Estos resultados sugieren que dichas neuronas estarían expresando los
MCHR1 y que debido a la interacción entre éste y la MCH-ROD, el conjugado es
internalizado. Este mismo trabajo demostró que la administración de la MCH i.c.v. y
yuxtacelular indujo una disminución en la frecuencia de disparo de neuronas del NDR.
El conjunto de resultados expuesto en este estudio sustentan las bases para explicar
cómo la MCH actúa sobre el ciclo sueño-vigilia induciendo el sueño REM y que los
efectos del neuropéptido sobre las neuronas del NDR se dan posiblemente a través de
la interacción de la MCH con su correspondiente receptor (Devera et al. 2015).
VICENTE RUIZ VIROGA 78
Los efectos pro-depresivos de la MCH al actuar sobre neuronas (posiblemente
serotoninérgicas) del NDR se han descrito en numerosos estudios. Lagos et al. (2011)
evidenciaron un efecto pro-depresivo a través del TNF inducido por la microinyección
de MCH directamente en el NDR, reflejado en el aumento del tiempo de inmovilidad de
la rata (Lagos et al. 2011b). Este efecto se vio revertido con el pre-tratamiento con
fluoxetina o con anticuerpos anti-MCH. Los resultados expuestos en este trabajo están
en concordancia con los reportes realizados por Roy et al. (2007), los cuales vinculan a
la MCH con la neurotransmisión serotoninérgica (Roy et al. 2007). En este mismo
estudio, los autores analizan los efectos del pre-tratamiento con fluoxetina sobre la
expresión del receptor MCHR1, y describen una disminución en la expresión de dicho
receptor (Roy et al. 2007). Por otro lado, Urbanavicius et al. (2014) demostraron un
efecto pro-depresivo dosis-dependiente de la MCH al ser microinyectada en el NDR
(Urbanavicius et al. 2014). Un estudio clínico realizado por Schmidt et al. (2015)
describieron en pacientes afectados por trastorno depresivo mayor, una disminución en
la concentración de MCH a nivel del LCR luego de 4 semanas de tratamiento con
antidepresivos (Schmidt et al. 2015).
El hecho de que la expresión del receptor de la MCH influya sobre el desarrollo de un
comportamiento pro-depresivo ha llevado a varios investigadores a abordar el
tratamiento de dicha patología con herramientas farmacológicas dirigidas al sistema
MCHérgico (Chung et al. 2011). Borowsky et al. (2002), a través de un tratamiento con
un antagonista del MCHR1, el SNAP-7941, lograron reducir los efectos ansiogénicos y
pro-depresivos inducidos por la MCH administrada i.c.v., al igual que los efectos sobre
la ingesta de alimento (Borowsky et al. 2002).
8.3- Transporte de MCH-ROD a través del LCR
En los últimos años se han realizado varios reportes que afirman que fibras MCHérgicas
provenientes del HL entran en contacto con el epéndimo de 3V, a partir de donde la
MCH podría ser liberada en el LCR y transportada por el sistema ventricular a distintas
partes del SNC. Este proceso de transporte permitiría que los neuropéptidos
(particularmente la MCH), pueda actuar en núcleos distantes a los núcleos MCHérgicos
VICENTE RUIZ VIROGA 79
a través de una transmisión en volumen y neurohumoral (Torterolo et al. 2008). Para
que pueda ejercer sus efectos en aquellas estructuras inervadas por fibras MCHérgicas,
la MCH debe ser captada desde el LCR y transportada al parénquima. Se cree que los
tanicitos son las células del epéndimo encargadas de realizar dicha tarea (Flament-
Durand and Brion 1985; Torterolo et al. 2008). Torterolo et al. (2008) a través de ensayos
de inmunofluorescencia evidenciaron la presencia de MCH en tanicitos ubicados en las
cavidades ventriculares (Torterolo et al. 2008). Dado que no hay ARNm de la prepro-
MCH en elementos del epéndimo y que la MCH no es sintetizada en éstos, los autores
concluyen que la presencia de la MCH en este tipo celular no-neuronal se debe a que los
tanicitos son capaces de captar dicho neuropéptido del LCR circulante y transportarlo al
parénquima (Rodríguez et al. 2005; Torterolo et al. 2008). Particularmente en el AqS, los
tanicitos MCH (+) extienden sus prolongaciones para entrar en contacto con las
neuronas serotoninérgicas presentes en el NDR (Torterolo et al. 2008). Esta observación
realizada por Torterolo y cols. brinda firmeza a los resultados obtenidos en esta Tesis
para el NDR, uno de los núcleos donde observamos señales MCH-ROD (+). Por otro lado,
Devera y cols. (2015) utilizando una ventana temporal de una a cuatro horas luego de la
microinyección i.c.v. observaron señales MCH-ROD (+) en el parénquima del NDR,
sugiriendo que el conjugado fue transportado hasta el acueducto, en donde los tanicitos
presentes en éste captaron la MCH-ROD para transportarlo al parénquima donde fue
internalizado por neuronas serotoninérgicas y no-serotoninérgicas (Torterolo et al.
2008; Devera et al. 2015).
Estas evidencias apoyan lo mencionado por Proescholdt et al. (1999) quienes afirman
que existen distintas regiones anatómicas en el sistema ventricular encargados de
transferir elementos transportados en el LCR desde las cavidades al parénquima
(Proescholdt et al. 1999). Höistad et al. (2005) afirman que el transporte ventricular de
neuropéptidos a través del LCR representa una vía de transporte relativamente estable
para estas moléculas, debido a la relativamente escasa presencia de peptidasas en el
LCR (Höistad et al. 2005). Esto podría garantizar que los neuropéptidos que son vertidos
en los ventrículos son capaces de recorrer distancias determinadas hasta llegar intactos
al núcleo blanco sin ser degradados.
Algunos autores han descrito que la propia MCH es capaz de influir sobre el flujo de LCR
a través de los ventrículos (Conductier et al. 2013a, 2013b). Conductier y cols. (2013)
VICENTE RUIZ VIROGA 80
describieron la capacidad de la MCH de acelerar el flujo de LCR al aumentar la frecuencia
de batido de las cilias presentes en las células epiteliales del epéndimo presentes en el
3V in vitro. Este efecto de la MCH es explicado por Conductier y cols. por las evidencias
que afirman la expresión de MCHR1 en dichas células del epéndimo, haciendo posible
que éstas respondan a la MCH aumentando la frecuencia de batido de las cilias e
induciendo la aceleración del flujo de LCR a través de los ventrículos y acueducto
(Conductier et al. 2013a).
Existe escasa evidencia de que la MCH sea liberada en los ventrículos y transportada por
el LCR a sus respectivos núcleos blanco por una vía neurohumoral. Sin embargo, han
podido cuantificarse los niveles de MCH presente en el LCR de varias especies de
mamíferos como la oveja y las ratas albinas (Ungerfeld et al. 2011; Dias Abdo Agamme
et al. 2015). Algunos estudios han medido los niveles de MCH en el LCR de pacientes
afectados por diversas patologías como la Enfermedad de Alzheimer, lo cual indica que
este neuropéptido es capaz de ser transportado o liberado en los ventrículos para su
transporte por el LCR (Schmidt et al. 2013). Esta serie de trabajos brindan una
explicación de cómo la MCH-ROD puede ser transportada en el LCR, ser captada por
elementos del epéndimo (por ejemplo, los tanicitos) y entrar al parénquima para
interactuar con las células blanco. En nuestro caso, las evidencias expuestas
previamente justifican cómo al inyectar MCH-ROD i.c.v. el conjugado pudo recorrer las
cavidades ventriculares y ser internalizado por elementos celulares en las estructuras de
interés para este trabajo.
8.4- Comparación entre la microinyección de MCH-ROD intra-NDR y la i.c.v.
Desde un punto de vista técnico, en comparación con el protocolo de microinyección
local intra-NDR, el protocolo de microinyección i.c.v. presentó mayores facilidades en
cuanto al tiempo transcurrido entre la implantación de la cánula guía, microinyección,
procesamiento del tejido, y la obtención de los cortes y su posterior análisis en el
microscopio.
VICENTE RUIZ VIROGA 81
A diferencia del protocolo de microinyección intra-NDR de MCH-ROD, el cual como se
explicó anteriormente nos permitió estudiar el patrón de distribución de marcas MCH-
ROD (+) localizado exclusivamente en el NDR, la microinyección i.c.v. nos permitió
explorar otras estructuras en el SNC de la rata donde se internalizó la MCH-ROD. La
aplicación i.c.v. del conjugado de MCH-ROD, si bien nos permitió obtener más
información acerca de elementos MCH-receptivos en estructuras del SNC, también
agregó a la circulación del LCR como un factor determinante de los resultados obtenidos.
De todas las estructuras analizadas, tanto NSL como NAc presentó gran cantidad de
marcas MCH-ROD (+), siendo ambas estructuras cercanas al sitio de inyección y de
localización periventricular (Bregma -0,92 mm). Es evidente que de no ser por la
circulación del LCR a través del sistema ventricular, no sería posible observar marcas en
estructuras alejadas del sitio de inyección como fueron Hc o el NDR.
8.5- Identificación de fenotipos neuroquímicos MCH-ROD (+)
Los ensayos de inmunofluorescencia pudieron demostrar que las señales MCH-ROD (+)
estaban presentes en neuronas presentes en el parénquima que fueron capaces de
internalizar dicho conjugado. La colocalización de la señal MCH-ROD (+) y NeuN (+) se
observó en todos los núcleos o estructuras analizadas en este trabajo. Los resultados de
estos ensayos de inmunofluorescencia se complementan con los obtenidos con los
ensayos para detectar GFAP en los tejidos tratados con MCH-ROD. En estos
experimentos observamos que las señales MCH-ROD (+) no colocalizaron con señales
positivas para GFAP (Gao et al. 2003). Estos resultados sugieren que los astrocitos no
son capaces de expresar MCHR1, lo cual justificaría la falta de bibliografía que describa
la presencia de dicho receptor en éste tipo celular. Dado lo mencionado, no sería posible
que los astrocitos internalicen el conjugado, lo cual explicaría que ambas señales no
colocalicen.
En conjunto, los resultados descritos nos permiten afirmar que las neuronas son el tipo
celular presentes en el parénquima capaz de internalizar la MCH-ROD, por un
mecanismo dependiente del MCHR1, descartando a los astrocitos como un tipo celular
capaz de realizar dicho proceso. Es importante aclarar que el presente trabajo no
VICENTE RUIZ VIROGA 82
contempló la posibilidad de que otros elementos de la neuroglia como los
oligodendrocitos o la microglia expresen el receptor y, por lo tanto, puedan internalizar
el conjugado debido a que no fueron realizados los ensayos para detectar dichos tipos
gliales. Por tal motivo, no es posible descartar a la neuroglia en su totalidad como
posibles blancos celulares para la MCH. Para esto, futuros ensayos de
inmunofluorescencia contra marcadores celulares para otros tipos de neuroglia (por
ejemplo, lectina o Iba1, del inglés ionized calcium-binding adapter molecule 1) prometen
ser un buen abordaje.
Estos resultados en primera instancia demuestran que en todos los núcleos y estructuras
analizadas en el presente trabajo, las neuronas serían los elementos celulares capaces
de internalizar el conjugado, posiblemente a través de su receptor MCHR1. Numerosos
estudios han evaluado los efectos de la MCH al ser internalizada a través de su receptor
y los mecanismos intracelulares que se activan al darse dicho evento (Hawes et al.
2000a; Tetsuka et al. 2004; Chung et al. 2009b). Muchos de estos estudios se realizaron
en líneas celulares no-neuronales en las cuales se realizó la sobreexpresión del receptor,
y aportaron valiosa información para describir los efectos intracelulares de la activación
de MCHR1 in vitro (Hawes et al. 2000a). Por otro lado, estudios empleando cultivos de
neuronas del hipotálamo u otras estructuras inervadas por fibras MCHérgicas, también
han permitido indagar sobre los efectos neuronales de la MCH sobre las corrientes
iónicas y/o la liberación de ciertos neurotransmisores (Gao and Pol 2001, 2002). Otros
estudios in vivo estudiaron, desde un punto de vista principalmente funcional, los
efectos de la MCH sobre ciertos fenotipos neuronales y la modulación de ciertos
neurotransmisores (Hassani et al. 2009; Devera et al. 2015; Urbanavicius et al. 2016).
Todos estos estudios se centran en los efectos directos o indirectos producidos por la
MCH al interactuar con sus correspondientes blancos neuronales, evidenciando a las
neuronas como el tipo celular sobre el cual actúa dicho neuropéptido.
En este trabajo, también se logró observar una correspondencia entre los núcleos y
estructuras que presentaron marcas MCH-ROD (+) y la presencia de fibras MCHérgicas.
Mediante ensayos de inmunofluorescencia contra la MCH, logramos confirmar la
presencia de fibras MCHérgicas en núcleos para los cuales se describe una densa
inervación por estas fibras (Bittencourt et al. 1992; Steininger et al. 2004; Chung et al.
VICENTE RUIZ VIROGA 83
2009b). Como describieron Presse et al. (2014), aquellas estructuras del SNC inervadas
por fibras MCHérgicas coinciden con sitios donde el ARNm del MCHR1 es expresado
(Chung et al. 2009b; Presse et al. 2014). Si bien las fibras observadas no se encontraron
en contacto aparente con las células MCH-ROD (+), estás se ubicaron cercanas a dichas
marcas. Considerando la capacidad de los neuropéptidos de ser liberados por
transmisión de volumen, dicho proceso podría justificar la separación física entre las
células que internalizaron a la MCH-ROD (marcadas con el conjugado) y las fibras
MCHérgicas (Trueta and De-Miguel 2012). En conjunto, la presencia de fibras
MCHérgicas y las neuronas MCH-ROD (+) cercanas son resultados complementarios que
confirman que en dichos núcleos de interés la MCH es liberada y captada por las
neuronas presentes en éstos que son MCH-receptivas.
8.5.1- Las neuronas GABAergicas en todos los núcleos estudiados son capaces de
internalizar la MCH-ROD
Uno de los fenotipos neuroquímicos sugeridos como receptivos para MCH-ROD fueron
las neuronas GABAérgicas o GAD-67 (+). Para todas las estructuras estudiadas, algunas
neuronas MCH-ROD (+) colocalizaron con señales GAD-67 (+) en NAc, NSL, Hc y NDR. A
nivel del NAc, Haemmerle et al. (2015) describe una densa inervación de aferencias
MCHérgicas dirigidas a neuronas GABAérgicas y colinérgicas en dicho núcleo
(Haemmerle et al. 2015). Las conexiones entre el HL y NAc constituirían un eje
hipotálamo-accumbens a través del cual la MCH ejerce su función como neuropéptido
orexigénico. La participación de la MCH en este eje y la modulación que ejerce sobre la
neurotransmisión GABAérgica en el NAc, ayudan a reforzar el papel descrito para dicho
neuropéptido en la modulación del valor hedónico de la cocaína y otros
comportamientos adictivos (Saper et al. 2002; DiLeone et al. 2003; Chung et al. 2009a).
Chen et al. (2013) describen la influencia del glutamato en HL, donde la inyección de
AMPA Y NMDA en dicha región del hipotálamo moduló de forma positiva la ingesta de
alcohol, aumentando la liberación de hipocretinas y reduciendo la liberación de MCH.
Este estudio no solo revela el rol de la neurotransmisión glutamatérgica sobre el sistema
VICENTE RUIZ VIROGA 84
MCHérgico, sino que también sugiere la participación de otras áreas del SNC en dicho
proceso (Chen et al. 2013).
Como se mencionó anteriormente, son escasos los estudios que describan efectos
funcionales de la MCH sobre el NSL, a pesar de que dicho núcleo sea uno de los más
inervados por fibras MCHérgicas (Chee et al. 2015). Chee y cols. (2015) describieron que
la activación de neuronas MCHérgicas aferentes al NSL desde el HL induce la liberación
de GABA en el NSL en rodajas de ratón. Este trabajo no solo describió a la MCH como un
modulador de la liberación de GABA, sino que también puso en evidencia que las
neuronas MCHérgicas no solo son GABAérgicas, sino también glutamatérgicas, siendo
este último neurotransmisor el que induce la liberación de GABA (Chee et al. 2015).
Desde el punto de vista funcional, ambos neurotransmisores en el NSL han sido
vinculados al comportamiento social entre machos y hembras, siendo éste facilitado
gracias a la liberación de GABA y glutamato (Bredewold et al. 2015).
Los ensayos de inmunofluorescencia para la detección de GAD67 en el presente trabajo,
demostraron que también existió colocalización de esta enzima con las señales MCH-
ROD (+) presentes en Hc (particularmente en CA3 y CA2). A nivel de Hc, Lima et al. (2013)
determinaron que neuronas GABAérgicas presentes en la formación hipocampal
(particularmente la población neuronal en CA3), reciben fibras aferentes MCHérgicas
provenientes del HL (Lima et al. 2013). Los autores discuten que las neuronas
GABAérgicas del Hc, en conjunto con las glutamatérgicas y colinérgicas, colaboran con
el procesamiento de información espacial a nivel hipocampal (Kobayashi and Amaral
1999; Lima et al. 2013; Lu et al. 2013). Tales observaciones aportarían sustento desde
un punto de vista circuital y neuroquímico a los efectos descritos para la MCH en el Hc
(Adamantidis and de Lecea 2009; Sita et al. 2016). En este trabajo no se estudió la
inervación MCHérgica del área septomedial ni la influencia de la MCH sobre la
neurotransmisión colinérgica, lo cual no quita la relevancia de la relación entre ambos
sistemas de neurotransmisión y las implicancias en el procesamiento de memorias.
Devera et al. (2015) describieron la internalización de MCH-ROD por neuronas tanto
serotoninérgicas como no-serotoninérgicas presentes en el NDR, al inyectar i.c.v. dicho
conjugado (Devera et al. 2015). Dichas neuronas no-serotoninérgicas fueron inmuno-
VICENTE RUIZ VIROGA 85
reactivas para GAD-67, identificándolas como un fenotipo neuronal receptivo para
MCH-ROD dentro del NDR (Devera et al. 2015). Además, Urbanavicius et al. (2016),
sugieren que tanto las neuronas serotoninérgicas como las GABAérgicas del NDR
podrían presentar contactos sinápticos con fibras MCHérgicas aferentes del HL y ZI
(Urbanavicius et al. 2016). Weissbourd et al. (2014) utilizando técnicas de
electrofisiología y rastreo viral, describieron fibras aferentes peptidérgicas de diversas
partes del SNC, entre ellas del HL, presentes en el NDR (Weissbourd et al. 2014).
Esta serie de trabajos ponen en evidencia la relación existente entre la MCH y la
neurotransmisión GABAérgica en los núcleos estudiados, y detallan cuales son las
posibles consecuencias funcionales de la interacción entre los dos sistemas de
neurotransmisores. En conjunto, los resultados obtenidos para los ensayos de
inmunofluorescencia para GAD-67 son sustentados por los trabajos mencionados y
representan una evidencia preliminar de que las neuronas GABAérgicas presentes en los
núcleos de interés podrían expresar MCHR1 y, por lo tanto, internalizar a la MCH-ROD a
través de su interacción con el receptor.
8.5.2- Las neuronas serotoninérgicas en el Núcleo Dorsal del Rafe son capaces de
internalizar la MCH-ROD
Los ensayos de inmunofluorescencia para serotonina demostraron una colocalización
de la MCH-ROD con marcas correspondientes a neuronas serotoninérgicas en el NDR.
Este resultado no solo sugiere que las neuronas serotoninérgicas podrían ser capaces de
internalizar la MCH a través de su interacción con su receptor MCHR1, sino que serviría
también de sustento para estudios anteriores que proponen un vínculo entre la MCH y
la serotonina. Yoon et al. (2013) describen que las neuronas MCHérgicas e
hipocretinérgicas del HL envían proyecciones a núcleos colinérgicos del tronco
encefálico y también a núcleos aminérgicos (Yoon and Lee 2013). Weissbourd et al.
(2014) discuten que la presencia de neuronas GABAérgicas en conjunto con las
serotoninérgicas en el NDR podría actuar como un circuito de regulación del disparo de
éstas últimas, y que existen núcleos dentro del Núcleo del Rafe que inervan
selectivamente neuronas serotoninérgicas para su regulación (Sparta and Stuber 2014;
VICENTE RUIZ VIROGA 86
Weissbourd et al. 2014). Estas observaciones sugieren que la MCH, al interactuar con
neuronas GABAérgicas puede modular indirectamente el disparo de neuronas
serotoninérgicas. Devera et al. (2015) pusieron en evidencia que la MCH-ROD no solo es
internalizada por neuronas no-serotoninérgicas, sino también por neuronas
serotoninérgicas. Este fenómeno tiene como consecuencia una disminución en la
frecuencia de disparo de estas neuronas, efecto que también se observó al administrar
la MCH-ROD de forma yuxtacelular (Devera et al. 2015). Por otro lado, Urbanavicius et
al. (2016), mediante ensayos de inmunofluorescencia sugieren que existen contactos
sinápticos entre fibras MCHérgicas que inervan al NDR y neuronas serotoninérgicas
presentes en el. Se propone que la MCH podría regular la neurotransmisión de
serotonina también directamente y no solo a través de GABA (Urbanavicius et al. 2016).
En un trabajo previo, Torterolo et al. (2008) demostró una relación anatómica entre
tanicitos ubicados en el epéndimo del AqS y neuronas serotoninérgicas del NDR. En este
trabajo, se describe un contacto o proximidad entre los procesos basales de los tanicitos
y los de las neuronas serotoninérgicas presentes en el NDR (Torterolo et al. 2008).
También se reportó la presencia de la MCH tanto en tanicitos como en dichas neuronas.
Al descartarse la síntesis de MCH en los tanicitos, se llegó a la conclusión de que dicho
neuropéptido era captado del LCR y transportado al parénquima (Torterolo et al. 2008).
Los autores proponen que la MCH puede ser liberada al sistema ventricular del SNC y
ser transportada por el LCR para luego ser captada por tanicitos que favorecerían su
pasaje al parénquima para interactuar con las neuronas presentes.
Este conjunto de reseñas anatómicas respecto a la inervación MCHérgica del NDR y las
neuronas serotoninérgicas en éste, explicaría los efectos pro-depresivos de la MCH y la
modulación del ciclo sueño-vigilia (Lagos et al. 2011a; Urbanavicius et al. 2014). Los
resultados presentados en esta tesis aportan evidencias complementarias a todo lo
mencionado en los trabajos anteriores y aportan observaciones adicionales que
sugieren la expresión de MCHR1 en neuronas serotoninérgicas. Estudios realizados por
Urbanavicius et al. (2014) y Lagos et al. (2011), observaron una reversión del efecto pro-
depresivo inducido tras la inyección intra-NDR de MCH, al pre-tratar a los animales con
el antagonista de MCHR1, el ATC-0175 previamente a la administración de MCH. Esta
reversión fue observada en el TNF, evidenciándose por una disminución del tiempo de
VICENTE RUIZ VIROGA 87
inmovilidad de la rata en dicho test (Lagos et al. 2011b; Urbanavicius et al. 2014). Los
resultados obtenidos en esta tesis al microinyectar ATC-0175 previamente a la MCH-
ROD i.c.v. son coherentes con la idea de que dicho pre-tratamiento es capaz de
interrumpir la interacción entre la MCH-ROD y MCHR1, por competencia entre la MCH-
ROD y el antagonista por el mismo sitio en el receptor.
8.5.3- Las señales MCH-ROD colocalizaron con neuronas TH (+) del Núcleo Dorsal del
Rafe
Además de las evidencias que demuestran interacción entre la MCH en neuronas
GABAérgicas y serotoninérgicas, los ensayos de inmunofluorescencia revelaron que la
MCH-ROD es capaz de ser internalizada por neuronas TH (+). Dichas observaciones
fueron realizadas a nivel del NDR, núcleo en el que existe una población considerable de
neuronas dopaminérgicas (Hornung 2012).
La MCH ha sido vinculada a la neurotransmisión dopaminérgica principalmente gracias
al vínculo que existe entre este neuropéptido y el circuito dopaminérgico mesolímbico
(Pissios et al. 2008; Liu and Borgland 2015). Existen pocos trabajos que detallen los
efectos de la MCH sobre las neuronas TH (+) presentes en el NDR, específicamente. Sin
embargo, numerosos grupos de trabajo han evidenciado la modulación de la liberación
de dopamina en diversos núcleos del SNC por parte de la MCH. Estos efectos
modulatorios se ponen en evidencia a nivel de NAc por Pissios et al. (2008) quienes
observaron en ratones knock-out para MCH, un aumento tanto en la liberación de
dopamina a nivel de NAc, sino también un aumento en la expresión del DAT (del inglés,
Dopamine Active Transporter). Los autores discuten que dicho fenómeno podría actuar
como una medida modulatoria para contrarrestar la ausencia de MCH en el circuito
mesolímbico (Pissios et al. 2008). Por otro lado, Domingos et al. (2013) vincularon a la
MCH con la liberación de dopamina a nivel estriatal con la preferencia a un alimento
respecto a su valor nutritivo (Domingos et al. 2013). En este trabajo, los autores
describen que la ingesta de sucrosa induce la activación de neuronas MCHérgicas,
desencadenando un aumento en la liberación de dopamina en el estriado. Por tal
motivo, los autores concluyen que las neuronas MCHérgicas en el HL son capaces de
VICENTE RUIZ VIROGA 88
sensar y comunicar el valor nutritivo de un alimento en base a los niveles de glucosa
extracelular, enviando señales a centros de recompensa en función del valor nutritivo,
modulando así, la preferencia por alimentos específicos (Domingos et al. 2013).
Si bien estos estudios no se concentran en los efectos de la MCH y la liberación de
dopamina específicamente en el NDR, sí destacan a la MCH y su papel modulador en los
circuitos de recompensa y estado de ánimo. La influencia de la MCH sobre las neuronas
TH (+) del NDR podría tener su participación, regulando el valor hedónico del alimento,
la interacción social o de drogas de abuso. Futuros estudios se requieren para dilucidar
qué efectos presenta la MCH sobre la activación de neuronas dopaminérgicas del NDR.
En conjunto, los resultados obtenidos de los ensayos de inmunofluorescencia realizados
para la presente Tesis de Maestría, permitieron:
identificar a las células MCH-receptivas como neuronas
descartar a los astrocitos como posibles células capaces de internalizar la MCH-
ROD
identificar a neuronas GABAérgicas, serotoninérgicas y TH (+) que internalizan a
la MCH-ROD (+) y que posiblemente expresen MCHR1.
8.6- Evidencias de la dependencia de MCHR1 y de clatrina para la internalización de
MCH-ROD
8.6.1- La internalización de MCH-ROD es dependiente del receptor MCHR1
El pre-tratamiento con ATC-0175 y MCH-ROD a T20 indujo una tendencia a disminuir la
internalización de la MCH-ROD, viéndose dicho proceso disminuido significativamente
en NSL y NAc (ambas estructuras próximas al sitio de microinyección). Es posible que,
debido al flujo de circulación del LCR, el pequeño volumen de ATC-0175 haya sido
transportado y captado rápidamente en dirección hacia las estructuras mencionadas,
alejándolas del Hc y NDR, las cuales no tuvieron diferencias significativas entre las
marcas MCH-ROD (+) entre los controles y los grupos pre-tratados, aunque se observa
VICENTE RUIZ VIROGA 89
una tendencia. Como se describió antes, la naturaleza molecular tanto del antagonista
como de la MCH-ROD pudo estar a merced del transporte del LCR a través de los
ventrículos y hacia la circulación sanguínea y el parénquima, distribuyendo al ATC-0175
y a la MCH-ROD a regiones del sistema nervioso que no fueron contempladas en el
presente trabajo (Bulat and Klarica 2011).
La disminución de la internalización de MCH-ROD con el ATC-0175 por parte de células
contenidas en núcleos inervados por fibras MCHérgicas sugiere que dicho proceso
depende de la interacción específica MCH-ROD – MCHR1. Estos resultados pueden
relacionarse con estudios anteriores que reportan a los antagonistas del MCHR1 como
agentes farmacológicos capaces de revertir los efectos generados por la MCH (Chung et
al. 2011). Los resultados presentes en este trabajo evidencian a nivel celular la
importancia de la interacción MCH-ROD – MCHR1 para la internalización de la MCH y la
activación de los procesos intracelulares que trae como consecuencia la unión de la MCH
a su receptor.
Muchos estudios han sugerido la administración o utilización de antagonistas del
MCHR1 como potenciales agentes terapéuticos para el tratamiento de trastornos
específicos en los que puede estar vinculada la MCH (Chung et al. 2011). Chaki et al.
(2005) sintetizaron el ATC-0175, antagonista de alta afinidad por el MCHR1. Al
administrar por vía oral dicho antagonista, se observaron efectos ansiolíticos y
antidepresivos en modelos animales para estudiar estrés y depresión (Chaki et al. 2005).
Otro antagonista que demostró revertir los efectos inducidos por la MCH, es el SNAP-
94847, el cual fue utilizado por Smith et al. (2009) para evaluar los efectos de la MCH
sobre el eje hipotálamo-hipofisario-adrenal (HPA; del inglés, hypothalamic-pituitary-
adrenal). En este estudio, la administración i.c.v. del antagonista fue capaz de bloquear
la liberación de ACTH (del inglés, Adrenocorticotropic Hormone) inducida por la MCH
(Smith et al. 2009). Este estudio permitió demostrar la relación existente entre dicho
neuropéptido y el estrés.
Los resultados obtenidos en el presente trabajo, se suma al grupo de evidencias que
sugieren que los efectos funcionales de la MCH en ratas son dependientes de la
interacción de ésta con su receptor MCHR1. Estas observaciones permiten apuntar al
VICENTE RUIZ VIROGA 90
sistema MCHérgico como un posible blanco terapéutico para el tratamiento de diversas
patologías o afecciones en las que la MCH participa.
8.6.2- La internalización de MCHR1 exhibe un proceso típico de receptor GPCR
Los resultados obtenidos del pre-tratamiento de los animales con PAO demostraron que
éste logró inhibir significativamente la internalización de la MCH-ROD, efecto que se
evidenció en una reducción de la cantidad de señales MCH-ROD (+) en los núcleos
estudiados con la excepción de NDR. Esto último puede ser producto de la distancia
entre el sitio de inyección y el núcleo mencionado. Debido a que la PAO además de estar
descrita como una droga que inhibe la internalización mediada por clatrina, también se
le adjudican otros efectos celulares, existe la posibilidad de que ésta haya sido captada
a lo largo del sistema ventricular, dejando menor cantidad de PAO para ser captada por
los tanicitos del acueducto y luego transportarla al parénquima del NDR. También es
posible que la concentración de PAO utilizada esté induciendo alguno de los otros
efectos descritos y no solamente la inhibición de la endocitosis mediada por clatrina
(Dutta and Donaldson 2012). Otro de los efectos de la PAO que se ha demostrado
también es la capacidad de bloquear el proceso de macropinocitosis. Es posible que la
PAO sea captada por tanicitos y ella misma impida su traspaso al parénquima, haciendo
imposible que llegue a los tipos celulares de interés y dificultando la observación de
diferencias significativas (Dutta and Donaldson 2012).
PAO ha sido reportado en la bibliografía como un inhibidor de la macropinocitosis y
fagocitosis (Moss and Ward 1991; Dutta and Donaldson 2012). Si bien no se conoce el
mecanismo, se ha descrito también que dicho fármaco es capaz de inhibir la endocitosis
mediada por clatrina, efecto que se ha puesto en evidencia en numerosos estudios
(Grady et al. 1995; Boudin et al. 2000). Dado que MCHR1 es un GPCR, algunos autores
afirmaron que el proceso de internalización de éste involucraba la endocitosis mediada
por clatrina (Lin 2013). Sin embargo, dicho proceso nunca fue evidenciado en sistemas
in vitro utilizando líneas neuronales ni en modelos in vivo. Por tal motivo, los resultados
referidos a tal experimento aportan evidencias preliminares del mecanismo celular que
media la internalización de MCHR1 in vivo.
VICENTE RUIZ VIROGA 91
Como se mencionó anteriormente, la ausencia de diferencias significativas entre los
controles y el grupo pre-tratado con PAO a nivel del NDR pueden deberse a diversos
factores. Uno de ellos puede ser producto de la inespecificidad de PAO. Esta
característica impide canalizar al fármaco específicamente a células que expresen
MCHR1, lo cual representa una limitante para PAO como herramienta farmacológica
para estudiar los mecanismos celulares de internalización de los GPCRs (Dutta and
Donaldson 2012). Además de esto, se le han atribuido a PAO otros efectos celulares
aparte de interferir con la endocitosis mediada por clatrina. García-Morales et al. (1990)
demostraron que PAO es capaz de inhibir la actividad de la tirosina fosfatasa en linfocitos
T e interferir con mecanismos intracelulares que favorecen la activación de estas células
(Garcia-Morales et al. 1990). Por otro lado, Takahashi et al. (1997) describen que PAO
es capaz de bloquear los cambios conformacionales que sufre el ADN al iniciarse
mecanismos de apoptosis (Takahashi et al. 1997). Otro efecto descrito para PAO, fue
reportado por Hmadcha et al. (1999), quienes demostraron el efecto inhibitorio de PAO
sobre la actividad de las ATPasas dependientes de calcio (Hmadcha et al. 1999). Los
autores discuten que este efecto puede afectar la concentración intracelular de calcio,
el cual a su vez actúa como cofactor y segundo mensajero en numerosas vías de
señalización intracelular (Hmadcha et al. 1999). Esta observación dificulta aún más la
comprensión de los mecanismos por los que PAO es capaz de inhibir la endocitosis
mediada por clatrina. Aun así, esto permite establecer un posible vínculo en las vías de
señalización activadas al activarse MCHR1 y PAO, dado que tras la activación de la
proteína Gq uno de los efectos ejercidos es un aumento de la concentración intracelular
de calcio (Lembo et al. 1999; Hawes et al. 2000a).
Al no conocerse bajo qué mecanismo PAO inhibe la endocitosis mediada por clatrina, no
es posible descartar que alguno de los efectos descritos para PAO tenga como efecto
colateral la inhibición de la internalización de los GPCRs. Se sabe que debido a los átomos
de arsénico presentes en la molécula de PAO, ésta es capaz de formar enlaces estables
con residuos de cisteína presentes en proteínas de las células, posiblemente
interfiriendo con el contacto entre dos moléculas específicas o induciendo un cambio
conformacional que afecte la función de éstas (Gerhard et al. 2003). Hamamoto et al.
(2015) estudiaron en un modelo in vitro con células HEK293, los aminoácidos clave para
VICENTE RUIZ VIROGA 92
la interacción entre el extremo C-terminal del receptor MCHR1 y proteínas G capaces de
activarse tras la activación de este receptor (Hawes et al. 2000a; Hamamoto et al. 2015).
Mediante la expresión del MCHR1 con mutaciones a nivel de su extremo C-terminal, los
autores lograron identificar cuales mutaciones lograron una pronunciada disminución
de la señalización mediada por la proteínas Gi/o, ambas activadas tras la activación de
MCHR1 (Hawes et al. 2000a; Hamamoto et al. 2015). Este abordaje podría ser adecuado
para identificar si los efectos de PAO se deben a su interacción con estos blancos
celulares.
Los resultados obtenidos en esta parte de la presente Tesis de Maestría, no solo brindan
evidencias preliminares que apuntan a que la internalización del complejo
receptor/ligando para el MCHR1 depende parcialmente de un proceso de endocitosis
mediada por clatrina, sino que también es de los primeros estudios realizados en
modelos in vivo para estudiar dicho mecanismo para este receptor metabotrópico. A
pesar de esto, numerosos estudios serían necesarios para detallar el efecto inhibidor de
PAO sobre la endocitosis mediada por clatrina de MCHR1.
9- CONCLUSIONES GENERALES
Dados los resultados y las observaciones obtenidas del presente trabajo de Tesis,
podemos concluir que:
El protocolo de microinyección de MCH-ROD intra-NDR debe continuar la puesta
a punto para adecuarse a los objetivos del estudio.
El protocolo de microinyección de MCH-ROD i.c.v. fue efectivo para el marcado
y la cuantificación de neuronas receptivas para la MCH-ROD, dado que el
conjugado fue internalizado por elementos celulares del NAc, NSL, Hc y NDR. La
ventana temporal entre los tiempos post-inyección empleados no fue
suficientemente amplia para realizar una curva temporal de internalización de
MCH-ROD y detectar una graduación en dicho proceso.
Se comprobó que en todos los núcleos estudiados, las neuronas son capaces de
internalizar la MCH-ROD, no así los astrocitos.
VICENTE RUIZ VIROGA 93
En todos los núcleos de interés, la MCH-ROD fue internalizado por neuronas
GABAérgicas, mientras que en el NDR el conjugado también fue captado por
neuronas serotoninérgicas y dopaminérgicas.
El pre-tratamiento i.c.v. con el antagonista del MCHR1, el ATC-175, fue capaz de
bloquear la internalización de MCH-ROD a T20 en elementos celulares de NSL,
NAc, Hc y NDR, lo cual pone en evidencia la dependencia del receptor MCHR1
para dicho fenómeno de internalización
El pre-tratamiento i.c.v con PAO, exhibió una tendencia a la disminución de la
cantidad de células MCH-ROD (+), lo cual indicaría que la internalización del
receptor MCHR1 es parcialmente dependiente de clatrina, característica descrita
para los GPCRs en general.
10- PERSPECTIVAS
Dados los resultados obtenidos de los experimentos de microinyección intra-
NDR, además del empleo de 60 minutos post-inyección, tiempos más extensos
(por ejemplo 4 horas) pueden ser necesarios para la obtención de resultados que
permitan realizar la cuantificación al inyectar el conjugado directamente en el
parénquima de los núcleos de interés.
La inmunodetección de los MCHR1 en los núcleos donde éste se expresa, puede
actuar como complemento para los resultados obtenidos de los experimentos
de microinyección de MCH-ROD i.c.v., permitiendo no solo localizar al receptor
en los núcleos en los que se concentran los estudios, sino también en aquellas
neuronas que fueron capaces de internalizar el conjugado.
En relación al ítem anterior, el marcado de neuronas MCH-ROD (+), MCHR1 y un
marcador para identificar el fenotipo neuroquímico de las neuronas MCH-ROD
(+), ofrecerían una evidencia sólida sobre qué fenotipos neuroquímicos expresan
el receptor MCHR1 y son MCH-receptivos.
Realizar experimentos in vitro, con la incubación de rodajas conteniendo los
núcleos de interés con MCH-ROD y PAO o ATC-0175, nos permitiría realizar una
VICENTE RUIZ VIROGA 94
curva dosis-respuesta para cada droga, pudiendo así dilucidar las
concentraciones específicas a las que el efecto inhibitorio de la internalización
de MCH-ROD es más notorio.
Para confirmar la colocalización de las señales de MCH-ROD con las señales
correspondientes a los fenotipos neuroquímicos de interés, z-stacks de las
inmunofluorescencias para detectar su ubicación en las tres dimensiones de los
cortes empleados.
11- CONTRIBUCIONES
Los resultados presentados en esta Tesis de Maestría fueron expuestos en formato
póster en los siguientes congresos:
Jornadas XV de la Sociedad Uruguaya de Biociencias (SUB) – 2014,
Maldonado, Uruguay
Título del poster: Estudio de internalización de la Hormona Concentradora
de Melanina (MCH) y su receptor mchr-1 en ratas: puesta a punto de un
protocolo de microinyección
9th World Congress International Brain Research Organization (IBRO) – 2015,
Rio de Janeiro, Brasil y Jornadas de SNU
Título del poster: In vivo approach to study the internalization of Melanin
Concentrating Hormone (MCH) and its receptor in the CNS of the rat
2nd FALAN Congress – 2016, Buenos Aires, Argentina
Título del poster: A novel in vivo approach to study the internalization of
Melanin-Concentrating Hormone in the CNS of the rat.
VICENTE RUIZ VIROGA 95
Parte de los resultados formarán parte de dos manuscritos a publicar que se
encuentran en elaboración:
1- “In vivo and in vitro evidences of the internalization of MCHR1 at
hippocampal neurons by rhodamine-labeled MCH” – Ruiz, Vicente;
Mouhape, Camila; Prunell, Giselle; Lagos, Patricia.
2- “Internalization dynamics of MCHR1 at several structures of the Central
Nervous System of the rat by a novel in vivo approach” – Ruiz, Vicente;
Urbanavicius, Jessika; Torterolo, Pablo; Lagos, Patricia
12- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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13- ABREVIATURAS
3V: tercer ventrículo
ACh: acetilcolina
Am: amígdala
AqS: Acueducto de Silvio
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ATV: área tegmental ventral
CA: Cornu Ammonis
cc: cuerpo calloso
ccx: corteza cerebral
CPF: corteza prefrontal
GABA: ácido γ-aminobutílico
GAD: glutamato descarboxilasa
GPCR: receptor acoplado a proteína G, del inglés: G Protein-coupled Receptor
Hc: hipocampo
i.c.v.: intracerebroventricular
intra-NDR: intra-rafe
i.p.: intraperitoneal
IP3: inositol 3-fosfato
HL: Hipotálamo lateral
Hp: hipotálamo
LC: locus coeruleus
LCR: Líquido Cefalorraquídeo
MCH: hormona concentradora de melanina
MCHR1: del inglés, Melanin Concentrating Hormone Receptor-1
MCH-ROD: MCH-rodamina
MSN: del inglés Medium Spiny Neurons
NAc: núcleo Accumbens
NDR: Núcleo Dorsal del Rafe
NPe: Núcleo hipotalámico Periventricular
NSL: Núcleo Septolateral
PAG: del inglés, Periaqueductal Gray
PAO: del inglés, phenylarsine oxide
PFA: paraformaldehído
PTX: del inglés, pertussis toxin
ROD: rodamina
SNC: Sistema Nervioso Central
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SuC: del inglés, Superior Colliculi
TH: tirosina hidroxilasa
VL: ventrículo lateral
ZI: Zona Incertohipotalámica