EVALUACIóN FINAL CURSO DE MéTODOS EN BIOTECNOLOGíAEvaluación Final
Curso De Métodos En Biotecnología Alumno: Luis del Pozo Yauner
Tema: Métodos Electroforéticos
Introducción: El nivel de desarrollo científico de las sociedades
humanas ha sido estimado, por lo general, por la cantidad de
conocimientos que atesoran, y la velocidad con que pueden
generarlos. El conocimiento puede dividirse en dos grandes grupos:
el que es mera descripción de nuestro entorno, sea este tan lejano
como los mismos límites de nuestro universo, o tan cercano como las
moléculas que nos componen; y el conocimiento ÒherramientaÓ, aquel
que en forma de métodos, procedimientos y tecnologías, nos permite
describir y sobre todo, modificar el entorno. Se reconoce, pues, un
vínculo de génesis entre todas las partículas de conocimiento. El
descriptivo se va convirtiendo en ÒherramientasÓ, y estas ayudan a
generar nuevo conocimiento. La historia de las ciencias, y por
consiguiente del hombre, ha sido también la historia del desarrollo
de los métodos. En el caso de la Biología, su desarrollo ha estado
condicionado por el avance de los métodos para identificar, aislar
y describir las propiedades de las moléculas que componen los
sistemas vivos. Uno de los más poderosos y populares de estos
métodos es la electroforesis, que dado su grado de diversificación
actual, es propio hablar de Òmétodos electroforéticosÓ. Como
concepto, ÒelectroforesisÓ se refiere al movimiento que
experimentan partículas cargadas, ya sean átomos individuales o
grandes complejos moleculares, cuando son sometidas al efecto del
un campo eléctrico. En este trabajo nos ocuparemos brevemente de su
desarrollo histórico, de la descripción de los conceptos y
principios básicos, así como de los métodos fundamentales usados en
la actualidad, señalando algunas aplicaciones específicas de estos.
La historia se inicia con Tiselius: En 1937 el bioquímico sueco
Arne Tiselius dio a conocer un nuevo método para separar las
proteínas de una mezcla. Este consistía en colocar un cierto
volumen de una solución proteica, conteniendo dos o más de estas
sustancias, en un tubo de vidrio en forma de ÒUÓ, sin llenar
completamente este. Luego el espacio
restante en cada extremo se ocupaba con el volumen necesario de una
solución de electrolitos libre de proteína, que actuaba como
amortiguador. Debía tenerse mucha precaución al adicionar la
solución amortiguadora, evitando que se mezclara con la solución de
proteínas a separar. Luego se sumergía un electrodo en la solución
amortiguadora libre de proteína de cada extremo, se conectaban los
electrodos a una fuente de electricidad y se sometía todo el
sistema a una campo eléctrico. Los componentes de la mezcla de
proteínas comienzan a moverse a diferente velocidad, en virtud del
signo y el número global de cargas, hacia el electrodo de carga
opuesta. Se formaban frentes de movimiento que reflejaban la
movilidad electroforética de cada componente, o grupos de
componentes de la mezcla, por lo que se le dio el nombre de
Òelectroforesis de frentes en movimientoÓ o Òmoving boundary
electrophoresisÓ a este sistema. Este fue uno de los pocos métodos
analíticos poderosos disponibles para los investigadores en la
época del desarrollo inicial de la química de proteínas; no
obstante, presentaba importantes desventajas, como exigir gran
cantidad de muestra, ser muy laborioso y en la práctica no permitir
la separación total de los componentes de la mezcla. Las
desventajas radicaban en su propia concepción; la separación
electroforética ocurría en el medio fluido del amortiguador, sin un
soporte que por su naturaleza limitara la mezcla convectiva de los
frentes en movimiento, sobre todo, apenas se suprimía el campo
eléctrico. Como consecuencia, el poder de resolución del método era
escaso. El sistema de Tiselius dio paso a aquellos que usaban un
soporte sólido, o gelatinoso, embebido en la solución amortiguadora
de pH, y sobre el que ocurría la separación electroforética. En
estos sistemas la muestra era constreñida a moverse en el seno del
soporte, y dada las cantidades relativamente pequeñas de muestras
que podían aplicarse, la separación total de los componentes en
bandas o zonas discretas se convertía en algo realizable. Al
desconectar el campo eléctrico, cada componente de la mezcla se
mantenía por un tiempo suficiente para fines prácticos, en la zona
del soporte que había alcanzado durante la electroforesis. Se les
llamó genéricamente Òelectroforesis de zonaÓ. Como puede suponerse,
el soporte es un factor muy importante para este tipo de
electroforesis. Uno de los primeros soportes usados fue el papel de
filtro, pero tenían inconvenientes como su fragilidad y la escasa
resolución que se alcanzaba en la separación, debido
fundamentalmente al gran
tamaño de sus poros moleculares. Luego, el papel fue sustituido por
las membranas de acetato de celulosa. Este material posee menor
tamaño de poro, lo que resulta en mayor poder de resolución, pero
de igual manera es frágil, lo cual hace su manipulación laboriosa,
y no permitía alta reproducibilidad de los resultados.
Probablemente esto se debió a la dificultad de establecer adecuados
controles de calidad en su manufactura. El acetato de celulosa, no
obstante, tuvo amplia aplicación en los métodos electroforéticos
usados en los estudios clínicos, y aún se usa en muchas
instituciones de salud de varios países. Los geles han sido muy
usados como soportes electroforéticos, y en la actualidad
permanecen, en el caso de los geles de agarosa y de poliacrilamida,
como los soportes de elección para la mayoría de las técnicas
electroforéticas aplicadas en las investigaciones en Biología y
ciencias afines. El gel de almidón, muy utilizado por la década de
los años 50s-60s, incrementó la resolución para algunas
aplicaciones, pero tiene inconvenientes, como rango limitado de
poro, lo cual limita el tamaño molecular de las especies que pueden
ser separadas, y además provoca intensa electroendoosmosis. Este
fenómeno también fue una limitante en el uso de otro gel, el de
agar. Hace relativamente poco tiempo, y gracias al desarrollo de
metodologías de purificación, se hizo posible obtener agarosa de
alta pureza a partir de ciertas algas productoras de agar. Con este
polisacárido natural se confeccionan geles que, en dependencia de
la concentración del reactivo usada, poseen rango de poros de
variado tamaño, aunque la distribución práctica de poros es
fundamentalmente hacia el rango de poro grande. La eliminación de
los grupos cargados disminuyó considerablemente el fenómeno de
electroendoosmosis. El gel de poliacrilamida, cuyo desarrollo se
inició antes que el de agarosa, es, junto con este último, los
soportes que poseen importancia práctica en la actualidad. Las
ventajas fundamentales del gel de poliacrilamida son la posibilidad
de seleccionar con suficiente exactitud el rango de poro, que en su
conjunto es de menor talla que en el gel de agarosa; además, es un
gel resistente, inerte y transparente; esta última propiedad es muy
importante para su uso en ciertos sistemas ópticos de detección y
estimación de la concentración de componentes separados por
electroforesis en él. El desarrollo de los soportes
electroforéticos hizo posible el diseño de nuevos procedimientos de
separación de las biomoléculas y otras sustancias sobre la base a
su carga eléctrica. Hoy son
varios las técnicas que se valen de este principio, y constituyen
valiosas herramientas en el laboratorio bioquímico. Las más
conocidas son la electroforesis en gel de agarosa, la
electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones nativas o
desnaturalizantes, el enfoque isoeléctrico, la electroforesis
bidimencional, la electroforesis en gel de campo pulsante y la
electroforesis capilar. A ellas haremos referencia, en algunos
casos brevemente, en este trabajo. Referencia:
Ninfa, A. J., & Ballou, D. P. Fundamental Laboratory Approach
For Biochemistry and Biotechnology. Pps 125-156. Fitzgerald
Scienc4e Press. Inc., Bethesda, MD.
Voet, D., & Voet, J. (1995). Biochemistry. 2nd Edition, pps.
89-96. John Wiley & sons, Inc., New York.
Algunos Conceptos Básicos: De inicio trataremos los conceptos
básicos que se aplican a la mayoría de los métodos
electroforéticos.
Una molécula de carga q en un campo eléctrico E experimenta una
fuerza (F):
F=qE
La movilidad electroforética (µ) de una molécula es:
µ = = Donde v es la velocidad de movimiento de la molécula, y f es
su coeficiente friccional.
Ley de Ohm: V= P=VI=RI2
Donde V es voltaje, R es resistencia del conductor, I es intensidad
de la corriente y P es potencia. Esta relación nos indica que si
incrementamos la I de la corriente en el experimento
electroforético, la P, y por consiguiente, el calor generado se
incrementa al cuadrado.
Dada la relación establecida en la ecuación:
P= Cuando disminuimos la fuerza iónica del amortiguador, y por
tanto su conductividad, aumenta la resistencia (R) al paso de la
corriente. Como consecuencia disminuye el calor generado por el
sistema (P), si V se mantiene constante. Por cada dos veces que
disminuyamos la fuerza iónica del amortiguador, podemos incrementar
1.4 veces el V sin provocar incremento significativo del calor
generado
La movilidad efectiva (µeff) de un electrolito débil es un promedio
de la movilidad efectiva de su forma ionizada:
µeff=µx Donde x es la fracción de moléculas ionizadas a un pH
determinado, y µ es la movilidad de la forma ionizada.
Referencias:
Garfin, D. E. Electrophoretic Methods (1996). Reprinted from:
Introduction to Biophysical Methods for Protein and Nucleic Acid
Research. Edited by Jay A. Glasel and Murray P. Detscher. Academic
Press.
Ninfa, A. J., & Ballou, D. P. (1998) Fundamental Laboratory
Approach For Biochemistry and Biotechnology, pps 125-156.
Fitzgerald Science Press. Inc., Bethesda, MD.
Voet, D., & Voet, J. (1995). Biochemistry. 2nd Edition, pps.
89-96. John Wiley & sons, Inc., New York.
Electroforesis en gel de agarosa: La agarosa es un polisacárido
lineal que se extrae de ciertas variedades de algas productoras de
agar (FMC Bioproduct, 1988, Sambrook et al, 1989). La estructura
básica que se repite a lo largo del polímero lineal es una unidad
compuesta por una molécula de D-galactosa y una de 3,6 anhidrido
galactosa, unidas por enlace glucosídico. Cuando la agarosa es
hidratada y fundida a
temperaturas altas y luego dejada enfriar, forma un gel en el que
las cadenas polisacarídicas se entrelazan, en asociación física
estabilizada por innumerables puentes de H, formando ases
interconectador, que finalmente resultan en una densa red o malla
cuyos poros moleculares limitan los espacios internos de la trama.
Los poros del gel de agarosa son mayores que los del gel de
poliacrilamida. En el gel de agarosa solo pueden ser separadas con
eficiencia proteínas de peso molecular mayor de 500kDa, y moléculas
de DNA de alrededor de 2000 pb. En la medida que se incrementa la
concentración de agarosa en el gel, el tamaño de los poros
disminuye. En el mercado hay disponibles muchos tipos de celdas
electroforéticas para realizar electroforesis en geles de agarosa.
Igualmente, están disponibles muchos tipos de agarosas, que varían
en sus propiedades químicas y físicas, como la intensidad de la
electroendoosmosis que su composición química promueve, la
resistencia mecánica del gel, la porosidad, y la temperatura de
gelificación, que para algunas de grado especial es
significativamente baja sin que se afecten otras características
como la resistencia mecánica del gel. Estas propiedades influyen
significativamente en los resultados del proceso de separación
electroforética (Sambrook et al, 1989). Aunque se ha usado en
técnicas para proteínas, el uso más frecuente de la agarosa es en
los métodos electroforéticos de separación de ácidos nucleicos.
Varios factores determinan la velocidad de migración de una
molécula de DNA en el gel de agarosa. Estos factores son: Tamaño
molecular del DNA: Debido a la resistencia friccional que ejerce el
gel sobre las moléculas de DNA que se mueven en su seno en
respuesta al campo eléctrico, aquellas de mayor talla se moverán a
una menor velocidad que las más pequeñas. La velocidad de migración
es inversamente proporcional al log10 del número de pares de bases,
para el caso de una molécula de DNA de doble cadena y lineal.
Conformación del DNA: La forma o conformación del DNA influye
significativamente en su movilidad electroforética. El DNA súper
enrollado (forma I), el DNA circular mellado (forma II) y el DNA
lineal de igual talla molecular migran a través del gel de agarosa
a diferente velocidad. Si bien la
concentración de agarosa del gel es el factor que primariamente
determina la velocidad relativa de migración de estas formas, otros
factores como la fuerza del campo eléctrico aplicado, la fuerza
iónica de amortiguador y el grado de súper enrollamiento de la
molécula en forma I, también influyen en el valor de este término
(Johnson and Grossman, 1977). Bajo algunas condiciones el DNA en
forma I migra más rápidamente que el III, pero en otras el orden se
invierte. Concentración de agarosa en el gel: Un fragmento de DNA
lineal de un tamaño molecular dado migrará a diferentes velocidades
en geles que posean diferente concentración de agarosa. La relación
entre la movilidad electroforética (µ) y la concentración del gel
(τ) se expresa en la siguiente ecuación: logµ=logµ0-Kr τ Donde µ0
es la movilidad electroforética libre del DNA, Kr es el coeficiente
de retardo, una constante que se relaciona a las propiedades del
gel y al tamaño y la forma de la molécula que migra. Esta relación
nos dice que, modificando la concentración del gel, podemos
resolver mezclas no totalmente separadas en un primer intento. El
rango óptimo de separación de geles de agarosa en dependencia de la
concentración se indica en la tabla siguiente:
Cantidad de agarosa en el gel, expresado en % (p/v)
Rango óptimo de separación de fragmentos lineales de
DNA (kb) 0,3 5-60 0,6 1-20 0,7 0,8-10 0,9 0,5-7 1,2 0,4-6 1,5 0,2-3
2,0 0,1-2
Voltaje aplicado: A bajo voltaje la velocidad de migración del DNA
es proporcional al voltaje aplicado. Pero en la medida que el campo
eléctrico es intensificado, la movilidad de las moléculas de DNA de
alto peso molecular comienza a no corresponder proporcionalmente al
incremento del voltaje. Como
consecuencia, el rango efectivo de separación en el gel de agarosa
disminuye con la elevación del voltaje. La máxima resolución en la
separación de fragmentos de DNA de más de 2kb se logra cuando se
realiza la corrida electroforética a 5 V/cm. La distancia a usar en
este cálculo es la que separa en línea recta a los electrodos de la
celda electroforética. Dirección del campo eléctrico: Los
fragmentos lineales de DNA se alinean con relación a la dirección
del campo eléctrico, de modo que al cambiar la dirección de este,
estos fragmentos deben realinealse para iniciar el movimiento en la
nueva dirección del campo. Los fragmentos de mayor talla consumen
más tiempo en el proceso de realineamiento, y quedan rezagados con
relación a los de talla menor. El cambio frecuente de la dirección
del campo eléctrico es la base de la electroforesis en gel de campo
pulsante. Composición de bases del DNA y la temperatura de corrida:
La influencia de estos factores es menor en el gel de agarosa que
en la electroforesis en gel de poliacrilamida, no obstante, en el
caso de geles confeccionados con agarosa de bajo punto de fusión, o
aquellos que contienen menos del 0,5% del polisacárido, es muy
conveniente realizar el ensayo a 40C, para evitar la fusión del
gel. Presencia de colorantes intercalantes: El colorante
fluorescente intercalante Bromuro de Etidio reduce la movilidad
electroforética del DNA lineal en un 15%. Este efecto se debe al
intercalamiento de las moléculas del colorante entre las bases
apiladas en la estructura del DNA, que torna rígidas y alargas a
las moléculas lineales o circulares con mella. Composición del
amortiguador: la movilidad electroforética del DNA es afectada por
la composición y la fuerza iónica de amortiguador usado en el
ensayo. En cuanto a la fuerza iónica, su efecto es expresión de la
relación entre este parámetro y la corriente eléctrica que fluye a
través del gel. En un medio de fuerza iónica cero, la conductancia
es mínima y la movilidad electroforética del DNA es escaza, si es
que migra. En cambio, si la fuerza iónica del amortiguador es muy
alta, el flujo de corriente se incrementa, lo que resulta en mayor
generación de calor, lo que puede incrementar la temperatura del
sistema más allá del punto de fusión de la agarosa, y eventualmente
desnaturalizar el DNA. Fragmentos lineales de DNA de doble cadena
migran alrededor de un 10% más rápido en amortiguador TAE que en
TBE o TPE, sin que esto signifique
incremento en la resolución. En cambio, la resolución de mezclas de
DNA súper enrollado es mejor en TAE que en TBE. Varios aparatos y
protocolos han sido desarrollados para satisfacer las diferentes
exigencias del trabajo experimental relacionado con la separación
electroforética de mezclas de DNA. Información abundante sobre este
particular se encuentra disponible en el web y textos de métodos.
Referencia:
FMC BioProducts (1988) ÒFMC BioProducts Sources Books,Ó Agarose
Monog., 4th ed., pp. 51-106. FMC BioProducts, Rockland, Me. ¤
Garfin, D. E. Electrophoretic Methods (1996). Reprinted from:
Introduction to Biophysical Methods for Protein and Nucleic Acid
Research. Edited by Jay A. Glasel and Murray P. Detscher. Academic
Press.
Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989). ÒMolecular
Cloning: A Laboratory Manual,Ó 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab.,
Cold Spring Harbor, NY.
Electroforesis en Gel de Poliacrilamida: La casi inigualable
resolución y flexibilidad que ofrece la electroforesis en gel de
poliacrilamida ha convertido a esta técnica en una de las más
usadas para la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Es
posible variar la porosidad del gel y la composición del sistema de
amortiguadores para satisfacer una amplio rango de requerimientos
experimentales. La separación puede realizarse en virtud de las
diferencias de carga, del tamaño molecular, o por una combinación
de ambos. El gel de poliacrilamida se forma por la copolimerización
de la acrilamida y un comonómero entrecruzante que es usualmente la
N,NÕ-metilenebisacrilamida (bisacrilamida). El entrecruzante es un
agente acrílico bifuncional que une covalentemente las cadenas
lineales de poliacrilamida (Righetti et al, 1989). Además de la
bisacrilamida se han usado otros entrecruzantes para propósito
especiales, como el piperazinediacrilamide, o PDA, que permite
obtener un gel con bajo fondo en la coloración con plata.
La reacción de polimerización, representada en la figura situada
debajo, es de adición de grupos vinilos, iniciada por un sistema
generador de radicales libres (Flory et al, 1953).
En las recetas más comunes de confección de geles de
poliacrilamida, la polimerización es iniciada por la adición de
persulfato de amonio, que es el agente iniciador, y de
tetrametiletilenediamina (TEMED), que funciona como agente
acelerador. El TEMED acelera la descomposición del persulfato de
amonio en radicales sulfato libres, los que inician la reacción al
convertir a los monómeros de acrilamida en radicales libres que
reaccionan, a su vez, con los monómeros no activados, procediendo
de esta forma la polimerización; para esta se necesita la presencia
de la base libre del TEME. La estructura del agente entrecruzante
N,NÕ-metilenebisacrilamida es la de dos moléculas de acrilamidas
unidas a través de sus grupos amino por una unidad de metilene.
Esta estructura le permite a una molécula de entrecruzante
participar en la reacción de polimerización de dos cadenas lineales
en crecimiento. Cuando esto ocurre, las cadenas lineales quedan
conectadas covalentemente por un puente de Cs y Ns alternantes.
Este puente posee dos enlaces C-N de tipo peptídico, lo cual
probablemente aporta cierto grado de rigidez a la estructura.
Cuanto mayor es la concentración relativa del agente entrecruzante,
mayor es la probabilidad de que se entrecrucen las cadenas lineales
de poliacrilamida, aunque esto parece ser verdadero hasta cierto
valor de concentración, como veremos luego (Gelfi C et al 1981a).
Muchos factores influyen profundamente el curso de la reacción de
polimerización, y si no son adecuadamente controlados, se pueden
comprometer las propiedades del gel y Consecuentemente la
reproducibilidad del ensayo electroforético. Entre estos factores
destacan:
q Pureza de los reactivos: La presencia de impurezas como el ácido
acrílico,
iones metálicos y acrilamida lineal, tanto en la acrilamida como en
la Bis, pueden inhibir la reacción de polimerización, y modificar
las propiedades del gel. q La concentración de los comonómeros: Los
geles de poliacrilamidan son caracerizados convencionalmente por
dos términos: El %T y el %C. El primero indica la concentración
total de monómeros (acrilamida + bisacrilamida) expresadas en
g/100mL de solución, y el %C indica la proporción relativa del
entrecruzante en la concentración total de monómeros
([Acril+Bis]/[Bis]x100). El tamaño de poro efectivo del gel es una
función inversa del valor de %T, lo cual significa que, a mayor
valor de %T, para un valor fijo bajo de %C, menor el tamaño de
poro. Por otra parte, la función que expresa la relación entre el
valor de %C y el tamaño de poro es bifásica; puede ser representada
como una campana invertida en un eje de coordenadas, donde x es %C
e y es tamaño de poro. En la medida que se incrementa %C a un %T
constante, disminuye en tamaño de poro, siendo este mínimo al valor
de 5%C. A valores mayores de 5%C el tamaño de poro se incrementa
(Gelfi C et al 1981a).
El rango de fraccionamiento con relación al valor de %T se
representa en la siguiente tabla:
Rango de fraccionamiento para geles de poliacrilamida %T Rango Mr
óptimo 5-12 20,000-150,000 10-15 10,000-80,000 > 15
<15,000
q El pH: Cuando el pH es menor de 6, la eficiencia de la reacción
de polimerizaci˜n disminuye significativamente (Caglio &
Righetti, 1993). Una forma de atenuar este efecto cuando se
necesitan confeccionar geles a pH ácido, es usar riboflavina como
fuente de radicales libres adicional, y la luz como activador en
presencia de O2, de la liberación de estos radicales. q La
presencia de O2: Puesto que la formación de poliacrilamida procede
como una reacción de polimerización de radicales libres, la
presencia de
agentes que reaccionan con estos y los atrapan, la inhibe. El
oxígeno es ese tipo de inhibidor. Por eso se hace necesario, para
ciertos requerimientos, eliminar el oxígeno disuelto en las
soluciones de reactivos mediante degasado. En ocasiones también se
hace necesario aislar del aire circundante a la solución donde está
ocurriendo la reacción de polimerización, mediante una fina capa de
agua previamente degasada. q Temperatura: En control de la
temperatura es crítico para lograr reproducibilidad en la
polimerización de la acrilamida. La temperatura tiene un efecto
directo sobre la velocidad de la reacción de polimerización, pues
esta es exotérmica. El calor liberado acelera, pues, a la reacción.
La temperatura de polimerización también influye en las
características finales del gel. El rango óptimo es de 230C a 250C.
A temperaturas cercanas a cero se forman geles de aspecto turbio,
porosos e inelásticos, y a temperaturas muy altas se forman cadenas
poliméricas cortas y el gel también es inelástico (Gelfi, C. et al
1981b). q Aditivos: Aditivos como los detergentes SDS y Tritón
X-100 pueden adicionarse a la mayoría de los sistemas de
amortiguadores sin que se altere la polimerización. En cambio, la
formamida y la urea provocan la formación de geles con tamaño de
poro menor que el que acontecería si no estuvieran estos reactivos
presentes. Además de los propios aditivos, los contaminantes que en
ocasiones les acompañan pueden también inhibir la polimerización. q
Tiempo: Si bien luego de transcurridos 15-20 min puede constatarse
la formación del gel, la polimerización aún está procediendo. Se
sugiere que cuando se emplee el sistema persulfato de amonio-TEMED,
se permita que esta transcurra durante al menos 2 horas, para
asegurar reproducibilidad en las características del gel. En cuanto
al sistema riboflavina-luz, por lo general la reacción procede más
lentamente, dependiendo de la intensidad de la luz.
La electroforesis en gel de poliacrilamida puede ser efectuada en
condiciones no desnaturalizantes para las proteínas, y en ese caso
se clasifica como Òelectroforesis en condiciones nativaÓ, o por el
contrario, en Òcondiciones desnaturalizantesÓ, tales que aseguran
total desnaturalización de estas. Esto es importante, pues si bien
en ambos casos la fuerza que mueve a las moléculas cargadas a lo
largo del gel es la atracción del polo con carga opuesta, la
separación de los componentes de la muestra no ocurre por el mismo
principio en ambos casos. El sistema de amortiguadores tienen un
efecto profundo en la corrida electroforética. El amortiguador
determina las condiciones de potencia del sistema, y afecta la
separación y resolusión de las bandas. Adicionalmente, cuando se
desea realizar un experimento en condiciones nativas, es muy
importante tener en cuenta el efecto de las características de
fuerza iónica, composición de iones y pH del amortiguador sobre la
actividad de las proteínas de la muestra. Los sistemas de
amortiguadores para electroforesis en gel de poliacrilamida se
clasifican en continuos y discontinuos. Sistema continuo: Es aquel
en el que un mismo amortiguador, con el mismo pH, es usado en el
gel y en los reservorios de los electrodos. Adicionalmente, las
muestras son cargadas directamente en el gel donde ocurrirá la
separación. Este sistema tiende a la difusión de las bandas, lo
cual hace que tenga menor resolución que el sistema discontinuo.
Cuando la concentración de los componentes de la muestra se acerca
a 1mg/mL, este sistema puede ser usado. Sistema discontinuo: El
primer sistema discontinuo fue desarrollado por Ornstein y Davis en
1964. Este fue un sistema para el análisis de proteínas del suero
en estado nativo, que desde entonces ha sido aplicado a muchas
otras proteínas. Este sistema consiste en cuatro partes
interrelacionadas: (1) el gel concentrador (stacking gel), (2) el
gel separador (running gel), (3) el amortiguador de electrodos, y
(4) la muestra. El gel concentrador es de poros grandes (4%T),
contiene amortiguador Tris-Cl 0.125M, pH 6.8 y se prepara en la
parte superior del gel separador. Este último posee valores de
5-30%T, contiene Tris-Cl 0.375M, pH 8.8. El amortiguador de los
electrodos es Tris 0.025 Glicina 0.192M, pH 8.3. La muestra se
deposita sobre el gel concentrador, diluida en amortiguador de
muestra Tris-Cl 0.0625 M, pH 6.8, y es cubierta por el amortiguador
del cátodo (reservorio superior). Cuando es aplicado el campo
eléctrico, los aniones Cl- y glicinato, así como las proteínas
cargadas negativamente, comienzan a moverse hacia el ánodo. El Tris
y otros cationes se mueven hacia el cátodo. Como la µeff del Cl- es
mayor que la de la glicina a pH 8.3 (Dado que el pKa de la glicina
es 9.8, solo 1/30 moléculas están disociadas a glicinato), se forma
una
región de baja conductividad y alto campo eléctrico detrás del
frente de movimiento del Cl-. Esto acelera el movimiento de las
proteínas de la muestra y del frente de movimiento de la glicina a
la misma velocidad del frente del Cl-. Se forma un arreglo de
frentes en movimiento, con el Cl- al frente, la glicina en la
retaguardia, y las proteínas en varios frentes comprimidos entre
ambos. Esto ejerce un efecto de concentración de las proteínas que
se ha planteado pueden llegar a alcanzar concentraciones del orden
de 100mg/mL (Chen et al, 1978). El pH del gel concentrador asciende
a 8.3 en la medida que la glicina se mueve a través de él. Dado que
el gel concentrador posee poros grandes, no ejerce efecto de tamiz,
y las proteínas avanzan solo dependiendo del efecto del campo
eléctrico. Cuando los frentes atraviesan el gel concentrador y
entran en el gel separador, la menor porosidad de este sí ejerce
efecto de tamiz, resistiéndose al paso de las proteínas en
dependencia de su tamaño molecular. Como este es un sistema en
condiciones nativas, también la forma influye en la movilidad
electroforética. A lo anterior debe añadirse que al penetrar las
proteínas en el gel separador, experimentan un súbito cambio del pH
del medio, de 8.3 a 8.8, el que luego asciende a 9.5 cuando el
amortiguador Tris-CL es sustituido por Tris- glicina. Este es el
valor de pH al ocurre la separación de los componentes de la
muestra en bandas discretas. Laemmlin en 1970 modificó es sistema
de Ornstein-Davis para usarlo en la estimación del peso molecular
de las proteínas. él incorporó el detergente aniónico
dodecil-sulfato de Na (SDS) al 0.1% en los amortiguadores del
sistema de Ornstein-Davis, y adicionó un paso de desnaturalización
al calor en presencia de 0.2% de SDS y 2-mercaptoetanol al 5%. En
tales condiciones, los enlaces S-S de las proteínas se reducen, y
las proteínas se desnaturalizan totalmente. El SDS se asocia a
estas en una relación de 1.4g de SDS por gramo de proteína. Las
propiedades del SDS se hacen dominantes sobre las de las proteínas,
estas adoptan una conformación extendida, similar a bastoncillos,
con dimensiones proporcionales a su masa molecular. En adición, la
densidad de carga del complejo SDS-proteína es independiente del pH
en el rango de 7 a 9. Por todo lo dicho, se hace claro que el
fraccionamiento de los componentes de la muestra depende únicamente
del efecto de tamiz del gel de poliacrilamida, de modo que es
posible estimar con buena exactitud la masa molecular de una
proteína, si se
posee varias de ellas de masa conocida (marcadores de peso
molecular para SDS- PAGE), pues la relación entre la movilidad
relativa de estas y el logaritmo de su peso molecular es lineal
dentro de un rango relativamente amplio para cada sistema. Están
disponibles en el comercio numerosos kits de proteínas de
referencia de peso molecular, tanto para rango de peso bajo, alto,
como rango amplio. En la tabla que sigue se muestra un ejemplo,
comercializado por la compañía Bio-Rad, así como el gráfico donde
se representa la relación lineal entre movilidad relativa relativa
y log del peso molecular.
Aunque el formato más usado en la actualidad es el gel en forma de
lámina, también se han desarrollado sistemas que emplean geles de
forma tubular. En las electroforesis en gel de poliacrilamida, para
la detección de las bandas se emplean colorantes como el negro
amido, el azul brillante de Coommassie, pero también coloraciones
con mayor sensibilidad para detectar proteínas. Uno de los métodos
más sensibles es la coloración con plata (Rabilloud et al., 1990).
También se emplea la coloración con Cu cuando se desea evitar el
paso de
fijación en electroforesis de SDS-PAGE. La especificidad de
reconocimiento de los anticuerpos permite identificar a componentes
específicos de la muestra, separados durante la electroforesis,
mediante el método de inmuno-fijación (immuno-blotting). Dado que
los anticuerpos reconocen fundamentalmente epitopes
conformacionales, su uso se limita a sistemas de electroforesis
nativa. Como veremos en el caso de la 2D-SDS PAGE, la
electroforesis en gel de poliacrilamida puede combinarse con otros
métodos, como el PCR, para detectar cambios puntuales en genes que
pueden ser causa de enfermedad, como es el caso de la
Fenilcetonuria (Michiels, L., et al.) Referencias:
Caglio, S & Righetti, P. G. (1993) On the pH dependence of
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Voet, D., & Voet, J. (1995). Biochemistry. 2nd Edition, pps.
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Enfoque isoeléctrico: Este es un poderoso método para separar las
moléculas anfotéricas de una mezcla sobre la base del valor de su
pI. Las proteínas son el caso mejor conocido de moléculas
afotéricas. Ellas se cargan negativamente cuando el pH del medio es
mayor que el valor de su pI, en cambio, cuando ocurre lo contrario,
el pH<pI, entonces su carga neta es de signo positivo. En ambas
condiciones las moléculas se moverán en un campo eléctrico,
obviamente dirigiéndose hacia el electrodo de carga opuesta. Pero
la esencia del método radica en la respuesta de las moléculas
anfotéricas cuando el valor de pH del medio se iguala al valor de
su pI. En esas condiciones las cargas negativas de la especie son
compensadas por igual número de cargas positivas, resultando en
carga neta igual cero. Cuando esto ocurre, la molécula deja de
responder al campo eléctrico y se detiene en la región donde pH=pI.
Para la realización del enfoque isoeléctrico es necesario
establecer un gradiente lineal y estable de pH a lo largo del gel,
cuyo rango de valores estará determinado por los pI de los
componentes de la muestra que son de nuestro
¤ Garfin, D. E. Electrophoretic Methods (1996). Reprinted from:
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Electroforesis Bidimensional: Dado que cada método electroforético
hace uso de, fundamentalmente, una propiedad física diferente de
las moléculas de la muestra para lograr su separación, la
combinación de dos de estos puede incrementar la capacidad de
resolución del ensayo en general. Esta es la lógica de la
electroforesis bidimensional, en la que se combinan dos técnicas
que separan las moléculas en base a características diferentes. La
combinación más frecuentemente usada es la de enfoque isoeléctrico
con la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. A este
ensayo de le ha denominado 2-D PAGE. Los dos principios de
separación son ortogonales y complementarios. Primero las proteínas
son separadas en bases a su pI en un ensayo de enfoque
isoeléctrico, usando un solo carril de un gel en lámina, o un gel
en forma cilíndrica. La separación ocurre en una sola dimensión.
Luego la porción de gel que contiene las proteínas es cortada en
una tira, en el caso de ser un gel en lámina, o el cilindro de gel
es tomado, y en ambos casos se adosan al extremo superior de un gel
para SDS-PAGE. El gel del enfoque isoeléctrico se orienta de modo
tal que el eje de movimiento de las proteínas durante el enfoque
queda perpendicular a la dirección de movimiento durante la
SDS-PAGE. Luego se realiza la segunda corrida, de modo que ahora la
separación ocurre en una segunda dimensión, perpendicular a la
anterior. Una vez concluida la separación electroforética, se
efectúa el paso de identificación mediante coloraciones estándar
para proteína, o especiales, según el interés. El uso de la
coloración de plata aporta mucha sensibilidad de detección al
método. El resultado final va ha depender de las condiciones
elegidas para cada ensayo;
como, por ejemplo, el rango del gradiente de pH usado en el ensayo
de enfoque isoeléctrico. La combinación de ambos métodos incrementa
significativamente la resolución, y hace posible resolver mezclas
muy complejas de proteínas. Esta característica ha convertido a la
2D-PAGE en una herramienta muy poderosa para la identificación de
nuevas proteínas, y el estudio de los patrones de expresión de
estas en la célula, bajo condiciones específicas, lo cual es muy
importante en la comprensión de nuestro proteoma.
Referencias:
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Bulletin 2651. Bio-Rad. www.bio-rad.com.
Hoving, S., Voshol, H., van Oostrum, J. (2001) High-Performance 2-D
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Pandey, A., Mann, M. (2000). Proteomics to study genes and genomes.
Nature, 405(15):837-846.
Electroforesis Capilar (EC): La EC es una familia de técnicas
relacionadas que emplean capilares de pequeño diámetro interior
(20-200µm) como celda donde estará contenido el sistema de
amortiguadores donde ocurrirá la separación electroforética de los
componentes de la muestra. Este formato permite acometer la
separación, con muy alta eficiencia, de moléculas de estructura
química muy diferentes, como proteínas y péptidos, DNA y
carbohidratos. También es posible separar moléculas
estructuralmente muy similares entre sí, como los enantiómeros, y
pequeñas del tipo de los compuestos farmacéuticos. Las prestancias
de este conjunto de técnicas se deben, en buena medida, al uso de
alto voltaje, lo cual genera dentro del capilar tanto flujo
electroforético de las especies iónicas de la muestra, como
electroosmótico de la solución amortiguadora. Las altas propiedades
de separación y los electroforegramas que resultan, recuerdan a un
híbrido entre la SDS-PAGE y la HPLC. Las características generales
y ventajas que supone el uso de la EC se pueden resumir en:
Emplea un tubo capilar donde ocurre la separación electroforética.
Utiliza campos eléctricos de muy alta tensión, de hasta 500 V/cm.
Usa metodología de detección muy moderna, que le dan al
electroforegrama
semejanza a un cromatograma. Posee un grado de eficiencia del orden
de la cromatografía de gas en capilar
, llegando a superarla en algunos casos. Requiere cantidades de
muestra muy pequeñas, lo cual le convierte en un
procedimiento analítico muy útil para el trabajo con sustancias muy
escasas y valiosas.
Su explotación es económica, pues consume pequeñas cantidades de
reactivos.
Es aplicable a un amplio grupo de compuestos, superando en este
rubro a muchos otros métodos electroforéticos.
La configuración instrumental básica para la EC es simple, y consta
de los siguientes elementos:
a) Un tubo capilar de sílice fundida que posea una ventana óptica
para el análisis del contenido. b) Una fuente de alto voltaje
regulable. c) Un par de electrodos. d) Dos reservorios de solución
amortiguadora. e) Un detector de UV.
Cada extremo del capilar es sumergido en uno de los reservorios de
amortiguador, y la ventana óptica es alineada con el detector.
Luego de llenar el capilar con solución amortiguadora, la muestra
puede ser introducida en él sumergiendo el extremo opuesto al que
posee la ventana óptica en la solución de muestra, y posteriormente
elevando este extremo unos 30 cm por encima del nivel del
reservorio del extremo del detector. Ya introducida la muestra, se
aplica el campo eléctrico y se procede a la separación
electroforética. De hecho, la mayoría de los trabajos realizados en
EC antes de 1988 se valieron de sistema confeccionados por los
mismos investigadores. Los sistemas comerciales modernos se
caracterizan, sobre todo, por su alto grado de automatización,
conferido por el control computarizado de todas las operaciones,
como la
inyección electrocinética de la muestra, el control exacto de la
presión y la temperatura del sistema, el desarrollo de los
procedimientos y las estrategias de separación; poseen eficaces
sistemas de disipación de calor y de recolección de fracciones. Es
necesario precisar el uso de algunos términos en el contexto de la
electroforesis capilar. Los fundamentales son: Tiempo de migración
(tm): Es el tiempo que toma a un soluto en moverse desde el inicio
del tubo capilar hasta la ventana óptica del detector. Movilidad
electroforética (µep): Se expresa en cm2/Vs y es la velocidad con
que se mueve un ion a lo largo del capilar en respuesta a la
intensidad del campo eléctrico. Velocidad electroforética (Vep): Se
expresa en cm/s, y es la distancia que recorre un soluto por unidad
de tiempo. Fuerza del campo eléctrico (E): Se expresa en V/cm. La
relación entre estos términos es la siguiente:
µep = = (1) La Vep se calcula dividiendo la longitud del capilar
(Ld) entre el valor de tm. La µep se calcula dividiendo la Vep
entre E. La Vep es independiente del voltaje y de la longitud del
capilar, pero es altamente dependiente del tipo de amortiguador
empleado, el pH y la temperatura. Las dos medidas del capilar que
son importantes son Ld, que es la longitud del capilar desde su
inicio hasta la ventana del detector, y la longitud total (Lt), que
incluye el segmento de capilar que continúa luego de la ventana del
detector, y que sirve para conectar al capilar con el reservorio de
amortiguador. La separación mensurable ocurre en el segmento Ld,
mientras que el cálculo de E se realiza dividiendo el voltaje total
entre Lt. La ecuación 1 nos permite calcular la µep aparente, pero
el cálculo de la real debe tener en cuenta el efecto del flujo
electroosmótico. Este factor debe ser
cuidadosamente controlado durante los experimentos de separación,
para lograr alta reproducibilidad. La electroosmosis: Es uno de los
procesos determinantes de la separación de los componentes de la
muestra en la EC. Este fenómeno es consecuencia de los grupos
ionizables presentes en la superficie interna de las paredes del
capilar. La sílica fundida posee grupos silanol que están en
contacto con el amortiguador contenido en el capilar. El grado de
ionización de estos grupos depende del pH del amortiguador empleado
en el ensayo. La sílica posee un pI de 1.5. A pH por encima de 1.5
la sílica se carga negativamente, y atrae cationes componentes del
amortiguador, lo cual crea una doble capa de iones. Cuando se
aplica un campo eléctrico a lo largo del capilar, la tendencia es
que los aniones se muevan hacia el ánodo, y los catones hacia el
cátodo, pero los grupos silanol de carga negativa están fijados en
la pared del capilar y non pueden moverse libremente, pero los
cationes de la doble capa, que si pueden hacerlo, se mueven hacia
en cátodo, y en su movimiento arrastran moléculas de agua. El
resultado es un flujo neto de solución amortiguadora en dirección
al electrodo negativo, que puede ser muy intenso. A pH igual a 9.0
en amortiguador borato 20 mM el flojo electroosmótico (FEO) es de
alrededor de 2mm/s, lo que en un capilar de 50 µm de diámetro
interno significa un flojo neto de 4 nL/s. A pH igual a 3 el FEO es
mucho menor, de 0.5 nL/s, lo que está determinado por el menor
grado de ionización de los grupos silanol de la pared capilar. El
FEO (Veo) es definido por la siguiente relación:
Veo = Donde es la constante dieléctrica del medio, η es la
viscosidad del amortiguador, y ζ es el potencial zeta medido en el
plano de corte cerca de la interfase líquido-sólido. El ζ está
relacionado al inverso de la carga por unidad de área de
superficie, al número de electrones de valencia, y a la raíz
cuadrada de la concentración de electrolito. Puesto que esta es una
relación inversa, el incremento de la concentración de electrolitos
resulta en la disminución del FEO. El FEO puede ser controlado, o
incluso suprimido, para realizar ciertos modos de
ensayo de EC. Por otro lado, el FEO permite el análisis simultaneo
de aniones, cationes y especies neutras en una misma corrida
electroforética. A pH neutro o alcalino el FEO es suficientemente
intenso como para obligar a todas las especies a moverse hacia el
ánodo. El orden de movimiento es: Cationes, especies neutras y
finalmente aniones. Para describir el efecto del pH sobre el FEO y
la movilidad de las especies ionizables de la muestra, emplearemos
el caso de péptidos. Los péptidos son zwitteriones; a pH muy
alcalino se cargan negativamente, y se mueven hacia el electrodo
positivo (ánodo) en respuesta al campo eléctrico. Pero a pH
alcalino el FEO es tan intenso que sobrepasa el efecto de atracción
que ejerce el ánodo sobre los péptidos, y estos se mueven junto al
amortiguador hacia el cátodo. A pH ácido, los péptidos se cargan
positivamente, y el FEO es débil. Como resultado. ambos, los
péptidos y el amortiguador fluyen hacia el cátodo. Para asegurar el
total control del sistema se hace necesario medir la intensidad del
FEO. Un modo de calcularlo es inyectando una muestra que contenga
una molécula neutra, como el metanol o la acetona, y midiendo el
tiempo que le toma en llegar hasta el detector. Para realizar
modalidades de EC que se basan en el enfoque isoeléctrico (EI-EC) y
la isotacoforesis (ISF-EC), se necesita eliminar el efecto de FEO.
Ello se logra recubriendo la superficie interna del capilar con una
sustancia no cargada, o usando capilares de teflón, que no poseen
grupos químicos ionizables. También se han usado aditivos como la
metilcelulosa. Cinética del flujo: Una consecuencia importante del
uso del campo eléctrico como generador del flujo de amortiguador
(FEO) en la EC, en lugar de los sistemas hidrodinámicos como las
bombas de presión que se usan en los sistemas de cromatografía
líquida, es que, en este último caso, el flujo posee un perfil de
tipo laminar o parabólico, como consecuencia de la caída de presión
que provoca la fricción de las moléculas del fluido con la
superficie interna de los empaques y las paredes de las tuberías.
Se establece un gradiente de flujo en el que la velocidad es mayor
en las capas centrales del fluido y se aproxima a cero en las capas
cercanas a la interfase líquido-sólido. Este gradiente de velocidad
provoca que la banda o zona donde se mueve cada componente de la
muestra se haga más ancha. Por el contrario, en los
sistemas en los que el campo eléctrico es quien provoca el flujo,
la fuerza impulsora del FEO se distribuye uniformemente a todo lo
largo del capilar, y en consecuencia, no se producen caídas de
presión. La velocidad de flujo es uniforme en toda la sección
transversal del capilar, excepto en la región muy cercana a la
interfase líquido-sólido, donde la velocidad también se aproxima a
cero. Eficiencia del sistema: La velocidad de migración, (Vep), se
calcula según la ecuación:
νep= µep E = µep Donde V es el voltaje y L es la longitud total del
capilar. El tiempo de migración (t) es:
t = =
Durante la migración a través del capilar ocurre dispersión de los
picos (σ2) como consecuencia de la difusión molecular. La σ2 se
calcula a partir de la ecuación:
σ2= 2Dmt= Donde Dm es el coeficiente de difusión del soluto
(cm2/s). El número de platos teóricos (N) está dado por la relación
siguiente:
N= Sustituyendo la ecuación de dispersión en la ecuación de cálculo
de los platos teóricos, tenemos la siguiente relación:
N = Sustituyamos los valores de la mioglobina de corazón de caballo
en la ecuación para el cálculo del número de platos teóricos.
MW=13,900, µep=0.65x10-4 cm2/Vs (en amortiguador bicina/TEA 20mM,
pH=8.5) Dm= 10-6 cm2/s, V=30,000 Volts. El cálculo de N es igual a
975x103 platos teóricos.
La dispersión en un sistema simple como el que analizamos aquí, se
asume como difusión dependiente del tiempo solamente. Esta ecuación
indica que las moléculas grandes como las proteínas y los Ac.
Nucleicos, con coeficientes de difusión (D) pequeños, generarán el
número mayor de platos teóricos. Un modo de incrementar la
eficiencia en el sistema de EC es incrementando el voltaje, lo cual
disminuye el tiempo de separación. El voltaje límite en los
sistemas actuales es de 30kV. No obstante la posibilidad de usar
capilares muy cortos para generar campos muy fuertes, el límite
práctico para el incremento de la fuerza del campo eléctrico es la
generación de calor, que se denomina Òcalentamiento de JouleÓ. El
calentamiento de Joule es consecuencia de la resistencia del
amortiguador al flujo de la corriente eléctrica. Esto puede ser
atenuado mediante el uso de sistemas apropiados de disipación de
calor, aunque con límites reales. No obstante las limitaciones que
establece la difusión, la EC es un método útil para la separación
de moléculas pequeñas, pues, dado que el valor de µep es una
función de la relación carga / masa, las moléculas pequeñas tienden
a tener mayor valor de µep. La resolución (Rs): La resolución entre
dos especies componentes de la muestra se calcula mediante la
ecuación:
Rs =
Donde Æ ep es la diferencia de movilidad electroforética entre los
dos componentes, µep es el promedio de la movilidad electroforética
de ambas especies y N es el número de platos teóricos. Si
sustituimos el conteo de platos teóricos en la ecuación de
resolución, se obtiene:
Rs= (0.177) Esta relación demuestra que incrementando el voltaje es
una medida limitada para incrementar la resolución, pues para
lograr el doble de la resolución es necesario incrementar el
voltaje al cuádruplo. La clave de cualquier acción para
incrementar
la resolución radica en Ƶep. La mejor forma de controlar la
movilidad de los distintos componentes de la muestra es eligiendo
la modalidad de EC apropiada unido a la selección del sistema
amortiguador adecuado. La producción de calor durante los ensayos
de EC es un fenómeno inevitable, dado el uso de campos eléctricos
intensos. Los dos problemas fundamentales que provoca la generación
de calor son:
¤ Gradientes de temperatura a través de la sección transversal del
capilar. ¤ Cambios de la temperatura del sistema en función del
tiempo (consecuencia de la disipación ineficiente del calor
generado).
Dado la siguiente relación:
= El calor generado es proporcional al cuadrado de la intensidad
del campo eléctrico. Por consiguiente, disminuyendo la intensidad
del campo o incrementando la longitud del capilar, se disminuye
dramáticamente el calor generado. Una consecuencia de la disipación
del calor producido es el gradiente de temperatura antes
mencionado. Dado que el calor se disipa por difusión, es de esperar
que la temperatura en la zona central del capilar sea mayor que en
las paredes del capilar. Como la viscosidad disminuye con el
aumento de la temperatura, tanto el FEO como la µep se
incrementarán para las moléculas que están en las capas de fluido
más centrales en el capilar. La consecuencia es un perfil de flujo
similar al hidrodinámico, con incremento del ancho de zonas o
bandas de migración de las especies. El uso de capilares de muy
pequeña sección transversal mejora la situación, al disminuir en el
cuadrado del radio del capilar la corriente que pasa a través de
él, y al mejorar la disipación del calor generado. La relación
entre gradiente térmico (ÆT), radio del capilar (r), la potencia
disipada (W) y la conductividad térmica (K) se expresa en la
siguiente ecuación:
ÆT= 0.24 El segundo problema, el incremento de la temperatura en
función del tiempo, se debe a la diferencia entre la velocidad de
disipación y de generación del calor. La
variación de la temperatura resultante modifica la viscosidad del
fluido y por consiguiente los factores que determinan el tiempo de
migración de las moléculas. La solución del problema depende tanto
del uso de capilares estrechos como del acoplamiento de sistemas de
enfriamiento, que pueden ser por aire o por líquido. La limitante
en el uso de capilares de pequeño diámetro interno es que al
disminuir este también disminuye el path length y consecuantemente
el límite de detección. La EC, como antes se mencionó, comprende
una familia de técnicas que poseen diferencias dramáticas en cuanto
a operatividad y características de separación. Estas técnicas
son:
a. Electroforesis capilar de zona. b. Enfoque isoeléctrico. c.
Electroforesis capilar en gel. d. Isotacoforesis. e. Cromatografía
capilar miscelar electrocinética.
Dado los objetivos de este trabajo, nos ocuparemos de la
descripción breve de las cuatro primeras técnicas. Electroforesis
capilar de zona: Es la forma más simple de EC, y se le conoce
también como EC de solución libre. El mecanismo de separación es
basado en las diferencias de la relación carga / masa de los
componentes de la muestra. Dos factores, la homogeneidad de la
solución amortiguadora y la constancia de la intensidad del campo
eléctrico son claves para lograr buenos resultados con esta
técnica. Luego de la inyección de la muestra y aplicado el campo
eléctrico, los componentes de la mezcla se separan en zonas
discretas. El parámetro fundamental, µep, puede ser aproximado a
partir de la teoría de Debeye-Hunckel- Henry:
µep= donde q es la carga neta, R es el radio de Stokes, y η es la
viscosidad del medio. La EC de zona es muy útil para el análisis de
mezclas de proteínas, como las proteasas, y péptidos, pues es
posible lograr la completa separación de, por ejemplo, proteínas
que solo difieren en un residuo de aminoácido. Esto puede ser muy
importante en el análisis de los mapas trípticos, haciendo posible
la
¤ Introduction to capillary electrophoresis. (1999) Beckman. ¤ Lux,
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and analytical operation of a modular capillary electrophoresis
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electrolyte chain length
on electroendosmotic flow in high voltage capillary zone
electrophoresis, Anal. Proc. (London) 25, 85.
Sub-Cell® GT Agarose Gel
Catalog Numbers 170-4401 to 170-4406 170-4481 to 170-4486
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U.S. Call 1-800-4BIORAD (1-800-424-6723)
Warranty Bio-Rad Laboratories warrants the Sub-Cell GT, Wide
Mini-Sub® cell GT, and Mini-Sub cell GT
electrophoresis systems against defects in materials and
workmanship for 1 year. If any defects occur in the instrument
during this warranty period, Bio-Rad Laboratories will repair or
replace the defective parts free. The following defects, however,
are specifically excluded:
1. Defects caused by improper operation.
2. Repair or modification done by anyone other than Bio-Rad
Laboratories or an authorized agent.
3. Use of fittings or other spare parts supplied by anyone other
than Bio-Rad Laboratories.
4. Damage caused by accident or misuse.
5. Damage caused by disaster.
6. Corrosion due to use of improper solvent or sample.
This warranty does not apply to parts listed below:
1. Platinum Electrode Wires
To insure the best performance from the Sub-Cell GT electrophoresis
systems, become fully acquainted with these operating instructions
before use. Bio-Rad recommends that you first read these
instructions carefully. Assemble and disassemble the unit
completely without casting a gel. After these preliminary steps,
you should be ready to cast and run a gel.
Bio-Rad also recommends that all Sub-Cell GT system components and
accessories be inspected for damage, cleaned as recommended in this
manual, and rinsed thoroughly with distilled water before
use.
Record the following for your records:
For any inquiry or request for repair service, contact Bio-Rad
Laboratories after confirming the model and serial number of your
instrument.
Model
Section 4 Care and
Maintenance...............................................................................11
4.1 Cleaning Sub-Cell GT Components
........................................................................12
4.2 Compatible Cleaning Agents
...................................................................................12
4.3 Maintenance Schedule
.............................................................................................12
4.4 Electrode
Replacement.............................................................................................13
4.5 RNase Decontamination
..........................................................................................14
Section 1 General Information
1.1 Introduction The Sub-Cell GT instruments (basic Sub-Cell GT
cell, Wide Mini-Sub® cell GT, and Mini-
Sub cell GT) comprise a comprehensive and flexible gel
electrophoresis system that effective- ly separates nucleic acids
using submerged agarose gels. Submarine agarose gels are easy to
cast and readily dissipate heat. These gels allow sample
underlaying and prevent electrical field dis- continuities caused
by wicks or sample well dehydration. Agarose gels are ideal for the
separation of DNA restriction digestions, Polymerase Chain Reaction
(PCR*)-amplified fragments, and genomic DNA and RNA prior to
Southern or northern blotting. If operated correctly, agarose gel
submarine electrophoresis can effectively separate nucleic acids
from 20 base pairs to 20 kilobase pairs in length.
The Sub-Cell GT systems are designed for years of reproducible and
rigorous use. These rugged systems incorporate many features that
make casting and running agarose gels simple and efficient. The gel
caster provides tape-free gel casting in trays. Gels can also be
cast in the GT bases using specially designed wedge gates.
Replaceable electrode cassettes provide a simple way to replace
electrode wires. A comprehensive assortment of base and tray sizes,
including a variety of preparative, analytical, and multichannel
pipet compatible combs, makes these systems ideal for any agarose
gel application.
Note:This manual contains instructions for the Sub-Cell GT
electrophoresis systems only. Prior to the release of the Sub-Cell
GT systems, Bio-Rad supplied similar agarose gel elec- trophoresis
cells: the original Sub-Cell DNA electrophoresis cell, Wide
Mini-Sub cell, and Mini- Sub cell systems. This manual does not
provide information on these earlier versions. Contact your local
Bio-Rad representative for information concerning the original
Sub-Cell systems.
Definition of Symbols
Caution, risk of electrical shock Caution (refer to accompanying
documents)
1.2 Safety The Sub-Cell GT electrophoresis systems are designed for
maximum user safety. The buffer
chambers are made of 3/16 inch (.476 cm) thick injection-molded
acrylic to create a leak-free electrophoresis environment. The
safety lids surround the buffer chamber to protect the user from
exposure to electrical currents. All Sub-Cell GT systems were
designed for indoor use only.
Before use, inspect the GT base for cracks or chips, which may
allow the buffer to leak from the base and cause a potential
electrical hazard. Additionally, inspect all electrical cables,
banana jacks, and plugs for loose connections, cracks, breaks, or
corrosion. Do not use any part that is cracked, charred, or
corroded. These parts may also cause a potential electrical hazard.
Contact your local Bio-Rad representative before using a part that
may be considered hazardous.
During electrophoresis, inspect the base and workbench for any
signs of buffer leakage. If leaking buffer is detected, disconnect
the power to the cell immediately and contact your local Bio-Rad
representative.
!
!
respect to ground. All of Bio-Rad’s power supplies meet this
important safety requirement. The recommended power supply for this
apparatus is the PowerPac 300 power supply. The PowerPac 300 power
supply contains safety features such as no load, overload, rapid
resis- tance change, and ground leak detection capabilities. The
maximum specified operating param- eters for the Sub-Cell GT
systems are given in Table 1.1.
Table 1.1 Sub-Cell GT systems operating parameters Sub-Cell Wide
Mini-Sub Mini-Sub GT Cell Cell GT Cell GT
Maximum voltage limit 200 VDC 150 VDC 150 VDC Maximum power limit
40 Watts 45 Watts 10 Watts Maximum Buffer temperature 40 C 40 C 40
C
Current to the cell, provided from the external power supply,
enters the unit through the lid assembly, providing a safety
interlock. Current to the cell is broken when the lid is removed.
Do not attempt to circumvent this safety interlock, and always turn
the power supply off before removing the lid or when working with
the cell.
Important: These Bio-Rad instruments are certified to meet IEC
1010-1** safety stan- dards. IEC-certified products are safe to use
when operated in accordance with the instruction manual. This
instrument should not be modified in any way. Alteration of this
instrument will:
• Void the manufacturer’s warranty • Void the IEC 1010-1 safety
certification • Create a potential safety hazard
IEC 1010-1 certification applies to equipment designed to be safe
between the operating temperatures of 4 °C and 40 °C and altitudes
up to 2,000 meters. Instruments are also safe at a max- imum
relative humidity of 80% for temperatures up to 31 °C decreasing
linearly to 50 % at 40 °C. Bio-Rad is not responsible for any
injury or damage caused by the use of this instru- ment for
purposes other than those for which it is intended, or by
modifications of the instrument not performed by Bio-Rad or an
authorized agent. No user-serviceable parts are contained in this
apparatus. To insure electrical safety, do not attempt to service
this apparatus.
1.3 System Components Each of the Sub-Cell GT systems comes with
the components listed in Table 1.2 (see
Figure 1.1 for part description). Check your instrument to be sure
all items are present. Note any damage to the unit which may have
occurred during shipping. Notify Bio-Rad Laboratories if any items
are missing or damaged.
Table 1.2 Sub-Cell GT System Components Sub-Cell GT Wide Mini-Sub
Cell Mini-Sub Cell
System GT System GT System Item Quantity Quantity Quantity GT Base
(buffer chamber) 1 1 1 Gel Casting Gates 2 2 2 Safety Lid and
Cables 1 1 1 UVTP Gel Tray 1 1 1 Fixed Position Comb 2 2 2
(15 well, 1.5 mm thick) (15 well, 1.5 mm thick) (8 well, 1.5 mm
thick) (20 well, 1.5 mm thick) (20 well, 1.5 mm thick) (15 well,
1.5 mm thick)
Leveling Bubble 1 1 1 Gel Caster (optional) 1 1 1 Instruction
Manual 1 1 1
2
UVTP gel tray
Gel caster
Cam lever
Fluorescent ruler
Leveling bubble
1.4 Specifications
Sub-Cell GT Wide Mini-Sub Cell Mini-Sub Cell System GT System GT
System
GT base footprint (L x W x H) 42 x 19.5 x 10 cm 26 x 20 x 7.5 cm 26
x 12 x 6.5 cm GT base buffer volume 1,500–2,000 ml 650–900 ml
265–320 ml GT base gel size 15 x 15 cm 15 x 7 cm 7 x 7 cm Gel tray
sizes 15 x 10 cm 15 x 7 cm 7 x 7 cm
15 x 15 cm 15 x 10 cm 7 x 10 cm 15 x 20 cm 15 x 25 cm
Construction GT base Molded clear plastic Gel casting gates
Aluminum Safety lid Molded clear plastic Banana plug/electrode
cassette Molded polycarbonate Banana plugs Gold-plated brass, 4.4
cm length Electrodes Platinum, 0.25 mm diameter Electrical cables
Dual, 20 AWG, tinned copper wire cable
Flame-retardant polyurethane insulation jacket Electrical leads
Nickel silver Gel tray UV-transparent acrylic plastic (UVTP) Combs
Molded plastic and machined acrylic Gel casting device
Polycarbonate
0.64 cm silicon foam
Section 2 Operating Instructions
Note: See Section 3, Gel and Electrophoresis Reagent Preparation,
for information on the preparation of RNA gels. See References 1
and 2 for more information on DNA and RNA electrophoresis.
2.1 DNA Gel Preparation DNA agarose gels can be used to separate
and visualize DNA of various sizes. Before cast-
ing an agarose gel, consult Table 2.1 to determine the appropriate
percent agarose gel to use, based on the size of DNA to be
separated.
Procedure
1. Determine the amount of agarose (grams) required to make the
desired agarose gel con- centration and volume. Use Tables 2.1 and
2.2 as a guide for agarose concentration and gel volume
requirements.
Example: For a 1% agarose gel, add 1 gram of agarose to 100 ml of
1x electrophoresis buffer.
4
GT base buffer volumes will vary depending on the size and
thickness of the gel used.
Table 2.1 Gel Concentration Required for DNA Separation 1-2
Gel Concentration (%) DNA Size (Kb) 0.50 1–30 0.75 0.8–12 1.00
0.5–10 1.25 0.4–7 1.50 0.2–3 2–5* 0.01–0.5
* Sieving agarose such as AmpliSize® agarose
Table 2.2 Gel Volume Requirements Gel Size 0.25 cm thick 0.5 cm
thick 0.75 cm thick 1.0 cm thick Base 7 x 7 cm 10 ml 20 ml 30 ml 40
ml
15 x 7 cm 20 ml 40 ml 60 ml 80 ml 15 x 15 cm 50 ml 100 ml 150 ml
200 ml Tray 7 x 7 cm 10 ml 20 ml 30 ml 40 ml 7 x 10 cm 15 ml 30 ml
45 ml 60 ml
15 x 7 cm 20 ml 40 ml 60 ml 80 ml 15 x 10 cm 30 ml 60 ml 90 ml 120
ml 15 x 15 cm 50 ml 100 ml 150 ml 200 ml 15 x 20 cm 70 ml 140 ml
210 ml 280 ml 15 x 25 cm 90 ml 180 ml 270 ml 360 ml
2. Add the agarose to a suitable container (e.g., 250 ml Erlenmeyer
flask, Wheaton bottle, etc.). Add the appropriate amount of 1x
electrophoresis buffer (see Section 3, Gel and Electrophoresis
Reagent Preparation, for electrophoresis buffer preparation) and
swirl to sus- pend the agarose powder in the buffer. If using an
Erlenmeyer flask, invert a 25 ml Erlenmeyer flask into the open end
of the 250 ml Erlenmeyer flask containing the agarose. The small
flask acts as a reflux chamber, allowing long or vigorous boiling
without much evaporation.
Note: A mark can be put on the lower flask at the same level as the
liquid. If evaporation occurs, water can be added to bring the
liquid back to the original starting level.
3. The agarose can be melted by boiling on a magnetic hot plate
(Step 4a) or in a microwave oven (Step 4b).
Caution: Always wear protective gloves, goggles, and a lab coat
while preparing and cast- ing agarose gels. The vessels containing
hot agarose can cause severe burns if allowed to contact skin.
Additionally, molten agarose can boil over when swirled.
Magnetic Hot Plate Method
4a. Add a stir bar to the undissolved agarose solution. Heat the
solution to boiling while stirring on a magnetic hot plate. Bubbles
or foam should disrupt before rising to the neck of the
flask.
Microwave Oven Method
4b. Place the gel solution into the microwave. Using a low to
medium setting, set the timer for a minimum of 5 minutes, stopping
the microwave oven every 30 seconds and swirling the flask gently
to suspend the undissolved agarose. This technique is the fastest
and safest way to dissolve agarose.
5. Boil and swirl the solution until all of the small translucent
agarose particles are dissolved. With the small flask still in
place, set aside to cool to 60 °C before pouring.
5
2.2 Casting Agarose Gel Slabs There are several ways to cast
agarose submarine gels using the Sub-Cell GT systems.
Gels may be cast with or without a UV-transparent plastic (UVTP)
tray directly on the stage of the Sub-Cell GT bases using the gel
casting gates. Gels may also be cast on the removable UVTP trays
with the aid of the gel caster or with standard laboratory
tape.
Casting gels on the base stages
1. Level the Sub-Cell base using the leveling bubble
provided.
2. Slide the gel casting gates into the slots at opposite ends of
the gel stage.
3. Place the comb(s) into the appropriate slot(s) of the base so
that the sample wells are near the cathode (black). DNA samples
will migrate toward the anode (red) during electrophoresis.
4. Prepare the desired concentration and amount of agarose in 1x
electrophoresis buffer (see Section 2.1). When the agarose solution
has cooled to 50–60 C pour the molten agarose between the
gates.
Warning: Hot agarose (>60 C) may cause the plastic in the cell
to warp or craze and will decrease the lifetime of the Sub-Cell
base. Warping may also result in sample wells of uneven
depth.
5. Allow 20–40 minutes for the gel to solidify at room
temperature.
6. Carefully remove the comb from the solidified gel. Remove the
gel casting gates.
7. Submerge the gel beneath 2 to 6 mm of 1x electrophoresis buffer
(see Section 3, Gel and Electrophoresis Reagent Preparation). Use
greater depth overlay (more buffer) with increasing voltages to
avoid pH and heat effects.
Casting Gels on the Base Stage With UVTP Tray
1. Level the cell using the leveling bubble provided.
2. Place the UVTP tray on the cell base stage.
Note: The Mini-Sub cell GT requires the 7 x 7 cm UVTP tray for
casting in the base. The Wide-Mini-Sub cell GT requires the 15 x 7
cm UVTP tray and the Sub-Cell GT sys- tem requires the 15 x 15 cm
UVTP tray for casting in the base.
3. Slide the gel casting gates into the slots at opposite ends of
the base stage. Insure the gates are evenly seated in the slots and
the gates uniformly contact all edges of the UVTP tray. The weight
of the gates provides a tight seal to prevent any leakage problems
during gel casting.
4. Place the comb(s) into the appropriate slot(s) of the trays so
that the sample wells are near the cathode (black). DNA samples
will migrate toward the anode (red) during electrophoresis.
5. Prepare the desired concentration and amount of agarose in 1x
electrophoresis buffer (see Section 2.1). When the agarose solution
has cooled to 50-60 °C, pour the molten agarose between the
gates.
Warning: Hot agarose (>60 °C) may cause the tray to warp or
craze and will decrease the lifetime of the tray. Warping may also
result in sample wells of uneven depth.
6. Allow 20-40 minutes for the gel to solidify at room
temperature.
7. Carefully remove the comb from the solidified gel. Remove the
gel casting gates.
8. Submerge the gel beneath 2 to 6 mm of 1x electrophoresis buffer
(see Section 3, Gel and Electrophoresis Reagent Preparation). Use
greater depth overlay (more buffer) with increasing voltages to
prevent pH and heat effects.
6
Removable tray (UVTP) gel casting using a Gel Caster or Mini-Gel
Caster
1. Level the Gel Caster or Mini-Gel Caster using the leveling feet
in the gel caster and the leveling bub- ble provided.
2. Disengage and slide the movable wall to the open end of the Gel
Caster or Mini-Gel Caster by turning and lifting the cam peg
upward.
Note: If casting more than one gel with the Gel Caster, add the
removable gel casting wall to the gel caster. The removable wall
will allow casting of two 15 x 10 cm trays, four 7 x10 cm trays or
one 15 x 10 cm and one 15 x15 cm trays.
3. Place the open edge of the UVTP tray against the fixed wall of
the Gel Caster or Mini-Gel Caster.
4. Slide the movable wall against the edge of the UVTP tray (Figure
2.1).
5. To seal the open tray ends, engage the cam peg by turning and
pressing downward simul- taneously.
6. When the cam peg has dropped into the appropriate slot, turn the
peg in either direction until resistance is felt. This action seals
the edges of the tray for casting.
7. Place the comb(s) into the appropriate slot(s) of the
tray.
Fig. 2.1. Sealing the UVTP tray for gel casting.
8. Prepare the desired concentration and amount of agarose in 1x
electrophoresis buffer (see Section 2.1). When the agarose solution
has cooled to 50–60 C pour the molten agarose between the
gates.
Warning: Hot agarose (>60 C) may cause the tray to warp or craze
and will decrease the lifetime of the tray. Warping may also result
in sample wells of uneven depth.
7
Engage and seal (press down and rotate)
Slide forward
Lift cam lever up
9. Allow 20–40 minutes for the gel to solidify at room
temperature.
10. Carefully remove the comb from the solidified gel.
11. Disengage the cam peg by turning and lifting upward. Slide the
movable wall away from the tray. Remove the tray from the Gel
Caster or Mini-Gel Caster.
Note: While the gel is solidifying, a light seal is formed between
the gasket and the gel (especially for low percentage agarose gels
[<0.8%]). Before moving the wall away from the tray, carefully
lift the tray on one side to release the seal or use a spatula to
break the seal between the agarose and gasket.
12. Place the tray onto the leveled Sub-Cell base so that the
sample wells are near the cathode (black). DNA samples will migrate
toward the anode (red) during electrophoresis.
13. Submerge the gel beneath 2 to 6 mm of 1x electrophoresis buffer
(see Section 3, Gel and Electrophoresis Reagent Preparation). Use
greater depth overlay (more buffer) with increasing voltages to
avoid pH and heat effects.
Removable tray (UVTP) gel casting using tape
1. Seal the ends of the UVTP gel tray securely with strips of
standard laboratory tape. Press the tape firmly to the edges of the
gel tray to form a fluid-tight seal.
2. Level the gel tray on a leveling table or workbench using the
leveling bubble provided with the instrument.
3. Prepare the desired concentration and amount of agarose in 1x
electrophoresis buffer (see Section 2.1). When the agarose solution
has cooled to 50–60 C pour the molten agarose into the gel
tray.
Warning: Hot agarose (>60 C) may cause the tray to warp or craze
and will decrease the lifetime of the tray. Warping may also result
in sample wells of uneven depth.
4. Allow 20–40 minutes for the gel to solidify at room
temperature.
5. Carefully remove the comb from the solidified gel.
6. Remove the tape from the edges of the gel tray.
7. Place the tray onto the leveled Sub-Cell base so that the sample
wells are near the cath- ode (black). DNA samples will migrate
toward the anode (red) during electrophoresis.
8. Submerge the gel under 2 to 6 mm buffer (see Section 3, Gel and
Electrophoresis Reagent Preparation). Use greater depth overlay
(more buffer) with increasing voltages to avoid pH and heat
effects.
2.3 Electrophoresis After the agarose gel has solidified, sample
loading and electrophoresis can begin. Agarose
gels can be run in many different types of electrophoresis buffers.
Nucleic acid agarose gel electrophoresis is usually conducted with
either Tris-Acetate-EDTA (TAE) buffer or Tris- Borate-EDTA (TBE)
buffer. While TAE buffer provides faster electrophoretic migration
of linear DNA and better resolution of supercoiled DNA, TBE buffers
have a stronger buffering capacity for longer or higher voltage
electrophoresis runs. Bio-Rad offers premixed 50x TAE and 10x TBE
buffers, as well as individual buffer reagents for use with the
Sub-Cell GT systems.
1. Prepare samples for gel loading. The maximum sample loading
volumes for Bio-Rad’s combs are listed in Section 6.2. Loading
volume is dependent upon the type of comb used (i.e., well
thickness and length) and thickness of the gel.
8
2. When loading volume is determined, add standard nucleic acid
sample loading dye to a final 1x concentration to make samples
dense for underlaying into sample wells (see Section 3, Gel and
Electrophoresis Reagent Preparation, for sample loading dye
preparation).
3. Load the samples into the wells using standard pipets.
Multichannel pipets can be used for loading samples only with the
Bio-Rad MP combs (see Section 6.2).
Note: Sample wells are often difficult to see. Well visualization
can be enhanced by placing black paper or tape under the base or
trays where comb placement or well formation is common.
4. Place the lid on the DNA cell carefully. Do not disturb the
samples. The Sub-Cell GT system lids attach to the base in only one
orientation. To attach the lid correctly, match the red and black
banana jacks on the lid with the red and black banana plugs of the
base.
5. Power requirements vary depending on gel thickness, length and
concentration, and type of electrophoresis buffer used. Refer to
Tables 2.3 and 2.4 for relative sample migration rates and for DNA
size migration with sample loading dyes for the different Sub-Cell
GT systems.
Note: Buffer recirculation is not required for most standard DNA
and RNA agarose gel electrophoresis. If buffer recirculation is
required, simply turn off the power supply, remove the safety lid,
and mix the running buffer as desired. After the buffer has been
mixed, reconnect the safety lid and continue electrophoresis.
Table 2.3 Relative Sample Migration Rates *
Bromophenol Blue Cell Type Voltage Migration Rate Sub-Cell GT cell,
15 x 15 cm gel 75 V 3.0 cm/hr Wide Mini-Sub cell GT, 15 x 10 cm gel
75 V 4.5 cm/hr Mini-Sub cell GT, 7 x 10 cm gel 75 V 4.5 cm/hr *
These sample migration rates were determined based on a 0.5 cm
thick 1.0% agarose gel using Bio-Rad’s Molecular Biology
Certified Agarose in 1x TAE electrophoresis buffer (diluted from
Bio-Rad’s Premixed 50x TAE Buffer). Migration rates will vary
depending on the voltage, current, and type of agarose or buffer
used.
Table 2.4 DNA size migration with sample loading dyes Agarose
Concentration (%) Xylene Cyanol Bromophenol Blue
0.5–1.5 4–5 Kb 400–500 bp 2.0–3.0** 750 bp 100 bp 4.0–5.0** 125 bp
25 bp
** Sieving agarose such as AmpliSize agarose.
2.4 Nucleic Acid Staining and Visualization Gels can be removed
from the base or gel tray for nucleic acid staining. The gel can
also
remain on the UVTP gel tray for staining.
Ethidium Bromide Staining Procedure
1. Place the gel into the appropriate volume of 0.5 µg/ml ethidium
bromide (EtBr) stain for 15–30 minutes. Use enough staining
solution to cover the entire gel.
Caution: Ethidium bromide is a suspected carcinogen and should be
handled with extreme care. Always wear gloves, eye glasses, and a
laboratory coat. Dispose of used EtBr solutions and gels
appropriately (Review EtBr Material Safety Data Sheet [MSDS] for
proper disposal methods).
2. Destain the gel for 10–30 minutes in dH2O using the same volume
used for staining.
Note: Ethidium Bromide can be removed from the DNA with extended
destaining. This will cause lower sensitivity of detection.
However, insufficient destaining will create higher background
fluorescence.
9
3. Rinse the gel briefly with dH2O to remove any residual staining
solution.
4. Place the gel on a UV transilluminator for nucleic acid
visualization and analysis. DNA- Ethidium Bromide complexes may be
illuminated with UV light of 254, 302, or 366 nm. Sensitivity
decreases with illumination at higher wavelengths. However, nicking
of DNA will increase below 302 nm. Table 2.5 gives the percentage
of transmittance of UV light through 1/4” (.64 cm) UV-transparent
plastic.
Note: Nucleic acids in the gel can be visualized through the UVTP
trays. If a UVTP tray is not used, place household plastic wrap
between the UV transilluminator and the gel to avoid contaminating
the transilluminator with nucleic acids or EtBr.
Table 2.5 Percent UV Transmittance through 1/4” (.64 cm) UV
Transparent Plastic (UVTP)
Approximate Wavelength (nm) % Transmittance
254 0 302 80 360 90
5. Photograph the gel using standard cameras and film (e.g.,
Bio-Rad’s Standard Polaroid Gel Documentation System) or with
CCD-based digitized image analysis systems (e.g., Gel Doc™ 1000 UV
fluorescent gel documentation system). Gels are generally pho-
tographed with a yellow, orange, or red interference filter. Red
filters generally give the cleanest background. Bio-Rad offers a
full-line of standard photography and CCD-based imaging systems for
nucleic acid gel analysis.
2.5 Note on Blotting Nucleic acids within the gel can be
transferred to membranes using the techniques of
Southern and Northern blotting. It is beyond the scope of this
instruction manual to include blotting procedures. Consult