Laboratoire de Botanique; Cytologie vegetale, Universite de Nancy I, Nancy Cedex, France

Evolution en culture in vitro des prothalles femelles ages chez Ie Ginkgo biloba L.

In vitro Culture of Female Gametophytes from Ginkgo biloba L.

RENE ROHR

Avec 10 figures

Res:u Ie 11 mai 1977 . Accepte Ie 16 juin 1977

Le gametophyte femelle de Ginkgo biloba L. a etc cultive in vitro en conditions aseptiques. Mis en culture de 4 a 6 mois apres la periode de fecondation, il est encore parfaitement capable de presenter des modifications importantes comme Ie verdissement a la lumiere de tous ses tissus superficiels, la production d'excroissances diverses et dont un type semble deriver du developpement d'initiales d'archegones; en fin, un tissu a pu en hre isole, il continue a s'accroitre apres plusieurs repiquages mensuels. La fecondation et l'embryogenese n'affectent en rien Ie comportement en culture du prothalle.

Summary

The female gametophyte of Ginkgo biloba L. has been cultured in vitro under sterile conditions. In gametophytes set in culture 4 to 6 months after fertilization the superficial tissues turn intensely green and produce a variety of outgrowths. One of them which has never been observed before, seems to be derived from the abnormal development of arch­egonia initial cells. A tissue has been isolated from the gametophyte and subcultured; it continues to grow after several transfers on the same medium.

Key words: female gametophyte, in vitro culture, Ginkgo.

Introduction

Dans les tentatives faites par FAvRE-DucHARTRE (1956) et TULECKE (1964) pour isoler Ie gametophyte femelle du Ginkgo biloba et Ie cultiver, seuls sont utilises des prothalles immatures preleves 11 a 14 semaines apres la pollinisation. Dans ces gametophytes, les archegones n'ont pas encore differencie d'oospheres. FAVRE-

Abreviations: A: Archegone, C: Col d'archegone, C.A: Cellules a amidon, C.M: Colonne micropylaire, E: Embryon, M: Membrane prothallienne.

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DUCHARTRE met en evidence quelques modifications des cellules prothalliennes bordant les archegones et de l'assise marginale de la region interarchegoniale. TULECKE observe des proliferations tissulaires au contact du milieu ainsi que dans la region periarchegoniale et il parvient ales cultiver plus d'un an.

Malheureusement, ces travaux deja anciens n'ont pas ete poursuivis et nos connais­sances actuelles et de la physiologie et de la cytologie de ce type de gametophytes en culture restent tres fragmentaires; en particulier, nous ne savons rien du comporte­ment de prothalles ayant acheve Ie developpement complet de leurs archegones, ni de l'incidence possible de la fecondation sur leur survie.

C'est pourquoi nous avons entrepris de suivre l'evolution en culture aseptique in vitro de gametophytes femelles ~ges de Ginkgo biloba. Ceux-ci sont preleves 4 et 6 mois apres la fecondation, a un stade ou leur unique fonction reste d'apporter au jeune embryon la nourriture necessaire a son developpement.

Materiel et Methodes

Les ovules contenant les prothalles Ont ete recoltes a Nancy de janvier a mars au moment de leur chute de I'arbre. La pollinisation a ete assuree au printemps precedent par deux Ginkgo males situes a proximite immediate de I'arbre femelle.

Nous avons libere les ovules de leur sarcotesta et laves a l'eau et a I'alcool a 800; puis

les prothalles ont ete mis a nu. Seule, 1a fine membrane prothallienne qui les entoure n'a pas ete 8tee. NollS n'avons mis en culture que Ie tiers superieur de chaque prothalle sectionne selon un plan perpendiculaire a son axe.

Le milieu de culture contient au litre: - Les macro-elements, Ie fer et les addenda organiques preconises par BOURGIN et NITSCH (1967). - Les oligo-elements de MURASHIGE et SKOOG (1962) excepte I'iodure de potassium. - 20 g de saccharose.

8 g d'agar.

Fig. 1: Region apicale d'un sommet prothallien apres 48 h de culture: on apers;oit la colonne micropylaire a droite tandis qu'a gauche, un massif de cellules hyalines emerge d'un col archegonial. Ces cellules arrondies et tres turgescentes sont peu dependantes les unes des autres (X35). Fig. 2: Aspect de la m&me region que figure I apres un mois de culture: ici, la colonne micro­pylaire est necrosee, mais I'archegone a produit un massif calloide blanc qui s'eJI:ve au dessus de la surface du prothalle (X 32). Fig. 3: Developpement d'un prothalle presentant trois archegones apres une semaine de culture: I'archegone superieur £econde forme une zone blanchatre (fleche superieure); les deux aut res archegones sont visibles par leur petit col fonce. Remarquer en bas Ie debut de la croissance des tissus qui entourent Ie col archegonial (X 35).

Fig. 4: Vue d'ensemble d'une sommite prothallienne 40 jours apres la mise en culture: l'augmentation du volume prothallien est mis en evidence par la rupture de la membrane du prothalle qui I'entoure. Celle-ci dissimule Ie col de I'un des deux archegones de­gene res cents (fleches). Remarquer les deux masses tissulaires blanchhres de part et d'autre de la colonne sur un axe perpendiculaire a celui des archegones: ils sont constitues de centres de croissance nombreux et ne sont aucunement en relation avec les archegones (X 12).

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- 0.1 mg d'acide indole acthique, 1 mg de 2-4 D (acide 2-4 dichlorophenoxyacetique) et 50 a 100 ml de lait de coco chauffe 3 h a 60 DC; ces derniers elements sont ajoutes apres filtration sur membrane (0.45 micron) au milieu sterilise a l'autoclave.

Le pH final est ajuste a 6 avec la soude. Les cultures sont realisees a 25 DC sous eclairage diffus de 4000 lux 16 h/jour. L'ensemble des cultures a porte sur 200 prothalles embryonnes ou non.

Resultats

En regie generale les prothalles cultives sont Ie siege d'une activite intense qui se traduit par des modifications importantes com parables sur les deux types de prothalles:

- Les sommites prothalliennes comprenant la colonne micropylaire et les cols archegoniaux verdissent intensement; dans 4 a 6 %, des cas, ce verdissement s'etend a la totalite de la region superficielle du prothalle avec une egale intensite.

- Toute la region externe du prothalle augmente de volume et deborde largement sur Ie pourtour de la section en contact avec Ie milieu.

- Des excroissances verdissant secondairement apparaissent partout ou les tis sus superficiels ont ete blesses, particulierement sur les bords de la section.

- Enfin, deux types originaux d'evolution ont ete observes: certains prothalles ont produit des cals blancMtres et friables dont Ie developpement cesse apres 3 semaines a 1 mois de culture; d'autres presentent des excroissances blanchltres a vertes tres compactes autour de la colo nne micropylaire. Ces proliferations ont retenu notre attention, particulierement Ie second type qui n'a jamais ete decrit dans de telles cultures.

1. Les eals blanes

Les archegones, dont Ie nombre varie de deux a quatre sur les prothalles observes s'ouvrent par un orifice tres etroit de part et d'autre de la colonne, qui dans la plupart des cas, ne presente pas d'evolution en culture (Fig. 3, fleches inferieures).

Fig. 5: Section longitudinale d'un sommet prothallien au niveau d'un cal hyalin: Ie cal (W:ches doubles) dont la partie superieure a ete eliminee au cours du traitement, fait partie de l'embryon; son developpement se fait essentiellement vers Ie bas de I'image par un p81e cotyledonaire constitue de petites cellules meristematiques, Remarquer a gauche de la colonne micropylaire Ie 2D archegone non feconde (X 40).

Fig. 6: Section d'une excroissance tissulaire verte: trois massifs cellulaires neoformes (partie superieure) sont produits par les cellules superficielles du prothalle; Ie tissu forme est com­parable, par sa structure, a celui du prothalle. Remarquer un centre meristematique a cellules plus petites (X 40). Fig. 7: Coupe semi-fine d'un centre meristematique de tissu vert: les cellules y sont petites et isodiametriques; elles contiennent un noyau central spherique souvent entoure d'amylo­plastes contenant de volumineux grains d'amidon. Les vacuoles sont de taille moyenne. L'existence de parois cellulaires neoformees montre que Ie centre est Ie siege de divisions cellulaires (neches) (X 600).

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Des la premiere semaine, 30 a 40 °/0 des prothalles sont Ie siege de modifications importantes au niveau du col d'un ou plusieurs archegones. Celui-ci s'elargit con­siderablement (Fig. 3, fleches superieures) et un massif de cellules arrondies en emerge (Fig. 1). Elles sont hyalines, tres turgescentes et independantes les unes des autres. L'accroissement de leur nombre apres quatre semaines de culture donne a cette emergence l'aspect d'un cal blanc de consistance friable et dont la taille depasse 1 mm (Fig. 2).

Vne coupe longitudinale passant par Ie centre d'un tel cal montre qu'il est d'origine embryonnaire (Fig. 5): ce sont les cellules parenchymateuses de la partie superieure du corps embryonnaire qui sont repousses hors du col par suite de leur augmentation de taille et de la poussee exercee par les tissus meristematiques de l'embryon. Ces derniers sont constitues par des cellules de taille reduite, Ie cytoplasme dense et peu vacuolise y entoure un noyau central. Le prothalle est constitue de trois types cel­luI aires differents a ce stade, outre ceux de l'embryon: - les cellules superficielles et celles de la colonne a caractere meristematique; - les cellules a reserves amylacees qui occupent les regions profondes du prothalle a l'exception d'un cylindre situe dans l'axe de l'embryon en dessous de lui (Fig. 5, fleches); - cette troisieme zone est appelee a &tre traversee par l'embryon au cours de son developpement. Les cellules de cette region sont de grande taille et ne contiennent pas d'amidon.

Dans quelques rares cas, de l'ordre de 3 {l/o, nous avons observe a partir de ces prothalles presentant des cals blancs, Ie developpement complet de l'embryon en plantule viable.

2. Les excroissances tissulaires

Des proliferations vertes tres compactes se forment frequemment a partir des assises superficielles de cellules qui bordent exterieurement les cols archegoniaux (Fig. 3, petites fleches). Ces formations particulieres atteignent 2.5 mm de hauteur apres deux mois de culture et finissent par entourer complerement l'orifice archegonial. Sur deux prothalles, nous avons note un developpement d'importance identique de la colonne micropylaire.

Des formations comparables, parfois blancM.tres, tres localisees ont ete observees dans 5 °/0 des cultures a egale distance de la colonne que les archegones, mais sur un axe perpendiculaire au leur (Fig. 4). Elles sont initialement spheriques et pro­duisent secondairement sur leur pourtour des massifs de cellules arrondis (Fig. 8).

Fig. S: Detail d'une excroissance verte sur un prothalle cultive un mois: la membrane pro­thallienne est percee part Ie tissu qui emerge a faible distance de la collonne micropylaire. Celle-ci est aplatie dans l'axe des deux arcMgones (X 32).

Fig. 9: Aspect general d'une culture de trois mois d'un prothalle: la surface, initialement lisse est recouverte entierement par des excroissances vertes arrondies et de taille variee (X2,S). Fig. 10: Vue d'ensemble apres plusieurs repiquages du tissu produit par la region margin ale du prothalle; il forme une masse hyaline friable a croissance lente (X IS).

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En coupe longitudinale, on peut remarquer que ces excroissances sont dues a la proliferation des celIules marginales du prothalIe dans la region interarchegoniale. Les cellules centrales de ces formation rappelIent par leur tailIe et leur forme, celIes des regions profondes du gametophyte (Fig. 6). Sur leur peripherie, ces massifs bourgeonnent au niveau de centres meristematiques (Fig. 6, fleche).

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Chaque centre meristematique est constitue d'un petit nombre de cellules de taille modeste au contour regulier. Elles sont etroitement liees les unes aux autres. Ces centres sont Ie siege de divisions cellulaires, comme I'indique la presence de parois neoformees plus minces que les parois preexistantes (Fig. 7, neches). Le noyau de ces cellules est spherique et occupe une position centrale; il est entoure d'amylo­plastes qui contiennent un ou deux gros grains d'amidon; I'appareil vacuolaire est constitue d'un nombre variable de vacuoles de taille modeste.

Le developpement conjugue de I'ensemble de ces proliferations finit par donner au prothalle une forme tres irreguliere; la surface, initialement lisse est abondamment recouverte d'excroissances vertes de taille variee (Fig. 9).

Ellcs finissent par confluer et forment un tissu compact qui produit a sa peri ph erie des massifs de cellules jeunes hyalines (Fig. 10); ce tissu continue a s'accrol'tre apres plusieurs repiquages mensuels. Nous etudierons ulterieurement I'ultrastructure des cellules qui Ie composent et ses variations en fonction du milieu nutritif.

Discussion et Conclusion

Cette etude revele une activite particuliere en culture in vitro de certaines regions tres localisees du gametophyte femelle de Ginkgo biloba: Ie sommet prothallien et la region marginale du prothalle. II a ete montre par des etudes cytologiques en microscopie photonique (FAVRE-DuCHARTRE, 1956) et electronique (DEXHEIMER, 1973 a, 1973 b) que Ie prothalle mlir est constitue par plusieurs types cellulaires; une carte en a ete etablie, delimitant cinq territoires principaux (DEXHEIMER, 1973 b). Ces auteurs ont montre precisement que les cellules de la colonne et celles de la marge du prothalle sont a caractere meristematique, ce qui est illustrt~ sur la figure 5; il n'est donc pas etonnant que l'activite du prothalle en culture y soit particulierement intense. Toutefois, il est remarquable que Ie caractere meristematique de ces cellules puisse encore se manifester de fa~on si spectaculaire dans nos cultures, plus de six mois apres la fecondation qui n'intervient elle meme quatre mois environ apres la pollinisation.

Cette activite se traduit d'une part par une abondante synthese de chlorophylle dans la colonne qui peut occasionnellement s'etendre avec la meme in ten site a toute la marge; - d'autre part, par des proliferations blanches et vertes qui concernent les unes, les cols archegoniaux, les autres, les tis sus marginaux du gametophyte.

Les emergences blanches que nous avons observees au cours de la premiere semaine de culture ont ete rencontrees sur des gametophytes in situ et attribuees au contrecoup de la croissance de I'embryon au sein du prothalle (FAVRE-DuCHARTRE, 1956). II semble toutefois que leur evolution en culture aille un peu plus loin, puisque in situ, leur volume ne depassc pas celui de la colonne. Dans un cas comme dans I'autre, ces formations constituees de cellules differenciees de I'embryon semblent bien incapables de subir une evolution ulterieure.

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L'origine des excroissances chlorophylliennes est trc~s differente puisqu'elles sont produites par Ie gametophyte lui-m~me. On peut en considerer quatre types qui dif­ferent par leur implantation sur Ie prothalle: - celles, deja signalees par TULECKE

(1956) au contact du milieu et sur Ie bord des archegones; - les deux autres types de proliferation observes dans nos culture a partir de la colonne elle-m~me et Ie regions tres localisees de l'espace interarchegonial. Ces dernieres, tres denses et d'aspect tissulaire n'ont jamais ete observees anterieurement; elles pourraient hre issues de la multiplication de quelques cellules de la marge de l'espace interarche­gonial, dont FAVRE-DuCHARTRE signale l'hypertrophie en culture et qu'il compare a des initiales d'archegones. Nos observations confirment cette hypothese: nous pensons que ces excroissances correspondent au developpement anarchique vers l'exterieur, d'initiales d'archegones, situees sur un axe perpendiculaire a celui des archegones existantes et qui dans Ie conditions naturelles, n'evoluent que rarement en archegones.

Ainsi les cultures que nous avons realisees permettent de reveler des potentia lites de divers types cellulaires du prothalle comme Ie verdissement et la proliferation cellulaire dans des regions tres differentes. Elles sont masquees dans les conditions naturelles et se manifestent en culture avec des prothalles tres .1ges et m~me embryonnes.

Litterature

BOURGIN, J. P., et J. P. NITSCH: Obtention de Nicotiana haploi'des a partir d'etamines cultivees in vitro. Ann. Physiol. veg. 9, 377-382 (1967).

DEXHEIMER, J.: Etude ultrastructurale du gametophyte femelle de Ginkgo biloba. I. Les cellules a reserves. Caryologia suppl. vol. 25, 85-96 (1973 a).

- Etude ultrastructurale du gametophyte femelle de Ginkgo biloba. II. Les cellules du som­met prothallien. Rev. Cyto!' et Bio!. veg. 36, 269-290 (1973 b).

FAVRE-DuCHARTRE M.: Contribution a l'etude de la reproduction chez Ie Ginkgo biloba. Rev. Cytol et Bio!. veg. XVII 1-2, 214 p. (1956).

MURASHIGE, T. et F. SKOOG: A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia plantarum 15, 473-497 (1962).

TULECKE, W.: A haploid tissue culture from the female gametophyte of Ginkgo biloba L. Nature 203,94-95 (1964).

RENE ROHR, Laboratoire de Botanique-Cytologie vegetale, Universite de Nancy I, case officielle 140, F-54037 Nancy Cedex, France.

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