FACULTAD DE FARMACIA
ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN Y EL PATRÓN DE
METILACIÓN DE GENES DEL METABOLISMO ENERGÉTICO
EN MODELOS DIETÉTICOS DE OBESIDAD CON DIFERENTE
DISTRIBUCIÓN DE MACRONUTRIENTES
Almudena Lomba Piquer
Servicio de Publicaciones de la Universidad de Navarra
ISBN 84-8081-099-8
FACULTAD DE FARMACIA
Memoria presentada por Dª Almudena Lomba Piquer para aspirar al grado de Doctor
por la Universidad de Navarra
Almudena Lomba Piquer
El presente trabajo ha sido realizado bajo nuestra dirección en el Departamento de
Ciencias de la Alimentación, Fisiología y Toxicología y autorizamos su presentación
ante el tribunal que lo ha de juzgar.
Pamplona, 8 de junio de 2010
Dr. Fermín I. Milagro Yoldi Dr. J. Alfredo Martínez Hernández
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quiero agradecer a la Universidad de Navarra, a la
Asociación de Amigos de la Universidad de Navarra y a la Fundación IberCaja por su
financiación económica gracias a la cual he podido realizar durante estos años mi
proyecto de investigación.
Dedico un agradecimiento especial al Departamento que me acogió y en el
que me he formado: el Departamento de Ciencias de la Alimentación, Fisiología y
Toxicología. Cuando empecé esta aventura era el Departamento de Fisiología y
Nutrición, más pequeño que el Departamento actual, que además de haber
cambiado de nombre y haberse unificado con bromatología y toxicología, ha
crecido considerablemente en relación al número de personas que lo forman. A
todas ellas muchas gracias por el apoyo, interés, consejo y ayuda que me han
dedicado. Me gustaría dedicar un reconocimiento especial a mis directores de tesis
Fermín Milagro y J.Alfredo Martínez, por brindarme la oportunidad de conocer de
cerca el apasionante mundo de la investigación y de formar parte de él durante mi
aprendizaje en el Departamento. Particularmente querría destacar y agradecer la
dedicación de Fermín y su cercanía y accesibilidad, así como el continuo seguimiento
de mi trabajo.
Todavía me parece extraño que este momento haya llegado para mí. Parece
que fue ayer cuando llegué al Departamento que ha sido mi casa durante estos 4
años que han pasado mucho mas rápido de lo que nunca hubiera imaginado. Sin
embargo, antes de que esta etapa termine me gustaría dedicar unas palabras a las
personas que han compartido de cerca estos años conmigo: a mis compañeros y
amigos del “Depar”. En primer lugar quisiera recordar a las 2 últimas personas que
defendieron la tesis y con las que tuve la oportunidad de compartir muchas
experiencias: mis amigas Blanca y Cris. Muchas gracias a las 2 por todos los
momentos vividos y el apoyo que supone tener cerca a 2 personas más veteranas
que siempre me han ayudado y que, de no haber sido por nuestro paso por el
“Depar” no hubiera conocido. Cris, muchas gracias también en esta etapa final de
la tesis: qué hubiera hecho yo sin tus explicaciones sobre los estilos del Word! Has
sido en esto y en otras cosas como una “pequeña censora”.
También recuerdo con cariño a Ana “la de Bioquímica” porque en mis
primeros meses en el Departamento fue mi maestra, la persona con la que aprendí
las primeras técnicas de laboratorio y me acogió como si me conociera de siempre.
Gracias Anita y espero que tengas mucha suerte en el nuevo proyecto en el que
estás inmersa. Ánimo!
Ahora quiero recordar a mis 2 “compañeros de fatigas”, a Helen y Diego,
que se encuentran en las mismas circunstancias que yo, muy próximos a defender
sus tesis. Helen gracias por tu ayuda, por estar pendiente de mis avances y por tu
saber estar. Diego, gracias porque desde el principio de mis andanzas por el
Departamento siempre estuviste dispuesto a tenderme una mano y a ayudarme,
en los momentos buenos y en los menos buenos. Gracias por tu paciencia y
disponibilidad. Llegarás lejos.
También quiero tener ahora un recuerdo muy especial para Bea, Adri y
Laurilla que son mis 3 amigas que me precederán y para las que en poco tiempo
comenzará la cuenta atrás. Bea, vales mucho y pase lo que pase siempre tienes un
buen gesto y una sonrisa, lo cual es digno de valorar y agradecer. Adri, en la
mayoría de buenos recuerdos que me llevo del “Depar”, siempre estás tú, valoro
mucho tu optimismo, compañerismo, buen humor y amistad. Laurilla, no tengo
palabras para agradecerte todo lo que has cuidado a tu compañera de sitio, me has
prestado ayuda incondicional y había momentos en los que incluso has detenido tu
trabajo para agilizar el mío. No olvido tu ayuda con el EndNote y tu “no te
preocupes” cuando me agobiaba al darme cuenta que me estabas dedicando algo
más que un cuarto de hora. Gracias por tu disponibilidad, paciencia y generosidad.
A Itzi, por su ayuda y por estar ahí siempre que la he necesitado. A Pedro
González‐Muniesa, con quien solo he tenido la oportunidad de coincidir éste año.
Tu presencia ha sido muy favorable para la armonía del grupo y aunque he
coincidido poco contigo siempre tienes algo agradable que decir y estás muy
pendiente de todo el mundo. Gracias.
A Santi por su simpatía y su cercanía. No llevas mucho tiempo en el “Depar”
pero te hiciste un hueco entre nosotros con gran facilidad. Gracias por tu
amabilidad.
Agradezco también al resto de mis compañeros, Tara, Ceci, Rocío, Pablo,
Paúl, Pedro Prieto, María, Marta, Noe, Mentx, Jonay, Carlos, José Antonio, Ana,
Pilar, Lorena. Aprovechad mucho el tiempo y disfrutad de estos años porque pasan
volando. Ana Laura, gracias por tu apoyo, por aportarme una visión siempre
positiva de los acontecimientos y por tu eterna sonrisa. “Ido” gracias por animarme
desde la distancia.
Gracias también a las técnicos Ana, Vero y Asun y a las secretarias del
Departamento Paula y Bea por su ayuda y su disponibilidad. Asun, ha sido genial
coincidir contigo todos los martes y jueves antes de inglés.
Agradezco a todas aquellas personas con las que he coincidido y que, de un
modo u otro, han participado en esta fase de mi vida.
Quiero ahora recordar a mi amiga de la carrera Melania que siempre ha
seguido mis pasos muy de cerca y no ha dejado de estar pendiente de mí desde
hace 12 años. Gracias por tu lealtad y tu amistad. Mucho ánimo, dentro de poco
serás tu la que estés escribiendo los agradecimientos de tu tesis.
A mi incondicional amiga Ame que desde que empecé esta etapa siempre
ha estado apoyándome y sabe de mi evolución y mis publicaciones casi más que yo
misma. Gracias por tus continuos e‐mails de ánimo y apoyo y por estar siempre
dispuesta a escucharme. Gracias por tu amistad.
A mis compañeras de piso de mi etapa de doctorado Amparo, Maca y
Gracia. Me habéis ayudado mucho en bastantes aspectos pero sobretodo a crecer
como persona. Doy gracias a Dios de que hallamos podido compartir tantos
momentos juntas y sé que nunca dejaré de contar con vuestra amistad.
A mis padres que siempre me han apoyado en todo, en concreto a mi
madre que siempre está dispuesta a escuchar mis rollos aunque no sepa de qué le
hablo. Mamá y Papá, GRACIAS.
A mis hermanos Miguel y Mar (y Alfonso, que eres como mi hermano
también). Sois los mejores y cada uno a su manera me apoya. Muchas gracias.
A Miguelito, mi sobrino preferido, por alegrarme éste último año de tesis
aunque él no haya sido consciente de ello. Eres un cielo.
Por último quiero dar las gracias a Edu, mi marido, por su alegría, su
paciencia, su optimismo, su serenidad y su sentido común. Porque tú eres el que
ha vivido ésto más de cerca y has sabido comprenderme y apoyarme en cada
momento según correspondía. GRACIAS.
Me alegra darme cuenta que, además de una tesis, me llevo de estos cuatro
años un montón de amigos y de gente que me ha demostrado muchas cosas y han
sido mi gran apoyo. Sin vosotros no hubiera llegado al final.
Esta tesis está dedicada a todos vosotros.
“Lo extraordinario es imposible para los que miden sus dificultades, imaginando que lo que no ha sucedido no puede suceder”
(William Shakespeare)
A Dios
A mis padres
A Miguel, Mar y Alfonso
A Miguelito
A Edu
“La doctrina del hombre se prueba por su paciencia”
(Pr, 19, 11)
ÍNDICE
Índice
‐14‐
ÍNDICE ................................................................................................... 13
ABREVIATURAS ..................................................................................... 16
INTRODUCCIÓN ..................................................................................... 19
1. OBESIDAD ........................................................................................................... 20
1.1. Definición, prevalencia e importancia en salud pública ............................. 20
1.2. Causas ......................................................................................................... 23
1.3. Complicaciones asociadas .......................................................................... 24
2. HÁBITOS DIETÉTICOS Y OBESIDAD ..................................................................... 29
2.1. Distribución de macronutrientes ............................................................... 29
2.2. Tipos de dietas ............................................................................................ 30
3. MODELOS DE ESTUDIO ....................................................................................... 35
4. EPIGENÉTICA ....................................................................................................... 39
4.1. Definición y clasificación de los procesos epigenéticos ............................. 39
4.2. Influencia de la dieta en los procesos de metilación del ADN ................... 44
4.3. La Epigenética como herramienta para el estudio de la susceptibilidad a
desarrollar trastornos metabólicos ........................................................................ 49
OBJETIVOS ............................................................................................ 53
DISEÑO EXPERIMENTAL Y METODOLOGÍA ............................................. 56
1. DISEÑO EXPERIMENTAL GENERAL ...................................................................... 57
2. REQUERIMIENTOS ÉTICOS .................................................................................. 57
3. ANIMALES Y DIETAS ............................................................................................ 59
4. DETERMINACIONES IN VIVO ............................................................................... 61
4.1. Calorimetría indirecta ................................................................................. 61
4.2. Test de sobrecarga intraperitoneal de glucosa .......................................... 62
5. DETERMINACIONES SEROLÓGICAS..................................................................... 63
6. DETERMINACIONES HEPÁTICAS ......................................................................... 64
7. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA ................................................................... 64
8. ESTUDIOS DEL PATRÓN DE METILACIÓN DEL ADN: TECNOLOGÍA MASSARRAY‐
SEQUENOM ................................................................................................................ 69
9. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS DATOS ..................................................... 71
Índice
‐15‐
RESULTADOS ...................................................................................... .. 72
DISCUSIÓN GENERAL ............................................................................. 97
1. CONSIDERACIONES GENERALES ......................................................................... 98
2. VALORACIÓN DE LOS EFECTOS DE LAS DIFERENTES DIETAS ISOCALÓRICAS
SOBRE EL PESO CORPORAL Y EL METABOLISMO ENERGÉTICO .................................. 99
3. ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN GÉNICA Y METILACIÓN DEL ADN EN GENES CLAVE
DEL METABOLISMO LIPÍDICO Y GLUCÍDICO ............................................................. 108
CONCLUSIONES ................................................................................... 116
BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................... 119
ANEXOS ............................................................................................... 153
ABREVIATURAS
Abreviaturas
‐17‐
ADN ó DNA: Ácido desoxirribonucléico
ARN ó RNA: Ácido ribonucléico
C: Dieta control
Ct: “Threshold cycle”
DM2: Diabetes mellitus tipo 2
ECV: Enfermedad cardiovascular
EE: Gasto energético
ELISA: Enzimainmunoensayo
FAS: Ácido graso sintasa
FFA: Ácidos grasos libres
GAPDH: Gliceraldehído ‐3‐ fosfato deshidrogenasa
GCK: Glucokinasa
HADHB: Hidroxiacil‐ CoA deshidrogenasa
HATs: Histonas acetiltransferasas
HDACs: Histonas desacetilasas
HDL: Lipoproteínas de alta densidad
HFD: Dieta “high fat diet”
HFS: Dieta “high fat sucrose”
HOMA‐IR: “Homeostatic model assessment index”
HS: Dieta “high sucrose”
IFN‐ gamma: Interferón gamma
IL‐4: Interleuquina 4
IL‐6: Interleuquina 6
IMC: Índice de masa corporal
Kcal: Kilocalorías
MDA: Malondialdehído
Abreviaturas
‐18‐
MnSOD: Manganeso superóxido dismutasa humana
NAFLD: Hígado graso no alcohólico
NDUFB6: NADH deshidrogenasa (ubiquinona) 1‐ beta subcomplejo 6
OXPHOS: Fosforilación oxidativa
RP: Tejido adiposo retroperitoneal
RQ: Cociente respiratorio
RT‐ PCR: Reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real
SAH: S‐ adenosil‐L‐ homocisteína
SAM: S‐ adenosil‐L‐ metionina
SC: Tejido adiposo subcutáneo
TBARS: “Thiobarbituric acid‐reactive substance”
TG: Triglicéridos
TNF‐ alfa: Factor de necrosis tumoral alfa
WAT: Tejido adiposo blanco
INTRODUCCIÓN
Introducción
‐20‐
1. OBESIDAD
1.1. Definición, prevalencia e importancia en salud pública
La obesidad se define como una enfermedad crónica multifactorial
caracterizada por un aumento de la masa grasa, y por lo tanto del peso corporal,
como consecuencia de un balance energético positivo mantenido en el tiempo
(Salas‐Salvado y cols., 2007). Esta ganancia de peso supone normalmente un
aumento de las reservas del organismo en forma de grasa en relación con el
promedio normal para la edad, sexo, talla y complexión (Damcott y cols., 2003);
(Moreno‐Aliaga y cols., 2005). Actualmente se considera la obesidad como una de
las alteraciones metabólicas de mayor repercusión no sólo desde el punto de vista
sanitario, sino también desde ámbitos psicológicos, sociales y económicos
(Friedman y Fanning, 2004). Este fenómeno, de naturaleza epidémica, se debe en
gran medida a los cambios ambientales y sociales que han tenido lugar en las
últimas décadas (Martinez, 2000) y que han interaccionado con una determinada
predisposición génica (Marti y cols., 2008; Martinez y cols., 2007).
Actualmente, este trastorno se ha convertido en una pandemia, con
creciente prevalencia (Martinez y cols., 2004), que supone una grave amenaza para
la salud pública, debido al riesgo a desarrollar enfermedades asociadas como la
diabetes, hipertensión, alteraciones inflamatorias, aumento del riesgo de padecer
cáncer, insuficiencia respiratoria y osteoartritis, entre otras (Salas‐Salvado y cols.,
2007), y por el elevado coste sanitario que se deriva de las mismas (Ballesta y cols.,
2006).
La organización mundial de la salud (OMS) estima que más de mil millones
de adultos en todo el mundo tiene sobrepeso, de los cuales 300 millones son
clínicamente obesos, siendo particularmente alarmante el marcado incremento en
la edad infantil (WHO/OMS, 2003). Las tasas de obesidad, del orden del 15% en
Europa (Lobstein y Frelut, 2003) y superiores al 30% en Norteamérica (WHO/OMS,
2003), justifican los esfuerzos de la comunidad científica para investigar las causas
de esta enfermedad, entre las que se encuentran componentes genéticos y
Introducción
‐21‐
endocrinos junto con factores ambientales: inadecuados hábitos dietéticos y
modelos sedentarios de actividad física (Moreno‐Aliaga y cols., 2005).
El grado de obesidad en adultos se establece preferentemente con relación
al índice de masa corporal (IMC) resultado de la división del peso corporal (kg)
entre el cuadrado de la talla (m2). Aunque el IMC no es aplicable como indicador de
adiposidad en ciertos casos, como deportistas, mujeres gestantes y ancianos, es el
índice utilizado por la mayoría de los estudios epidemiológicos y organizaciones de
salud internacionales para el uso clínico dada su reproductividad, facilidad de
utilización y capacidad de reflejar la adiposidad en la mayoría de la población
(Salas‐Salvado y cols., 2007).
Tabla 1. Clasificación del índice de masa corporal (IMC) según los últimos criterios de la Sociedad Española para el Estudio de la Obesidad (Salas‐Salvadó y cols., 2007).
Los datos actuales revelan que la tasa de obesidad en España se aproxima al
15,5%, siendo más elevada a partir de los 45 años, en el colectivo femenino y en las
personas con menor nivel de instrucción (Salas‐Salvado y cols., 2007). A su vez, la
prevalencia de sobrepeso se estima en un 39,2%, siendo más elevada en el
colectivo masculino. En conjunto, el exceso ponderal se estima que afecta al 54,7%
de la población española entre 25 y 64 años (Salas‐Salvado y cols., 2007). Estas
tasas son especialmente preocupantes en la población infantil y juvenil (entre 2 a
24 años) que se sitúa actualmente en un 26,3% de sobrepeso y obesidad (Aranceta‐
Valores límite
CATEGORÍA del IMC (kg/m2)
Peso insuficiente < 18,5
Normopeso 18,5‐24,9
Sobrepeso grado I 25‐26,9
Sobrepeso grado II (pre‐obesidad) 27‐29,9
Obesidad tipo I 30‐34,9
Obesidad tipo II 35‐39,9
Obesidad tipo III (mórbida) 40‐49,9
Obesidad tipo IV (extrema) > 50
Valores límite
CATEGORÍA del IMC (kg/m2)
Peso insuficiente < 18,5
Normopeso 18,5‐24,9
Sobrepeso grado I 25‐26,9
Sobrepeso grado II (pre‐obesidad) 27‐29,9
Obesidad tipo I 30‐34,9
Obesidad tipo II 35‐39,9
Obesidad tipo III (mórbida) 40‐49,9
Obesidad tipo IV (extrema) > 50
Introducción
‐22‐
Bartrina y cols., 2005). Datos preliminares del estudio DRECE (Dieta y Riesgo de
Enfermedades Cardiovasculares en España) muestran que en 14 años se ha
producido un incremento del 34,5% en la prevalencia de personas con exceso de
peso corporal (Gutierrez‐Fisac y cols., 2004).
Figura 1. Distribución de la prevalencia de obesidad en España (%) por áreas geográficas y sexo. Estudio DORICA “Dieta y Riesgo Cardiovasculares en España” (2005).
Los estudios que analizan el impacto económico de la obesidad sobre el
gasto sanitario, incluyendo el coste directo de su tratamiento, así como los gastos
indirectos que ocasiona, coinciden en atribuir porcentajes muy importantes (entre
el 2 y 7%) del presupuesto sanitario en diferentes países (Ballesta y cols., 2006). El
coste económico que implica la obesidad en España, según el estudio Delphi, se ha
estimado en unos 2.500 millones de euros anuales, lo que supone casi un 7% del
coste sanitario total (Gonzalez‐Zapata y cols., 2007).
Introducción
‐23‐
1.2. Causas
Las causas de la obesidad se basan en el desequilibrio producido en la
ecuación que comprende tanto a la ingesta de energía como a la energía que es
liberada por el organismo en favor de la primera variable. Este exceso de energía se
acumula en las células grasas del tejido adiposo que, debido a este fenómeno,
aumentan su volumen tanto de forma hipertrófica (aumento de tamaño) como
hiperplásicamente (aumento de número de células) (Bray, 2004a). El depósito
excesivo de lípidos conduce a diversos problemas clínicos relacionados con la
obesidad, ya sea directamente por la grasa extra acumulada o debido al aumento
de secreción de ácidos grasos libres y de diversos péptidos, que pueden
determinan el establecimiento de un estado pro‐inflamatorio que puede ser
dañino para las células de este tejido y que puede ser un factor determinante en el
establecimiento de obesidad y de sus patologías relacionadas (Bray 2004a).
Existen diversos factores que influyen en el exceso de peso y en el
subsiguiente establecimiento de la obesidad. Además, estos factores determinan
las diferencias que se presentan en la prevalencia de obesidad entre los distintos
países alrededor del mundo (Seidell, 1995). Estos factores son de tipo:
Demográfico: la edad y la etnia.
Sociocultural: el nivel de educación (la población con niveles de educación
más bajos presentan mayor prevalencia de obesidad), el nivel económico o la
profesión (la obesidad se relaciona con los estratos de ingresos más bajos) y el
estado civil (después del matrimonio suele aumentar el sobrepeso)
Biológico: el número de hijos se relaciona con mayor sobrepeso.
Conductual y ambiental: la nutrición (grasa de la dieta), el tabaco (al
abandonarlo se suele aumentar de peso), el alcohol (un elevado consumo de
bebidas alcohólicas se relaciona con un aumento del IMC) y por supuesto la
Introducción
‐24‐
actividad física (las personas físicamente más activas tienden a ser más delgadas
que aquellas que optan por el sedentarismo).
Otro de los factores que pueden determinar tanto la presencia de obesidad
como la distribución de los tejidos grasos entre las distintas partes del organismo
corresponde a la genética. Este hecho es más evidente a partir de estudios
familiares, de gemelos y de adopción (Calle y Thun, 2004). A partir de estas
investigaciones se ha estimado que entre el 40 y el 70% de los casos de sobrepeso
se encuentran relacionados con factores hereditarios (Comuzzie, 2002).
Sin embargo, los factores genéticos por sí solos no pueden determinar con
total seguridad la presencia de obesidad. Es necesario que estos factores se
asocien a factores sociales/ambientales, especialmente a aquellos relacionados con
una mayor disponibilidad de comidas densas calóricamente y a un estilo de vida
que cada vez facilite más la inactividad física. Es decir, los factores genéticos
predisponen a la enfermedad, pero son los factores ambientales los que potencian
y determinan su efecto final sobre el metabolismo (Marti y cols., 2008).
1.3. Complicaciones asociadas
El exceso de este tejido adiposo se acompaña de un aumento dramático en
el desarrollo de insulino‐resistencia y diabetes tipo 2, así como también de
dislipidemia, hipertensión, y de enfermedades cardiovasculares (Glass y Witztum,
2001). En términos generales, las patologías implicadas con la obesidad se pueden
clasificar a grandes rasgos dentro de dos categorías: las que son consecuencia
directa del aumento de la masa de tejido graso y aquellas enfermedades que están
relacionadas con los cambios metabólicos producidos debido al exceso de grasa
(Figura 2).
Introducción
‐25‐
Figura 2. Los problemas de salud asociados a la obesidad pueden ser atribuidos tanto al incremento de tamaño de las células de grasa o al incremento en la masa total del tejido adiposo. ECV, enfermedad cardiovascular; DM2, diabetes mellitus tipo 2; NAFLD, enfermedad del hígado graso no alcohólico (modificado de Bray, 2004a).
De esta forma, dentro de las que son consecuencia directa del aumento de
grasa se incluyen:
a) Estigma social: el sobrepeso se encuentra altamente estigmatizado en la
sociedad (Gortmaker y cols., 1993), lo que hace que los individuos que padecen
obesidad se encuentren expuestos a múltiples consecuencias psicológicas debido a
al rechazo social.
b) Apnea del sueño: en sujetos obesos se han observado alteraciones en
las funciones pulmonares debido a la disminución del volumen de los pulmones
provocada por la elevación de la presión producida en el diafragma debido al
aumento de la masa de tejido graso. En algunos casos, el sobrepeso asociado a la
apnea del sueño puede convertirse en un trauma bastante serio para la salud
(Poulain y cols., 2006)
Introducción
‐26‐
c) Osteoartritis: la obesidad aumenta considerablemente la presencia de
esta anomalía. El desarrollo de esta enfermedad se traduce en un aumento
considerable en el coste económico que conlleva la obesidad (Felson, 1992).
Dentro de los desordenes metabólicos derivados del exceso de grasa en el
organismo se destacan: la insulino‐resistencia, la diabetes mellitus tipo 2 (DM2) y el
síndrome metabólico, la enfermedad del hígado graso no‐alcohólico (NAFLD) y la
esteatohepatitis no‐alcohólica, la colelitiasis, la hipertensión y enfermedad
cardiovascular (ECV), cáncer y cambios endocrinos:
a) DM2, insulino‐resistencia y síndrome metabólico: la DM2 se encuentra
altamente relacionada a la presencia de sobrepeso tanto en mujeres como en
hombres y además en todos los grupos étnicos. El riesgo de padecer diabetes
aumenta considerablemente con el grado y duración del sobrepeso, sobretodo si la
acumulación de grasa es de tipo visceral. La presencia de la insulino‐resistencia
esta relacionada con la presencia de obesidad, y se ha observado que valores altos
de IMC se correlacionan con una alta secreción de insulina. Además esta insulino‐
resistencia es uno de los indicadores por excelencia del síndrome metabólico (Chan
y cols., 1994; Colditz y cols., 1995). El síndrome metabólico es el resultado de una
combinación de factores genéticos y ambientales asociados al estilo de vida, en los
que la obesidad visceral y la resistencia a insulina se consideran los componentes
patogénicos fundamentales. Está relacionado con un incremento significativo del
riesgo de diabetes, enfermedad coronaria y enfermedad cerebrovascular , con
aumento del riesgo de mortalidad (DeFronzo y Ferrannini, 1991). Existen diversas
definiciones del síndrome metabólico establecidas por diversos organismos: World
Health Organization, Internacional Diabetes Federation, European Group for the
Study of Insulin Resistance, American College of Endocrinology (Day, 2007) entre
las que cabe destacar la plasmada en el tercer informe del National Cholesterol
Education Program Expert Panel of Detection, Evaluation and Treatment of High
Blood Cholesterol in Adults (ATP III) (Grundy y cols., 2004). Según el criterio del ATP
III, el síndrome metabólico para ser considerado como tal debe cumplir 3 o más de
los siguientes factores:
Introducción
‐27‐
Obesidad central, definida por una medición del perímetro de la cintura: ≥ 102 cm
en varones y ≥ 88 cm en mujeres.
Aumento de los triglicéridos: ≥ 150 mg/dL (1,7 mmol/L).
cHDL (colesterol unido a proteínas de alta densidad) reducido: < 40mg/dL
(1,03mmol/L) en varones, <50 mg/dL (1,3 mmol/L) en mujeres.
Aumento de la presión arterial: sistólica ≥ 130 y/o diastólica ≥ 85 mmHg, o toma de
tratamiento antihipertensivo.
Aumento de la glucosa plasmática en ayuno: glucemia ≥100 mg/L (5,6 mmol/L).
b) Hígado graso no‐alcohólico (NAFLD) y esteatohepatitis no‐alcohólica: el
hígado graso se define como un conjunto de anomalías desarrolladas en este
órgano y que están altamente asociadas a la obesidad. El sobrepeso se ha
relacionado con una prevalencia de 75% de esteatosis, 20% de esteatohepatitis y
un 2% de cirrosis en un estudio llevado a cabo en pacientes del norte de Italia
(Bellentani y cols., 2000).
c) Colelitiasis: tanto la hiperinsulinemia, la dislipidemia como la obesidad
son factores de riesgo conocidos para el desarrollo de esta patología hepatobiliar
(Boland y cols., 2002). Este aumento en el riesgo se puede explicar por el aumento
del colesterol, cuya producción es directamente proporcional a la cantidad de
grasa extra del cuerpo, y además por el aumento de grasa en el hígado, ligado a la
obesidad (Bray, 2004a).
d) Hipertensión: la obesidad, y en particular la obesidad de tipo central o
visceral, ha sido consistentemente asociada a hipertensión y a riesgo
cardiovascular. Según estudios poblacionales, al menos dos tercios de la
prevalencia de hipertensión está ligada directamente a la obesidad (Krauss y cols.,
1998).
e) ECV: el aumento en el peso corporal se ha asociado con numerosas
anormalidades cardíacas. Por ejemplo, el riesgo en mujeres de Estados Unidos a
desarrollar una enfermedad coronaria se encuentra aumentado 3,3 veces en
aquellas que presentan un IMC mayor a 29 Kg/m2 al compararlas con mujeres con
un IMC menor a 21 Kg/m2 (Manson y cols., 1995).
Introducción
‐28‐
f) Cáncer: se ha observado que personas que presentan sobrepeso son
más susceptibles a desarrollar ciertos tipos de cáncer, como los de tipo colorrectal,
de mama, endometrio, hígado, esófago, próstata, entre otros (Calle y Thun, 2004).
g) Cambios endocrinos: los cambios en el sistema reproductor son los más
importantes que se encuentran relacionados con el sobrepeso (Metwally y cols.,
2008).
A nivel hematológico, en pacientes obesos se ha observado un aumento de
los niveles circulantes del factor activador del plasminógeno (PAI‐1), así como en
pacientes con diabetes tipo II. Cuanto más graves son las manifestaciones del
síndrome metabólico, más alto es el nivel plasmático de PAI‐1 (Juhan‐Vague y cols.,
2003). El síndrome metabólico explica una parte importante del nivel de variación
plasmática de PAI‐1, siendo esta relación más fuerte en hombres que en mujeres
(45% vs. 26%) (Henry y cols., 1998). Estudios de intervención sugieren que si se
mejora la resistencia a la insulina, el disminuyen los niveles plasmáticos de PAI‐1.
Se ha propuesto tomar en consideración el aumento de los niveles de PAI‐1 como
un componente real del síndrome metabólico (Juhan‐Vague y cols., 1991).
Además, la obesidad se ha asociado con un estado pro‐inflamatorio y de
estrés oxidativo, debido a la liberación de citoquinas características de inflamación
(como IL‐6 y TNF‐alfa secretadas por los macrófagos que migran al tejido adiposo
en la adipogénesis) y la formación de especies reactivas de oxígeno como
consecuencia de la disfunción mitocondrial presentada en personas obesas. En los
seres humanos, se han detectado citoquinas proinflamatorias circulantes en
individuos obesos, lo que sugiere un estado de desregulación de la respuesta
inflamatoria. En modelos animales, tanto en estudios genéticos como en obesidad
inducida por la dieta, este trastorno aparece asociado con la disfunción inmune
(Lamas y cols., 2004; Mancuso y cols., 2006). In vitro, la secreción de citoquinas
inflamatorias como la IL‐4 e IFN‐gamma se encontró deteriorada (Mito y cols.,
2000). Estos hechos a su vez dan pie para el desarrollo de muchas de las secuelas
metabólicas negativas de la enfermedad, como la resistencia a la insulina o la
arteriosclerosis (Greenberg y Obin, 2006). Estos fenómenos también completan el
Introducción
‐29‐
círculo vicioso en el cual este estado pro‐inflamatorio actúa sobre los mismo
adipocitos, modificando su señalización e induciendo nuevos procesos
proadipogénicos con características patogénicas (Galinier y cols., 2006).
2. HÁBITOS DIETÉTICOS Y OBESIDAD
2.1. Distribución de macronutrientes
La alta disponibilidad de alimentos, el aumento de la densidad energética
de los mismos y la disminución de la actividad física, son factores que están
contribuyendo en gran medida al aumento del peso corporal (Goris y Westerterp,
2008). Así, la alimentación desempeña un papel clave en la génesis de la obesidad y,
por tanto, su modificación va a ser fundamental en la prevención y tratamiento del
sobrepeso, obesidad (Bray y cols., 2004b), y síndrome metabólico (Muzio y cols.,
2007).
En relación a los estudios de la distribución de macronutrientes en las dietas,
inicialmente se hipotetizó que la alta ingesta de grasa era la causante exclusiva del
aumento en la prevalencia de la obesidad, lo que llevó al establecimiento de dietas
hipocalóricas mediante la disminución de la ingesta lipídica. Sin embargo, diversos
estudios demostraron que a pesar de haber disminuido la grasa de la dieta y por
tanto la ingesta calórica total, los índices de obesidad continuaban aumentando
(Best y Grainger, 2007). Así se demostró que aquellas dietas con menor contenido
en grasa producían modestas pérdidas de peso a corto plazo pero difícilmente
sostenibles a lo largo del tiempo (Abete y cols., 2006). Posteriormente, las
investigaciones se centraron en el contenido en hidratos de carbono de las dietas.
Al reducir el contenido lipídico aumentaba la ingesta de hidratos de carbono, los
cuales parecían ser los responsables de los desequilibrios hormonales (elevados
niveles de insulina) que conducían a una ingesta continuada, dificultando la
adherencia a la dieta. Así, la restricción de la ingesta de los hidratos de carbono se
estableció como una nueva estrategia nutricional para el control de la obesidad
Introducción
‐30‐
(Malik y Hu, 2007). Este tipo de dietas parecían mejorar la pérdida de peso y ciertas
variables metabólicas comparadas con las de alto contenido en carbohidratos, sin
embargo tampoco aseguraban el mantenimiento del peso perdido a largo plazo.
Por otro lado, se demostró que ciertos alimentos o sustancias presentes en
los mismos, podrían influir específicamente en el tratamiento y prevención de la
obesidad (Abete y cols., 2008). Por este motivo, numerosas investigaciones tratan
de determinar la influencia específica de los diferentes macro y micronutrientes
presentes en los alimentos sobre la regulación del peso corporal. Así, no sólo se
tiene en cuenta la distribución de los hidratos de carbono, lípidos y proteínas, sino
el tipo de restricción energética (Abete y cols., 2010).
2.2. Tipos de dietas
2.2.1 Dietas con alto contenido en grasa
Estas dietas suelen ser denominadas “dietas con bajo contenido en hidratos
de carbono (low‐carbohydrate)” y/o con alto contenido en grasas o “dietas
cetogénicas”, ya que tienden a provocar cetosis (Bellido, 2004). La distribución de
macronutrientes suele ser de entre 45‐65% de lípidos, mientras que el contenido
en hidratos de carbono puede ser inferior al 30% del total de energía (McAuley y
cols., 2006).
Las dietas con muy baja proporción en carbohidratos, pero con un alto
contenido en grasa, son anunciadas a través de los medios de comunicación como
apropiadas para perder peso corporal y mejorar el estado de salud (Abete y cols.,
2006). Aunque se considera que este tipo de dietas no parece incrementar el riesgo
de enfermedad cardiovascular y diabetes tipo 2 (Freedman y cols., 2001), la
Asociación Americana de Diabetes recomienda actualmente una reducción en el
contenido de grasa y un incremento en el aporte de carbohidratos complejos
(American Diabetes Asotiation, 2002). Por otra parte, la reducción del número de
calorías a partir de una dieta con elevado aporte de grasas, atenúan pero no
impiden el desarrollo de resistencia a la insulina y obesidad en ratones (Petro y
Introducción
‐31‐
cols., 2004), lo que deja en evidencia el importante papel que juega la distribución
de macronutrientes y su contenido en estos fenómenos. Además, las dietas con
alto contenido lipídico suelen aportar una alta proporción de grasas saturadas y
una pequeña cantidad de grasas poliinsaturadas, siendo a menudo éste tipo de
dietas las consumidas por pacientes obesos y con enfermedad de hígado graso no
alcohólico (NAFLD) (Musso y cols., 2003).
Una ingesta elevada de ácidos grasos saturados se halla estrechamente
relacionada con la incidencia de enfermedades cardiovasculares, mientras que los
ácidos grasos insaturados tendrían un papel protector frente a este tipo de
trastornos (Slavin, 2005).
Por otro lado, la restricción de los hidratos de carbono implica la
movilización de grasa como fuente de energía, dando lugar a la formación de
cuerpos cetónicos y disminución del apetito como consecuencia del descenso de
los niveles plasmáticos de glucosa e insulina (Freedman y cols., 2001).
2.2.2 Dietas con alto contenido en azúcares simples
La base de este tipo de dietas es, por un lado, disminuir la densidad
energética de la dieta dado el elevado aporte de energía por gramo de grasa (9
kcal/g) respecto a los hidratos de carbono (4 kcal/g) o las proteínas (4 kcal/g), por
lo que una reducción en la ingesta de grasa daría lugar a un descenso de la ingesta
calórica (McMillan‐Price y Brand‐Miller, 2004). Por otro lado, el efecto termogénico
inducido por la grasa es menor que el de las proteínas e hidratos de carbono, lo
que supone un gasto energético menor en su utilización (McMillan‐Price y Brand‐
Miller, 2004). Finalmente, los alimentos de igual contenido calórico, con mayor
proporción de grasa, son menos saciantes que los que presentan mayor contenido
en carbohidratos y proteínas. Por todo esto, los hidratos de carbono han sido
tradicionalmente recomendados en lugar de las grasas. Sin embargo, estudios
nutricionales recientes han demostrado que dependiendo del tipo de hidrato de
carbono consumido, una elevada ingesta de los mismos puede provocar un
aumento en los niveles de triglicéridos y favorecer su almacenamiento en forma de
grasa corporal (Noakes y Clifton, 2004); (Strychar, 2006). De hecho, programas de
Introducción
‐32‐
intervención han confirmado que el tipo de glúcido (simple o complejo) influye en
la evolución de parámetros metabólicos (Gaesser, 2007; Raben, 2002). Así, los
azúcares simples (y de alto índice glucémico) son digeridos y absorbidos
rápidamente, incrementando las demandas de insulina y aumentando el riesgo de
desarrollar diabetes mellitus tipo 2 (Schulze y cols., 2004). Los hidratos de carbono
complejos (y de bajo índice glucémico) han sido propuestos para el tratamiento y
prevención de la obesidad, ya que son absorbidos lentamente, disminuyen la
glucemia e hiperinsulinemia postprandial y producen una mayor sensación de
saciedad, que a su vez provoca la disminución de la ingesta energética (Riccardi y
cols., 2008), favoreciendo así el control del peso corporal (McMillan‐Price y Brand‐
Miller, 2004).
El consumo excesivo de azúcares se ha relacionado con varias anomalías
metabólicas y estados de salud adversos en seres humanos. Aunque los ensayos
experimentales son limitados, la evidencia de estudios observacionales y de meta‐
análisis en el ser humano han relacionado un mayor consumo de refrescos con una
ingesta energética mayor, incremento en el peso corporal y un menor consumo de
nutrientes esenciales (Johnson y cols., 2009; Vartanian LR y cols., 2007).
Se ha demostrado que las dietas ricas en sacarosa presentan efectos
perjudiciales en lo referente a la acción de la insulina en ratas, tanto a nivel
hepático como periférico (Pagliassotti y Prach, 1995; Podolin y cols., 1998; Storlien
y cols., 1988). Durante su absorción, la sacarosa se hidroliza en cantidades iguales
de fructosa y glucosa. En consecuencia, las dietas ricas en fructosa se han
comparado directamente con aquellas que presentan un alto nivel de glucosa o
elevado porcentaje de almidón en su composición, en un intento de distinguir qué
fracción del disacárido de sacarosa induce de forma mayoritaria el estado de
resistencia insulínica en ratas (Thorburn y cols., 1989; Tobey y cols., 1982). El
estudio llevado a cabo por Thorburn y cols., (1989) demostró que una dieta que
contenía 35% de fructosa produjo resistencia a la insulina, mientras que una dieta
que contenía 35% de glucosa, no lo hizo. Otro estudio experimental llevado a cabo
en ratas comparó los efectos de dietas ad libitum ricas en sacarosa, fructosa y
glucosa, y fructosa y almidón, estudiando la insulino‐resistencia y la tolerancia a la
Introducción
‐33‐
glucosa desarrollada por los 3 grupos dietéticos, sugiriendo sus resultados que la
fructosa es el principal mediador de nutrientes que produce la intolerancia a la
glucosa y la insulino‐resistencia inducida por dietas ricas en sacarosa (Thresher y
cols., 2000).
Sin embargo, el tema está en discusión debido al hallazgo de datos
controvertidos en relación al sobrepeso. Así, aunque muchos estudios
epidemiológicos han mostrado una relación positiva entre un mayor consumo de
bebidas azucaradas y el riesgo de la obesidad (Bachman y cols., 2006; Malik y cols.,
2006; Palmer y cols., 2008), otros estudios han mostrado evidencias en contra de
esta hipótesis (Forshee y cols., 2008; Johnson y cols., 2009). En roedores, el
consumo de dietas ricas en azúcares refinados parece incrementar el desarrollo de
obesidad y resistencia insulínica (Chicco y cols., 2003; Lomba y cols., 2009; Toida y
cols., 1996). Sin embargo, existen controversias acerca de los efectos las dietas con
alto contenido en azúcares simples. En este contexto, algunos autores han
observado efectos paradójicos de un exceso de ingesta energética de sacarosa
asociada con una disminución de la ganancia de peso (Goodson y cols., 2001;
Kanazawa y cols., 2003).
Asimismo el alto contenido en fibra de las dietas se establece como un
factor determinante en la regulación del peso corporal (Slavin, 2003). La ingesta de
alimentos con alto contenido en fibra favorece el mantenimiento del peso, así
como la mejora de los niveles de colesterol, gracias a una mayor sensación de
saciedad tras las comidas (Rodríguez y cols., 2005).
En este sentido, estudios previos han demostrado que las dietas ricas en
fibra insoluble son capaces de disminuir la ingesta de alimentos, el vaciado gástrico,
la tasa y la cantidad de absorción de grasas, e influye en la oxidación de grasas y el
almacenamiento de grasa, provoca una disminución de la glucosa postprandial y
los niveles de lípidos (Linko y cols., 2005), sensibilidad a la insulina y menor
aumento de peso (Isken y cols., 2009). Otra investigación llevada a cabo por Zhang
y cols. (2009) en ratas alimentadas con arroz salvaje, rico en almidón, concluyó que
Introducción
‐34‐
esta dieta fue capaz de inhibir el aumento del estrés oxidativo y demostró una
mejora en el perfil lipídico y el estado antioxidante.
Un mecanismo de acción similar al de la fibra dietética es el que lleva a cabo
el almidón resistente, que corresponde a la fracción del almidón ingerido que pasa
sin digerir al intestino grueso (Englyst y Cummings, 1985). Es aquí donde el almidón
se somete a una fermentación más o menos completa, lo que lleva a la producción
y absorción de ácidos grasos de cadena corta (Cummings y Englyst, 1987;
Cummings y cols., 1987). Esta fracción del almidón ha sido denominado almidón
resistente y definido por el European FLAIR Concerted Action on Resistant Starch
(EURESTA) como “la suma del almidón y sus productos de hidrólisis que no se
absorbe en el intestino delgado de individuos sanos” (1992). La importancia del
almidón resistente para la salud humana, en relación a la diabetes, el sobrepeso,
enfermedades cardiovasculares o cáncer, aún no se conoce bien. Sin embargo al no
digerirse, no se absorbe la glucosa en el intestino delgado
de los seres humanos sanos (Englyst y Cummings, 1986; Englyst y Cummings,
1987), y por tanto se puede esperar la reducción tanto de glucemia postprandial
como de la insulinemia después de su ingesta en comparación con el almidón
digestible. Tal efecto del almidón resistente puede ser beneficioso en el control de
la diabetes. Por otra parte, éste puede modificar, al igual que la fibra dietética, la
cantidad y velocidad de absorción de otros macronutrientes de la dieta como
azúcares y grasas, pudiendo ser beneficioso en el control de la glucemia y lipidemia
(Raben y cols., 1994).
Los principales carbohidratos alimentarios, el almidón o la sacarosa, pueden
afectar de manera diferente el metabolismo lipídico y el estado antioxidante en
ratas, con un aumento del aclaramiento de triglicéridos y de la ingesta de
micronutrientes antioxidantes proporcionados por los azúcares complejos en
relación con los refinados (Robert y cols., 2008).
Introducción
‐35‐
3. MODELOS DE ESTUDIO
Para el estudio de la obesidad en animales se emplean mayoritariamente
dos modelos de suministro de alimentos:
a) Modelos Ad libitum: Es el modelo de suministro de alimentos mas
ampliamente utilizado en estudios de experimentación animal. En éste tipo de
diseño el animal tiene libre acceso a la comida y bebida sin ningún tipo de
restricción en su ingesta. Diversos autores señalan el desarrollo de sobrepeso
(Boque y cols., 2009), aumento de la ingesta (Bourgoin y cols., 2008) y la adiposidad
(Garcia‐Diaz y cols., 2007; Milagro y cols., 2009), resistencia insulínica (Boque y cols.,
2009; Bourgoin y cols., 2008; Elmarakby e Imig, 2010; Milagro y cols., 2009),
hipertensión (Elmarakby e Imig, 2010), hiperleptinemia (Milagro y cols., 2009) e
hipertrigliceridemia (Bourgoin y cols., 2008), entre otros, como resultado de la
administración de dietas con distinta densidad calórica a la recomendada y sin
limitar su acceso a los animales. La principal ventaja del modelo Ad libitum es que
ante una dieta palatable, el aumento de peso y el desarrollo de obesidad son
rápidos.
b) Modelo Pair‐fed: Consiste en alimentar a todos los animales que
intervienen en este tipo de estudios con la misma cantidad de Kcal / g de peso
corporal del grupo cuya ingesta de alimento es menor. El grupo que recibe la dieta
en estudio limita su cantidad de kilocalorías a las consumidas por el grupo control,
el día anterior, como han descrito numerosos autores (de Meijer y cols., 2010;
Lomba y cols., 2009). La restricción de la ingesta calórica en ratones hace disminuir
su peso corporal (Goodrick, 1978) y mejora la respuesta inmune (Weindruch y cols.,
1979). En ratas este tipo de dietas mantiene el peso corporal (Hulman y Falkner,
1994), aumenta su tiempo de supervivencia (Davis y cols., 1983) y retrasa el
desarrollo de la diabetes (Gerritsen, 1976). La ventaja más notable del modelo
Pair‐fed es que a igualdad de ingesta calórica se observan mejor las diferencias que
son debidas al consumo de macro (o micro) nutrientes.
Introducción
‐36‐
Los diferentes estudios realizados en los últimos años por otros autores en
ambos modelos de estudio y diferentes tratamientos dietéticos, muestran
resultados diversos (Tablas 2 y 3).
Tabla 2. Algunos ejemplos de autores que han utilizado modelos Ad libitum o Pair‐fed en el estudio de la obesidad y el metabolismo.
Especie Modelo Tipo de dieta Duración del tratamiento dietético Principales efectos en el grupo tratado Referencia
Ratas Ad libitum High sucrose Medición inicial: 3 semanas A las 3 semanas:
Wistar (63% de sacarosa) Medición intermedia: 15 semanas 1.) Alteración temprana del metabolismo lipídico (aumento de
Medición final: 30 semanas LCA‐CoA en músculo)
2.) No se obsevaron daños en los depósitos de glucógeno ni
en la oxidación de glucosa en este momento
A las 15 y 30 semanas:
1.) Aumento de los niveles de triglicéridos y LCA‐CoA muscular
2.) Mayor oxidación de glucosa
3.) Reducción de los depósitos de glucógeno
4.) Insulino‐resistencia periférica
5.) Hiperglucemia moderada
Ratas Ad libitum High sucrose Medición inicial: 4 semanas A las 4 semanas:
Wistar Medición final: 12 semanas 1.) No se registraron diferencias en la ingesta
calórica, tejido adiposo subcutáneo y peso
2.) Mayor proporción de tejido adiposo mesentérico
A las 12 semanas:
1.) Mayor cantidad de grasa subcutánea y
mesentérica
2.) Hiperinsulinemia
3.) Hiperlipidemia
Ratas Ad libitum High fat 6 semanas 1.) Aumento de ganancia de peso corporal
Sprague‐Dawley (36% de grasa) 2.) Resistencia insulínica
3.) Aumento de niveles plasmáticos de leptina
4.) Aumento de niveles plasmáticos de TBARS
Ratas Ad libitum High fat 11 semanas 1.) Sobrepeso
Wistar (59% de grasa) 2.) Aumento significativo de adiposidad
retroperitoneal
3.) Insulino‐resistencia
4.) Hiperleptinemia
5.) Ligera hipermetilación del promotor de la leptina
Ratas Pair‐fed High sucrose 16 semanas 1.) Aumento en la producción de triglicéridos hepáticos
Sprague‐Dawley (60% de sacarosa) (Medición de algunos parámetros 2.) Ligero aumento en los niveles de ácido úrico a las 8 semanas,
a la mitad y final del tratamiento) constantes desde ese momento hasta el final del tratamiento
3.) Aumento de los niveles séricos de triglicéridos y colesterol
4.) Aumento ligero de adiposidad
5.) Aumento ligero de peso corporal
6.) Ligero aumento de triglicéridos séricos a las 8 y 16 semanas
7.) Aumento significativo de los niveles de colesterol séricos a las
8 y 16 semanas
8.) Aumento significativo de los niveles de insulina al final del
tratamiento
9.) Aumento hepático de MCP‐1 y TNF‐α
Ratas Pair‐fed High sucrose 13 semanas 1.) No se registraron diferencias significativas
Sprague‐Dawley (66% de sacarosa) en cuanto a ganancia de peso entre ambos grupos
2.) Hipertensión
3.) Insulino‐resistencia
Especie Modelo Tipo de dieta Duración del tratamiento dietético Principales efectos en el grupo tratado Referencia
Ratas Ad libitum High sucrose Medición inicial: 3 semanas A las 3 semanas:
Wistar (63% de sacarosa) Medición intermedia: 15 semanas 1.) Alteración temprana del metabolismo lipídico (aumento de
Medición final: 30 semanas LCA‐CoA en músculo)
2.) No se obsevaron daños en los depósitos de glucógeno ni
en la oxidación de glucosa en este momento
A las 15 y 30 semanas:
1.) Aumento de los niveles de triglicéridos y LCA‐CoA muscular
2.) Mayor oxidación de glucosa
3.) Reducción de los depósitos de glucógeno
4.) Insulino‐resistencia periférica
5.) Hiperglucemia moderada
Ratas Ad libitum High sucrose Medición inicial: 4 semanas A las 4 semanas:
Wistar Medición final: 12 semanas 1.) No se registraron diferencias en la ingesta
calórica, tejido adiposo subcutáneo y peso
2.) Mayor proporción de tejido adiposo mesentérico
A las 12 semanas:
1.) Mayor cantidad de grasa subcutánea y
mesentérica
2.) Hiperinsulinemia
3.) Hiperlipidemia
Ratas Ad libitum High fat 6 semanas 1.) Aumento de ganancia de peso corporal
Sprague‐Dawley (36% de grasa) 2.) Resistencia insulínica
3.) Aumento de niveles plasmáticos de leptina
4.) Aumento de niveles plasmáticos de TBARS
Ratas Ad libitum High fat 11 semanas 1.) Sobrepeso
Wistar (59% de grasa) 2.) Aumento significativo de adiposidad
retroperitoneal
3.) Insulino‐resistencia
4.) Hiperleptinemia
5.) Ligera hipermetilación del promotor de la leptina
Ratas Pair‐fed High sucrose 16 semanas 1.) Aumento en la producción de triglicéridos hepáticos
Sprague‐Dawley (60% de sacarosa) (Medición de algunos parámetros 2.) Ligero aumento en los niveles de ácido úrico a las 8 semanas,
a la mitad y final del tratamiento) constantes desde ese momento hasta el final del tratamiento
3.) Aumento de los niveles séricos de triglicéridos y colesterol
4.) Aumento ligero de adiposidad
5.) Aumento ligero de peso corporal
6.) Ligero aumento de triglicéridos séricos a las 8 y 16 semanas
7.) Aumento significativo de los niveles de colesterol séricos a las
8 y 16 semanas
8.) Aumento significativo de los niveles de insulina al final del
tratamiento
9.) Aumento hepático de MCP‐1 y TNF‐α
Ratas Pair‐fed High sucrose 13 semanas 1.) No se registraron diferencias significativas
Sprague‐Dawley (66% de sacarosa) en cuanto a ganancia de peso entre ambos grupos
2.) Hipertensión
3.) Insulino‐resistencia
(Chicco y cols., 2003)
(Toida y cols., 1996)
(Elmarakby e Imig, 2010)
(Milagro y cols., 2009)
(Sanchez‐Lozada y cols., 2010)
(Hulman y Falkner , 1994)
Introducción
‐37‐
Tabla 3. Ejemplos de experimentos en los que se emplean para la administración de la dieta ambos modelos, Ad libitum y Pair‐fed.
Especie Modelo Tipo de dieta Duración del tratamiento dietético Principales efectos en el grupo tratado Referencia
Rata Pair‐fed High fat‐sucrose 12 días Pair‐fed:
Sprague‐Dawley Para confirmar el estudio: (41% de sacarosa, 1.) No se registró aumento significativo de peso
Ad libitum 39% de grasa) 2.) No hubo diferencias en el peso del tejido adiposo
3.) Ligera reducción de los niveles de triglicéridos plasmáticos
4.) Ligera reducción de los ácidos grasos no esterificados
5.) Aumento ligero en la producción de triglicéridos hepáticos
6.) Ligero aumento de los niveles de glucosa e insulina plasmática
7.) Aumento ligero de la actividad total y específica de
lipoproteinlipasa
8.) Aumento ligero de la actividad total y específica de
lipoproteinlipasa en músculo
Ad libitum:
1.) Aumento significativo de peso corporal
2.) Mayor adiposidad
Ratón Pair‐fed High fat 11 semanas Pair‐fed :
C57BL/6J (B6) Ad libitum (58% de grasa) 1.) Aumento significativo del porcentaje de grasa total y peso
respecto al grupo control
2.) Mayores niveles de glucosa plasmática en relación con el
grupo control
Ad‐libitum:
1.) Aumento significativo del porcentaje de grasa total y peso
respecto al grupo control y al Pair‐fed
2.) Mayor % de eficiencia respecto al grupo control y Pair‐fed
3.) Mayor ingesta que el grupo control y Pair‐fed
4.) Mayores niveles de glucosa plasmática en relación con el
grupo Pair‐fed y control
5.) Hiperinsulinemia respecto al grupo Pair‐fed y control
Rata Ad libitum High fat Ad libitum:
Long‐Evans Para confirmar el estudio: (45% de grasa) Ad libitum : 7 semanas 1.) Mayor ganancia de peso
Pair‐fed Pair‐fed : 4 semanas 2.) Hiperleptinemia
3.) Hiperinsulinemia
4.) Mayor adiposidad
5.) Intolerancia a la glucosa
6.) Niveles elevados de FFA plasmáticos
Pair‐fed :
1.) Ganancia significativa de adiposidad en
comparación con los animales control (Ad libitum )
2.) Similar nivel de glucosa sanguínea e intolerancia
a la glucosa que el modelo Ad libitum
3.) Niveles de insulina plasmática ligeramente menor
(probablemente debido al largo perído de ayunas
marcado por el protocolo Pair‐fed )
Especie Modelo Tipo de dieta Duración del tratamiento dietético Principales efectos en el grupo tratado Referencia
Rata Pair‐fed High fat‐sucrose 12 días Pair‐fed:
Sprague‐Dawley Para confirmar el estudio: (41% de sacarosa, 1.) No se registró aumento significativo de peso
Ad libitum 39% de grasa) 2.) No hubo diferencias en el peso del tejido adiposo
3.) Ligera reducción de los niveles de triglicéridos plasmáticos
4.) Ligera reducción de los ácidos grasos no esterificados
5.) Aumento ligero en la producción de triglicéridos hepáticos
6.) Ligero aumento de los niveles de glucosa e insulina plasmática
7.) Aumento ligero de la actividad total y específica de
lipoproteinlipasa
8.) Aumento ligero de la actividad total y específica de
lipoproteinlipasa en músculo
Ad libitum:
1.) Aumento significativo de peso corporal
2.) Mayor adiposidad
Ratón Pair‐fed High fat 11 semanas Pair‐fed :
C57BL/6J (B6) Ad libitum (58% de grasa) 1.) Aumento significativo del porcentaje de grasa total y peso
respecto al grupo control
2.) Mayores niveles de glucosa plasmática en relación con el
grupo control
Ad‐libitum:
1.) Aumento significativo del porcentaje de grasa total y peso
respecto al grupo control y al Pair‐fed
2.) Mayor % de eficiencia respecto al grupo control y Pair‐fed
3.) Mayor ingesta que el grupo control y Pair‐fed
4.) Mayores niveles de glucosa plasmática en relación con el
grupo Pair‐fed y control
5.) Hiperinsulinemia respecto al grupo Pair‐fed y control
Rata Ad libitum High fat Ad libitum:
Long‐Evans Para confirmar el estudio: (45% de grasa) Ad libitum : 7 semanas 1.) Mayor ganancia de peso
Pair‐fed Pair‐fed : 4 semanas 2.) Hiperleptinemia
3.) Hiperinsulinemia
4.) Mayor adiposidad
5.) Intolerancia a la glucosa
6.) Niveles elevados de FFA plasmáticos
Pair‐fed :
1.) Ganancia significativa de adiposidad en
comparación con los animales control (Ad libitum )
2.) Similar nivel de glucosa sanguínea e intolerancia
a la glucosa que el modelo Ad libitum
3.) Niveles de insulina plasmática ligeramente menor
(probablemente debido al largo perído de ayunas
marcado por el protocolo Pair‐fed )
(Mantha y Deshaies, 2000)
(Petro y cols., 2004)
(Posey y cols., 2009)
Introducción
‐38‐
(Continuación de la Tabla 3)
(de Meijer y cols., 2010)
Especie Modelo Tipo de dieta Duración del tratamiento dietético Principales efectos en el grupo tratado Referencia
Ratón Pair‐fed High fat 1º experimento: 9 semanas 1º experimento
C57BL/6J (B6) Ad libitum (59,9% de grasa) 2º experimento:19 semanas Pair‐fed:
Ad libitum (10 semanas) + 1.) Ligero aumento del peso corporal en comparación con el grupo control
Dieta control (9 semanas) o 2.) Ligero aumento del % de grasa mesentérica, retroperitoneal, epididimal
Pair‐fed (9 semanas) o e inguinal en comparación con el grupo control
Ad libitum (9 semanas) 3.) Aumento significatico de los niveles de colesterol respecto al grupo control
4.) Aumento significativo de los niveles de triglicéridos respecto al grupo Ad‐libitum
Ad‐libitum:
1.) Mayor peso corporal que el grupo Pair‐fed y control
2.) Esteatosis Hepática y aumento significativo del peso del hígado
3.) Insulino‐resistencia
4.) Aumento significativo del % de grasa mesentérica, retroperitoneal, epididimal
e inguinal en comparación con el grupo control y Pair‐fed
5.) Niveles elevados de glucosa en ayunas
6.) Aumento significatico de los niveles de colesterol respecto al grupo control
7.) Reducción significativa de los niveles de triglicéridos respecto al grupo control
8.) Reducción significativa de la expresión de FAS respecto al grupo control y Pair‐fed
9.) Aumento significativo de la expresión de PPAR‐α respecto al grupo control y Pair‐fed
2º experimento
Ad‐libitum + posterior dieta control (10% de grasa):
1.) Reducción del significativa peso corporal, respecto a la etapa Ad‐libitum
2.) Reducción significativa de Alanina aminotransaminasa respecto a la etapa previa
3.) Reducción significativa del colesterol respecto a la etapa previa
4.) Incremento significativo de los triglicéridos respecto a la etapa previa
5.) Reducción significativa del peso del hígado
6.) Reducción signiificativa de todos los depósitos grasos respecto a la etapa previa
7.) Reducción significativa de los niveles de insulina en ayunas y del índice HOMA respecto
a la etapa previa
8.) Reversión de la esteatosis hepática
Ad‐libitum + posterior high fat Pair‐fed :
1.) Importante reducción de la ganancia de peso corporal respecto a la etapa previa
Ad‐libitum
2.) Aumento signiificativo de los niveles de colesterol respecto a la etapa
previa Ad‐libitum y grupo control
3.) Aumento significatico de los niveles de triglicéridos pero solo respecto a la
etapa previa Ad‐libitum
4.) Aumento significativo de la expresión hepática de FAS respecto al grupo control y
Ad‐Libitum ,a las 19 semanas
5.) Mantenimiento de la esteatosis hepática
Ad‐libitum + posterior high fat Ad‐libitum :
1.) Ligero aumento de la ganancia de peso corporal de forma consecutiva
2.) Aumento significativo de Alanina aminotransaminasa respecto a la etapa previa
Ad‐Libitum y control y Pair‐fed
3.) Aumento significatico de los niveles de triglicéridos pero solo respecto a la
etapa previa Ad‐libitum
4.) Aumento significativo de los depositos grasos respecto al grupo control, a las
19 semanas
5.) Aumento significativo del peso corporal respecto al grupo control, al as 19 semanas
6.) Reducción significativa de la expresión hepática de PPAR‐α respecto al grupo control y Pair‐fed
7.) Exacerbación del estado de esteatosis hepática
Especie Modelo Tipo de dieta Duración del tratamiento dietético Principales efectos en el grupo tratado Referencia
Ratón Pair‐fed High fat 1º experimento: 9 semanas 1º experimento
C57BL/6J (B6) Ad libitum (59,9% de grasa) 2º experimento:19 semanas Pair‐fed:
Ad libitum (10 semanas) + 1.) Ligero aumento del peso corporal en comparación con el grupo control
Dieta control (9 semanas) o 2.) Ligero aumento del % de grasa mesentérica, retroperitoneal, epididimal
Pair‐fed (9 semanas) o e inguinal en comparación con el grupo control
Ad libitum (9 semanas) 3.) Aumento significatico de los niveles de colesterol respecto al grupo control
4.) Aumento significativo de los niveles de triglicéridos respecto al grupo Ad‐libitum
Ad‐libitum:
1.) Mayor peso corporal que el grupo Pair‐fed y control
2.) Esteatosis Hepática y aumento significativo del peso del hígado
3.) Insulino‐resistencia
4.) Aumento significativo del % de grasa mesentérica, retroperitoneal, epididimal
e inguinal en comparación con el grupo control y Pair‐fed
5.) Niveles elevados de glucosa en ayunas
6.) Aumento significatico de los niveles de colesterol respecto al grupo control
7.) Reducción significativa de los niveles de triglicéridos respecto al grupo control
8.) Reducción significativa de la expresión de FAS respecto al grupo control y Pair‐fed
9.) Aumento significativo de la expresión de PPAR‐α respecto al grupo control y Pair‐fed
2º experimento
Ad‐libitum + posterior dieta control (10% de grasa):
1.) Reducción del significativa peso corporal, respecto a la etapa Ad‐libitum
2.) Reducción significativa de Alanina aminotransaminasa respecto a la etapa previa
3.) Reducción significativa del colesterol respecto a la etapa previa
4.) Incremento significativo de los triglicéridos respecto a la etapa previa
5.) Reducción significativa del peso del hígado
6.) Reducción signiificativa de todos los depósitos grasos respecto a la etapa previa
7.) Reducción significativa de los niveles de insulina en ayunas y del índice HOMA respecto
a la etapa previa
8.) Reversión de la esteatosis hepática
Ad‐libitum + posterior high fat Pair‐fed :
1.) Importante reducción de la ganancia de peso corporal respecto a la etapa previa
Ad‐libitum
2.) Aumento signiificativo de los niveles de colesterol respecto a la etapa
previa Ad‐libitum y grupo control
3.) Aumento significatico de los niveles de triglicéridos pero solo respecto a la
etapa previa Ad‐libitum
4.) Aumento significativo de la expresión hepática de FAS respecto al grupo control y
Ad‐Libitum ,a las 19 semanas
5.) Mantenimiento de la esteatosis hepática
Ad‐libitum + posterior high fat Ad‐libitum :
1.) Ligero aumento de la ganancia de peso corporal de forma consecutiva
2.) Aumento significativo de Alanina aminotransaminasa respecto a la etapa previa
Ad‐Libitum y control y Pair‐fed
3.) Aumento significatico de los niveles de triglicéridos pero solo respecto a la
etapa previa Ad‐libitum
4.) Aumento significativo de los depositos grasos respecto al grupo control, a las
19 semanas
5.) Aumento significativo del peso corporal respecto al grupo control, al as 19 semanas
6.) Reducción significativa de la expresión hepática de PPAR‐α respecto al grupo control y Pair‐fed
7.) Exacerbación del estado de esteatosis hepática
Introducción
‐39‐
4. EPIGENÉTICA
4.1. Definición y clasificación de los procesos epigenéticos
Entre los diferentes mecanismos que pueden estar involucrados en las
diferencias interindividuales presentes en la obesidad, la regulación epigenética de
la expresión génica ha emergido en los últimos años como un factor que podría
contribuir de manera importante. En éste sentido, la epigenética ha sido definida
como el estudio de los cambios heredables en la expresión del un gen que se
producen en ausencia de un cambio en su secuencia de ADN (Junien y Nathanielsz,
2007). El prefijo epi en epigenética implica características que están "encima de" o
"además de" la genética, la superación del paradigma convencional asignado a la
herencia del ADN.
Los cambios epigenéticos incluyen la metilación del ADN, las modificaciones
covalentes de las histonas, el empaquetamiento del ADN alrededor de los
nucleosomas, el plegamiento de la cromatina y la unión de la cromatina a la matriz
nuclear (Dolinoy y Jirtle, 2008). De todos éstos procesos, probablemente los mas
estudiados sean las modificaciones de histonas y la metilación del ADN (Wild y
Flanagan, 2010).
4.1.1. Modificación de histonas
Las histonas, especialmente los residuos amino terminales de acceso a las
histonas H3 y H4 y las colas amino y carboxilo terminales de H2A, H2B y H1, son
susceptibles a una variedad de modificaciones post‐traduccionales, incluyendo la
fosforilación de la serina y treonina, acetilación de lisina , la metilación de lisina y
arginina, ubiquitinación de lisina, biotinilación lisina, ribosilación de ADP (adenosín
bifosfato), glicosilación y carbonilación (Margueron y cols., 2005). Dichas
modificaciones en las histonas puede crear o estabilizar los sitios de unión para las
proteínas reguladoras, como factores de transcripción, proteínas implicadas en la
condensación de la cromatina o la reparación del ADN, pero también puede tener
el efecto contrario, lo que altera u ocluye los sitios de unión de la cromatina
Introducción
‐40‐
(Goldberg y cols., 2007). Algunas de estas modificaciones son compatibles con
otras reacciones, facilitando así otras modificaciones que se produzcan y/o
coexistan, mientras que otras modificaciones son incompatibles, afectando
negativamente a otros cambios en las histonas.
Figura 3. (A) Estructura del nucleosoma. (B) Representación esquemática de la organización de las histonas en el núcleo formando un octámero que es rodeado por el ADN (línea negra). Primero se deposita un tetrámero H3/H4 en el ADN, seguido por dos dímeros H2A/H2B dando lugar al dominio globular constituido por las 8 proteínas histónicas (Modificado de Allis y cols., 2007).
a) Acetilación de histonas
Las histonas sufren acetilación y desacetilación, especialmente de los
residuos de lisina en la cola N‐terminal. Este mecanismo de regulación está
catalizado por dos tipos de enzimas, Histonas acetiltransferasas (HATs) e Histonas
desacetilasas (HDACs), que no sólo actúan sobre sustratos de histonas, sino
también en las proteínas no histónicas. En el proceso de acetilación, el acetil‐
coenzima A es el donante del grupo acetilo (Sadoul y cols., 2008). De hecho, la
síntesis nuclear del acetil‐CoA es un paso limitante para la acetilación de las
histonas. Así, el metabolismo del acetil‐CoA está directamente relacionado con la
regulación de la cromatina y puede afectar a diversos procesos celulares en las que
se entrecruzan la acetilación y el metabolismo, tales como estados de la
enfermedad y el envejecimiento (Takahashi y cols., 2006). La acetilación y
desacetilación de las histonas H3 y H4 influyen en la estructura de la cromatina y
en la accesibilidad a los factores de transcripción, ya que se supone que la
acetilación abre la estructura de la cromatina condensada y permite a la
maquinaria transcripcional un acceso más fácil a las regiones promotoras. Se
A BA B
Introducción
‐41‐
mantiene la hipótesis de que algunos inhibidores de HDACs podrían ser posibles
fármacos en el tratamiento de la obesidad (Milagro y cols., 2010).
b) Metilación de histonas
La metilación de histonas representa una buena combinación potencial con
respecto a otras modificaciones, debido a que los residuos de lisina pueden
albergar fracciones mono, di o tri‐metil en su grupo amino, mientras que los
residuos de arginina puede llevar residuos mono o dimetil en su grupo guanidinio
(Allis y cols., 2007 ). Ambas metilaciones, en la lisina y en la arginina, pueden actuar
como activadores o represores de la transcripción de genes (Bannister y cols.,
2002).
Existen una serie de nutrientes y compuestos de la dieta que se han
relacionado con cambios en la metilación de las histonas. Así, dosis altas de
diferentes minerales, como el cromo, el níquel y el arsénico, inducen cambios en la
metilación de las histonas en diferentes residuos (H3K4, H3K9 y H3K27 (Chen y
cols., 2006; Zhou y cols., 2009). Por otro lado las lisina metiltransferasas
transportan un grupo metilo de la S‐adenosil‐L‐metionina (SAM) al grupo amino de
un residuo de lisina, dando lugar al producto S‐adenosil‐L‐homocisteína (SAH)
(Dillon y cols., 2005). SAM está formado por grupos metílicos derivados de
nutrientes como la colina, metionina, o metil‐tetrahidrofolato, mientras que la
betaína, colina, metionina, zinc y ácido fólico son necesarios para la conversión de
la homocisteína en metionina. Así, los efectos de estos nutrientes en las marcas
epigenéticas están relacionadas entre sí, interactuando entre ellos para alterar el
ADN y los procesos epigenéticos de metilación de histonas (Campion y cols., 2009b).
c) Otras modificaciones de histonas
La fosforilación de histonas, aunque menos estudiada que la metilación y
acetilación, se cree que juega un papel directo en la mitosis, la muerte celular,
Introducción
‐42‐
reparación, replicación y recombinación, y por lo general relacionada con la
activación de la transcripción génica (Oki y cols., 2007). Se conocen diferentes
factores dietéticos que facilitan esta modificación, incluyendo la genisteína, que se
ha asociado a la fosforilación de H1 y H3 en las células cancerosas (Cappelletti y
cols., 2000), el sulforafano (Davie y Chadee, 1998), el alcaloide de la vinca
vinblastina (Juan y cols., 1998), o la micotoxina zearalenona (Ahamed y cols., 2001).
En cuanto a los factores metabólicos y ambientales, la histona H2AX, que media la
reparación del ADN, es rápidamente fosforilada cuando el ADN es dañado por la
hipoxia (Celeste y cols., 2003). Otras modificaciones de las histonas con efectos
sobre la expresión génica son la biotinilación de histonas, que depende de la
disponibilidad de biotina (la deficiencia de biotina produce efectos importantes
sobre la estructura de la cromatina (Hassan y Zempleni, 2006). Y por último la
ubiquitinación de las histonas H2A y H2B, que es inhibida por altas concentraciones
de níquel (Ke y cols., 2006).
Figura 4. Tipos de modificaciones en la cola amino‐terminal de las histonas y sitios susceptibles de cambios (Modificado de Allis y cols., 2007).
4.1.2. Metilación del ADN
La metilación del ADN es un proceso epigenético que participa en la
regulación de la expresión génica de dos maneras: directamente al impedir la
Histona H3
Histona H4
Histona H2A
Histona H2B
Fosforilación
Acetilación
Metilación(arginina)
Metilación(lisina activa)
Metilación(lisina reprimida)
Ubiquitinación
Histona H3
Histona H4
Histona H2A
Histona H2B
Fosforilación
Acetilación
Metilación(arginina)
Metilación(lisina activa)
Metilación(lisina reprimida)
Ubiquitinación
Introducción
‐43‐
unión de factores de transcripción, e indirectamente propiciando la estructura
"cerrada" de la cromatina (Mesa‐Cornejo y cols., 2006). La metilación de islas CpG,
definidas como regiones genómicas que contienen una alta frecuencia de
dinucleótidos Citosina‐Guanina (CG), tiene como resultado la conversión de la
citosina en 5‐metilcitosina. Cuando éste hecho ocurre en las regiones promotoras,
se asocia a menudo con el silenciamiento de genes (Chuang y Jones, 2007). Hay
tres enzimas que intervienen en el establecimiento y mantenimiento de los
patrones de metilación del ADN: las metiltransferasas de ADN DMNT3A y DMNT3B
son metiltransferasas de novo; mientras que DNMT1 asegura que los patrones de
metilación se copian fielmente a través de cada división celular (Klose y Bird, 2006).
Estas enzimas cooperar entre sí para establecer y mantener los patrones de
metilación celular del ADN y también interactúan con las desacetilasas y
metiltransferasas de histonas y proteínas de unión a metilcitosina en un complejo
sistema de regulación. La metilación de las islas CpG reprime la transcripción de
genes y es un elemento de control de la expresión génica (Figura 5).
Figura 5. Procesos de metilación del ADN. (A) El gen está abierto y este hecho favorece su expresión. (B) Cuando los genes se metilan, la cromatina se compacta y la expresión del gen se reduce.
En las células humanas, la mayoría de las islas CpG en regiones no
promotoras de los genes se encuentran hipermetiladas, hecho que está
Introducción
‐44‐
relacionado con la represión de la transcripción, mientras que las islas CpG
localizadas en las regiones promotoras de los genes activos están desmetiladas
(Urnov, 2002). Se ha propuesto que la metilación del ADN es un proceso reversible
y que los patrones de metilación dependen de un equilibrio dinámico entre los
procesos de metilación y desmetilación (Delcuve y cols., 2009; Niehrs, 2009).
En los últimos años, el análisis del ADN metilado representa una interesante
herramienta para el diagnóstico, terapia y pronóstico de enfermedad, así como en
el campo de la farmacogenética y estudios epidemiológicos (Mesa‐Cornejo y cols.,
2006).
4.2. Influencia de la dieta en los procesos de metilación del ADN
El impacto de la nutrición en los mecanismos epigenéticos (Ahmed, 2007;
Liddle y Jirtle, 2006), esta siendo estudiado cada vez con más interés. Parece que
cada vez hay más evidencia del papel determinante del medio ambiente,
incluyendo la nutrición, sobre la expresión de muchos genes relacionados con el
estado de salud (Dolinoy y cols., 2006; Tang y Ho, 2007).
El proceso de la metilación del ADN depende de la ingesta de grupos
donantes de metilo y cofactores ingeridos con los alimentos, que están
involucrados en el metabolismo de la metionina y el folato (Chmurzynska, 2010).
En éste sentido, las metiltransferasas emplean SAM como donante de grupos
metilo (Hitchler y Domann, 2009) que puede inducir directamente marcas
epigenéticas, siendo la biodisponibilidad de éste metabolito influenciado
directamente por la dieta. Así, el SAM está formado por grupos metil derivados de
la colina, metionina, o metil‐tetrahidrofolato. La betaína, colina, metionina, zinc y
ácido fólico son necesarios para la conversión de la homocisteína en metionina
(Zeisel, 2009). Varios compuestos dietéticos están implicados en la regulación de la
metilación del ADN. La vitamina B12 es un cofactor en la remetilación, mediada por
el folato, de la homocisteína a metionina, la cual es posteriormente activada a SAM,
el donante de metilo para la metilación del ADN. SAM se convierte en SAH después
Introducción
‐45‐
de la metilación del ADN. La hidrólisis reversible de la SAH a homocisteína
completa el ciclo. En condiciones de una elevada concentración de homocisteína,
esta reacción se invierte resultando un aumento de la concentración de la SAH
potente inhibidor de la SAM. La deficiencia en vitamina B12 lleva a una
acumulación de homocisteína en suero (Geisel y cols., 2005).
Figura 6. Versión simplificada del metabolismo monocarbonado. Esta vía es dependiente de la disponibilidad dietética de metionina, colina, betaína y vitamina B12. (Modificado de Chmurzynska, 2010)
Los efectos de estos nutrientes en las marcas epigenéticas están
relacionados entre sí, interactuando entre ellos para alterar los procesos
epigenéticos de metilación del ADN. De hecho, la perturbación del metabolismo de
uno de los donantes de metilo es consecuencia de cambios compensatorios en
otros debido a la interrelación de estas vías metabólicas (Hitchler y Domann, 2009).
Los estudios experimentales que modifican la composición de los nutrientes
de la dieta, muestran que la restricción de donantes de metilo provoca, en general,
la hipometilación del ADN (Locker y cols., 1986; Zapisek y cols., 1992) y la
suplementación produce hipermetilación del mismo (Choi SW y cols., 2005;
Steegers‐Theunissen y cols., 2009). Algunos países de todo el mundo recomiendan
a las mujeres que planean un embarazo la ingesta diaria de 400 microgramos de
ácido fólico sintético en el período periconcepcional para prevenir defectos de
nacimiento en los niños. El uso periconcepcional de ácido fólico se asocia con
Metilén‐tetrahidrofolato
MetioninaSAM
SAH
Reacciones deReacciones demetilacimetilacióónn
Betaína
Dimetil ‐glicina
Metil‐tetrahidrofolatoHomocisteína
Tetrahidrofolato
Cisteína
B6
Glicina
Colina
B12CH3
Metilén‐tetrahidrofolato
MetioninaSAM
SAH
Reacciones deReacciones demetilacimetilacióónn
Betaína
Dimetil ‐glicina
Metil‐tetrahidrofolatoHomocisteína
Tetrahidrofolato
Cisteína
B6
Glicina
Colina
B12CH3
Introducción
‐46‐
cambios epigenéticos en IGF2 en el niño que puede afectar a la programación
intrauterina del crecimiento y desarrollo, con consecuencias para la salud y la
enfermedad durante toda la vida (Steegers‐Theunissen y cols., 2009). Por otra
parte, la reducción importante de determinados suplementos alimenticios que
participan en los ciclos de la metionina y el folato durante el período
periconcepcional, puede conducir a la alteración epigenética de la metilación del
ADN en la descendencia, y modificar fenotipos relacionados con la salud en adultos
(Sinclair y cols., 2007).
Tabla 4. Ejemplos de cambios dinámicos en la metilación del ADN cuando es afectado por el aporte dietético de grupos donantes de metilo. Algunos de ellos presentan relación con la obesidad. (Modificado de Campión y cols., 2010)
El período vital en el que las modificaciones epigenéticas parecen ser más
determinantes son el embarazo y la lactancia. Así, investigaciones recientes han
puesto de relieve la importancia de ambientes adversos perinatales, durante el
embarazo o la lactancia, en el futuro desarrollo de la obesidad, lo que sugiere que las
opciones de la influencia de la nutrición de la madre o el estilo de vida pueden alterar
la programación durante el desarrollo del feto y sus crías (Vickers, 2007). De hecho, el
papel de la nutrición en la edad adulta es un tema de debate en relación a la
(Lv y cols., 2009)
Especie Tejido Estado nutricional Efecto Gen Relación con la obesidad Referencia
Humano Eritrocitos Folato sérico elevado El estado de metilación no SOD∙3
registró cambios (Superóxido dismutasa‐3)
Ratón Hígado, riñón Exceso de ácido fólico, Vitamina B12, Hipermetilación del ADN Alelo A (vy ) La obesidad materna induce la amplificación
y cerebro colina y betaína durante el desarrollo transgeneracional de la obesidad
Ratón deficiente Aorta Suplementación con betaína No hubo efectos TNF‐alpha La betaína puede ejercer un efecto antiaterogénico
en ApoE (Factor de necrosis tumoral alfa) al favorecer la inhibición de la inflamación
Rata Hígado Dieta deficiente en folato, tras el Incremento de la metilación ADN genómico
destete de los animales
Rata Hígado Deficiencia de Vitamina B12 Hipometilación Promotor de la Cistationina‐β
sintasa
Oveja Hígado fetal Restricción en el suministro de Múltiples cambios Nivel de metilación alterado en Los descendientes en edad adulta presentaron
vitaminas específicas y metionina un 4% de un total de 1400 islas CpG aumento de adiposidad y exceso de peso
Especie Tejido Estado nutricional Efecto Gen Relación con la obesidad Referencia
Humano Eritrocitos Folato sérico elevado El estado de metilación no SOD∙3
registró cambios (Superóxido dismutasa‐3)
Ratón Hígado, riñón Exceso de ácido fólico, Vitamina B12, Hipermetilación del ADN Alelo A (vy ) La obesidad materna induce la amplificación
y cerebro colina y betaína durante el desarrollo transgeneracional de la obesidad
Ratón deficiente Aorta Suplementación con betaína No hubo efectos TNF‐alpha La betaína puede ejercer un efecto antiaterogénico
en ApoE (Factor de necrosis tumoral alfa) al favorecer la inhibición de la inflamación
Rata Hígado Dieta deficiente en folato, tras el Incremento de la metilación ADN genómico
destete de los animales
Rata Hígado Deficiencia de Vitamina B12 Hipometilación Promotor de la Cistationina‐β
sintasa
Oveja Hígado fetal Restricción en el suministro de Múltiples cambios Nivel de metilación alterado en Los descendientes en edad adulta presentaron
vitaminas específicas y metionina un 4% de un total de 1400 islas CpG aumento de adiposidad y exceso de peso
(Uekawa y cols., 2009)
(Sinclair y cols., 2007)
(Hirsch y cols., 2008)
(Waterland y cols., 2008a)
(Kotsopoulos y cols., 2008)
Introducción
‐47‐
modificación de los patrones epigenéticos del ADN y la posible transmisión a través de
los gametos (Cobiac, 2007). Así, los cambios en los patrones de metilación del ADN
podrían ser un resultado de la interacción de diversos factores dietéticos, tales como
los desequilibrios en la oferta de donantes de metilo, sobre todo ácido fólico, o la
exposición a inhibidores de la metiltransferasa del ADN, como los polifenoles y,
posiblemente, isotiocianatos de las plantas (Johnson y Belshaw, 2008).
En éste sentido, los intercambios endocrinos entre feto y la madre, las
posturas intrauterinas, nutrición peri o prenatal, y la atención materna puede
contribuir al desarrollo de marcas epigenéticas específicas (Lathe, 2004). De hecho,
la desnutrición materna o el estrés, a veces asociada con bajo peso al nacer,
aumenta el riesgo de enfermedades metabólicas y cardiovasculares en los hijos,
que ha sido parcialmente explicada por alteraciones en el metabolismo de los
glucocorticoides (Lesage y cols., 2001; Mairesse y cols., 2007). Algunos de estos
eventos se deben a desequilibrios fisiológicos, endocrinos o nutricionales, pero
también puede referirse a los mecanismos epigenéticos.
Tabla 5. Algunos ejemplos de los cambios dinámicos en el patrón de metilación del ADN y modificación de histonas debidos a diferentes condiciones nutricionales (Modificado de Campión y cols., 2009b)
Estado nutricional Modelo Condición dietética/nutricional Dosis/manipulación Duración del tratamiento Efectos epigenéticos y/o metabólicos Referencia
Alteraciones maternas Rata Reducción del flujo sanguíneo en el útero Ligadura de las arterias 3 días 43% menos de metilación en p53
durante el embarazo uterinas
Microminerales Humano Ingesta de micronutrientes (folato, Menor consumo de donantes Larga duración Aumento de la metilación de
vitaminas A y B1) de grupos metilo p16 (INK4a) y p14 (ARF)
Rata Deficiencia de selenio 0,2 mg selenio kg‐1
Ratas de reciente destete 20% menos de metilación en el ADN
Células Caco‐2 Deficiencia de arsenito 0,1 o 2 µmoles de arsenito L‐1
7 días 20% menos de metilación en el ADN
Dieta vegetariana Humano Dieta vegetariana vs. omnívora No se muestra o determina Años 30‐40% menos de metilación en el gen
de la Superoxido dismutasa
Ácidos grasos Células HCT116/HT‐29 Suplementación con butirato 4 mmoles L‐1
24 horas 70% menos de metilación en RAR‐β2
(receptor del ácido retinóico β2 )
Otros compuestos Células KYSE 510/150 Suplementación con genisteína de soja 5, 10 o 20 µmoles L‐1
6 días Reversión de la hipermetilación del gen
Células OSCC Suplementación con polifenoles de té 20 o 50 µmoles L‐1
6 días Inhibición de la ADN metiltransferasa
(epigalocatequina‐3‐galato)
Colonocitos de rata Suplementación con grupos dialilo disulfuro 200 µmoles L‐1
3‐6 horas Incremento de la acetilación de histonas
Ratón Administración oral de sulforafano 10 µmoles L‐1
6 horas Reducción del 50‐65% en la actividad
histona deacetilasa
Abeja Ingesta de jalea real Alimento con jalea real No se muestra o determina 10‐15% menos de metilación en la
dinactina p62
Toxinas o drogas Rata Bisfenol A durante el embarazo y lactancia 50 mg kg‐1de dieta Perinatal 15% menos de metilación en el activador
de la proteína de unión a CDK5 (CabpIAP)
y ganancia de peso corporal
Estado nutricional Modelo Condición dietética/nutricional Dosis/manipulación Duración del tratamiento Efectos epigenéticos y/o metabólicos Referencia
Alteraciones maternas Rata Reducción del flujo sanguíneo en el útero Ligadura de las arterias 3 días 43% menos de metilación en p53
durante el embarazo uterinas
Microminerales Humano Ingesta de micronutrientes (folato, Menor consumo de donantes Larga duración Aumento de la metilación de
vitaminas A y B1) de grupos metilo p16 (INK4a) y p14 (ARF)
Rata Deficiencia de selenio 0,2 mg selenio kg‐1
Ratas de reciente destete 20% menos de metilación en el ADN
Células Caco‐2 Deficiencia de arsenito 0,1 o 2 µmoles de arsenito L‐1
7 días 20% menos de metilación en el ADN
Dieta vegetariana Humano Dieta vegetariana vs. omnívora No se muestra o determina Años 30‐40% menos de metilación en el gen
de la Superoxido dismutasa
Ácidos grasos Células HCT116/HT‐29 Suplementación con butirato 4 mmoles L‐1
24 horas 70% menos de metilación en RAR‐β2
(receptor del ácido retinóico β2 )
Otros compuestos Células KYSE 510/150 Suplementación con genisteína de soja 5, 10 o 20 µmoles L‐1
6 días Reversión de la hipermetilación del gen
Células OSCC Suplementación con polifenoles de té 20 o 50 µmoles L‐1
6 días Inhibición de la ADN metiltransferasa
(epigalocatequina‐3‐galato)
Colonocitos de rata Suplementación con grupos dialilo disulfuro 200 µmoles L‐1
3‐6 horas Incremento de la acetilación de histonas
Ratón Administración oral de sulforafano 10 µmoles L‐1
6 horas Reducción del 50‐65% en la actividad
histona deacetilasa
Abeja Ingesta de jalea real Alimento con jalea real No se muestra o determina 10‐15% menos de metilación en la
dinactina p62
Toxinas o drogas Rata Bisfenol A durante el embarazo y lactancia 50 mg kg‐1de dieta Perinatal 15% menos de metilación en el activador
de la proteína de unión a CDK5 (CabpIAP)
y ganancia de peso corporal
(Thaler y cols., 2009)
(Pham y cols., 2003)
(Mas y cols., 2007)
(Davis y cols., 2000)
(Uthus y cols., 2006)
(Spurling y cols., 2008)
(Druesne‐Pecollo y cols., 2006)
(Myzak y cols., 2006)
(Kucharski y cols., 2008)
(Dolinoy y cols., 2007)
(Fang y cols., 2005)
(Kato y cols., 2008)
Introducción
‐48‐
Hay varios ejemplos sobre el papel de las intervenciones nutricionales en el
embarazo, tales como la restricción de proteínas, la deprivación calórica, la
deficiencia o suplementación de micronutrientes y la alimentación excesiva a base
de grasa, que determinan un conjunto de trastornos en los hijos. Dos de los
informes más interesantes provienen de Ravelli y cols. (1999), que mostraron que
la mayoría de los niños nacidos después de la hambruna holandesa de 1944‐45
desarrollaron obesidad en la vida adulta, y de Eriksson y cols. (Eriksson y cols.,
2003), que concluyeron que el retraso del crecimiento fetal es un factor de riesgo
para la obesidad.
No sólo los micronutrientes pueden inducir cambios epigenéticos. Un
aumento en la expresión del gen de la Manganeso superóxido dismutasa humana
(MnSOD) se ha asociado con una disminución de la metilación de islas CpG de de
un grupo vegetariano con un grupo omnívoro (Johnson y cols., 2007). Otros
factores dietéticos como los ácidos grasos son susceptibles a participar en la
regulación epigenética de la metilación del ADN (Hitchler y Domann, 2009). Por
ejemplo, los tocoferoles se han relacionado con modificaciones epigenéticas de las
histonas (Nottke y cols., 2009). Otros compuestos presentes en diferentes
alimentos vegetales, tales como la isoflavona genisteína (Manzo y cols., 2009),
polifenoles del té (Lin y cols., 2007) y el disulfuro‐dialilo del ajo (Halees y cols.,
2003) también son capaces de regular metiltransferasas de ADN o acetilación de
las histonas en cultivos de células cancerosas. Un hallazgo reciente de Kucharski y
cols. (Kucharski y cols., 2008) puso de manifiesto que la información epigenética
puede ser alterada por la diferente ingesta en las abejas y que la flexibilidad de
modificaciones epigenéticas pueden provocar cambios profundos en el desarrollo,
incluyendo la reproducción y el comportamiento. En el tejido adiposo humano,
Bouchard y cols. (2010) han demostrado recientemente los efectos de la restricción
calórica sobre la metilación del ADN y la expresión génica. Los avances en estas
áreas abrirán las puertas a estudiar el efecto de diferentes nutrientes y las
condiciones que facilitan la metilación del ADN, modificaciones de las histonas y
otros mecanismos implicados en la regulación epigenética de genes específicos
Introducción
‐49‐
relacionados con el aumento de peso y la aparición de diferentes enfermedades
metabólicas.
4.3. La Epigenética como herramienta para el estudio de la
susceptibilidad a desarrollar trastornos metabólicos
El número de publicaciones sobre los genes regulados por mecanismos
epigenéticos está aumentando continuamente, algunos de ellos relacionados con
el cáncer (Nosho y cols., 2009 ; Worthley y cols.,2010), y otros con enfermedades
metabólicas como la hipertensión (Friso y cols., 2008), aterosclerosis, diabetes
(Ling y cols., 2008) y obesidad (Milagro y cols., 2009). En este contexto, la búsqueda
de promotores de genes susceptibles a la regulación epigenética y con un papel en
el desarrollo de la obesidad es de gran interés. Así, de los aproximadamente 800
genes humanos con posible regulación epigenética
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez), un 13% de ellos, definidos como
Epiobesogenes, podrían estar asociados a la obesidad. Los Epiobesogenes son un
conjunto de genes implicados en la obesidad y susceptibles de ser regulados por
mecanismos epigenéticos (Campion y cols., 2009b). El conocimiento de la
modificación de sus patrones de metilación, debido a diferentes factores dietéticos,
la edad, la inflamación o algunos de los aspectos fisiológicos que rodean al
sobrepeso, puede ser crucial para investigar el papel de estos mecanismos en la
prevención, el desarrollo y tratamiento de la obesidad (Martinez y cols., 2008).
Una de las adipoquinas clave involucradas en el peso corporal y regulación
de la ingesta de alimentos cuya región promotora presenta islas CpG que podrían
verse afectadas por la metilación dinámica, es la leptina. En ratas obesas, una isla
CpG en el promotor de la leptina resultó hipermetilado por la dieta alta en grasa
(Milagro y cols., 2009) y fue asociado a bajos niveles circulantes de leptina, lo que
sugiere que esta posición podría ser importante en la regulación de la expresión
del gen de leptina. Este hallazgo indica que la leptina es una secuencia diana de
diferentes factores de transcripción, cuyo promotor puede ser influenciado por la
obesidad inducida por la dieta y sugiere que los mecanismos epigenéticos podrían
Introducción
‐50‐
estar involucrados en la pandemia reciente de obesidad mediante el control de la
expresión de genes epiobesogénicos importantes (Campion y cols., 2009b).
Además de la adipogénesis, la inflamación es un proceso importante que participa
en la obesidad y sus comorbilidades asociadas (Moreno‐Aliaga y cols., 2005; Zulet y
cols., 2007). La inflamación podría inducir hipermetilación y dañar el ADN en los
promotores de varios genes (Stenvinkel y cols., 2007; Valinluck y Sowers, 2007),
cerrando el círculo entre sobrepeso y epigenética. Así, el estudio de los patrones de
metilación de los promotores de varios genes inflamatorios en diferentes
poblaciones celulares, como células de la sangre, hepatocitos o adipocitos, podría
ser un buen marcador del desarrollo de la obesidad o, por el contrario, de la
respuesta inducida por dietas de adelgazamiento (Martinez y cols., 2008). Así, el
TNF‐alfa es una citocina proinflamatoria, que está comúnmente elevada en los
sujetos obesos y cuyo promotor es susceptible de ser regulado por metilación de la
citosina. La regulación epigenética del promotor de TNF‐alfa humano por la
metilación de la citosina puede estar implicado en la susceptibilidad a perder peso
después de seguir una dieta hipocalórica equilibrada (Campion y cols., 2009a).
Introducción
‐51‐
Tabla 6. Ejemplos de varios genes humanos implicados en la obesidad cuya regulación por mecanismos epigenéticos ha sido descrita recientemente (epiobesogenes). (Modificado de Campión y cols., 2009b)
Un estudio en profundidad del porcentaje de metilación de las diferentes islas
CpG en los Epiobesogenes y su relación con el riesgo de sufrir obesidad o
enfermedades metabólicas, podría permitir crear una puntuación o score epigenético
que ayudaría a controlar mejor el peso corporal y conocer el riesgo de enfermedad
(Dandona y Roberts, 2009). Esta puntuación epigenotípica podría servir como una
herramienta de diagnóstico / pronóstico para prever la respuesta a una dieta
Papel en la obesidad Símbolo del gen Nombre Referencia
Adipogénesis PPARGC1A Receptor activador del proliferador de peroxisomas gamma‐coactivador 1‐alfa
Adipogénesis NR0B2 Receptor nuclear asociado a heterodímeros pequeños
Adipogénesis FGF2 Factor de crecimiento fibroblástico‐2
Adipogénesis PPARG Receptor activador del proliferador de peroxisomas gamma
Adipogénesis PTEN Homólogo de fosfatasa y tensina
Adipogénesis RARA Receptor alpha del ácido retinoico
Adipogénesis CDKN1A Ciclina dependiente del inhibidor de la quinasa 1A (p21, Cip1)
y ciclo celular
Adipogénesis e LEP Leptina
inflamación
Adipogénesis ESR1 Receptor de estrógenos alfa
Adipogénesis NR3C1 Receptor de glucocorticoides
Inflamación e TNF Factor de necrosis tumoral (Superfamilia TNF, miembro 2)
insulino‐resistencia
Inflamación y CASP8 Caspasa 8
apoptosis
Metabolismo lipídico LPL Lipoprotein lipasa
Metabolismo lipídico FABP4 Proteína de unión a ácidos grasos 4
Señalización insulínica CAV1 Caveolina 1
Señalización insulínica PIK3CG Fosfoinositol‐3‐quinasa, catalítico, gamma pp
Resistencia insulínica SSTR2 Receptor de somatostatina 2
Resistencia insulínica HSD11B2 11 beta‐hidroxiesteroide deshidrogenasa 2
y adiposidad
Resistencia insulínica IGFBP3 Proteína trasportadora del factor de crecimiento insulínico
Papel en la obesidad Símbolo del gen Nombre Referencia
Adipogénesis PPARGC1A Receptor activador del proliferador de peroxisomas gamma‐coactivador 1‐alfa
Adipogénesis NR0B2 Receptor nuclear asociado a heterodímeros pequeños
Adipogénesis FGF2 Factor de crecimiento fibroblástico‐2
Adipogénesis PPARG Receptor activador del proliferador de peroxisomas gamma
Adipogénesis PTEN Homólogo de fosfatasa y tensina
Adipogénesis RARA Receptor alpha del ácido retinoico
Adipogénesis CDKN1A Ciclina dependiente del inhibidor de la quinasa 1A (p21, Cip1)
y ciclo celular
Adipogénesis e LEP Leptina
inflamación
Adipogénesis ESR1 Receptor de estrógenos alfa
Adipogénesis NR3C1 Receptor de glucocorticoides
Inflamación e TNF Factor de necrosis tumoral (Superfamilia TNF, miembro 2)
insulino‐resistencia
Inflamación y CASP8 Caspasa 8
apoptosis
Metabolismo lipídico LPL Lipoprotein lipasa
Metabolismo lipídico FABP4 Proteína de unión a ácidos grasos 4
Señalización insulínica CAV1 Caveolina 1
Señalización insulínica PIK3CG Fosfoinositol‐3‐quinasa, catalítico, gamma pp
Resistencia insulínica SSTR2 Receptor de somatostatina 2
Resistencia insulínica HSD11B2 11 beta‐hidroxiesteroide deshidrogenasa 2
y adiposidad
Resistencia insulínica IGFBP3 Proteína trasportadora del factor de crecimiento insulínico
(Ling y cols., 2008)
(He y cols., 2008)
(Chang y cols., 2008)}
(Noer y cols., 2007)
(Goel y cols., 2004)
(Roupret y cols., 2008)
(Majid y cols., 2008)
(Noer y cols., 2007)
(Noer y cols., 2007)
{Milagro y cols., 2009; Noer y cols., 2007 ;
Stoger, 2006}
(Lai y cols., 2005)
(Oberlander y cols., 2008)
(Sullivan y cols., 2007)
(Lazcoz y cols., 2006)
(Hirasawa y cols., 2006)
(Semba y cols., 2002)
(Torrisani y cols., 2008)
(Alikhani‐Koopaei y cols., 2004)
(Chang y cols., 2002)
Introducción
‐52‐
hipocalórica así como para identificar individuos con mayores factores de riesgo para
desarrollar obesidad y otras enfermedades relacionadas, como por ejemplo el
síndrome metabólico(He y cols., 2010).
Principalmente son dos los objetivos perseguidos actualmente en el ámbito de
los factores dietéticos que influyen en la epigenética: en primer lugar, la identificación
(a una edad temprana) de las personas que podrían presentar perfiles específicos de
metilación en genes concretos que sugieran una mayor susceptibilidad a diferentes
enfermedades metabólicas, incluyendo el exceso de peso corporal y la diabetes tipo 2
y que permita la prevención y el control de su evolución. Y en segundo lugar, el uso de
la suplementación de la dieta como medio de contrarrestar perfiles epigenómicos
adversos de manera individualizada, similar a la administración de inhibidores de las
histonas deacetilasas e inhibidores de DNMTs s en la terapia del cáncer. Por lo tanto,
los desafíos en cuanto al papel de la epigenética en la obesidad incluirán la descripción
de los factores nutricionales que influyen en las marcas epigenómicas (Campion J y
cols., 2009b), la caracterización de los períodos vulnerables de la epigenética a lo largo
de la vida, la identificación de los puntos CpG supuestamente implicados en las
regiones promotoras de cada gen y la aplicación de la Epigenómica en el diseño de
biomarcadores fiables de obesidad y enfermedad metabólica, como se ha comprobado
para el cáncer y otras enfermedades crónicas (Schuffler y cols., 2009, Thorne y cols.,
2009).
OBJETIVOS
Objetivos
‐54‐
Una alimentación desequilibrada es un factor que puede inducir diversas
alteraciones metabólicas. En este contexto, un importante número de estudios
experimentales han demostrado que no sólo la ingesta calórica, sino también el
contenido de macronutrientes en la dieta puede desempeñar un papel importante
en la homeostasis de la insulina, y que la distribución inadecuada de
macronutrientes puede constituir un factor de riesgo para el desarrollo de
obesidad, diabetes, hipertensión y otros trastornos metabólicos. Así, el consumo
excesivo de hidratos de carbono, grasas, o de ambos, puede jugar un papel en el
desarrollo de resistencia a la insulina, esteatosis hepática y alteraciones lipídicas
asociadas a la obesidad y el síndrome metabólico. Por otra parte, la exposición a
diferentes factores nutricionales, químicos y físicos puede influir en los procesos
epigenéticos que contribuyen a modificar el perfil de expresión génica, lo que
podría alterar el riesgo de enfermedad. Los cambios epigenéticos relacionados con
los patrones de metilación del ADN podrían ser no sólo el resultado de la
interacción de diversos factores dietéticos y ambientales, sino también la causa de
algunas diferencias interindividuales relativas a la propensión a desarrollar
obesidad y otras enfermedades metabólicas.
El objetivo general del presente proyecto, según estas premisas, fue evaluar
la influencia de la distinta proporción en macronutrientes de diferentes dietas
isocalóricas sobre la obesidad, así como su efecto sobre la expresión génica y la
regulación epigenética de genes clave en las vías de la glucólisis, β‐oxidación,
lipogénesis y oxidación mitocondrial en hígado y tejido adiposo.
Los objetivos específicos fueron los siguientes:
1. Comparar dos regímenes dietéticos distintos, sin diferencias en el
contenido de energía (pair‐fed) pero con distinto contenido en hidratos de
carbono complejos y simples (almidón vs. sacarosa) sobre el peso corporal,
la adiposidad y diferentes marcadores de la homeostasis energética, así
como sobre la expresión de genes del metabolismo energético en hígado y
tejido adiposo blanco.
Objetivos
‐55‐
2. Estudiar la influencia del consumo de una dieta rica en sacarosa y grasas
saturadas (HFS) según un modelo de alimentación pair‐fed sobre cambios
bioquímicos, de peso y adiposidad, así como sobre los patrones de
metilación y la expresión de algunos genes clave del metabolismo hepático.
3. Evaluar el efecto de la ingesta de una dieta con elevada proporción de
grasas (HFD), según un modelo de alimentación pair‐fed, sobre el peso, la
adiposidad y diferentes marcadores del metabolismo lipídico, así como
sobre la expresión de genes clave del metabolismo en el tejido adiposo y el
patrón de metilación del ADN de esos mismos genes.
DISEÑO EXPERIMENTAL Y METODOLOGÍA
Diseño experimental y metodología
‐57‐
1. DISEÑO EXPERIMENTAL GENERAL
Los objetivos previstos fueron abordados con el diseño en paralelo de 3
estudios experimentales realizados en ratas Wistar (Figura 7). La administración de
la alimentación se realizó según un modelo pair‐fed y las 4 dietas con diferente
distribución de macronutrientes que se suministraron fueron las siguientes:
Dieta con elevada proporción de azúcares refinados (sacarosa) → HS
(“high sucrose”)
Dieta rica en grasas y azúcares refinados → HFS (“high fat‐sucrose”)
Dieta con alta proporción en grasas saturadas → HFD (“high fat diet”)
Dieta rica en almidón y baja en grasa → C (control)
La duración del tratamiento dietético fue de 69 días. La finalidad fue evaluar
tanto el efecto sobre el peso producido por cada una de las dietas (a pesar de que
el aporte calórico era el mismo en todos los grupos de intervención) como la
influencia de las diferencias en el aporte de macronutrientes sobre diversas
determinaciones de bioquímica sérica y hepática, expresión génica y regulación
epigenética del ADN (esta última se estudió en los animales tratados con dietas
HFS y HFD).
2. REQUERIMIENTOS ÉTICOS
Todos los procedimientos llevados a cabo durante el período experimental
fueron realizados según las normas nacionales e institucionales de la Protección de
los Animales y el Comité de Uso de la Universidad de Navarra.
Diseño experimental y metodología
‐58‐
Figura 7. Desarrollo general del diseño experimental.
Wistar
48
4 grupos
1212
1212
1111
1313
Control
HFS
HS
HFD10 semanas de
tratamiento dietético(pair‐fed)
Semana 5
SACRIFICIO
Estudios de expresión génica
Ensayos por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) para la medición
de insulina y adiponectina
Estudio del patrón de metilación de diferentes genes con implicación metabólica
Determinación de MDA yTG hepáticos
Determinaciones bioquímicas
Dietas
Disección de tejidos
Obtención de suerosPrueba de toleranciaa la glucosa
Calorimetría indirecta
Wistar
48
4 grupos
1212
1212
1111
1313
Control
HFS
HS
HFD
1212
1212
1111
1313
12121212
1212
1111
1313
Control
HFS
HS
HFD
Control
HFS
HS
HFD10 semanas de
tratamiento dietético(pair‐fed)
Semana 5
SACRIFICIO
Estudios de expresión génica
Ensayos por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) para la medición
de insulina y adiponectina
Estudio del patrón de metilación de diferentes genes con implicación metabólica
Determinación de MDA yTG hepáticos
Determinaciones bioquímicas
Dietas
Disección de tejidos
Obtención de suerosPrueba de toleranciaa la glucosa
Calorimetría indirecta
HFS
HFD
HS
Experimento 1
Experimento 3
Experimento 2
Control Lipids Health Dis. 2010; 9:60.
Mol Genet Metab.2010; en prensa.
J Nutrigenet Nutrigenomics. 2009; 2:267‐272.
HFS
HFD
HS
Experimento 1
Experimento 3
Experimento 2
Control Lipids Health Dis. 2010; 9:60.
Mol Genet Metab.2010; en prensa.
J Nutrigenet Nutrigenomics. 2009; 2:267‐272.
Diseño experimental y metodología
‐59‐
3. ANIMALES Y DIETAS
Un total de 48 ratas Wistar, de 8 semanas de vida, suministradas por el
Centro de Farmacobiología Aplicada (CIFA, Pamplona, España) fueron alojadas
individualmente en jaulas mantenidas en una habitación aislada a una temperatura
constante entre 21 y 23°C, con humedad controlada y con un ciclo de 12 horas de
luz (desde las 8 a las 20 horas). Los animales fueron asignados aleatoriamente
dentro de 4 grupos distintos: un grupo Control (n = 12) alimentado a base de pellet
estándar, un grupo de dieta alta en grasa: “high fat diet” (HFD; n = 11), un grupo de
dieta alta en grasas saturadas y azúcares simples: “high fat‐sucrose diet” (HFS, n =
12) y un último grupo alimentado con una dieta de elevado contenido en azúcares
simples: “high sucrose diet” (HS; n = 13). La administración de la alimentación se
realizó según un modelo pair‐fed. Las mediciones de la ingesta y el peso corporal
fueron realizadas diariamente.
En la mitad del período experimental se realizaron además 2
determinaciones in vivo: La sobrecarga intraperitoneal de glucosa (Iffiu‐Soltesz y
cols., 2010) y estudios de calorimetría indirecta (Garcia‐Diaz y cols., 2007). La
finalidad de ambos estudios fue comprobar la presencia o no de posibles
alteraciones metabólicas incipientes producidas por cada una de las dietas
ensayadas en la mitad del tratamiento dietético (semana 5).
Al final del período experimental, se procedió al sacrificio de los animales
por decapitación: inmediatamente se recolectó la sangre y se pesaron y recogieron
los diferentes depósitos grasos, hígado y músculos. El suero y los distintos órganos
y tejidos fueron almacenados a ‐80°C para posteriores determinaciones
bioquímicas, y de expresión génica y estudios epigenéticos, respectivamente.
3.1. Composición de las dietas empleadas
Para cada uno de los 3 experimentos se utilizó una dieta en la que el aporte
de un determinado macronutriente (o dos, en el caso del grupo HFS) era mayor
que el recomendado en condiciones normales. Sin embargo, en todos los grupos, la
Diseño experimental y metodología
‐60‐
ingesta calórica fue ajustada al consumo diario de Kcal registrado en el grupo
control (modelo pair‐fed), con objeto de fijar en cada grupo el mismo consumo
calórico de la dieta administrada en cada caso y evaluar posteriormente si se
producían diferencias de peso entre grupos, conociendo que el aporte energético
en cada uno de ellos era el mismo. La dieta suministrada en el Experimento 1 fue
elaborada manualmente, a base de pienso (2014 Teklad Global 14% Protein Rodent
Maintenance Diet, Harlan Iberica, Barcelona, España) y leche condensada “La
lechera” en proporción 1:1,5. Se emplearon dietas comerciales para la realización
del Experimento 2 (D12451, Research Diets, New Brunswick, NJ, USA ) y
Experimento 3 (D12330, Research Diets, New Brunswick, NJ,USA), y en la dieta
control (2014 Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet, Harlan Iberica,
Barcelona, España) usada como referencia en los 3 experimentos. La composición
de la dieta estándar suministrada al grupo de referencia aportó 18% de la energía
en forma de proteínas, 71% de la energía como carbohidratos y el 11% en forma de
grasa.
Todas las dietas contenían en su composición suplementos minerales y
vitamínicos acordes con los requerimientos nutricionales de los animales.
La distribución de macronutrientes por dieta de estudio y experimento se
detalla en la Tabla 7.
Tabla 7. Composición energética de las dietas experimentales
HS HFS HFD
Ingesta energética (Kcal/g) 3,39 4,73 5,56
Proteínas (%) 12,5 20,0 16,4
Grasas (%) 18,5 45,0 58,0
Carbohidratos (%) 69,0 35,0 25,5
Sacarosa 41,6 17,5 0,0
Maltodextrina 10 0,0 10,1 12,6
Almidón 27,4 7,4 12,9
Experimento 1 Experimento 3Experimento 2
HS HFS HFD
Ingesta energética (Kcal/g) 3,39 4,73 5,56
Proteínas (%) 12,5 20,0 16,4
Grasas (%) 18,5 45,0 58,0
Carbohidratos (%) 69,0 35,0 25,5
Sacarosa 41,6 17,5 0,0
Maltodextrina 10 0,0 10,1 12,6
Almidón 27,4 7,4 12,9
Experimento 1 Experimento 3Experimento 2
Diseño experimental y metodología
‐61‐
4. DETERMINACIONES IN VIVO
4.1. Calorimetría indirecta
El consumo de oxígeno (O2) y la producción de dióxido de carbono (CO2)
fueron medidos usando el calorímetro indirecto Oxylet 00 O2/CO2 (Panlab SL,
Barcelona, España) como se ha descrito previamente (Garcia‐Diaz y cols., 2007).
Cada animal fue colocado en una de las cuatro cámaras acrílicas (350 mm x
200 mm x 180 mm). El flujo de aire de la habitación fue regulado a cada una de las
cámaras a razón de 700 mL / min, y posteriormente los niveles de O2 y CO2 de
cada cámara así como el aire de la sala se midieron cada 3 minutos. El período de
muestreo por cámara fue de 2 horas de recogida de datos.
El cociente respiratorio (RQ) se calculó como la relación entre el volumen de
CO2 producido y el volumen de O2 consumido, según las fórmulas propuestas por
el fabricante (Panlab SL, Barcelona, España), al igual que el gasto energético (EE).
Las fórmulas aplicadas para la obtención de los resultados fueron las siguientes:
VO2 = F x ‐100
[O2]s
[O2]e
100
x F x
[O2]e
100
1‐
[O2]s
1001‐ ‐
100
[CO2]s
VO2 = F x ‐100
[O2]s
[O2]e
100
x F x
[O2]e
100
1‐
[O2]s
1001‐ ‐
100
[CO2]s
VO2 = F x ‐100
[O2]s
[O2]e
100
x F x
[O2]e
100
1‐
[O2]s
1001‐ ‐
100
[CO2]s
‐100
[O2]s
100
[O2]s
[O2]e
100
x F x
[O2]e
100
1‐[O2]e
100
[O2]e
100
1‐
[O2]s
1001‐ ‐
100
[CO2]s
100
[CO2]s
[O2]e
100
1‐F x
[O2]s
100
1‐ ‐100
[CO2]s
x100
[CO2]s
100
[CO2]e‐VCO2 =
[O2]e
100
1‐F x
[O2]s
100
1‐ ‐100
[CO2]s
x100
[CO2]s
100
[CO2]e‐
[O2]e
100
1‐F x
[O2]s
100
1‐ ‐100
[CO2]s
x100
[CO2]s
100
[CO2]e‐
[O2]e
100
1‐F x[O2]e
100
1‐[O2]e
100
[O2]e
100
1‐F x
[O2]s
100
1‐ ‐100
[CO2]s[O2]s
100
1‐ ‐100
[CO2]s
100
[CO2]s
x100
[CO2]s
100
[CO2]s
100
[CO2]e
100
[CO2]e‐VCO2 =
Diseño experimental y metodología
‐62‐
Donde:
[O2]e = Concentración de oxígeno que fluye al interior de la jaula
[O2]s = Concentración de oxígeno dentro de la jaula
[CO2]e = Concentración de dióxido de carbono que fluye al interior de la jaula
[CO2]s = Concentración de dióxido de carbono dentro de la jaula
F = Flujo de aire que entra a la jaula
VO2 = Consumo de oxígeno
VCO2 = Producción de dióxido de carbono
Dentro de la fórmula del gasto energético se encuentra incluido el peso del
animal estudiado.
4.2. Test de sobrecarga intraperitoneal de glucosa
Después de un ayuno de 12 h, las ratas alimentadas con las 3 dietas en
estudio y la dieta control fueron sometidas a un test de sobrecarga intraperitoneal
de glucosa para lo cual se inyectó por vía intraperitoneal una solución de glucosa al
30% a dosis 1g / Kg de peso corporal, como describen otros autores (Iffiu‐Soltesz y
cols., 2010). Para cuantificar los niveles de glucosa se tomaron muestras de sangre
de la vena de la cola a los 0, 15, 30, 60 y 120 minutos después de la administración
de glucosa. Los niveles de glucosa en sangre se determinaron utilizando un
glucómetro Glucotrend 2 (Roche Diagnostic, Mannheim, Alemania).
RQ =VCO2
VO2
RQ =VCO2
VO2
RQ =VCO2
VO2
EE (Kcal / día / peso corporal 3 / 4) = [ 3,815 + (1,232 x RQ) x VO2 x 1,44]EE (Kcal / día / peso corporal 3 / 4) = [ 3,815 + (1,232 x RQ) x VO2 x 1,44]
Diseño experimental y metodología
‐63‐
5. DETERMINACIONES SEROLÓGICAS
Los niveles circulantes de colesterol total y HDL‐colesterol fueron medidos
con los kits CP y HDL CP directo (ABX diagnóstico, Montpellier, Francia),
respectivamente; los triglicéridos y el lactato se midieron con un kit Randox y un
kit L‐lactato, respectivamente (Laboratorios Randox LTD, Ardmore Road, Reino
Unido). Los ácidos grasos libres (FFA) se cuantificaron con el kit NEFA C (Wako
Chemicals, Neuss, Alemania). Todos ellos se analizaron mediante métodos
cinéticos a tiempo final específicos y automatizados (COBAS MIRA, Roche, Basilea,
Suiza) según protocolos convencionales (Monreal y cols., 2005). La adiponectina
sérica (Linco Research, St. Charles, Missouri, EE.UU.) y los niveles de insulina
(Mercodia AB, Uppsala, Suecia) se midieron por técnicas de enzimainmunoensayo
(ELISA) en un equipo automatizado Triturus (Grifols International SA, Barcelona,
España).
Finalmente, el riesgo de presentar insulino‐resistencia se evaluó
considerando el índice HOMA‐IR de acuerdo con estudios publicados en roedores
anteriormente (Boque y cols., 2009) según la fórmula:
HOMA‐IR = (insulina plasmática en ayunas x glucosa plasmática) /22,5
Este índice estima el estado basal de la función beta celular del páncreas y
la sensibilidad a la insulina (Vogeser y cols., 2007).
Diseño experimental y metodología
‐64‐
6. DETERMINACIONES HEPÁTICAS
A partir de muestras de hígado de realizaron 2 determinaciones en los 3
grupos alimentados con las dietas experimentales y en el grupo de referencia:
Para la determinación de malondialdehído hepático (MDA) se utilizó un
ensayo colorimétrico de peroxidación de lípidos (kit de ensayo TBARS, Cayman
Chemical Company, EE.UU.), después de sonicar las muestras de hígado durante 15
segundos a 40 V en tampón RIPA con inhibidores de proteasas y centrifugar a 1600
g durante 10 minutos a 4°C. El MDA es considerado el principal producto de
autooxidación y degradación de ácidos grasos poliinsaturados o sus ésteres y sus
concentraciones plasmáticas son utilizadas frecuentemente como biomarcador
para estudiar el estrés oxidativo en humanos (Grotto y cols., 2007) y roedores
(Ahmed y cols., 2009).
Los niveles de triglicéridos hepáticos se determinaron mediante un ensayo
colorimétrico (triglicéridos MR, Cromatest; Linear Chemicals, España) tras 15
segundos de sonicación a 40 V en tampón Tris‐Cl. Un aumento de los niveles
hepáticos de triglicéridos puede ser indicio de un deterioro del metabolismo de los
lípidos y de esteatosis hepática leve (Lomba y cols., 2010).
7. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA
7.1. Extracción y cuantificación de ARN
El ARN total fue extraído para la realización de RT‐PCR a partir de hígados y
tejido adiposo epididimal previamente almacenados y congelados a ‐80°C,
utilizando Tri® (Sigma‐Aldrich, Missouri, USA). Por cada 50 mg de hígado y 50 – 100
mg de tejido adiposo recolectado en un tubo de 15 mL, se agregó 1,7 mL de Tri® y
se llevó a un homogenizador. La homogenización se realizó primero lavando en
agua con etanol 75%, agua y Tri® antes de homogenizar la muestra. Luego las
Diseño experimental y metodología
‐65‐
muestras se traspasaron a tubos convenientemente etiquetados y se centrifugó a
12000 g durante 10 minutos. Posteriormente se descartó la fase superior, se
incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos y se añadió cloroformo. Se
agitaron los tubos y se volvieron a centrifugar a 12000 g durante 15 minutos. Luego,
se recuperó la fase superior (que contiene el ARN) en tubos nuevos y se les añadió
2‐propanol. A continuación se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos
y se deshechó el sobrenadante. Seguidamente se lavó el ARN con etanol al 75% y
se centrifugó por última vez durante 5 minutos. Finalmente, el pellet de ARN se
resuspendió en agua molecular libre de ARNasas, ADNasas y proteasas (5Prime Inc.,
Garthersburg, MD, US). Una pequeña fracción se empleó para evaluar la cantidad
de ARN y su grado de pureza respecto a proteínas y sales minerales. Esta se pudo
conocer midiendo su absorbancia ultravioleta a 260 y 280 nm en un
espectrofotómetro para microanálisis de muestras NanoDrop ND‐1000 (Nanodrop,
Wilmington, DE, EE.UU). La pureza del ARN extraído fue determinado como el
cociente A260 / A280 con valores esperados entre 1,8 y 2 (Fleige y cols., 2006). La
otra fracción se conservó a ‐80°C para la posterior realización del RT‐PCR.
7.2. Reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real (RT‐PCR)
La técnica RT‐PCR (“quantitative real time polimerase chain reaction”)
consta de las siguientes fases:
a) Tratamiento de las muestras de ARN con ADNasas y retrotranscripción
Mediante este proceso se consigue, a través de la acción de la transcriptasa
inversa (enzima de tipo ADN‐polimerasa,) la transformación del ARN de partida en
ADN (ADN complementario).
El ARN extraído fue tratado con ADNasas con un kit DNA free (Ambion, TX,
EEUU). Se calculó el volumen necesario a utilizar de cada muestra conservada para
disponer de 2 µg de ARN y se llevó a un tubo eppendorf. Luego se agregó la
solución de ADNasas y se llevó la muestra a un termociclador programado con una
temperatura constante de 37°C durante 20 minutos. Después, se añadió una
Diseño experimental y metodología
‐66‐
solución de inactivación a cada muestra, se centrifugó y se llevó el sobrenadante a
un tubo nuevo previamente etiquetado. Posteriormente, los 2 µg de ARN fueron
utilizados como la hebra molde para la síntesis de ADN de hebra simple con una
transcriptasa reversa M‐MLV (Invitrogen Technologies, Canadá).
Se añadió a cada tubo soluciones de desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) y
de oligodT (DNA sintético que es complementario a la terminación poliadenilada
presente en el ARN mensajero y que se utiliza como cebador universal para la
transcripción reversa) y se incubaron a 65°C durante 5 minutos. Luego se agregó
ditiotreitol (DTT), inhibidor de ARNasa y la enzima retrotranscriptasa y por último
se incubó a 50 minutos a 37°C y se inactivó la reacción tras 15 minutos a 70°C.
b) RT‐PCR: metodología Taqman
Fundamento
Las sonda Taqman contiene un “emisor o reporter” marcado con un
fluoróforo en el extremo 5´ que emite una longitud de onda absorbido por un
“atenuador o quencher” no fluorescente unido en el extremo 3´. Cuando la
secuencia diana de interés está presente en la muestra, dicha sonda se alinea
específicamente entre los cebadores sentido y antisentido. Durante la reacción, se
produce la liberación del “emisor” marcado y como consecuencia, se incrementa
su fluorescencia. La acumulación de productos de PCR se detecta directamente
monitorizando el incremento de la fluorescencia del “emisor”. Cuando la sonda
está intacta y por lo tanto no se ha dado la reacción, la proximidad del “emisor”
marcado al “atenuador”, anula su fluorescencia (Figura 8).
Diseño experimental y metodología
‐67‐
Figura 8. Esquema de la RT‐PCR según la metodología Taqman (modificado de Taqman Gene Expression Assays Protocol)
Procedimiento
Realizamos reacciones de PCR cuantitativa a tiempo real en un sistema de
detección ABI PRISM 7000 HT de acuerdo a las recomendaciones de la casa
comercial (Applied Biosystems, CA, EEUU). Para asegurar el buen resultado de la
reacción de PCR, previamente se realizaron pruebas utilizando distintas diluciones
(1:100, 1:1000 y 1:500) de muestras controles para determinar cual era la dilución
más adecuada para la realización de los experimentos posteriores. La reacción de
PCR se realizó bajo el siguiente programa de temperaturas: 1 ciclo a 50°C durante 2
1.‐) Polimerización
4.‐) Polimerización completada
3.‐) Rotura del “reporter”
2.‐) Desplazamiento de la cadena
1.‐) Polimerización
4.‐) Polimerización completada
3.‐) Rotura del “reporter”
2.‐) Desplazamiento de la cadena
1.‐) Polimerización
4.‐) Polimerización completada
3.‐) Rotura del “reporter”
2.‐) Desplazamiento de la cadena
Diseño experimental y metodología
‐68‐
minutos, 1 ciclo a 95°C por 10 minutos y por último 40 ciclos a 95°C con duración
de 15 segundos y a 60°C por 1 minuto. Se estudiaron los siguientes genes tanto en
hígado como en tejido adiposo epididimal: Hydroxiacil‐CoA deshidrogenasa
(HADHB; Rn00592435_m1), Glucoquinasa (GCK; Rn00688285_m1), NADH
deshidrogenasa (ubiquinona) 1‐beta subcomplejo 6 (NDUFB6; Rn03416136_m1) y
Ácido graso sintasa (FAS; Rn01463550_m1). Para normalizar los niveles de
expresión de los genes se emplearon Ubiquitina (Rn01789812_g1) y Gliceraldehído
3‐fosfato deshidrogenasa (GAPDH; Rn 99999916_s1) como controles internos
(Applied Biosystems, Austin, TX, EE.UU.) utilizando el software Genorm (Garcia‐
Diaz D y cols., 2007). Todas las sondas Taqman, tanto de los genes de rata como de
los controles internos fueron suministradas por Applied Biosystems, CA, EEUU. La
totalidad las muestras se analizaron por triplicado.
7.3. Cálculo de la expresión génica por el método comparativo 2‐∆∆ct
Los datos de expresión génica se calcularon utilizando el método de
cuantificación relativa, siguiendo las recomendaciones del fabricante (Applied
Biosystems, EEUU) donde la cantidad de expresión del gen a estudiar, normalizado
a un gen de referencia endógeno y relativa a un calibrador, es expresada por la
fórmula aritmética 2‐∆∆ct.
Para llegar a los resultados de dicha fórmula aritmética, los datos de la
amplificación del gen obtenidos por la RT‐PCR fueron exportados como valores Ct
(threshold cycle, ciclo de amplificación en el cual la señal de fluorescencia emitida
se encuentra considerablemente por encima de los niveles de amplificación
inespecífica y es inversamente proporcional al número de copias iniciales de la
muestra). Posteriormente los valores Ct para el gen de estudio se sustraen a los
valores Ct del gen de referencia endógena para determinar los valores ∆Ct para
cada una de las muestras. El gen de referencia endógeno se utiliza para normalizar
la cantidad de ARN y debe ser propiamente validado de manera que no sea
afectado por el tratamiento experimental (Livak y Schmittgen, 2001).
Diseño experimental y metodología
‐69‐
Finalmente, a los valores ∆Ct del gen en estudio se le restan los valores de
∆Ct de un valor de referencia dando el valor ∆∆Ct. Dicho cálculo se puede realizar
asumiendo que la eficiencia de la amplificación del gen en estudio y el gen de
referencia endógena son iguales, lo cual se consigue si las sondas utilizadas son
diseñadas y optimizadas según las pautas de Applied Biosystems (Applied
Biosystems, EEUU).
De ésta manera, en el presente proyecto de investigación, los cambios en la
expresión de los genes estudiados tras la finalización del tratamiento dietético de
todos los grupos de experimentación se calcularon por el método 2‐∆∆ct,
normalizados a los genes de referencia GAPDH y ubiquitina utilizando el software
Genorm (Garcia‐Diaz y cols., 2007; Vandesompele y cols., 2002 ) y relativizándolos
al grupo control, es decir al que sirve de referencia para los 3 experimentos que
componen éste trabajo.
8. ESTUDIOS DEL PATRÓN DE METILACIÓN DEL ADN:
TECNOLOGÍA MASSARRAY‐SEQUENOM
Fundamento
Esta técnica se basa en el tratamiento del ADN genómico con bisulfito,
seguido de la amplificación por PCR y un proceso patentado de fragmentación
base‐específica. El patrón de corte resultante depende de la presencia de citosinas
metiladas en el ADN genómico original. Los productos de degradación son
automática y cuantitativamente analizados por espectrometría de masas
MALDITOF (Figura 9).
Diseño experimental y metodología
‐70‐
Figura 9. Esquema del proceso de estudio del patrón de metilación del ADN según la metodología Sequenom (modificado de Sequenom DNA Methylation Analysis Protocol)
En el presente trabajo de investigación se estudió el patrón de metilación
en los Experimentos 2 y 3. Los cebadores utilizados para cada uno de los genes por
experimento se detallan en la tabla 8.
Tabla 8.Cebadores utilizados para el estudio de los patrones de metilación en los Experimentos 2 y 3.
Gen
GCK TAGAATTAGGGAGGAAGTAGGAAGG GGATTTTGAGGTATTGTATTGATTTTT
HADHB TTTTTTTATTAGTAGGAAAAGGGTAGT GGGTTGATTTTTGAATAAGATTTGA
FAS GGGTTGATAAGTAAGGTTTTGAGGTTTTGGTTT GTTATAGAAAGGGTGGGTGTTTGAG
NDUFB6 TTTTAGGTTAAGAAGGTGGGAATTT TGGTTGAAGGATTAAGAGTTGAGTT
HADHB TTTTTTTATTAGTAGGAAAAGGGTAGT GGGTTGATTTTTGAATAAGATTTGA
Cebador sen do (5´→3´) Cebador an sen do (3´→5´)
Experimento 3
Experimento 2
Gen
GCK TAGAATTAGGGAGGAAGTAGGAAGG GGATTTTGAGGTATTGTATTGATTTTT
HADHB TTTTTTTATTAGTAGGAAAAGGGTAGT GGGTTGATTTTTGAATAAGATTTGA
FAS GGGTTGATAAGTAAGGTTTTGAGGTTTTGGTTT GTTATAGAAAGGGTGGGTGTTTGAG
NDUFB6 TTTTAGGTTAAGAAGGTGGGAATTT TGGTTGAAGGATTAAGAGTTGAGTT
HADHB TTTTTTTATTAGTAGGAAAAGGGTAGT GGGTTGATTTTTGAATAAGATTTGA
Cebador sen do (5´→3´) Cebador an sen do (3´→5´)
Experimento 3
Experimento 2
ADN metilado ADN no metilado
Tratamiento con Bisulfito
PCR y lavado
Transcripción In vitro
con Polimerasa T7
Fragmentación base‐específica
del ARN
Obtención de datos
ADN metilado ADN no metilado
Tratamiento con Bisulfito
PCR y lavado
Transcripción In vitro
con Polimerasa T7
Fragmentación base‐específica
del ARN
Obtención de datos
ADN metilado ADN no metilado
Tratamiento con Bisulfito
PCR y lavado
Transcripción In vitro
con Polimerasa T7
Fragmentación base‐específica
del ARN
Obtención de datos
Diseño experimental y metodología
‐71‐
9. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS DATOS
Los resultados se presentan como promedio ± desviación estándar (ó
promedio ± error estándar cuando así se indique) de las medias. La mayoría de las
variables se distribuyeron normalmente. El criterio de normalidad se evaluó por la
prueba de Shapiro‐Wilk. En las variables que no presentaron una distribución
normal se realizó la modificación logarítmica y se realizaron nuevamente las
pruebas de normalidad. En aquellas variables que no cumplieron las condiciones de
normalidad después de la conversión logarítmica se aplicó el test no paramétrico U
de Mann‐Whitney. El resto de datos se analizaron mediante la prueba paramétrica
t de Student. Los análisis de correlación se realizaron mediante el test de Pearson o
Spearman, dependiendo del carácter paramétrico o no paramétrico de la variable
en cuestión, respectivamente.
Aquellas diferencias cuya probabilidad fue superior al 5% (p<0,05) se
consideraron significativas y con tendencia a la significación o marginalmente
significativas aquellas que presentaron una probabilidad superior al 10% (p< 0,1)
(Martínez‐González y cols., 2001).
Los análisis estadísticos se realizaron mediante el programa SPSS 15.0 para
Windows (Chicago, IL, EE.UU).
RESULTADOS
Resultados
‐73‐
ARTÍCULO 1:
En éste trabajo se incluyen los estudios llevados a cabo para cumplir con el objetivo 1
de esta Tesis Doctoral.
Resultados
‐74‐
Resultados
‐75‐
Resultados
‐76‐
Resultados
‐77‐
Resultados
‐78‐
Resultados
‐79‐
Resultados
‐80‐
Resultados
‐81‐
ARTÍCULO 2:
En éste trabajo se incluyen los estudios llevados a cabo para cumplir con el objetivo 2
de esta Tesis Doctoral.
Resultados
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Resultados
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Resultados
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Resultados
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Resultados
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Resultados
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Resultados
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Resultados
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Resultados
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Resultados
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ARTÍCULO 3:
En éste trabajo se incluyen los estudios llevados a cabo para cumplir con el objetivo 3
de esta Tesis Doctoral.
Resultados
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Resultados
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Resultados
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Resultados
‐95‐
Resultados
‐96‐
DISCUSIÓN GENERAL
Discusión general
‐98‐
1. CONSIDERACIONES GENERALES
La obesidad representa uno de los problemas mas importantes de Salud
Pública, no sólo por el elevado número de personas que la padecen, sino por las
complicaciones metabólicas y costes sociales que conlleva (Salas‐Salvado y cols.,
2007). La presencia de esta enfermedad está relacionada con una serie de
trastornos cardiovasculares y metabólicos como la hipertensión, la diabetes tipo 2,
hiperinsulinemia, dislipidemias, arteriosclerosis, e incluso algunos tipos de cáncer
(Gutierrez Guisado y cols., 2008; Ingelsson y cols., 2009). Además, el tratamiento
de todas sus comorbilidades supone un elevado gasto sanitario, el cual podría
reducirse mediante estrategias terapéuticas adecuadas (Perez‐Rodrigo y cols.,
2006).
En la obesidad están implicados numerosos elementos causales, entre los
que se encuentran factores genéticos, metabólicos, endocrinológicos, ambientales
(hábitos dietéticos y actividad física) y psicosociales. El papel de ciertos
microorganismos, la epigenética, el aumento de la edad materna, la mayor tasa de
fecundidad entre personas que presentan mayor adiposidad y menor nivel
sociocultural, los trastornos del sueño, la iatrogenia farmacéutica, la reducción de
la variabilidad de la temperatura ambiente, e intrauterina y los efectos
intergeneracionales son algunos de los factores que también podrían intervenir en
la epidemia de la obesidad (McAllister y cols., 2009). De hecho, en la mayor parte
de los pacientes que desarrollan obesidad es difícil establecer una única causa,
atribuyéndose en gran medida a la interacción entre la carga genética y los factores
ambientales relacionados con el estilo de vida (Marti y cols., 2008; Weinsier y cols.,
1998). Así, las vías metabólicas involucradas en la homeostasis energética son
especialmente sensibles a los cambios en la composición de la dieta (Prentice y
Poppitt, 1996). Del mismo modo, los factores dietéticos participan, sin lugar a
dudas, en la etiología de dichos trastornos metabólicos en los seres humanos
(Popkin y Gordon‐Larsen, 2004). Los porcentajes y el tipo de macronutrientes de la
dieta no sólo pueden influir en la salud cardiometabólica o en la sensibilidad a la
insulina, sino también en el aumento de peso y adiposidad. En éste sentido, se ha
Discusión general
‐99‐
postulado que la epigenética se encuentra posiblemente involucrada en la
pandemia actual de obesidad (Junien y Nathanielsz, 2007). Así, la regulación
epigenética de la expresión génica ha emergido en los últimos años como un factor
potencialmente importante (Campion y cols., 2009b). En este contexto, la
epigenética se define como los cambios en la transcripción de genes que no son
debidos a modificaciones en la secuencia de ADN (Allis y cols., 2007 ). Así, la
metilación del ADN y las modificaciones de las histonas constituyen procesos
epigenéticos que participan en la regulación de la expresión génica, tanto
impidiendo la unión de factores de transcripción como propiciando una estructura
compacta de la cromatina (Mesa‐Cornejo y cols., 2006). Por tanto, la epigenética
hace referencia a los cambios reversibles del ADN que hacen que unos genes se
expresen más o menos dependiendo de la nutrición y otros factores metabólicos.
Los desequilibrios nutricionales pueden provocar alteraciones orgánicas que
podrían ser explicadas por la hipótesis del “fenotipo ahorrador” (Hales y Barker,
1992) y que a medio o largo plazo son responsables de trastornos metabólicos
como la obesidad y el síndrome metabólico (Waterland, 2008b). De hecho, los
datos obtenidos en modelos animales y en humanos demuestran que las
alteraciones en la regulación a nivel epigenético pueden causar obesidad
(Waterland, 2005). Los continuos avances científicos promueven la investigación
acerca de la implicación de mecanismos epigenéticos en el inicio, desarrollo y
tratamiento de enfermedades como el cáncer, la diabetes tipo 2 y la obesidad
(Dolinoy y Jirtle, 2008).
2. VALORACIÓN DE LOS EFECTOS DE LAS DIFERENTES DIETAS
ISOCALÓRICAS SOBRE EL PESO CORPORAL Y EL
METABOLISMO ENERGÉTICO
Las relaciones entre la ingesta energética, gasto energético, composición
nutricional de la dieta y la adipogénesis determinan el depósito de las reservas
energéticas corporales, la mayor parte de la cuales aparecen como triglicéridos en
Discusión general
‐100‐
el tejido adiposo (Martinez y cols., 2002). Cuando el aporte de energía excede
crónicamente al gasto energético o la distribución nutricional de la dieta favorece
la acumulación de lípidos, se produce un desequilibrio que conlleva el desarrollo de
sobrepeso y a largo plazo de obesidad (Loos y Bouchard, 2003). Diversos estudios
experimentales en ratas han demostrado que no sólo la ingesta calórica, sino
también la distribución de macronutrientes en la dieta juega un papel importante
en la regulación de los niveles de insulina, los cuales pueden constituir un factor de
riesgo asociado a la obesidad, la diabetes y otros trastornos metabólicos (Axen y
cols., 2003; Storlien y cols., 1988). Un considerable número de ensayos en
humanos han estudiado la relación de la composición de la dieta, en cuanto a la
distribución de macronutrientes, con el desarrollo de obesidad (Abete y cols.,
2010). La capacidad del metabolismo de ajustarse a la composición en
macronutrientes de la dieta es posible gracias a que muchas de las células del
organismo son capaces de utilizar sustratos derivados tanto de hidratos de carbono
como de grasas y proteínas. La más notable excepción la representa el sistema
nervioso central, incapaz de utilizar significativamente ácidos grasos como
combustible y, en consecuencia, dependiente de un adecuado aporte de glucosa, o
en su defecto de cuerpos cetónicos como sustrato alternativo (Labayen y Martinez,
2002).
El presente proyecto de investigación estuvo basado en 3 experimentos
realizados conjuntamente, en los que la administración de la dieta se realizó a
través de un modelo pair‐fed para asegurar que el aporte calórico era el mismo en
todos los grupos experimentales respecto al grupo control o de referencia. La
diferencia radica en el porcentaje de macronutrientes suministrado a los animales
de cada uno de los experimentos. En el primero de ellos se evaluaron los efectos de
una dieta con un elevado aporte de azúcares simples (HS), en el segundo se aportó
una excesiva proporción de grasas saturadas y azúcares simples (HFS) y en el
tercero se estudiaron los efectos producidos por una dieta con una proporción de
grasas muy superior a la recomendada (HFD), todos ellos durante 10 semanas.
De acuerdo al diseño experimental, la energía total consumida durante el
estudio fue similar en todos los grupos. Sin embargo, los animales alimentados con
Discusión general
‐101‐
las 3 dietas experimentales aumentaron su peso significativamente en relación al
grupo control (Lomba y cols., 2009; Lomba y cols., 2010). Esto confirma que no
solo la ingesta energética sino también la composición de los alimentos ingeridos
parece influir en la regulación del peso corporal (Horton y cols., 1995).
El consumo de las dietas HS, HFS y HFD indujo una mayor ganancia de peso
y masa grasa que la dieta control a pesar de que la ingesta fue isocalórica. Otros
autores han obtenido resultados similares en roedores alimentados con un modelo
ad libitum de dietas con alta proporción de azúcares simples, grasas o ambas
(Barnard y cols., 1993; Boque y cols., 2009). En modelos de alimentación pair‐fed
en roedores, la bibliografía informa tanto de aumento de peso significativo con
dietas HS (Reiser y Hallfrisch, 1977), HFS (Petro y cols., 2004) y HFD (Atshaves y
cols., 2010) como de ausencia de diferencias en la ganancia de peso entre los
grupos alimentados con estos tipos de dietas y los grupos de referencia (de Meijer
y cols., 2010; Mantha y Deshaies, 2000). Estos datos indican que no sólo la cantidad
de energía, sino también la proporción de macronutrientes en la dieta pueden
estar implicados en la obesidad y la acumulación de grasa (Abete y cols., 2006).
Por otra parte, el gasto energético se incrementó ligeramente en los
animales alimentados con las dietas HS (Experimento 1), HFS (Experimento 2) y
HFD (Experimento 3), sugiriendo que el consumo de una dieta con elevado
porcentaje en éstos sustratos energéticos podría conllevar un incremento del
metabolismo basal o la termogénesis, tratando de combatir la excesiva
acumulación de grasa en el tejido adiposo. Sin embargo, no se vieron efectos sobre
el coeficiente respiratorio. El coeficiente respiratorio se define como la relación
entre el volumen de CO2 eliminado y el del O2 absorbido utilizándose para
determinar la oxidación relativa de los sustratos; normalmente es de 0,8 aunque
depende del tipo de macronutriente que se esté oxidando, pudiendo variar entre
0,7 si se oxidan grasas mayoritariamente, hasta 1 si se oxidan hidratos de carbono
(Leaf, 1985). Un coeficiente respiratorio alto podría reflejar una oxidación de
lípidos inferior, lo cual podría ser un indicador de ganancia de peso (Beer‐Borst y
cols., 2000; Schutz, 1995), aunque otros investigadores (Flatt y Guptta, 1999), han
Discusión general
‐102‐
publicado que la eficiencia metabólica podría jugar un papel menor en el desarrollo
de la obesidad.
En relación a la dieta HS (Experimento 1), nuestros datos ayudan a entender
algunos de los efectos discordantes que se han observado en ratas como
consecuencia del empleo de dietas altas en sacarosa. Así, Kanazawa y cols., (2003)
mostraron que la dieta rica en sacarosa, al contrario que la de alto contenido en
grasas, no aumenta el peso corporal en ratas. El modelo experimental de Goodson
S y cols. (2001) es un buen ejemplo de un diseño experimental similar al nuestro,
ya que utilizaron una dieta isoenergética rica en sacarosa y la compararon con
dietas isoenergéticas control y rica en grasas (HFD). Estos investigadores
observaron que las ratas que recibieron la dieta HS ganaron menos peso que las
controles. Sin embargo, otros autores observaron un aumento de la ingesta y el
peso corporal cuando la sacarosa fue proporcionada a los animales en forma de
solución y separada de la comida (Lawton y Blundell, 1992), o como suplemento
(Blundell y Hill, 1988). Goodson y cols. (2001) explicaron este resultado por el
hecho de que en su experimento la sacarosa fue mezcada en la dieta y de que al
administrar la alimentación empleando un modelo ad‐libitum probablemente los
animales no podían reducir su ingesta de alimentos. Sin embargo, los datos de
Goodson y cols. (2001) no van en la misma dirección que los nuestros, que no
pueden ser explicados por diferencias en la ingesta de alimentos, sino sólo por
causa de cambios metabólicos. En este sentido, estudios previos han demostrado
que las dietas ricas en fibra insoluble son capaces de disminuir la ingesta de
alimentos, el vaciado gástrico, la tasa y los niveles de absorción intestinal de grasas,
e influyen en la oxidación y el almacenamiento de grasa provocando una
disminución de la glucosa postprandial y de los niveles de lípidos (Linko y cols.,
2005), mejorando la sensibilidad a la insulina y provocando un menor aumento de
peso (Isken F y cols., 2009). Otra investigación llevada a cabo por Zhang y cols.
(2009) en ratas alimentadas con arroz salvaje, rico en almidón, concluyó que esta
dieta fue capaz de inhibir el aumento del estrés oxidativo y demostró propiedades
beneficiosas en lo referente a los perfiles de lípidos séricos y al estado antioxidante.
Discusión general
‐103‐
Respecto a la dieta HFS (Experimento 2), nuestros resultados confirman que
la distribución y el tipo de macronutrientes de la dieta (en éste caso sacarosa vs.
almidón y grasas saturadas vs. ácidos grasos insaturados) podrían influir en el
desarrollo de trastornos metabólicos (Lomba A y cols., 2010). Son bien conocidas
las propiedades obesogénicas, hiperinsulinémicas e insulino‐resistentes de este
tipo de dieta (Fonseca y cols., 2000). Existen estudios que demuestran que la dieta
HFS favorece el desarrollo de hipertensión y aumenta los niveles de triglicéridos
plasmáticos (Fonseca y cols., 2000). Además, la intolerancia a la glucosa y la
hiperinsulinemia que inducen las dietas HFS pueden indirectamente tener efectos
perjudiciales sobre el hueso, alterando la absorción de calcio (Li y cols., 1990). En
un estudio en ratas realizado por Barnard y cols. (1993), los autores comprobaron
la presencia estadísticamente significativa de placas de ateroma en las arterias
coronarias de las ratas alimentadas con dieta HFS, lo que no se observó en el grupo
control, confirmando el factor de riesgo cardíaco que supone el consumo de ésta
dieta. Por su parte Grimditch y cols. (1988) llevaron a cabo un estudio en ratas en
el que compararon una dieta HFS estándar con otras 3 dietas HFS en las que
variaron el aporte de fibra, de ejercicio físico y de grasas, respectivamente. Los
autores atribuyeron los efectos descritos para la dieta HFS a la presencia de
sacarosa o la ausencia de hidratos de carbono complejos, no a la elevada
proporción de grasas en la dieta, siendo al parecer la sacarosa la principal
responsable de la resistencia a la insulina que no mejoró mediante la adición de
fibra a la dieta o el entrenamiento físico.
La dieta HFD (Experimento 3) empleada en éste estudio aportó un 58% de la
energía en forma de grasa, de la cual el 54% se proporcionó en forma de ácidos
grasos saturados. Este hecho, unido a la baja proporción de hidratos de carbono
consumidos, puede desempeñar un papel importante en el desarrollo de obesidad
y resistencia a la insulina. Así, los ácidos grasos saturados pueden promover estrés
en el retículo endoplasmático y disfunción hepática en roedores (Wang y cols.,
2006). Además, una ingesta de grasas saturadas superior al 10% del total de
energía puede provocar resistencia a la insulina en los seres humanos y, por lo
tanto, puede no ser adecuado para los pacientes con NAFLD (hígado graso no
Discusión general
‐104‐
alcohólico) (Musso y cols., 2003). Por otra parte, las dietas ricas en ácidos grasos
saturados inducen una reducción de la tolerancia a la glucosa en ratas Zucker
(Beylot y cols., 2006). Varios estudios en humanos sugieren que las dietas con bajo
contenido en grasas saturadas y elevada proporción de hidratos de carbono y fibra
dietética mejoran de forma significativa la salud mediante el aumento de la
sensibilidad insulínica y reducen el riesgo de enfermedad cardiovascular (Anderson
y cols., 2000).
En la mitad del período experimental (semana 5) se realizó, en los 3 grupos
experimentales y en el grupo control, un test de sobrecarga intraperitoneal de
glucosa para comprobar si los animales presentaban en ese momento alguna
alteración en el metabolismo de la glucosa. Cuando se realizó este test, la curva de
tolerancia a la glucosa fue mas alta y más prolongada en el tiempo en los grupos
HFS (Experimento 2) y HFD (Experimento 3) respecto al control, según lo descrito
por otros autores después del consumo de dietas HFS (Hattori y cols., 2009), HFD
(Timmers y cols., 2010) y HS (Kergoat y cols., 1987) ad libitum. Por su parte, en el
grupo HFD (Experimento 3), el pico máximo de glucosa en sangre se registró
después de 15 minutos de la administración intraperitoneal de la sobrecarga de
glucosa, lo cual ha sido descrito por otros autores (Timmers y cols., 2010). En los
grupo HS (Experimento 1) y HFS (Experimento 2) este pico máximo de glucosa en
sangre se registró a los 30 minutos de recibir la sobrecarga de glucosa. En este
contexto, en los modelos de dietas ad libitum, la resistencia a la insulina aparece
después de 2 semanas, sin cambios importantes en los triglicéridos séricos, glicerol
plasmático, o la presión arterial, incluso antes de cualquier síntoma de obesidad o
hipertrofia del adipocito (Barnard y cols., 1998). En este sentido, Grimditch y cols.
(1988) han publicado que, de los dos principales componentes de la dieta HFS, el
azúcar refinado causa un daño mayor que el alto contenido en grasa durante las
pruebas de tolerancia a la glucosa. Sin embargo, la combinación de azúcar refinado
y alto contenido graso dio lugar a un empeoramiento de la respuesta.
Por otra parte, Barnard y cols. (1998) demostraron que la aparición de
resistencia insulínica se produce antes de que otras manifestaciones del síndrome
metabólico tengan lugar, siendo la ingesta alimentaria, pero no el aumento de
Discusión general
‐105‐
peso excesivo, la causa subyacente. Además, los estudios en humanos han indicado
también que la resistencia a la insulina suele preceder a otros aspectos del
síndrome metabólico como la dislipidemia y la hipertensión (Mitchell y cols., 1992).
En este sentido, es probable que en el momento de la sobrecarga de glucosa
intraperitoneal, los grupos HFS (Experimento 2) y HFD (Experimento 3) hayan
desarrollado ya un estado temprano de resistencia a la insulina que se caracteriza
por una menor sensibilidad a la misma, no pudiendo compensar sobrecargas
puntuales de glucosa. Sin embargo, no se observaron diferencias en los niveles
séricos de insulina en las condiciones de ayuno tras la finalización del experimento.
En relación con el metabolismo de los lípidos, los niveles circulantes de HDL
y colesterol total disminuyeron significativamente en los grupos HS (Experimento
1) y HFS (Experimento 2), de manera similar a como exponen otros autores (Kirino
y cols., 2009). Esta reducción podría ser, en parte, el resultado de los niveles de
colesterol HDL más bajos, como ha sido descrito previamente por Boqué y cols.
(2009) con una dietas similares (ad libitum) en ratas Wistar, aunque estas
diferencias no fueron estadísticamente significativas. El tipo de carbohidrato
(almidón frente sacarosa) (Dumaswala y cols., 1976) y de grasa en la dieta (Beynen
y Lemmens, 1987) afectan el metabolismo del colesterol en ratas. Sin embargo, el
comportamiento de los triglicéridos séricos fue diferente en estos experimentos,
presentando un ligero aumento (p= 0,09) en el grupo HS respecto al grupo control
(Experimento 1) como se ha descrito también en otros estudios (Frayn y Kingman,
1995; Kanazawa y cols., 2003; Robert y cols., 2008) y siendo estadísticamente
inferiores en el grupo HFS en comparación al grupo de referencia (Experimento 2).
En éste sentido, otros autores han obtenido resultados similares: Boqué y cols.
(2009) llegaron a un resultado parecido en ratas Wistar alimentadas con una dieta
HFS ad libitum durante 35 días, Yamamoto y cols. (2006) en ratas Sprague‐Dawley
que recibieron una dieta HFS durante 4 semanas, y Jourdan y cols. (2010) en
ratones alimentados durante más de 20 semanas con esa misma dieta.
Aunque se considera que la fructosa es un azúcar que puede provocar
hipertrigliceridemia y se cree que para contrarrestar este efecto podría ser útil la
sacarosa (2000), el consumo de sacarosa también parece estar asociado a niveles
Discusión general
‐106‐
elevados de triglicéridos en los seres humanos (1998). Sin embargo, en relación con
otras fuentes de hidratos de carbono, los efectos del consumo de azúcar sobre las
lipoproteínas de alta densidad y los niveles de lipoproteína de baja densidad no
están claros. Los principales carbohidratos alimentarios, el almidón o la sacarosa,
pueden afectar de manera diferente al metabolismo lipídico y al estado
antioxidante en ratas, probablemente al influir en el aclaramiento de triglicéridos y
a través del suministro de micronutrientes antioxidantes proporcionados por los
azúcares complejos en relación con los refinados (Robert y cols., 2008).
Probablemente la conversión de los excedentes de azúcar en triglicéridos podría
estar relacionada con un aumento de la lipogénesis hepática.
En éste sentido, los resultados de los Experimentos 1 y 2 sugieren un
aumento del aclaramiento de triglicéridos por el hígado y el tejido adiposo,
confirmando las diferencias en cuanto al metabolismo de los lípidos entre los
modelos roedores y humanos. En el Experimento 3 los niveles de triglicéridos
séricos en el grupo HFD y C fueron similares entre sí, sugiriendo que el efecto era
provocado por el azúcar de la dieta.
En relación con los triglicéridos hepáticos, estos lípidos aumentaron en los 3
experimentos llevados a cabo en éste trabajo, de forma ligera en el grupo HS
(Experimento 1), probablemente mediado por un aumento de la lipogénesis
hepática, y muy marcadamente en los grupos HFS (Experimento 2) y HFD
(Experimento 3). Estos datos sugieren una alteración del metabolismo lipídico y
esteatosis hepática leve. Es bien conocido que el consumo de un tercio más de
calorías en forma de grasa dietética, pero no de carbohidratos, produce esteatosis
en ratas (Ahmed y cols., 2009). Estos autores indican que la distribución y
utilización de este exceso de grasa en el hígado en el grupo HFD ad libitum
proporciona el primer evento en el desarrollo de NAFLD en ratas Sprague‐Dawley.
En algunos estudios en humanos (Ceriello y cols., 1998; Liu y cols., 2002),
pero no en todos (Ma y cols., 2005), un mayor consumo de alimentos y bebidas con
alto contenido en azúcar se asocia con aumento de la inflamación y el estrés
oxidativo. Sin embargo, pocos estudios han evaluado los efectos del consumo de
Discusión general
‐107‐
azúcar a largo plazo en los marcadores de estrés oxidativo y la inflamación
(Johnson y cols., 2009). En éste sentido, el malondialdehído (MDA) es considerado
el principal producto de autooxidación de los ácidos grasos poliinsaturados o sus
ésteres y sus concentraciones plasmáticas se emplean con frecuencia como
marcador de estrés oxidativo en humanos (Grotto y cols., 2007) y roedores (Ahmed
y cols., 2009) Este estado oxidativo sistémico se evaluó mediante la detección de la
peroxidación lipídica de malondialdehído y se determinó como especies reactivas
del ácido tíobarbitúrico (TBARS) (Vetelainen y cols., 2007). Al determinar los niveles
de MDA hepático, en los 3 experimentos se obtuvieron mayores niveles en los
grupos tratados con las dietas experimentales respecto al grupo C, pero estas
diferencias solo resultaron estadísticamente significativas en el grupo HFS
(Experimento 2). Otros autores han observado aumentos similares en el estrés
oxidativo con modelos ad libitum empleando dietas HFS (Yamamoto y Oue E, 2006),
HFD (Dobrian y cols., 2001) y dietas de cafetería (Milagro y cols., 2006). La
peroxidación de lípidos conlleva la reducción de la capacidad oxidativa
mitocondrial hepática y una mayor susceptibilidad al daño hepático y esteatosis
(Thyfault y cols., 2009). En este sentido, los ácidos grasos saturados pueden
promover el estrés del retículo endoplásmático del hepatocito y el daño del mismo,
dando lugar al desarrollo de disfunción hepática en roedores (Wang y cols., 2006).
El estado inflamatorio relacionado con la obesidad también puede ser originado
por el estrés oxidativo, el cual induce lesiones celulares y podría ser capaz de
alterar la producción de adipocitoquinas y la sensibilidad a la insulina (Furukawa y
cols., 2004).
Entre las adipocitoquinas se encuentra la adiponectina, ampliamente
descrita como un factor de sensibilidad a la insulina con efectos antidiabético y
antiaterogénico (Kadowaki y cols., 2006) que sólo se expresa en los adipocitos
maduros (Ahima, 2006; Kadowaki y cols., 2006). De los 3 experimentos realizados,
sólo se obtuvo una tendencia a la significación estadística en relación con la
adiponectina en el Experimento 3 (HFD‐C), resultando mayores sus niveles en el
grupo HFD. En este sentido, la expresión de adiponectina se reduce generalmente
en modelos de roedores obesos y resistentes a la insulina, mientras que los niveles
Discusión general
‐108‐
plasmáticos de adiponectina suelen ser menores en las personas obesas,
particularmente en aquellas con obesidad visceral (Kadowaki y cols., 2006). Sin
embargo, hay informes de que las dietas HFD inducen la expresión de adiponectina
en los adipocitos de roedores en etapas tempranas (Li y cols., 2002) o tardías
(Stroubini y cols., 2009) de la alimentación con dichas dietas. Es probable que el
ligero aumento observado en el grupo HFD pueda estar relacionado con un
mecanismo de compensación contra la resistencia a la adiponectina, como otros
autores han sugerido con anterioridad (Stroubini y cols., 2009).
3. ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN GÉNICA Y METILACIÓN DEL
ADN EN GENES CLAVE DEL METABOLISMO LIPÍDICO Y
GLUCÍDICO
El mantenimiento del peso corporal está sometido a un control estricto en
el que participan diversos mecanismos condicionados tanto por la carga genética,
como por factores ambientales relacionados con el estilo de vida (Marti y cols.,
2008; Perusse y cols., 2005). Entre los diferentes mecanismos que podrían provocar
diferencias interindividuales relativas al desarrollo de la obesidad y otras
enfermedades metabólicas, la regulación epigenética de la expresión génica ha
emergido en los últimos años como un factor potencialmente importante
(Campion y cols., 2009b). En este contexto, no sólo la ingesta de los donantes de
grupos metilo (betaína, colina, metionina, zinc y ácido fólico) podría modificar la
metilación del ADN, sino también podrían estar involucrados algunos
macronutrientes tales como los ácidos grasos (Waterland y Rached, 2006). Entre
los inhibidores naturales de las histonas deacetilasas (HDACs) que pueden ser
obtenidos a través de la dieta, el butirato y, en menor medida, el propionato son
los ácidos grasos de cadena corta más relevantes. Ambos son producidos por la
fermentación microbiana de la fibra dietética en el intestino grueso e inhiben las
HDAC tipo I, II y IV (Waldecker y cols., 2008). Otros inhibidores clásicos de HDACs
presentes en los alimentos son el disulfuro de dialilo, presente en el ajo (Druesne‐
Discusión general
‐109‐
Pecollo y cols., 2007), el sulforafano, de las crucíferas (Myzak y cols., 2006) y la
genisteína, una isoflavona de soja con actividades antiestrogénicas (Basak y cols.,
2008).
La posible reversibilidad de la metilación del ADN hace de la epigenética un
blanco atractivo para la intervención terapéutica de enfermedades como el cáncer,
la diabetes tipo 2 y la obesidad (Dolinoy y Jirtle , 2008; Zardo y cols., 2008). En este
contexto, se han descrito diferentes genes humanos en cuya regulación influyen
mecanismos epigenéticos en relación con enfermedades metabólicas (Campion y
cols., 2009b), como HSD11B2 (hipertensión), PPAR‐gamma (arteriosclerosis) o
PPARGC1 (diabetes). Otros genes implicados en el desarrollo de la obesidad, como
la leptina (Milagro y cols., 2009) y TNF‐alfa (Campion y cols., 2009a), parecen estar
regulados también por mecanismos epigenéticos.
En éste sentido, en este proyecto de investigación se estudió la expresión
génica y regulación epigenética de 4 genes directamente implicados en el
mantenimiento de la homeostasis energética: NDUFB6 (oxidación mitocondrial),
FAS (lipogénesis de novo), HADHB (β‐oxidación) y GCK (glucolisis).
Discusión general
‐110‐
Figura 10. Genes y vías metabólicas implicadas en el estudio llevado a cabo en el presente trabajo de investigación.
Respecto a NDUFB6, este gen codifica para una proteína de la membrana
mitocondrial interna que participa en el transporte electrónico mitocondrial
(Smeitink y van den Heuvel, 1999). La proteína codificada por NDUFB6 es una
subunidad del complejo I ubiquinona oxidorreductasa que se encuentra en la
membrana mitocondrial interna. Esta proteína tiene actividades NADH
TEJIDO ADIPOSO
Glucosa
Glucosa‐6P
GCK
Fructosa‐6P
Fructosa 1,6‐bis P
Gliceraldehído‐P
1,3‐bisfosfoglicerato
3‐fosfoglicerato
2‐fosfoglicerato
Fosfoenolpiruvato
Piruvato
Acetil‐CoAMalonil‐CoAAcil‐CoA AGTGFAS
CITOPLASMA CELULAR
NÚCLEO
NDUFB6
NDUFB6
CICLO DE KREBS
HADHB
MITOCONDRIA
β‐oxidación
Cadena transportadorade electrones
Glucolisis
Lipogénesis
TEJIDO ADIPOSO
Glucosa
Glucosa‐6P
GCKGCK
Fructosa‐6P
Fructosa 1,6‐bis P
Gliceraldehído‐P
1,3‐bisfosfoglicerato
3‐fosfoglicerato
2‐fosfoglicerato
Fosfoenolpiruvato
Piruvato
Acetil‐CoAMalonil‐CoAAcil‐CoA AGTGFAS
Acetil‐CoAMalonil‐CoAAcil‐CoA AGTGFASFAS
CITOPLASMA CELULAR
NÚCLEO
NDUFB6
NDUFB6
CICLO DE KREBS
HADHB
MITOCONDRIA
β‐oxidación
Cadena transportadorade electrones
Cadena transportadorade electrones
Glucolisis
Lipogénesis
Discusión general
‐111‐
deshidrogenasa y oxidorreductasa, y transfiere electrones desde el NADH a la
cadena respiratoria (Smeitink y van den Heuvel, 1999). El aceptor de electrones
inmediato de la enzima se cree que es la ubiquinona (Willems y cols., 2009). El
complejo I tiene un papel clave en la regulación de la fosforilación oxidativa
(OXPHOS), y NDUFB6 está entre el conjunto de genes que muestran una reducción
significativa de OXPHOS en el músculo de pacientes con diabetes tipo 2 en
comparación con los sujetos control sanos (Bianchi y cols., 2004; Mootha y cols.,
2003).
En éste sentido se obtuvo una reducción significativa de la expresión de
éste gen en el tejido adiposo epididimal con las dietas HS (Experimento 1) y HFD
(Experimento 3), aunque no se observaron diferencias de expresión génica en el
tejido hepático. Estudios previos han documentado que la expresión de este gen
fue menor en el músculo esquelético humano de sujetos diabéticos, estando
probablemente asociado a la resistencia insulínica mediante el control de la
fosforilación oxidativa (Ling y cols., 2007). Este estudio sugiere que una
disminución en la expresión de NDUFB6 podría estar relacionada con el desarrollo
de resistencia a la insulina. En nuestro caso, NDUFB6 presenta una reducción de su
expresión en el tejido adiposo epididimal del grupo alimentado con las dietas HS
(Experimento 1) y HFD (Experimento 3), y aunque no registramos diferencias
estadísticamente significativas en la glucosa circulante y en los niveles de insulina,
ambos parámetros son ligeramente superiores en estos grupos. Por lo tanto,
nuestro estudio es el primero en investigar la expresión de NDUFB6, un
componente clave de la cadena respiratoria, en el tejido adiposo, y su correlación
con una dieta obesogénica. Nuestros resultados sugieren un deterioro en la
fosforilación oxidativa mitocondrial del adipocito que parece ser específico de las
ratas alimentadas con este tipo de dietas, dado que la expresión de NDUFB6 se
modifica en el tejido adiposo visceral, incluso cuando la cantidad de calorías es
similar a la del grupo control, alimentado con una dieta no obesigénica (Lomba y
cols., 2009).
En relación a los estudios epigenéticos en NDUFB6, solo fueron realizados
en el Experimento 3 (C‐HFD), obteniendo una hipermetilación estadísticamente
Discusión general
‐112‐
significativa en el grupo HFD en la posición +143 / +158, mientras que el gen se
encontró significativamente hipometilado en las posiciones ‐7 / +3 / +14 y +34 y
ligeramente hipometilado (p = 0,08) en la posición +36 / +46 /+ 58 en relación al
grupo control. En este sentido, Ling y cols. (2007) demostraron que los patrones de
metilación del ADN en NDUFB6 se asocian con una disminución dependiente de la
edad en su expresión en el músculo esquelético, abriendo la posibilidad de que las
marcas epigenéticas puedan predisponer al individuo a la resistencia a la insulina y
diabetes mellitus tipo 2. No existe hasta el momento ningún otro estudio que
relacione éste gen con variaciones epigenéticas.
Por su parte el enzima FAS cataliza la síntesis de ácidos grasos de cadena
larga a partir de acetil‐CoA y malonil‐CoA y es uno de los pasos que limita la
velocidad de la lipogénesis de novo (Ronti y cols., 2006). En nuestro caso, el estudio
de expresión del gen que codifica para el enzima FAS se llevó a cabo en hígado en
el Experimento 2 (C‐HFS), mientras que en el Experimento 3 (C‐HFD) se analizó este
gen en el tejido adiposo blanco, resultando en ambos casos reducida la expresión
en el grupo tratado respecto al control, aunque ésta reducción solo fue
estadísticamente significativa en el grupo HFD (Experimento 3). El balance
energético es fisiológicamente importante en la regulación de FAS y, por lo general,
las dietas con alta proporción de carbohidratos y baja en grasas aumentan su
expresión (Semenkovich, 1997). La dieta HFD empleada es de composición opuesta,
siendo más elevada en grasas y menor su proporción en hidratos de carbono, y
esto parece explicar la reducción de la expresión de FAS.
Los estudios epigenéticos en FAS se llevaron a cabo en el Experimento 3,
resultando hipometilada significativamente solo la posición ‐833 / ‐839 del
promotor del gen para el grupo alimentado con dieta HFD. Al parecer, este es el
primer trabajo que aborda el estudio epigenético de FAS en relación con la
obesidad. Sin embargo, la expresión y los patrones de metilación de este gen se
han estudiado como factor de predicción en varios tipos de tumores (Nosho y cols.,
2008; Ogino y cols., 2007). En estos estudios, las variaciones en los niveles de
metilación de FAS se han asociado con una mayor susceptibilidad a diferentes tipos
de cáncer.
Discusión general
‐113‐
En relación a HADHB, este gen codifica para una proteína trifuncional (Orii y
cols., 1999) de la membrana mitocondrial interna formada por subunidades α y β
que contribuye a tres de las cuatro reacciones necesarias para la β‐oxidación
mitocondrial de ácidos grasos de cadena larga (Kamijo y cols., 1994). La deficiencia
de HADHB causa el metabolismo anormal de los ácidos grasos (Yeh y cols., 2006).
La expresión génica de HADHB fue estudiada en los Experimentos 2 (C‐HFS) y 3 (C‐
HFD), pero solo resultó estadísticamente significativa en el Experimento 2, donde
se observó un incremento de su expresión hepática en el grupo alimentado con la
dieta HFS. Sobre la regulación dietética de este gen, Oshida y cols. (1999)
informaron de que la actividad de HADHB en el músculo resultó mayor en ratas
alimentadas con una dieta alta en sacarosa. Según estos investigadores, el grupo
con alta proporción de sacarosa en la dieta mostró un patrón metabólico en los
músculos que favorecía la oxidación de carbohidratos sobre la de grasa. Un estudio
posterior en humanos demostró que la actividad HADHB aumentó cuando se
produjo la oxidación de palmitato (Ribet y cols., 2010). Estos resultados sugieren
que este enzima aumenta su rendimiento en presencia de ácidos grasos. En el caso
del Experimento 3 (C‐HFD), aunque las diferencias no tuvieron relevancia
estadística, se observó una ligera disminución de la expresión de HADHB en el
tejido adiposo epididimal del grupo alimentado con la dieta HFD. Este hallazgo
sugiere que la capacidad de este tejido para la oxidación de triglicéridos se ve
afectada, lo cual contribuye probablemente a la adiposidad inducida por la dieta
HFD. Respecto al estudio epigenético llevado a cabo para HADHB en el
Experimento 2, no se registraron cambios en el patrón de metilación en ninguna de
las 6 islas CpGs analizadas. Al parecer no existen estudios en la bibliografía
relacionados con el patrón de metilación de este gen. Por lo tanto, este trabajo es
el primero en analizar la regulación epigenética de HADHB en respuesta a factores
dietéticos o metabólicos, aunque no se encontraron diferencias ni en el tejido
adiposo epididimal ni en el hígado. De todos modos, como los cambios en la
expresión de genes aparentemente no se correlacionaron con los niveles de
metilación en las regiones promotoras investigadas, deben llevarse a cabo más
estudios para verificar la importancia de los mecanismos epigenéticos inducidos
por la dieta en la regulación de la homeostasis energética.
Discusión general
‐114‐
Finalmente la glucokinasa (GCK) es clave en la homeostasis energética ya
que participa en la fosforilación de la glucosa en el hígado como primer paso de la
vía glucolítica. La glucokinasa cataliza el paso limitante de la glucólisis: la
fosforilación de la glucosa en glucosa‐6‐fosfato. En el hígado, la actividad GCK
determina la tasa de utilización de glucosa y la síntesis del glucógeno (Gorman y
cols., 2008). La importancia de GCK en el ser humano se pone de manifiesto por el
hecho de que las mutaciones heterocigotas de GCK llevan a la pérdida de su
función y causar diabetes MODY 2 (Maturity Onset Diabetes of the Young), una
enfermedad caracterizada por su inicio precoz y la hiperglucemia persistente
(Stoffel y cols., 1992). Su expresión se activa en pacientes con diabetes tipo 2 (Caro
y cols., 1995). El estudio de la expresión de éste gen solo se llevó a cabo en el
experimento 2 (C‐HFS) observándose un ligero aumento (aunque no
estadísticamente significativo) en el grupo HFS, al igual que han observado otros
autores (Perez y cols., 1998). En lo que respecta a los estudios epigenéticos, no se
detectaron cambios en el patrón de metilación de GCK. Sólo una publicación ha
abordado el estudio de la metilación de este gen, aunque en relación con el
proceso de envejecimiento (Jiang y cols., 2008). Aún no existen trabajos que hayan
investigado su papel en estudios nutricionales (Lomba y cols., 2010)
Discusión general
‐115‐
Tabla 9. Resumen de los principales hallazgos obtenidos en los 3 Experimentos llevados a cabo en el presente trabajo de investigación. Todos los grupos de
experimentación fueron comparados respecto al grupo control). Las flechas (↑↓) indican cambios significativos en la variable. =; sin cambios. HS, dieta con alta proporción de azúcares simples y baja de complejos; HFS, dieta con alta proporción de grasas y azúcares simples; HFD, dieta con alto porcentaje en grasas.
Los resultados de este trabajo permiten afirmar que la ingesta de dietas
isocalóricas con diferente distribución de macronutrientes (almidón vs. sacarosa,
hidratos de carbono vs. grasas) sin diferencias en cuanto a la ingesta de energía
(pair‐fed), podrían desempeñar un papel importante en el desarrollo de la
obesidad y enfermedades asociadas. La ingesta crónica de dietas isocalóricas HS,
HFS y HFD afecta a la expresión de genes clave en la regulación del metabolismo
energético tanto en hígado como en tejido adiposo. El consumo continuado de
este tipo de dietas es capaz de modificar el patrón de metilación del ADN de
algunos de estos genes, lo que sugiere la importancia de la epigenética como diana
terapéutica en el estudio de la obesidad y sus comorbilidades asociadas.
DIETAS
RESULTADOS DE MAYOR INTERÉS OBTENIDOS
PESO COLESTEROL
TOTAL HDL
TG
SÉRICOS HEPÁTICOS
MDA(TBARS)
EXPRESIÓNGÉNICA
METILACIÓNDEL ADN
HS
HFS
HFD
Experimento 1
Experimento 2
Experimento 3= =
p=0,09 p=0,09
=
( ) ( )
=
=NDUFB6
Epi
HADHB Hígado
FAS y NDUFB6
Epi
HADHB y GCKHígado
=
1 CpG FAS
3 CpGNDUFB6 1 CpGNDUFB6
No determinada
Epi
DIETAS
RESULTADOS DE MAYOR INTERÉS OBTENIDOS
PESO COLESTEROL
TOTAL HDL
COLESTEROL
TOTAL HDL
TG
SÉRICOS HEPÁTICOS
MDA(TBARS)
EXPRESIÓNGÉNICA
METILACIÓNDEL ADN
HS
HFS
HFD
Experimento 1
Experimento 2
Experimento 3= =
p=0,09 p=0,09
=
( ) ( )( )
=
=NDUFB6
Epi
HADHB Hígado
FAS y NDUFB6
Epi
HADHB y GCKHígado
=
1 CpG FAS
3 CpGNDUFB6 1 CpGNDUFB6
No determinada
Epi
CONCLUSIONES
Conclusiones
‐117‐
El presente trabajo de investigación ha permitido llegar a las siguientes
conclusiones:
1. La ingesta de dietas con exceso en el contenido de grasas (HFD), grasas y
azúcares simples (HFS) o alta proporción de azúcares simples y baja de
complejos (HS) produce un exceso de peso de forma independiente a la
ingesta total de energía, lo que sugiere que la distribución y el tipo de
macronutrientes ingeridos juegan un papel importante en el inicio de la
obesidad y el desarrollo de las complicaciones metabólicas asociadas.
2. La ganancia de peso (g/día) hallada en los distintos grupos dietéticos
alimentados con dietas ricas en grasas (HFD), grasas y azúcares simples
(HFS) o elevada proporción de azúcares simples (HS) fue similar entre sí,
mostrando todos ellos mayor adiposidad visceral y total que el grupo
control.
3. Los grupos experimentales con distinto contenido en grasas y azúcares (HS,
HFS y HFD) presentaron un aumento de los niveles de triglicéridos
hepáticos, sugiriendo un estado de esteatosis hepática leve. Además, el
tratamiento dietético en el grupo HFS (dieta rica en grasas y azúcares
simples) provocó un incremento significativo de los niveles de
malondialdehído hepático, indicando un incremento del estrés oxidativo,
así como una reducción significativa de los triglicéridos séricos.
4. Los estudios de expresión génica en el tejido adiposo epididimal de los
animales, tras la ingesta durante 10 semanas de una dieta isocalórica rica
en sacarosa (HS), mostraron una reducción de la expresión de NDUFB6
(oxidación mitocondrial) en el grupo HS respecto al grupo control. Estos
datos sugieren un deterioro de la fosforilación oxidativa mitocondrial del
adipocito que parece ser específico de las ratas alimentadas con ese tipo de
dieta.
5. La ingesta crónica de una dieta HFS, administrada según un modelo pair‐fed,
cursó con un aumento de la expresión hepática de HADHB, un gen clave en
Conclusiones
‐118‐
la oxidación lipídica, y GCK, regulador de la glucolisis. Sin embargo, los
patrones de metilación de los genes GCK y HADHB en el hígado no
mostraron modificaciones, lo que apunta a que los cambios de expresión
génica probablemente no se deban a cambios en la metilación del ADN sino
que existen otros factores más determinantes en la regulación de la
expresión de estos genes.
6. La ingesta crónica isocalórica de una dieta HFD rica en grasas saturadas,
administrada según un modelo pair‐fed, afecta a la expresión en el tejido
adiposo epididimal de genes clave que regulan el metabolismo energético,
incluyendo la lipogénesis (FAS) y las funciones mitocondriales (NDUFB6).
7. El consumo continuado de una dieta rica en grasas (HFD) y/o la ganancia de
peso asociada, es capaz de modificar el patrón de metilación del ADN de
FAS y NDUFB6 en el tejido adiposo epididimal, aunque también existen
otros factores que podrían influir a éste nivel como son las modificaciones
histónicas y diferentes factores transcripcionales.
La conclusión general de este trabajo es que la distribución de
macronutrientes de la dieta, sin diferencias en cuanto a la ingesta calórica total,
podría desempeñar un papel importante en el aumento de peso y las
manifestaciones del síndrome metabólico, al afectar específicamente a la
expresión de genes clave del metabolismo energético. El consumo mantenido de
dietas con una proporción de macronutrientes no saludable es capaz de modificar
en ciertos casos el patrón de metilación de algunos genes involucrados en el
mantenimiento de la homeostasis energética, lo que podría afectar a la expresión
de genes clave del metabolismo energético implicados en la obesidad y el
síndrome metabólico a través de mecanismos epigenéticos.
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