Jorge Monserrat Sanz
Prácticas de Inmunología (2.5h) Aula 23 15:00-17:30
1. Primer día: Seminarios Interactivos (2.5 horas): Fundamentos en Inmunofluorescencia y Citometría de flujo.
2. Segundo día: Aplicaciones de la citometría de flujo.
3. Tercer día: Análisis de imágenes de citometría de flujo. Problemas. (Cae un problema en el examen)
4. Cuarto día: Problem Based Learning
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Fundamentos y aplicaciones analíticas y separativas
de la inmunofluorescenciay la citometría de flujo
Asignatura de InmunologíaUniversidad de Alcalá
Unidad mixta
CSIC/UAH
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ObjetivosObjetivos•• 1. Comprender los requisitos que deben cumplir los m1. Comprender los requisitos que deben cumplir los méétodos para el todos para el
estudio de la heterogeneidad celular.estudio de la heterogeneidad celular.
•• 2. Comprender los fundamentos de la citometr2. Comprender los fundamentos de la citometríía de flujo.a de flujo.
•• 3. Comprender las etapas en el proceso de la informaci3. Comprender las etapas en el proceso de la informacióón obtenida n obtenida
por citometrpor citometríía.a.
•• 4. Conocer las aplicaciones de estas t4. Conocer las aplicaciones de estas téécnicas.cnicas.
•• 5. Conocer como se realizan estudios de citometr5. Conocer como se realizan estudios de citometríía de flujoa de flujo
•• 6. Interpretar y evaluar cr6. Interpretar y evaluar crííticamente los resultados de estos estudiosticamente los resultados de estos estudios..
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Relevancia
1. Estudio directo de las patologías mediante esta tecnología:Conocimiento y búsqueda de información de carácter
pronóstico
2. Interpretación de vuestra fuente de lectura: la bibliografía de toda la comunidad científica biomédica
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Heterogeneidad celular en el sistema inmune
CD19CD19
CD3CD3
CD56CD56
CD4CD4 CD8CD8
CD2CD2
CD45
CD14
CD45RACD45RA CD45RACD45RA CD45RACD45ROCD45RO CD45ROCD45RO
CD15
NeuNeuMonoMonoBBNKNKT4T4 T8T8
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Criterios de caracterizaciCriterios de caracterizacióón de los tipos celularesn de los tipos celulares
•• CelularesCelulares–– MorfologMorfologíía al microscopio.a al microscopio.
•• MolecularesMoleculares–– GenotGenotíípicopico. (Genoma) Recombinaciones som. (Genoma) Recombinaciones somááticasticas–– FenotFenotíípico (pico (ProteomaProteoma) ) RNARNA expresado, expresado, proteproteíínas.nas.–– CitomaCitoma: An: Anáálisis estadlisis estadíístico stico multimulti--celular.celular.
-- AntAntíígenos de diferenciacigenos de diferenciacióón linfocitarian linfocitariaLos antLos antíígenos de superficie pueden ser utilizados como genos de superficie pueden ser utilizados como marcadores marcadores
especespecííficosficos de lde lííneas, tipos y subtipos celulares. neas, tipos y subtipos celulares.
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Para estudiar la heterogeneidad celular Para estudiar la heterogeneidad celular son necesarias tson necesarias téécnicas:cnicas:
•• 1. Con resoluci1. Con resolucióón a nivel de cn a nivel de céélula individual lula individual
•• 2. Que caractericen la c2. Que caractericen la céélula en funcilula en funcióón de varias n de varias caractercaracteríísticas (parsticas (paráámetros). metros). X, Y, Z...X, Y, Z...
•• 3. Capaces de realizar medidas en n3. Capaces de realizar medidas en núúmeros representativos meros representativos de cde céélulas. lulas. 100 c100 céélulas error lulas error ±± 10%,10%, 10.000 error 10.000 error ±± 1%1%
•• 4. Capaces de almacenar, procesar, representar, analizar y 4. Capaces de almacenar, procesar, representar, analizar y reducir toda esa informacireducir toda esa informacióón sobre cn sobre céélulas individuales en lulas individuales en conclusiones conclusiones úútiles acerca de las poblaciones celulares.tiles acerca de las poblaciones celulares.
Jorge Monserrat Sanz0 256 512 768 1024
4C5144001 FSC-Height ->
GranulocitosGranulocitosCD15+CD15+
MonocitosMonocitosCD14+CD14+
LinfocitosLinfocitosCD3+CD3+
Τ2αβΤ2αβΤ1γδΤ1γδCD4+CD4+CD8+CD8+
CD56+CD56+CD19+CD19+
CD5+CD5+CD5CD5--
MorfologMorfologíía y anta y antíígenos de diferenciacigenos de diferenciacióón en el ann en el anáálisis de lisis de la heterogeneidad celularla heterogeneidad celular
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Fases de la citometría: Fases de la citometría: 1. Pre-citometría:
1. Anticuerpos monoclonales y sondas:1. Estudio a nivel tisular2. Estudio a nivel celular
2. Técnicas de separación celular3. Técnicas en Inmunofluorescencia
2. Citometría(Alternativas: Microscopia de fluorescencia, Confocal, Genética Molecular…)
3. Análisis cuantitativo4. Análisis biológico.
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Anticuerpos como herramientas en investigación
• Ventaja• Capacidad de reconocimiento muy específica• Detección muy sensible picomolar• Inconveniente• Son invisibles
– Conjugación con moléculas “reporter”• Radioisótopos: RIA, Rosalyn Yalow 1977
• Enzimas: ELISA, inmunohistoquímica
• Moléculas fluorescentes: inmunofluorescencia, citometría de flujo, LSC.
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Técnicas de separación celular
• Gradientes de densidad: Medios de densidad constanteGradientes continuos o discontinuos
• Elutriación centrifuga• Sorting: - Magnético
- Sorter
-- Células en tejidos:Células en tejidos:
-- Células en disolución::
1. Inmunohistoquímica2. Procesamiento mécanico3. Separación por mallas y filtros
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Técnica de separación mediante Técnica de separación mediante FicollFicoll--HypaqueHypaque
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DirectoDirecto IndirectoIndirecto BiotinadoBiotinado11
22
11
22
11bb
bb
bbbb bb
bb
bbbb
bb
bb bb
bb
Tipos de marcajes inmunofluorescentes
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Microscopia de fluorescenciaMicroscopia de fluorescencia
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FUNDAMENTOS DE LA
CITOMETRÍA DE FLUJO
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¿Qué es la citometría de flujo?
FSC
90º90º2- 4º
Columna de muestra
Meeting Meeting pointpointLáserLáser
Detecto
res de lu
z
Detecto
res de lu
z
AmplificaciónAmplificacióndigitalizacióndigitalización
RepresentaciónRepresentacióny y AnalisisAnalisis
FlujoFlujo
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VENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJOVENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO-- Medidas multiparamétricas (x, y, z) en grandes números de Medidas multiparamétricas (x, y, z) en grandes números de
células individuales (miles).células individuales (miles).
-- Aumento en la representatividad de las muestras estudiadas y enAumento en la representatividad de las muestras estudiadas y en
la precisión de las medidas.la precisión de las medidas.
-- A menor tiempo de dedicación mayor productividad. A menor tiempo de dedicación mayor productividad.
DESVENTAJASDESVENTAJASLa citometría de flujo no aporta información sobre la distribuciLa citometría de flujo no aporta información sobre la distribución ón
espacial de las células estudiadas.espacial de las células estudiadas.
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CitómetroCitómetro de de flujoflujo
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¿Cómo funciona un citómetro?• Sistema de flujo• Dispersión de la luz• Fluorescencia• Separación y detección de la luz• Amplificación• Corrección de errores: solapamiento espectral y formación
de dobletes• Digitalización y almacenamiento de la información
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SISTEMA DE ABSORCION DE SISTEMA DE ABSORCION DE MUESTRAMUESTRA
MUESTRAMUESTRA
AIREAIRE
FLUJOFLUJOMUESTRAMUESTRA
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Cámarade flujo
FSC
90º90º
Fluido envolvente
Columna de muestra
Luz dispersada lateralmente Luz dispersada lateralmente y luz fluorescente, y luz fluorescente, α α = 90= 90º
Luz incidenteLuz incidente
Luz dispersada hacia delante, Luz dispersada hacia delante, αα==2- 4º
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INFORMACIÓN QUE SE OBTIENE: LUZINFORMACIÓN QUE SE OBTIENE: LUZ
-- PROPIEDADES AL ATRAVESAR LA LUZ:PROPIEDADES AL ATRAVESAR LA LUZ:-- LUZ REFLEJADA O DIFRACTADALUZ REFLEJADA O DIFRACTADA
-- PROPIEDADES FLUORESCENTES:PROPIEDADES FLUORESCENTES:-- FLUOROCROMOS (FITC, PE, APC, TC…) FLUOROCROMOS (FITC, PE, APC, TC…)
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Luz dispersada a 90 grados
Detector
Detector de 90º
Laser
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DETECCION DE LUZ DISPERSADA DETECCION DE LUZ DISPERSADA HACIA DELANTE (FORWARD HACIA DELANTE (FORWARD
SCATTERED LIGHT, FSC)SCATTERED LIGHT, FSC)
FSCFSC
SSCSSC
El detector de FSC El detector de FSC convierteconvierte luzluz dispersadadispersada haciahaciadelantedelante en un en un pulsopulso de de voltajevoltaje proporcionalproporcional al al tamañotamaño
de la de la célula/particulacélula/particula
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DETECCION DE LUZ DISPERSADA DETECCION DE LUZ DISPERSADA LATERALMENTE (SIDE SCATTERED LIGHT, LATERALMENTE (SIDE SCATTERED LIGHT,
SSC)SSC)
FSCFSC
SSCSSC
El detector de SSC El detector de SSC convierteconvierte la la luzluz dispersadadispersada lateralmentelateralmenteen un en un pulsopulso de de voltajevoltaje proporcionalproporcional a l a l contenidocontenido en en
orgánulosorgánulos membranososmembranosos ((granularidadgranularidad))
Jorge Monserrat Sanz0 256 512 768 1024
4C5144001 FSC-Height ->
GranulocitosGranulocitosCD15+CD15+
MonocitosMonocitosCD14+CD14+
LinfocitosLinfocitosCD3+CD3+
Τ2αβΤ2αβΤ1γδΤ1γδCD4+CD4+CD8+CD8+
CD56+CD56+CD19+CD19+
CD5+CD5+CD5CD5--
MorfologMorfologíía y anta y antíígenos de diferenciacigenos de diferenciacióón en el ann en el anáálisis de lisis de la heterogeneidad celularla heterogeneidad celular
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Laser
Detectores de fluorescencia
Freq
Fluorescencia
Detector
Detector de fluorescencia(PMT3, PMT4 etc.)
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Fluorescencia
FSCFSC
FLFL--11
FLFL--22
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Imagen de Fluorescencia: Doble Marcaje CD16 PE y CD3 Imagen de Fluorescencia: Doble Marcaje CD16 PE y CD3 PercpPercp
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Fluorescencia• Proceso por el que una molécula absorbe luz, aumenta su
energía y vuelve al estado basal emitiendo un fotón.• Parte de la energía se pierde en las transiciones entre los
distintos estados por tanto el fotón emitido tiene menos energía (mayor longitud de onda) que el que fue absorbido.
t (t (μμss))
EE
λλ11<<λλ22
λλ 11
λλ 22
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Espectros• Espectro de Absorción
– Representación de la intensidad de absorción de luz de distintas las longitudes de onda por una sustancia.
• Espectro de Emisión– Representación de la intensidad de emisión de una sustancia
excitada con luz de una determinada longitud de onda.
λ (nm)
excitaciónexcitación medidamedida
Inte
nsid
ad d
e In
tens
idad
de
fluo r
esce
n cia
fluo r
esce
n cia
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FluoresceinaFluoresceina (FITC)(FITC)
400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
Relat
ive I
nten
sity
Wavelength
ProteinasProteinas
ExcitaciónExcitación EmisiónEmisión300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
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EtidioEtidio
PEPE
AcidoAcido ParináricoParinárico
Texas RedTexas Red
PEPE--TR Conj.TR Conj.
PIPI
FITCFITC
600 nm300 nm 500 nm 700 nm400 nm457350 514 610 632488Laseres
comunes
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FluorocromosFluorocromos
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SondasSondas
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Proceso de señales• 1. Separación de señales luminosas
• 2. Detección de señales luminosas
• 3. Amplificación de señales eléctricas
• 4. Corrección de errores – Compensación de señales
– Discriminación de señales debidas a dobletes (proceso de pulsos).
•• 6. Transformaci6. Transformacióón de sen de seññales elales elééctricas analctricas analóógicas en digitalesgicas en digitales
•• 7. Almacenamiento matricial (7. Almacenamiento matricial (listlist modemode) de la informaci) de la informacióón n resultanteresultante
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PMT
PMT
PMT
PMT
FiltrosDicroicos
BandpassFiltros
Optica en los citómetros de flujo
Laser
1
2
3
4
Flujo Celular
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DETECCIÓN DE FLUORESCENCIADETECCIÓN DE FLUORESCENCIATC
PerCPQR
Cy5APC
FL-1 FL-2 FL-3 FL-4DetectoresDetectores
FluorocromosFluorocromos
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Amplificación de señales
• Lineal• (intervalos regulares) • apropiada para:
– Señales que oscilan en un rango limitado (0-1.000)
– Con distribuciones con picos estrechos como el contenido en DNA.
• Logarítmica • (intervalos crecientes)
– Cubre un rango más amplio de variación de la señal (0-10.000).
1001001010 200200
100100 2002001010 10001000
101011 2020
100100 2002001010 10001000
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EscalasEscalas
FSC FSC EjEj: Lineal: Lineal FLFL--1 1 EjEj: Logarítmica: Logarítmica
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Compensación de señales• Fundamento Superposición de
espectros de emisión. Parte de la señal de emitida por un
fluorocromo es leída por el detector de otro color
• Concepto sustracción de una parte de la señal medida en un color a la señal medida en otro color
• FL-2 - %FL1
λλ
excitaciónexcitación
medidamedida
Inte
nsid
ad d
e flu
ores
cen c
iaIn
tens
idad
de
fluor
esce
n cia
FLFL--11 FLFL--22
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Discriminación de señales debidas a dobletes (proceso de pulsos)
• Señal analógica (V)• Altura de señal (H)• Anchura de señal (W)• Área de señal (A)
• En base a la información de área y anchura se pueden detectar dobletes (dos células que pasan juntas).
WWAA
HH
tt
VV
2 2 xWxW
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DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO DE INFORMACIÓNDE INFORMACIÓN
NN
1122334455667788......
1000010000
FSCFSC
2222334433442222......
SSCSSC
1111222211223388......
FLFL--11
1111334411112211......
FLFL--22
1122331122331122......
FLFL--33
1133334411113344......
FLFL--44
2222333355551122......
TIEMPOTIEMPO
1111111122222222......
Los Los pulsospulsos dede““VoltajeVoltaje””(se(seññalesales analanalóógicasgicas) son ) son transformadastransformadas en en seseññalesales digitalesdigitalesLas seLas seññales digitales ales digitales almacenanalmacenan en un soporte informen un soporte informáático en modo listado tico en modo listado
(almacenamiento (almacenamiento multiparammultiparaméétricotrico).).
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PROCESO DE INFORMACION
HistogramasHistogramasDiagramasDiagramas biparamétricosbiparamétricos
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Proceso de la información generada
• Representación de la información
• Selección de la información
• Reducción de la información
• De la célula a la población celular
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RepresentaciRepresentacióón n monoparammonoparaméétricatrica de datos.de datos.Histogramas. Histogramas. Se representa en cada valor de x Se representa en cada valor de x
(intensidad de fluorescencia) el n(intensidad de fluorescencia) el núúmero de mero de ccéélulas que emiten esa intensidad.lulas que emiten esa intensidad.
M1
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HistogramasHistogramas
SSCSSC
FSCFSC
FLFL--11
FLFL--22
FLFL--33
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Representación Representación biparamétricabiparamétrica en 2Den 2D
Diagrama de puntos / dot plot
+
+--
RepresentaciRepresentacióón simultn simultáánea nea de dos parde dos paráámetros metros XX e e YY..
XX representa el valor de la representa el valor de la seseññal de un paral de un paráámetrometro. .
YY representa el valor de la representa el valor de la seseññal del otro.al del otro.
++-
-FLFL--11
FLFL-- 22
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RepresentaciRepresentacióón 3D n 3D CountourCountour plotplot / / Diagramas de contornos
X, Y mX, Y máás una tercera dimensis una tercera dimensióón.n.
Una superficie tridimensionalUna superficie tridimensionalLa altura representa el nLa altura representa el núúmero de mero de ccéélulas con una determinada lulas con una determinada combinacicombinacióón de ambos n de ambos parparáámetros.metros.
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Diagrama de dot plot density
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SelecciSeleccióón de subpoblaciones n de subpoblaciones definidas en diagramas definidas en diagramas monoparammonoparaméétricostricosSitSitúúan los valores lan los valores líímite superior e mite superior e inferior de un parinferior de un paráámetro que metro que definen a las cdefinen a las céélulas de interlulas de interéés.s.
SelecciSeleccióón de la informacin de la informacióónnGatesGates (Puertas) / ventanas ((Puertas) / ventanas (windowswindows))
M1
M2
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GatesGates biparambiparaméétricostricos..
Se pueden utilizar puertas Se pueden utilizar puertas biparambiparaméétricastricas definidas en base a la definidas en base a la combinacicombinacióón de los valores de dos n de los valores de dos parparáámetros metros
Se emplean para estudiar las Se emplean para estudiar las caractercaracteríísticas de subpoblaciones sticas de subpoblaciones celulares celulares
R1
R2
R3
R4
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GatesGates llóógicos / Puertas lgicos / Puertas lóógicasgicasPueden combinarse distintas puertas y emplearse simultPueden combinarse distintas puertas y emplearse simultááneamente como neamente como
criterio para seleccionar las ccriterio para seleccionar las céélulas de interlulas de interéés. s.
R1
R2
R3
R4
R5
R6
R7
LINFOCITOSLINFOCITOSMONOCITOSMONOCITOS
GRANULOCITOSGRANULOCITOS
TAMAÑOTAMAÑO
CO
MPL
EJI
DA
D C
EL
UL
AR
CO
MPL
EJI
DA
D C
EL
UL
AR
R5 R5 andand R1R1
T
NK
TK
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¿Qué significa la realización de un “gate” electrónico?¿Qué significa la realización de un “gate” electrónico?
N
12345678...
10000
FSC
22343422...
SSC
11221218...
FL-1
11341121...
FL-2
12312312...
FL-3
13341134...
FL-4
22335512...
TIEMPO
12345678...
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Estadisticasmonoparamétricas
M1
M2
Histogram Statistics
Marker Left, Right Events % Gated % Total Mean Geo Mean CV Median PeakAll 1, 9910 9917 100.00 99.17 1027.48 827.78 37.34 1113.97
M1 685, 9910 8725 87.98 87.25 1153.33 1139.97 16.01 1144.44M2 14, 685 1192 12.02 11.92 106.29 79.55 95.61 66.12
File: ap-24h.011 Log Data Units: Linear ValuesTube: Panel: Acquisition Date: 26-Apr-99 Gate: G3Gated Events: 9917 Total Events: 10000X Parameter: FL3-H FL3-IP (Log)
Análisis de la información.Análisis de la información.
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Estadisticas biparamétricas• Cuadrantes Combinación de dos
umbrales de positividad para dos
parámetros
• Número de células
• % de células
• MFI mean, geo mean
+--
++
-
+-
Quadrant Statistics
File: FEN-A11R.007 Log Data Units: Linear ValuesSample ID: Patient ID: Tube: tube #7 Panel: BronquirisAcquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No GateGated Events: 5000 Total Events: 5000X Parameter: FL1-H CD2 FITC (Log) Y Parameter: FL2-H CD16 PE (Log)Quad Location: 15, 17
Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo MeanUL 785 15.70 15.70 5.42 4.50 1553.17 1274.92UR 877 17.54 17.54 62.04 52.73 1159.04 700.05LL 951 19.02 19.02 2.81 2.37 3.67 3.17LR 2387 47.74 47.74 70.94 63.08 6.30 5.43
Jorge Monserrat Sanz
Estadística por regiones
• Selección libre de un conjunto
de combinaciones de valores
correspondientes a dos
parámetros.R1
R2 MicrobeadsMicrobeads
LinfocitosLinfocitos
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Información generada de una muestra marcada en triple color
Quadrant Statistics
File: FEN-A11R.007 Log Data Units: Linear ValuesSample ID: Patient ID: Tube: tube #7 Panel: BronquirisAcquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No GateGated Events: 5000 Total Events: 5000X Parameter: FL1-H CD2 FITC (Log) Y Parameter: FL2-H CD16 PE (Log)Quad Location: 15, 17
Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo MeanUL 785 15.70 15.70 5.42 4.50 1553.17 1274.92UR 877 17.54 17.54 62.04 52.73 1159.04 700.05LL 951 19.02 19.02 2.81 2.37 3.67 3.17LR 2387 47.74 47.74 70.94 63.08 6.30 5.43
Quadrant Statistics
File: FEN-A11R.007 Log Data Units: Linear ValuesSample ID: Patient ID: Tube: tube #7 Panel: BronquirisAcquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No GateGated Events: 5000 Total Events: 5000X Parameter: FL1-H CD2 FITC (Log) Y Parameter: FL2-H CD16 PE (Log)Quad Location: 15, 17
Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo MeanUL 785 15.70 15.70 5.42 4.50 1553.17 1274.92UR 877 17.54 17.54 62.04 52.73 1159.04 700.05LL 951 19.02 19.02 2.81 2.37 3.67 3.17LR 2387 47.74 47.74 70.94 63.08 6.30 5.43
Quadrant Statistics
File: FEN-A11R.007 Log Data Units: Linear ValuesSample ID: Patient ID: Tube: tube #7 Panel: BronquirisAcquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No GateGated Events: 5000 Total Events: 5000X Parameter: FL1-H CD2 FITC (Log) Y Parameter: FL2-H CD16 PE (Log)Quad Location: 15, 17
Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo MeanUL 785 15.70 15.70 5.42 4.50 1553.17 1274.92UR 877 17.54 17.54 62.04 52.73 1159.04 700.05LL 951 19.02 19.02 2.81 2.37 3.67 3.17LR 2387 47.74 47.74 70.94 63.08 6.30 5.43
Del análisis de cada matriz (9x20.000) nos quedamos con 12Del análisis de cada matriz (9x20.000) nos quedamos con 12--24 24 nímerosnímeros
Jorge Monserrat Sanz
Estadísticas/Reducción de la información• Análisis gráfico ofrece
información numérica sobre las poblaciones estudiadas.
• Esta información numérica de una muestra se representará en una fila de una matriz de datos
• Con la matriz de datos se obtendrá información estadística y representaciones gráficas sobre poblaciones de individuos.
9x9x2000020000
célu
las
célu
las
parámetrosparámetros
casocasovariablesvariables
Población controlPoblación controlPoblación casosPoblación casos