i n m u n o l o g a . 2 0 1 3;3 2(2):5769

Inmunologa

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Glc

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A

O

P

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I

R

C

E

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L

D

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V

C

E

0h

www.elsev ier .es / inmunologia

evisin

eneracin de diversidad de los receptores de antgeno eninfocitos: validacin del modelo de accesibilidad en elontrol de la recombinacin V(D)J

lberto Garca-Mariscal, Beatriz del Blanco y Cristina Hernndez-Munain

epartamento de Biologa Celular e Inmunologa, Instituto de Parasitologa y Biomedicina Lpez-Neyra (IPBLN-CSIC), Consejo Superiore Investigaciones Cientficas, Parque Tecnolgico de Ciencias de la Salud, Armilla, Granada, Espana

nformacin del artculo

istoria del artculo:

ecibido el 19 de marzo de 2012

ceptado el 26 de julio de 2012

n-line el 13 de noviembre de 2012

alabras clave:

eceptores de clulas T

nmunoglobulinas

ecombinacin V(D)J

romatina

pigenmica

actores de transcripcin

infocitos

iferenciacin celular

r e s u m e n

La recombinacin V(D)J consiste en el ensamblaje de los segmentos gnicos presentes en los

genes de las cadenas variables de los receptores de antgeno para generar la diversidad del

reconocimiento antignico en linfocitos. El conocimiento de su regulacin en condiciones

normales es esencial para entender los casos en que este proceso se desregula, dando lugar

a transformaciones leucmicas. La recombinacin V(D)J se inicia por accin de una endo-

nucleasa especfica presente exclusivamente en linfocitos inmaduros. Segn el modelo de

accesibilidad propuesto hace ms de 25 anos, la recombinacin V(D)J est regulada a tra-

vs del control de la accesibilidad de esta endonucleasa a sus sitios de corte en el ADN,

de acuerdo con unos programas de diferenciacin celular muy definidos. En esta revisin

se resumen los hallazgos descubiertos en este campo en los ltimos anos, tales como el

importante papel que tiene la conformacin gnica y la posicin de estos genes en el ncleo

celular, as como aquellos que muy recientemente han permitido la validacin definitiva del

modelo de accesibilidad. 2012 Sociedad Espaola de Inmunologa. Publicado por Elsevier Espaa, S.L. Todos los

derechos reservados.

Generation of lymphocyte antigen receptor diversity: Validation of theaccessibility model in controlling V(D)J recombination

eywords:

-cell receptors

a b s t r a c t

V(D)J recombination is the assembly of gene segments at the antigen receptor loci in order

to generate antigen receptor diversity in T and B lymphocytes. Detailed knowledge of how

mmunoglobulins V(D)J recombination is normally regulated during lymphocyte development is essential to

of dysregulation of this process that result in leukemic transformation.

(D)J recombination understand the caseshromatin

pigenomicsV(D)J recombination is triggered by action of a specific endonuclease which is exclusi-

vely expressed in immature lymphocytes. According to the accessibility model proposed

Autor para correspondencia.Correo electrnico: chmunain@ipb.csic.es (C. Hernndez-Munain).

213-9626/$ see front matter 2012 Sociedad Espaola de Inmunologa. Publicado por Elsevier Espaa, S.L. Todos los derechos reservados.ttp://dx.doi.org/10.1016/j.inmuno.2012.07.003

dx.doi.org/10.1016/j.inmuno.2012.07.003http://www.elsevier.es/inmunologiamailto:chmunain@ipb.csic.esdx.doi.org/10.1016/j.inmuno.2012.07.003

58 i n m u n o l o g a . 2 0 1 3;3 2(2):5769

Transcription factors

Lymphocytes

Cell differentiation

more than 25 years ago, DNA cleavage by this endonuclease is very strictly controlled during

cell differentiation by regulating its accessibility to chromatin. This review summarizes the

advances in the field over the last few years, including the important role of the genomic

conformation and position of the antigen receptor loci within the nucleus, as well as those

that have recently culminated with the validation of the accessibility model to control this

process.

2012 Sociedad Espaola de Inmunologa. Published by Elsevier Espaa, S.L. All rights

Estructura molecular del complejo de losreceptores de antgeno en linfocitos T y B

Existen 2 tipos de linfocitos, linfocitos T y B, los cuales madu-ran a partir de precursores linfoides comunes presentes en lamdula sea. Cada linfocito expresa un nico tipo de recep-tor que reconoce un antgeno de forma especfica, lo que seconoce como receptores clonotpicos. Los receptores de ant-geno de los linfocitos T (TCR) reconocen antgenos peptdicos,presentados por las molculas del complejo principal de histo-compatibilidad en la membrana de las clulas presentadorasde antgeno1, mientras que los receptores de antgeno delos linfocitos B (BCR) reconocen antgenos solubles2. A pesarde estas importantes diferencias funcionales, los TCR y losBCR tienen muchas caractersticas estructurales comunes1,2.Ambos estn formados por dmeros de cadenas peptdicasvariables unidas por puentes disulfuro, las cuales son respon-sables del reconocimiento antignico. Estas cadenas variablesestn asociadas a una serie de cadenas invariables, impor-tantes para la expresin del receptor en membrana y para latransduccin de las senales intracelulares (fig. 1). Las cade-nas invariables tambin se asocian entre s como dmeros. Losdmeros de cadenas invariables presentes en los TCR estn for-mados por distintas asociaciones de miembros de la familiaCD3: CD3, CD3 y CD3. Los dmeros de cadenas invaria-bles presentes en los BCR estn formados por miembros de lafamilia CD79: CD79 (tambin conocidos como Ig).

Existen 7 cadenas variables de los receptores de antgeno:TCR, TCR, TCR, TCR, IgH, Ig e Ig, que se emparejan entres, de forma especfica, para generar los 4 posibles tipos dereceptores de antgeno en linfocitos. Los linfocitos T puedenexpresar 2 tipos de TCR, en funcin de las cadenas variablesque expresen sus receptores de antgeno: TCR o TCR. Laasociacin especfica de una cadena TCR con una cadenaTCR o de una cadena TCR con una cadena TCR da lugara la generacin de los 2 linajes de linfocitos T: los linfocitosT y los linfocitos T con funcionalidades diferentes3. Loslinfocitos B tambin pueden expresar 2 tipos de BCR en fun-cin de la expresin de las cadenas variables que expresen susreceptores de antgeno. La asociacin de la cadena de inmu-noglobulina pesada, IgH, con una de las 2 posibles cadenas deinmunoglobulina ligeras, Ig o Ig, da lugar a las inmunoglo-bulinas de membrana presentes en los BCR.

Cada una de las cadenas variables consta de 2 regionesdiferenciadas: una regin variable extracelular localizada en

el extremo amino terminal y una regin constante localizadaen el extremo carboxilo terminal (fig. 1). Las regiones variablesde cada una de estas cadenas estn encargadas del reconoci-miento antignico. Estas regiones contienen 3 tramos cortos

reserved.

de secuencias hipervariables4 denominadas regiones deter-minantes de complementariedad (CDR)(fig. 1). Hay un totalde 6 CDR por receptor. La combinacin tridimensional de lossegmentos peptdicos constituidos por los CDR de cada cadenaes lo que confiere una mayor especificidad de antgeno a cadareceptor. La regin constante de todas las cadenas variablesde los receptores de antgeno, excepto las de las cadenas lige-ras de inmunoglobulinas, incluye una regin transmembranay una regin citoplsmatica corta. Estas regiones constantestienen un papel importante en la interaccin fsica y funcio-nal de las cadenas variables con los dmeros de las cadenasinvariables1,2.

Organizacin genmica de los genes de lascadenas variables de los receptores de antgeno

Las regiones variables de las cadenas de los receptores deantgeno vienen determinadas por distintas combinacionesgnicas de los segmentos V (variable), D (diversidad) y J (joi-ning) que componen cada uno de los genes que las codifican(Tcra, Tcrb, Tcrg, Tcrd, Igh, Igk, Igl)5. Los segmentos gnicos V, Dy J se encuentran en las regiones 5 de cada gen con una distri-bucin de segmentos muy conservada entre humano y ratn,mientras que los exones que dan lugar a las regiones constan-tes se encuentran en las regiones 3 (fig. 2). Los segmentos V,D y J se reordenan a nivel gnico durante el desarrollo de loslinfocitos mediante un proceso denominado recombinacinV(D)J5. Este proceso permite la generacin de un enormerepertorio de receptores para antgenos distintos en linfoci-tos T y B con una mnima inversin en material gentico. Esteproceso confiere una especificidad antignica distinta a cadalinfocito vrgen, lo que permite un reconocimiento prctica-mente ilimitado de antgenos distintos. La existencia de estemecanismo de generacin de los distintos TCR y BCR en lin-focitos es la base de la inmunidad especfica o adaptativa, adiferencia de la inmunidad innata. La inmunidad innata estimplicada en la proteccin del huesped frente a los patge-nos o antgenos extranos de una forma inespecfica. En lainmunidad innata tienen un papel importante tanto mecanis-mos celulares como moleculares. La inmunidad innata celularest basada en la activacin de clulas que reconocen y res-ponden frente a patgenos de forma inespecfica. Entre lasclulas responsables de la inmunidad innata se encuentranlos fagocitos, como los macrfagos, los neutrfilos y las clu-las dendrticas, los basfilos y los eosinfilos, los mastocitos y

las clulas asesinas naturales, adems de las clulas que par-ticipan en la presentacin de los antgenos a los linfocitos T.La inmunidad innata molecular est basada en el desenca-denamiento de distintas cascadas, tales como la inflamacin

i n m u n o l o g a . 2 0 1 3;3 2(2):5769 59

CD3

CD3CD3

TCR o TCR

Ig o Ig Ig o Ig

IgH IgH

TCR o TCR

CD79/Ig CD79/Ig

Figura 1 Estructura de los TCR e BCR. Los TCR y TCR estn formados por 2 cadenas variables TCR y TCR, o TCR yTCR, respectivamente, unidas covalentemente por puentes disulfuro asociadas a tres dmeros de cadenas CD3 (CD3,CD3 y CD3). Los BCR estn formados por 2 cadenas variables, una cadena pesada IgH y una cadena ligera Ig o Ig,unidas covalentemente por puentes disulfuro asociadas a 2 dmeros de cadenas CD79 (CD79, tambin conocidas comoIg). En amarillo se representan las regiones variables y en verde se representan las regiones constantes de las cadenasvariables. Las regiones hipervariables o CDR se representan como franjas naranjas. Las cadenas de los dmeros CD3 serepresentan en azul y las cadenas de los dmeros CD79/Ig se representan en marrn.

Tcrb V(35)

V/( 100)

V5 V2 V4 V3 J1 C1 E1 V1,3

E

J E C

C

E3 E2 C2

C3 C1 C2b C2a C C 3RR

3E Ed

J2 V1,2 V1,1 J4 C4

HsA

D1 pD2 D2 J2 E C

C

V5 J(60) C E

n

pTEAJ1

PD1 D1 J1 C1 PD 2 D2 J2 C2 E V14

Tcra/Tcrd

Tcrg

Igh

Igk

Igl

VH( 150)J558 DH(13) PDQ52 JH

n

V(140)

V2 V2x J2 C2 E2-4 V1 J3 C3 J1 C1 E3-1

KI/KII

Figura 2 Estructura gnica de los genes de las cadenas variables de los receptores de antgeno. Se representa la estructuragnica de los genes Tcrb, Tcra/Tcrd, Tcrg, Igh, Igk e Igl. Los segmentos gnicos se representan por rectngulos amarillos y lasRSS con tringulos negros o blancos, segn contengan una RSS con una secuencia espaciadora de 23 pares de bases o de12 pares de bases, respectivamente. Las regiones constantes se representan como rectngulos verdes. Los promotores estnasociados a determinados segmentos gnicos y se representan en azul. Los enhancers se representan como crculos rojos.

. 2 0 1

60 i n m u n o l o g a

o el complemento. Ambas cascadas cooperan con la inmuni-dad especfica para ayudar en la eliminacin de los patgenos.Una diferencia fundamental entre los sistemas inmunitariosinnato y adaptativo es que el primero no confiere inmunidadprotectora al huesped a largo plazo.

Regulacin de los reordenamientos de lossegmentos gnicos V, D y J durante eldesarrollo de los linfocitos

Los linfocitos T y B proceden de un precursor linfoide comnde mdula sea (fig. 3) donde se detectan reordenamientosDH-JH del gen Igh3,6. Algunos de estos precursores migran altimo, donde reciben la senalizacin mediada a travs de losreceptores Notch, comenzando as la diferenciacin del linajede los linfocitos T3. Los timocitos ms inmaduros se denomi-nan timocitos doble-negativos (DN) por carecer de la expresinde los receptores de superficie CD4 y CD8. Los timocitos DNpueden subdividirse en 4 estadios de diferenciacin sucesi-vos en funcin de la expresin de los receptores CD25 y CD44:DN1 (CD25-CD44+), DN2 (CD25+CD44+), DN3 (CD25+CD44) yDN4 (CD25-CD44). Los timocitos DN1 son las clulas que aca-ban de migrar al timo desde la mdula sea y, por tanto,portan los reordenamientos DH-JH del gen Igh que ocurrie-ron anteriormente. En los timocitos DN2 y DN3 ocurren losreordenamientos productivos de los genes Tcrb, Tcrg y Tcrd,

permitiendo la generacin de los linfocitos T (en el casode reordenamientos productivos de los genes Tcrg y Tcrd)o la expresin de un pre-TCR (en el caso de un reordena-miento productivo del gen Tcrb). El pre-TCR consiste en una

ReordenamientosDH-J H

DN1 DN2 DN3 DN4

ClulasT

ReordenamientosVH-D HJH

Pro-B

Precursorlifoide de

mdula sea

Pre-BI

Pre-BIIgrandes

ReordenamientosTcrb, Tcrg y Tcrd

ReordeT

Sealizacinpre-TCR

Sealizacinpre-BCR

Figura 3 Representacin de la maduracin de los linfocitos T y B. Elpasando los precursores de los linfocitos T (tonos tostados) y B (tmaduracin3,6. Se especifican los estadios donde ocurren los reoreceptores de antgeno, as como los momentos donde ocurren l

3;3 2(2):5769

cadena TCR y una cadena invariable denominada pre-T,asociadas a los dmeros de las cadenas invariables CD37. Lasenalizacin mediada a travs del pre-TCR dispara la proli-feracin y la diferenciacin de los timocitos DN3 a timocitosdoble-positivos (DP) CD4+CD8+. A partir del estadio DN4, sedetectan los primeros reordenamientos del gen Tcra, siendoestos muy abundantes en los timocitos DP. La expresin de unTCR en las clulas DP inhibe la expresin de las protenasRAG-1/2, inhibindose sucesivos reordenamientos en el genTcra, y permite su diferenciacin a linfocitos T CD4 o TCD8 que migran fuera del timo como linfocitos T maduros.

La diferenciacin de los linfocitos B se rige por un esquemamuy similar al de la diferenciacin de los linfocitos T (fig. 3).Los precursores linfoides que permanecen en la mdula seavan diferenciando a travs de distintos estadios intermedios(clulas pro-B, clulas pre-BI y clulas pre-BII) antes de darlugar a los linfocitos B maduros6. Tal y como ocurre duranteel desarrollo de los linfocitos T, durante la maduracin de loslinfocitos B se activan sucesivamente los reordenamientos delos distintos genes de las cadenas de inmunoglobulinas. Pri-mero reordena el gen de la cadena pesada, Igh, y despusreordenan los genes de las cadenas ligeras, Igk e Igl. En lasclulas pro-B ocurren los reordenamientos completos del genIgh, lo que da lugar a la expresin de un pre-BCR en las clu-las pre-BI. El pre-BCR consiste en una cadena IgH y 2 cadenasinvariables, V-preB (1 o 2) y 5, asociadas a las cadenas invaria-bles CD79. La senalizacin mediada a travs del pre-BCR en

las clulas pre-BI dispara su proliferacin y su diferenciacina clulas pre-BII. En la fase de reposo que sigue a la prolife-racin mediada por esta senalizacin, en las llamadas clulaspre-BII pequenas, ocurren los reordenamientos de los genes

Pre-BIIIpequeas

DP

CD4

CD8

TIMO

Mdulasea

Clulas B

Reordenamietoslgk e lgl

namietoscra

ClulasT

diagrama representa los distintos estadios por los que vanonos azules) a lo largo de su desarrollo para surdenamientos de las distintas cadenas variables de losas senalizaciones a travs del pre-TCR y el pre-BCR.

2 0 1 3

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i n m u n o l o g a .

e las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas, Igk e Igl. Laxpresin de un BCR en estas clulas inhibe la expresin deas protenas RAG-1/2, inhibindose futuros reordenamientosnicos, y permite su diferenciacin a linfocitos B madurosue migrarn a periferia.

egulacin de la recombinacin V(D)J in vivo:Modelo de accesibilidad

l proceso de recombinacin V(D)J es especfico de los genese los receptores de antgeno ya que es dependiente de la pre-encia de una secuencia senal de recombinacin (RSS) queanquea cada uno de los segmentos gnicos V, D y J5 (fig. 2). Elroceso de recombinacin V(D)J se inicia cuando las protenasecombination Antigen Gene (RAG)-1 y RAG-2 reconocen juntas

2 RSS compatibles de 2 segmentos gnicos distintos (V y D, D J o V y J), para formar un complejo sinptico5. Para que 2 RSSean compatibles se necesita que cumplan la llamada regla2/23, por la cual una RSS ha de tener una secuencia espacia-ora de 12 pares de bases y la otra una secuencia espaciadorae 23 pares de bases entre sus secuencias consenso de reco-ocimiento por las protenas RAG-1/2. Una vez formado esteomplejo, las protenas RAG-1/2, que juntas forman una endo-ucleasa, introducen un corte de doble cadena entre cada RSS

cada segmento gnico a recombinar; por ejemplo, introducenn corte de doble cadena entre la unin de un segmento V yu RSS asociada y otro corte entre la unin de un segmento J

su RSS asociada para poder generar una recombinacin VJ.stos cortes son procesados y ligados mediante la ruta de repa-acin de rupturas de doble cadena de ADN no homlogo.as uniones que ocurren entre los segmentos gnicos V-D,-J o V-J se denominan uniones codificantes, mientras que

as uniones que ocurren entre las RSS se denominan unioneso codificantes. Las uniones codificantes generan una nuevastructura genmica del gen que, en caso de ser productiva,er capaz de dar lugar a una cadena variable funcional deCR o BCR. Las uniones no codificantes generan unos crcu-

os extracromosmicos que contienen las secuencias gnicasxistentes entre los segmentos gnicos que han sido reorde-ados. Estos crculos extracromosmicos permanecern en elcleo celular de los linfocitos en reposo y solo desaparece-n por dilucin cuando las clulas proliferen, ya que no tienenapacidad de replicacin.

La especificidad gnica de esta reaccin viene dada por elecho de que solo los segmentos gnicos V, D y J de los genes de

as cadenas variables de los receptores de antgeno estn flan-ueados por las RSS. Este hecho determina por qu son estos

os nicos genes de todo el genoma que sufren el proceso deecombinacin V(D)J. Por otro lado, existe tambin una especi-cidad que determina que este proceso ocurra exclusivamenten precursores linfoides, debido a que las protenas RAG-1/2olo se expresan durante la maduracin de los linfocitos5. Sinmbargo, existen otros niveles de regulacin no explicados pora mera presencia de las RSS en estos genes o la expresinestrictiva de las protenas RAG-1/2 en los precursores de lin-

ocitos. En concreto, se pueden distinguir 4 niveles adicionalese regulacin (i-iv)5. (i) Control del linaje celular: que determinaue los genes Igh, Igk e Igl solo reordenen de forma completa enrecursores de linfocitos B y que los genes Tcra, Tcrb, Tcrd y Tcrg

;3 2(2):5769 61

solo reordenen de forma completa en precursores de linfocitosT. (ii) Control temporal: que establece el orden en que ocurrenlos reordenamientos de estos genes durante el desarrollo delos linfocitos (fig. 3). Los reordenamientos de los genes Tcrb,Tcrg y Tcrd ocurren en timocitos DN2-DN3, mientras que losreordenamientos del gen Tcra ocurren en la transicin de timo-citos DN4 a timocitos DP tras recibir los timocitos DN3 unasenalizacin a travs del pre-TCR. Los reordenamientos delgen Igh ocurren en clulas pro-B, mientras que los genes Igle Igk reordenan en clulas pre-BII tras recibir las clulas pre-BI una senalizacin a travs del pre-BCR. (iii) Control del ordende los reordenamientos entre los distintos segmentos gnicos: quecontrola que los segmentos D y J de los genes Tcrb e Igh reor-denen antes que los segmentos V; as, primero ocurren losreordenamientos DJ o DHJH y luego se completan los reorde-namientos VDJ o VHDHJH, respectivamente. (iv) Control de laexclusin allica: que determina que solo se reordene de formaproductiva uno de los 2 alelos en los genes Tcrb, Igh, Igk e Igl.Este fenmeno de exclusin allica a nivel del reordenamientognico determina que solo exista un tipo de receptor clonot-pico en cada linfocito. En los dems genes de las cadenas delos receptores de antgeno, Tcra, Tcrd y Tcrg, no existe exclusinallica a nivel de los reordenamientos gnicos. Sin embargo,existe una exclusin allica a nivel de la expresin de los TCRen la membrana celular que viene determinada por el mejoremparejamiento entre s de unas determinadas cadenas varia-bles de cada receptor respecto a otras durante el ensamblajede los receptores8. Por ejemplo, aunque puedan expresarse 2cadenas TCR en un timocito DP, una de ellas siempre tendruna mejor afinidad que la otra para asociarse establementecon la cadena TCR expresada en esa clula. Este mecanismode exclusin allica a nivel del ensamblaje de los receptoresen la membrana participa, junto con el otro mecanismo deexclusin allica a nivel de reordenamientos gnicos, en laexpresin de los receptores clonotpicos en linfocitos T.

Para explicar estos 4 niveles adicionales de control de larecombinacin V(D)J a nivel gnico, hace 25 anos, G.D. Yan-copoulos y F.W. Alt (1985) propusieron el llamado modelo deaccesibilidad9. Este modelo propone que la estructura de lacromatina, la cual es especfica de cada gen de cadena variablede los receptores de antgeno y de cada estadio celular duranteel desarrollo linfoide, determina la accesibilidad de las pro-tenas RAG-1/2 a las RSS y, por tanto, la propia especificidady regulacin de la recombinacin V(D)J. Este modelo ha sidoavalado por numerosos experimentos que han evidenciadoque la activacin de la recombinacin V(D)J se correlacionacon una apertura de la cromatina y la presencia de deter-minadas marcas epigenticas asociadas, tales como son lasensibilidad generalizada a las enzimas nucleasas, la activa-cin de la transcripcin, las modificaciones covalentes de lashistonas relacionadas con la activacin de la transcripciny la hipometilacin del ADN5. Adems, numerosos experi-mentos in vivo e in vitro han demostrado que la cromatina,en s misma, representa una barrera fsica para la iniciacinde la recombinacin V(D)J, tal y como ocurre con el procesode transcripcin. As, el grupo de D. Baltimore, en 1990, demos-

tr que las protenas RAG-1/2 son suficientes para activarla recombinacin V(D)J de construcciones reporteras trans-fectadas en fibroblastos, pero no la de los genes endgenosde las cadenas variables de los receptores de antgeno10,

. 2 0 1

62 i n m u n o l o g a

indicando que estos genes tienen una estructura de cromatinacerrada que impide su recombinacin en otros tipos celu-lares distintos a los precursores linfoides. En 1996, el grupode M. Schlissel demostr que estos genes tienen una estruc-tura de cromatina distinta dependiendo del tipo celular y desu estadio de diferenciacin, lo cual determina la accesibi-lidad de las protenas RAG-1/2 en cada gen a lo largo de ladiferenciacin de los linfocitos B y T11. Los ensayos in vitro,utilizando secuencias purificadas y protenas RAG-1/2 recom-binantes, han demostrado que la cromatinizacin del ADNinhibe la reaccin de recombinacin V(D)J12,13. Estos expe-rimentos, junto con el papel esencial demostrado por lassecuencias reguladoras, tales como potenciadores (enhancers)y promotores transcripcionales5, han apoyado de forma slidael modelo de accesibilidad en el control de la recombinacinV(D)J.

Como se muestra en la figura 2, todos los genes de cadenasvariables de los receptores de antgeno contienen numerosospromotores transcripcionales asociados a mltiples segmen-tos gnicos V, D y J, y uno o 2 enhancers situados cerca delas regiones constantes5. Los enhancers son los elementosresponsables de la expresin gnica especfica de tejido14,15,activando a promotores situados a largas distancias. Estos ele-mentos funcionan mediante el reclutamiento de factores detranscripcin (FT) dando lugar al ensamblaje de unos comple-jos multiproteicos denominados enhanceosomas16. Se aceptaque, para que estos factores regulen los programas de expre-sin gnica especfica de tejido, mltiples FT han de unirsea los enhancers de una forma combinatorial, explicando as lagran diversidad existente de enhancers y programas de diferen-ciacin gnica. Una vez unidos a los enhancers, los FT reclutanotros complejos proteicos y enzimticos para la activacin dela transcripcin gnica, tales como el denominado complejomediador, las enzimas modificadores de histonas y los com-plejos remodeladores de cromatina. El complejo mediadordirige la unin de los FT a los promotores y a los enhan-cers, facilitando las interacciones fsicas entre ambos17. Loscomplejos modificadores de la cromatina y las enzimas modi-ficadoras de histonas funcionan cambiando la estructura dela cromatina en el rea de influencia de los enhancers18. Loscomplejos modificadores de la cromatina, tales como el com-plejo SWI/SNF, reposicionan o eliminan nucleosomas a lo largodel ADN de una forma dependiente de ATP19, siendo res-ponsables de la creacin de regiones libres de nucleosomasque, a su vez, facilitan el reclutamiento de otros FT dentrode un enhancer. Por otro lado, las enzimas modificadoras delas histonas son las responsables de las marcas epigenticasque definen la estructura de la cromatina de un determi-nado gen. Los estudios epigenticos han demostrado que losenhancers se caracterizan por tener marcas epigenticas comu-nes, tales como altos niveles de acetilacin de la histonaH3, altos niveles de monometilacin de la lisina 4 de la his-tona H3 (H3K4me1), bajos niveles de trimetilacin de H3K4(H3K4me3) y altos niveles de acetilacin de la lisina 27 de lahistona H3 (H3K27ac)15,20,21. Dentro de estas marcas, los altosniveles de H3K4me1 y los bajos niveles de H3K4me3 son alta-mente predictivos de la identidad de un enhancer, mientras

que los altos niveles de H3K27ac son altamente predictivosde su actividad20. En cuanto a las marcas epigenticas parala identificacin de otros elementos reguladores destacan los

3;3 2(2):5769

altos niveles de H3K4me3, descritos para la identificacin depromotores activos, y el reclutamiento del factor de unin ala secuencia CCCTC (CTCF), descrito para la identificacin desecuencias aisladoras15.

Los estudios realizados a gran escala han establecido quelos enhancers son los elementos responsables de dirigir losprogramas de diferenciacin celular, mediante la formacinde plataformas moleculares constituidas por FT constitu-tivos especficos de tejido, capaces de guiar la unin deFT inducibles en respuesta a senales extracelulares15,18. Losenhanceosomas formados por FT constitutivos constituiran unestado preactivado del enhancer, permitiendo que este res-ponda rpidamente a una senalizacin. De acuerdo con estosdatos, nuestros experimentos de caracterizacin de los dis-tintos enhanceosomas ensamblados en el enhancer del gen Tcra(E), durante el desarrollo de los timocitos (fig. 4A), han deter-minado que E se encuentra en un estado inactivo y ocupadopor numerosos FT constitutivos en timocitos DN3, tales comoCREB, Ets-1, Fli-1, GATA-3, y las protenas E2A y HEB, constitu-yendo una plataforma molecular para el rpido reclutamientode FT inducibles por la ruta de activacin del pre-TCR entimocitos DN4-DP, tales como NFAT, AP-1 y Egr-1, pasandoas a un estado activo22,23. Por tanto, el ensamblaje combi-natorial de FT constitutivos e inducibles dicta la activacinde E durante el desarrollo de los timocitos. Este meca-nismo de activacin de enhancers inducibles, especficos detejido, parece representar un paradigma general en la regu-lacin de la expresin gnica en respuesta a una senalizacinextracelular.

Mltiples estudios funcionales han establecido el papelesencial de los enhancers presentes en los genes de las cade-nas variables de los receptores de antgeno en el control de larecombinacin V(D)J, tanto mediante su delecin en el genomade ratn (ratones knock-out) o mediante su integracin en cons-trucciones reporteras de recombinacin V(D)J transfectadasen clulas o microinyectadas en oocitos de ratn (ratonestransgnicos)5. Por ejemplo, la delecin del enhancer presenteen un gen concreto inhibe especficamente la transcripcin yel reordenamiento gnicos de ese gen. Estos datos funcionalesse correlacionan con la disminucin de las marcas epigenti-cas relacionadas con la actividad de ese enhancer, lo cual setraduce en una inaccesibilidad del complejo de la ARN poli-merasa ii (Pol-II) a los promotores y de las protenas RAG-1/2a las RSS presentes en el rea de influencia del enhancer. Portanto, los enhancers son los elementos controladores de la acce-sibilidad a largas distancias, actuando como iniciadores de laapertura de la cromatina en grandes regiones del genoma ycontrolando la activacin de la transcripcin y del reordena-miento gnicos durante el desarrollo.

Los promotores, por otro lado, dirigen la iniciacin de latranscripcin desde sitios concretos, proporcionando una pla-taforma para el reclutamiento del complejo de la Pol-II ydirigiendo la recombinacin V(D)J de un segmento o un grupode segmentos gnicos concretos5. Las evidencias experimen-tales demuestran que los promotores modifican la estructurade la cromatina a nivel local a diferencia del papel ms glo-bal que ejercen los enhancers. Por ejemplo, (i) la delecin del

promotor asociado al segmento D1 inhibe la transcripcin yla recombinacin de ese segmento gnico en concreto, den-tro del grupo de segmentos gnicos D1J, sin afectar al grupo

i n m u n o l o g a . 2 0 1 3;3 2(2):5769 63

A

LEF-1/TCF-1

CREBSp1

GC-II E2A Ets-1/Fli-1 Sealizacin por elpre-TCR

TEA J49p

V distales

Reordenamientos VJ primarios

Reordenamientos VJ secundarios

Timocitos DN4 y DP tempranos

J proximales

C E

V proximalesV distales

Runx1Runx1

Ets-1 E2AGATA-3

Timocitos DN3

B

LEF-1/TCF-1

Sp1E2AEgr-1AP-1

NFATNFAT

NFAT

Ets-1/Fli-1

Runx1Runx1

Ets-1 E2AGATA-3

Figura 4 Representacin esquemtica de los enhanceosomas de E y reordenamientos en el gen Tcra durante el desarrollode los timocitos. (A) Modelo para el ensamblaje de distintos enhanceosomas de E durante el desarrollo de los timocitos.Los FT estn indicados por valos o crculos coloreados. En timocitos DN3, E est ocupado por FT constitutivos detimocitos. Los FT TCF-1 o LEF-1 (valo de color morado) unidos al ADN provocan una curvatura que facilita la interaccinentre los factores unidos a ambos lados. Tras la senalizacin por el pre-TCR, se reclutan FT inducibles, tales como NFAT(crculos rojos), AP-1 (valos azules) y Egr-1 (valo violceo), dando lugar a la activacin del enhancer en timocitos DN4y timocitos DP tempranos23. (B) Esquema de los reordenamientos VJ primarios y secundarios en el gen Tcra. Lossegmentos gnicos V y J se representan por rectngulos amarillos y las RSS con tringulos negros o blancos (segncontengan una RSS con una secuencia espaciadora de 23 pares de bases o de 12 pares de bases, respectivamente). La reginconstante C se representa como un rectngulo verde. Los promotores estn representados en azul. Se indica la posicin delos promotores TEA y J49p, y la de los promotores asociados a los segmentos gnicos V. E se representa como un crculorojo.

damgJtaorbee

add

e segmentos gnicos D2J24; (ii) la delecin del promotorsociado al segmento gnico V14 inhibe su transcripcin ger-inal y su recombinacin sin afectar a los dems segmentos

nicos V25; (iii) en el caso del gen Tcra, los promotores TEA y49p dirigen los reordenamientos que afectan a los segmen-os J gnicos situados inmediatamente 3 del promotor, sinfectar a los situados ms 3 en el gen26. En conjunto, estasbservaciones indican que, en contraste con la accin globalealizada por los enhancers en los genes de las cadenas varia-les de los receptores de antgeno, los promotores tienen unfecto localizado en la estructura de la cromatina, estando sufecto restringido a uno o a unos pocos segmentos gnicos.

Es interesante destacar el papel de E y los promotores

sociados a los segmentos J y V en la regulacin de los reor-enamientos sucesivos que ocurren en el gen Tcra durante elesarrollo de los timocitos (fig. 4B) con el fin de maximizar las

oportunidades para expresar una cadena TCR productiva27.Los primeros reordenamientos VJ que ocurren en el genTcra se denominan reordenamientos primarios y afectan a lossegmentos V proximales y a los segmentos J distales (en fun-cin de su distancia con respecto a la localizacin de la reginC). Los reordenamientos primarios ocurren en la primera fasede diferenciacin de los timocitos DN3 a DP: timocitos DN4 yDP tempranos28. Si los reordenamientos VJ primarios resul-tan improductivos se activan subsecuentes reordenamientosVJ denominados reordenamientos secundarios en timoci-tos DP tardos27. Los reordenamientos secundarios afectan alos segmentos V distales y a los segmentos J proximales(en funcin de su distancia con respecto a la localizacin de

la regin C). Los mecanismos moleculares implicados en laactivacin de los reordenamientos primarios y secundariosdel gen Tcra son muy distintos entre s. La activacin de los

64 i n m u n o l o g a . 2 0 1 3;3 2(2):5769

RAG1

H3K27acCTCF ycohesina

Factors detranscripcin

Nucleosoma

H3K9me

H3ac

H3K4me3

Segmentosgnicos

RSS

E

J49p

TEATEA

a

b

TEA

E

E

RAG2 RAG2RAG1

Figura 5 Modelo de interaccin fsica entre E y el promotor TEA para la activacin de la recombinacin VJ en el gen Tcra. (a) Entimocitos DN3, E y los promotores TEA y J49p estn ocupados por FT constitutivos. Las histonas H3 estn hiperacetiladaspor accin de acetilasas de histonas unidas al enhancer, y los promotores TEA y J49p estn reprimidos y empaquetados encromatina silenciada por la marca epigentica H3K9me. (b y c) La interaccin entre E y un promotor requiere la formacinde un puente molecular mediado por los FT unidos a las secuencias reguladoras y facilitado por la unin de CTCF ycohesinas33. La formacin de un holocomplejo funcional entre ambas secuencias reguladoras permite el ensamblaje delcomplejo de la Pol-II en el promotor. La activacin de la transcripcin conlleva la aparicin de nuevas marcas epigenticasque incluyen H3K27ac en E y H3K4me3 en el promotor. El paso del complejo de la Pol-II a travs del ADN de los segmentosJ situados inmediatamente 3 del promotor abre la estructura de la cromatina y permite que las RSS sean permisibles

e as

para el reconocimiento de las protenas RAG-1/2, inicindos

promotores TEA y J49p por E es responsable de la activa-cin de los reordenamientos VJ primarios en respuesta ala senalizacin que reciben los timocitos DN3 a travs delpre-TCR26. Nuestros recientes estudios in silico y de valida-cin de sitios de unin para FT en las secuencias de estospromotores revelan la presencia de numerosas secuenciasespecficas para la unin de FT constitutivos e inducibles,tales como TCF-1/LEF-1, Egr, NFAT y AP-1, entre otros (datosno publicados), de una forma similar a como ocurre en E23.La activacin de TEA por FT inducibles podra constituir lasbases moleculares para explicar su capacidad de responder ala senalizacin mediada por el pre-TCR, activando los reorde-namientos VJ primarios en timocitos DN4 y DP tempranos,y de no responder a la accin del enhancer del gen Tcrd, E,en timocitos DN2-DN329. Los reordenamientos secundariosse activan como consecuencia de la apertura de la cromatinade los segmentos J proximales, mediada por el acercamientode los promotores V distales, los cuales se activan de formaindependiente de E como consecuencia de los reordenamien-tos primarios30. La activacin de los promotores V distales noes dependiente de E y promueve la apertura de la cromatina

de los segmentos J proximales, permitiendo as los reorde-namientos VJ secundarios sucesivos que ocurren en el genTcra30.

las recombinaciones VJ primarias del gen Tcra35,37.

La naturaleza de la arquitectura de los genes, que codificanpara las cadenas variables de los receptores de antgeno conlos enhancers y promotores situados a largas distancias entres, precisa del establecimiento de puentes moleculares entreestos elementos para la activacin de la transcripcin y larecombinacin V(D)J. La existencia de interacciones fsicasdirectas entre promotores y enhancers ha sido demostradaexperimentalmente en los genes de las cadenas variablesde los receptores de antgeno mediante la tcnica de cap-tura de la conformacin cromosmica3133. En el caso dela activacin del gen Tcra se ha demostrado adems que lainteraccin entre E y el promotor TEA est facilitada porla unin de CTCF y sus cohesinas asociadas33. Aunque CTCFy las cohesinas puedan tener un papel importante en lamediacin de la interaccin fsica entre ambas secuenciasy en la formacin del lazo intracromosmico resultante,los FT unidos a los promotores TEA/J49p y E podran seresenciales en esta interaccin mediante la formacin de unholocomplejo funcional (fig. 5). Es interesante destacar queinteracciones entre FT que se unen a E y los promotoresTEA y J49p, tales como LEF-1 y AP-1, se han demostrado

capaces de mediar lazos intramoleculares entre regiones 5 y3 distantes en el genoma para la activacin de la transcripc-in34.

2 0 1 3

Vayp

EceddbhetdcPtqtEdgtElpcltnlsncaccplg

dSdvddeeilqPqe1c

i n m u n o l o g a .

alidacin experimental del modelo deccesibilidad: los enhancers, los promotores

la elongacin transcripcional son esencialesara el reclutamiento de las protenas RAG-1/2

l modelo de accesibilidad estaba basado en la observa-in de que la transcripcin germinal (transcripcin iniciadan los promotores de los segmentos gnicos no reordena-os de los genes de las cadenas variables de los receptorese antgeno) se correlaciona con la activacin de la recom-inacin V(D)J durante el desarrollo de los linfocitos9. Hastaace pocos anos se pensaba que la transcripcin germinalra el resultado inherente de la accesibilidad de la croma-ina impartida por la activacin de promotores y enhancers,e tal forma que la activacin de estos elementos regularaonjuntamente la accesibilidad de las protenas RAG-1/2 y laol-II al ADN mediante una apertura general de la estruc-ura de la cromatina. El grupo de M.S. Krangel demostrue la elongacin transcripcional, a lo largo de los segmen-os J, media la activacin de los reordenamientos VJ35.stos investigadores introdujeron una secuencia bloqueadorae la elongacin transcripcional en medio de los segmentosnicos J e inhibieron la recombinacin VJ de los segmen-os J situados inmediatamente 3 de la regin bloqueadora.stos resultados han sido concluyentes para determinar quea elongacin transcripcional en s misma, procedente de losromotores asociados a los segmentos J, tiene un papelausal en la iniciacin de la recombinacin VJ. La regu-acin de la recombinacin V(D)J mediada por la elongacinranscripcional parece ser esencial en el control del reorde-amiento V(D)J en genes largos, tales como el gen Tcra, en

os que la accesibilidad de la cromatina de las RSS de losegmentos J, dirigida por la activacin de los promotores,ecesita propagarse a varios segmentos gnicos J que care-en de promotor. En el caso de segmentos gnicos que tengansociados un promotor en exclusiva no hara falta la elonga-in transcripcional para activar su recombinacin. En estosasos, el simple ensamblaje del complejo de la Pol-II a esosromotores abrira la cromatina permitiendo el acceso de

as protenas RAG-1/2 a las RSS asociadas a esos segmentosnicos.

Aunque todos los datos anteriormente descritos apoyan elmodelo de accesibilidad, este no ha sido validado de formaefinitiva hasta muy recientemente por los grupos de D.G.chatz y M.S. Krange mediante el anlisis de la unin in vivoe la protena RAG-1 a los RSS en los genes de las cadenasariables de los receptores de antgeno durante el desarrolloe los linfocitos36,37. La protena RAG-2 reconoce una marcae cromatina abierta, H3K4me3, a lo largo de todo el genoman los precursores de los linfocitos38,39. Por tanto, RAG-2 sencuentra unida a toda la cromatina activa en estas clulas,ndependientemente que se trate o no de las RSS. Sin embargo,a protena RAG-1 solo reconoce a las RSS accesibles36,37, por loue su unin es predictiva de una recombinacin V(D)J activa.or tanto, el reclutamiento de RAG-1, y no de RAG-2, es lo

ue determina la especificidad de la recombinacin V(D)J. Enstos experimentos36,37 se analiz el reclutamiento de RAG-

por inmunoprecipitacin de cromatina a los genes de lasadenas variables de los receptores de antgeno y se observ

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que los promotores, los enhancers y la transcripcin activa sontodos esenciales para que RAG-1 pueda ser reclutada a deter-minadas RSS, validando de forma definitiva el modelo deaccesibilidad9. En resumen, estos estudios han demostradoque el control de la recombinacin V(D)J ocurre a travs de laregulacin de la accesibilidad de las RSS a la protena RAG-1(que funciona en conjuncin con la protena RAG-2) mediada atravs de la activacin de las secuencias reguladoras presentesen cada gen y de la elongacin transcripcional. Actualmente,se desconoce el mecanismo molecular del reclutamiento de laprotena RAG-1 a travs de la elongacin transcripcional, peroprobablemente est mediada por la apertura de la cromatinaque acompana o es consecuencia del paso del complejo de laPol-II.

Papel de la conformacin gnica y de lalocalizacin nuclear de los genes de lascadenas variables de los receptores de antgenoen la regulacin de la recombinacin V(D)J

Aunque est aceptado que la accesibilidad de la cromatinaes fundamental para que la recombinacin V(D)J pueda tenerlugar, se ha demostrado que esta no es suficiente en algunoscasos40, existiendo otro nivel de regulacin que se ha denomi-nado ms all de la accesibilidad. Este nivel de regulacinadicional depende de 2 procesos que ocurren en los genesde las cadenas variables de los receptores de antgeno a nivelnuclear: cambios de la conformacin gnica y cambios de lalocalizacin subnuclear.

Mediante experimentos de hibridacin in situ con sondasfluorescentes para las regiones proximales y distales, analiza-dos por microscopa confocal (3D-FISH), el grupo de J.A. Skokdemostr que la conformacin gnica y la localizacin en elncleo de los genes de las cadenas variables de los recepto-res de antgeno tienen un papel fundamental en el proceso derecombinacin V(D)J41. As estos genes pueden encontrarseen configuraciones extendidas o contradas como consecuen-cia de la separacin o yuxtaposicin de las regiones V con lasregiones J, respectivamente. De hecho, la contraccin de ungen ocurre en el mismo momento en que ese gen se transcribey est listo para ser recombinado, incluso en ausencia de lasprotenas RAG-1/241. Un ejemplo interesante de regulacin dela conformacin gnica ha sido revelado en el anlisis del locusTcra/Tcrd por el grupo de M.S. Krangel42. Este locus contiene 2genes que codifican para 2 cadenas variables de los recepto-res de antgeno, Tcrd y Tcra (fig. 2), con distintos programas derecombinacin y expresin durante el desarrollo de los timo-citos (fig. 3). Cada alelo del gen Tcrd solo tiene una oportunidadpara reordenar sus segmentos gnicos en timocitos DN2-DN3y, por ello, los segmentos V, que estn distribuidos a lo largode toda la regin V/, deben tener las mismas oportunidadesde reordenarse en estas clulas. De forma coherente con estasituacin, los experimentos de 3D-FISH del locus Tcra/Tcrd hanmostrado que esta regin se encuentra totalmente contradaen timocitos DN3 (fig. 6A). En timocitos DP, el gen Tcra puede

sufrir mltiples rondas de reordenamientos VJ hasta con-seguir una cadena TCR capaz de ensamblarse con la cadenaTCR (fig. 4B). Para favorecer los reordenamientos sucesivosdel gen Tcra primero se activa E por la senalizacin mediada

66 i n m u n o l o g a . 2 0 1 3;3 2(2):5769

Linfocitos B

Timocitos DN3

Sealizacin por el pre-TCR

Timocitos DP tempranos

A

B

Progenitores linfoides

VH distal

V distal

C

CH

Clulas pro-B Grandes

Clulas pre-BII

Pequeas

RAG+RAG-RAG+RAG-

+IL-7

Pre-BCR Pre-BCR

ReginC

V/ centrales

V/proximales

Regin C

V/ distales

V/ distales

V/ distales

V/ centrales

V/ centrales

V/ proximales

V/ proximales Regin C

Figura 6 Conformacin gnica y localizacin subnuclear de los genes de las cadenas variables de los receptores deantgeno. (A) Estados conformacionales del locus Tcra/Tcrd. Los segmentos V/ estn localizados en 3 regiones: distal(segmentos gnicos V/ situados en la regin ms alejada de la regin constante C), central (segmentos gnicos V/situados en la regin central) y proximal (segmentos gnicos V/ situados en la regin ms cercana a la regin constanteC). El diagrama describe las distintas conformaciones gnicas del locus observadas en los distintos tipos celulares:extendida del locus en linfocitos B, totalmente contrada en timocitos DN3, y extendida en las regiones V/distales/centrales y contrada de las regiones V/ proximales en timocitos DP tempranos42. (B) Conformacin gnica ylocalizacin subnuclear de los genes Igh e Igk durante el desarrollo de los linfocitos B. Los crculos y rombos coloreadosrepresentan los extremos de los genes Igh e Igk detectados mediante sondas fluorescentes utilizadas en experimentos de3D-FISH41. La representacin de rombos y crculos permite distinguir los 2 alelos de cada gen. Las regiones VH del gen Ighse representan mediante crculos o rombos rojos. Las regiones CH del gen Igh se representan mediante crculos o rombosverdes. Las regiones V del gen Igk se representan mediante crculos o rombos azules. Las regiones C del gen Igk se

chas

representan mediante crculos o rombos amarillos. Las man

por el pre-TCR en timocitos DN4 y DP tempranos, lo cualdispara la transcripcin mediada por los promotores de lossegmentos V proximales y de los segmentos J distales, TEAy J49p, para generar los reordenamientos primarios. Comoconsecuencia de estos reordenamientos primarios, y si estosno han resultado productivos, se activan los reordenamientossecundarios que afectan a los segmentos V distales/centralesy a los segmentos J proximales. De forma coherente con estasituacin, los experimentos de 3D-FISH han mostrado que laregin que contiene los segmentos V distales y centrales seencuentra en una configuracin extendida en timocitos DP,lo cual favorecera un uso secuencial 5-3 de los segmentosV (fig. 6A). Se desconoce el mecanismo molecular respon-sable de la contraccin de los genes de las cadenas variables

de los receptores de antgeno. Los anlisis de la conforma-cin gnica del locus Tcra/Tcrd, en ausencia de E o E, handemostrado que los enhancers no estn implicados en la yux-taposicin de las regiones distales con las regiones proximales

negras representan las zonas de heterocromatina.

del locus42. Recientemente se ha evaluado la posible contribu-cin de CTCF en este proceso4345. Los datos obtenidos indicanque, aunque este factor media en la regulacin de la recom-binacin V(D)J, CTCF no es el responsable de la contraccingnica de los genes de las cadenas variables de los receptoresde antgeno4446. Otros candidatos que podran mediar en lacontraccin gnica de estos genes incluyen determinados FT,tales como Pax5, Ikaros, YY1, el factor X de clulas pro/pre-B ylas protenas E41. Tambin se postula que la transcripcin pors misma est implicada en la regulacin de la conformacingnica de las cadenas variables de los receptores de antgeno.

Durante los ltimos 10 anos se ha demostrado que lalocalizacin nuclear de estos genes tiene tambin un papelfundamental en la regulacin de la recombinacin V(D)J. As,

para que un gen recombine, se necesita que ese gen seencuentre fuera de las zonas represivas del ncleo (alejadode las regiones que contienen la heterocromatina y de lalmina interna del ncleo)41,47. Adems, en el caso de los

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gqctssrrdbegddcedn

cegtFqybchsetuedrecamzqrLgcBlc1ccdiIclem

b

control of V(D)J recombination. Adv Immunol. 2006;91:45109.

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enes de las cadenas variables de los receptores de antgenoue sufren exclusin allica, se ha observado que la asocia-in de estos genes con compartimentos nucleares represivosiene un papel fundamental en este proceso41,47. La exclu-in allica de los genes Igh y Tcrb se regula a travs deu fuerte tendencia a asociarse con compartimentos nuclea-es represivos, lo cual determina una reducida eficiencia deecombinacin, contribuyendo as a que las posibilidadese que ambos alelos reordenen simultneamente sean muyajas48,49. En el caso del gen Igk, el mecanismo que regula suxclusin allica es distinto. El ADN de los 2 alelos de esteen estn diferencialmente metilados, lo que determina suistinta predisposicin a asociarse con las reas represivasel ncleo y a sufrir recombinacin50. Actualmente se des-onocen los elementos reguladores y los factores implicadosn la asociacin de determinados genes de cadenas variablese los receptores de antgeno con compartimentos represivosucleares.

En la figura 6B se resumen los cambios detectados en laonformacin gnica y localizacin nuclear de los genes Igh

Igk durante el desarrollo de los linfocitos B41. En los pro-enitores linfoides de linfocitos T y B ambos genes estnranscripcionalmente inactivos. Los estudios mediante 3D-ISH de estos genes en estos estadios tempranos indicanue estos genes tienen una conformacin gnica extendida

se encuentran asociados a la lmina interna de la mem-rana nuclear. Los progenitores linfoides maduran en mdulasea, recibiendo una senalizacin a travs de IL-76. En laslulas pro-B, el gen Igh sufre una relocalizacin nuclearacia regiones transcripcionalmente activas, un cambio deu conformacin gnica a una configuracin contrada y unmparejamiento de los 2 alelos del gen a travs de los segmen-os VH, todo lo cual permite el reordenamiento VH a DHJH enno solo de los alelos. No se conoce el mecanismo que median el emparejamiento de los 2 alelos Igh, pero ocurre de formaependiente de la presencia de las protenas RAG-1/2. Si eseeordenamiento es improductivo se inicia el reordenamienton el otro alelo del gen Igh. En las clulas pro-B el gen Igkontina con una conformacin gnica extendida y asociado

la membrana nuclear. En clulas pre-BI el alelo correcta-ente reordenado del gen Igh se expresa y se encuentra en

onas transcripcionalmente permisibles del ncleo, mientrasue el alelo Igh no reordenado se asocia con las reas nuclea-es de heterocromatina para inhibir su posible recombinacin.a recombinacin VHDHJH productiva de uno de los alelos delen Igh permite su expresin en la membrana celular juntoon las cadenas invariables V-preB y 5 para dar lugar al pre-CR, lo cual transduce una senalizacin intracelular que dirige

a diferenciacin de las clulas pre-BI a clulas pre-BII. En laslulas pre-BII grandes, no hay expresin de protenas RAG-/2 por lo que la recombinacin V(D)J est inhibida. En estaslulas, los alelos del gen Igk sufren una contraccin de suonformacin gnica, a la vez que estos se asocian con rease heterocromatina. El alelo Igh no reordenado (o reordenado

mproductivamente) se asocia junto con los alelos del gengk en zonas de heterocromatina, sufriendo una descontrac-in en su conformacin gnica. En clulas pre-BII pequenas,

as protenas RAG-1/2 vuelven a reexpresarse. Esto permitel reordenamiento V-J de un alelo del gen Igk que se haovido hacia posiciones del ncleo permisivas para la trans-

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cripcin y el reordenamiento gnicos. Si este reordenamientoresulta improductivo se activa el mismo proceso en el otroalelo del gen Igk. El alelo no reordenado (o reordenado deforma improductiva) del gen Igh permanece asociado con laheterocromatina y con una configuracin extendida, reforzn-dose la exclusin allica de este gen mediante la inhibicindel reordenamiento VH a DHJH. El alelo del gen Igh que sufriun reordenamiento productivo en las clulas pro-B perma-nece transcripcionalmente activo y se encuentra localizadoen las reas permisivas del ncleo celular en clulas pre-BII.El correcto reordenamiento de uno de los alelos del gen Igkpermite la expresin de una cadena Igk que se empareja conla cadena Igh para la expresin de un BCR en la membranacelular, dando lugar a la diferenciacin de las clulas pre-BII alinfocitos B. En los linfocitos B ambos alelos de cada gen tie-nen una configuracin extendida y se encuentran en regionestranscripcionalmente permisivas. De esta forma, se aseguraque solo un alelo de cada gen, Igh e Igk, porte un reorde-namiento productivo y solo se exprese un tipo de receptorclonotpico en cada linfocito B vrgen.

En resumen, podemos concluir que las evidencias experi-mentales indican que la accesibilidad de la cromatina, juntocon la conformacin gnica y la localizacin subnuclear de losgenes que codifican para las cadenas variables de los recepto-res de antgeno de linfocitos, regulan de forma conjunta elproceso de recombinacin V(D)J37,41,47.

Financiacin

El trabajo presentado est financiado por el Ministeriode Economa y Competitividad (BFU2009-08796), la Junta deAndaluca (CTS-6587 y CVI-4526) y el Consejo Superiorde Investigaciones Cientficas (201020E060), parcialmentefinanciados con fondos FEDER de la Unin Europea.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningn conflicto de intereses.

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