Generalidades de Nutrición y Metabolismo de los

Protozoarios Parásitos

Nutrición

• Dependencia metabólica del hospedero• Capacidad biosintética limitada• Conocimiento derivado de cultivos y en pocas

especies• Single omission tests: difícil sacar conclusiones• Sustancias nutritivas universales: HC, aa,

vitaminas, minerales y oligoelementos. Se suman: nucleósidos, AG, esteroles y porfirinas

Nutrición - Mecanismos

• Difusión simple: moléculas no polares, liposolubles, AG no disociados, drogas hidrofóbicas

• Transporte mediado: PM bajo, iones, H, Na, Cl, aa, azúcares. No utiliza energía, cinética de saturación y especificidad

• Transporte activo: sistemas de transporte contra gradiente de concentración

• Endocitosis: pinocitosis y fagocitosis

Glúcidos

• Transporte mediado en membranas celulares• T. brucei: 2 sistemas, a) glucosa y manosa y b)

fructosa y glucosamina• T. equiperdium: 1 sitio de hexosas y 1 de

glicerol• E. histolytica: glucosa por 2 sitios, paso

limitante• Plasmodium: modulación de la membrana de la

célula huésped (eritrocito) con poros.

Caso: Metabolismo de Galactosa en Trypanosoma brucei.

• El metabolismo de la Gal es esencial para la sobrevida de T. brucei.

• Gal está presente en cantidades importantes en las VSG

• Los transportadores de hexosas de T. brucei son incapaces de transportar Gal que se obtiene por la epimerización de la UDP-glucosa a la UDP-galactosa por la UDP-glucosa 4´epimerasa (galE).

Glicoconjugados de superficie en Trypanosoma brucei

Mutante condicional null para galE• Bajo condiciones no permisivas

que induce la deprivación de Gal.

• Por medio de la adición de Tetraciclina al medio se produce la expresión de galE

• Después de 96h la división cesa y la ME revela una morfología alterada y aparición de vesículas aberrantes cerca del bolsillo flagelar.

Scanning electron microscopy of galE-cKO Tet. Effects on cellular morphology after galactose starvation for 0 h (A), 48 h (B), 96 h (C and D), and 144 h (E and F) are shown. Scale bars, 2 m.

Efecto de la deprivación de Gal en el crecimiento de T. brucei y contenido de nucleótidos

(A)Growth of galE-cKO with and without Tet

(B) ratio of UDP-Gal/UDP-Glc in the galE-cKO without Tet

(C) Sugar nucleotide levels of the galE-cKO Tet cells.

• Los niveles celulares de UDP-galactosa caen rápidamente luego de la deprivación de Gal llegando a niveles indetectables a las 72 hs.

Impacto de la deprivación de Gal sobre las VSG

El análisis de las glicoproteínas extraídas por lectin blotting muestra que la Gal está virtualmente ausente y que se reducen las estructuras de poli-N-acetillactosamina

Impacto de la deprivación de Gal sobre las VSG

El análisis por MALDI-TOF de una VSG (221) confirma la pérdida completa de galactosa del ancla de glicosilfosfatidylinositol

Aminoácidos

• Translocación – mediada en su gran mayoría• Endocitosis de proteínas.• T. brucei: 4 sitios operativos• T. cruzi: Arg altamente específico, con 3

sistemas; Thr es contra gradiente, se intercambia con Ala

• Plasmodium: Hb es la mayor fuente de aa, ingresa por endocitosis a través del citostoma

Caso: la Arginina es un aa esencial para Toxoplasma gondii

• En la mayoría de los eucariotes existen dos genes de carbamoil fosfatasa sintetasa (CPS), una es glutamina dependiente y se requiere para sintetizar pirimidinas (CPSII), la otra (CPSI) está dedicada a la biosíntesis de Arg a partir de carbamoil fosfato

• T. gondii carece del gen de la CPSI• Deprivación de Arg bloquea

multiplicación en taquizoítos, lo rescata la citrulina.

Deprivación dispara transformación de taquizoítos en bradizoítos

Verde: proteína expresada por taquizoítos

Rojo: proteína expresada por bradizoítos

Azul: núcleos teñidos con DAPI

A: 48hs medio normal

B: 48hs medio sin Arg

C: 7 d sin Arg

D: 14 d sin Arg

E: Contraste de fase de D

F: Cepa PLK 4 d sin Arg

Caso: Degradación de la Hb en Plasmodium

Hemoglobina· 95% de las proteínas totales de GR· Abundante (>300 mg/ml o approx 5

mM)· 60-80% es degradada durante el

estadio eritrocitario · 110 g (en un total de 750) se

consumen en 48 hs con una parasitemia del 20%

Trofozoíto en GR

Merozoíto entrando un GR

Endocitosis del citoplasma eritrocitario

food vacuole

cytostome

pinocytosis (rings)

Vacuola DigestivaUn lisosoma especializado

ATP

ADP

H+

(pH 5-5.4)

Proteasas de la vacuola• plasmepsinas I & II

(aspártico)• falcipainas I - III (tiol)• falcilysinas (metallo)

digestion de hemoglobina

citoplasmaparasitario

Camino endocítico

El clivaje inicial de plasmepsinas es específico y conduce a la desestabilización de la Hb

• Hb es clivada entre Phe-33 y Leu-34 (cadenas α)– ‘región bisagra’– conservada– Importante para estabilizar el

tetrámero• Se forman fragmentos

grandes de globina suceptibles de proteólisis posterior – Se libera Heme

a-F33/L34í

La digestión de la Hb es un proceso ordenado

• Exopeptidasa?• Amino acidos libres?

hemoglobina

+ hemefragmentos deglobina grandes

Fragmentos chicos (6-8 aa)

plasmepsina

falcipainaplasmepsinafragmentos medios

(20 aa) falcilysina

La vacuola Digestiva de PlasmodiumUn lisosoma especializado

hemoglobin

+heme globinfragments

small fragments(6-8 amino acids)

ATP

ADP

ATP

ADP

H+ plasmepsin

falcipain

plasmepsin

falcilysin

Pfmdr-1?

aminoacids

amino-peptidase

proteins

• Desestabiliza y lisa membranas • Las hidrolasas se liberan en el

citoplasma del parásito • El parásito muere

El Heme libre es tóxico

Posible Mecanismos de Detoxificación• heme hemozoína (pigmento malárico)• Degradación mediada por H2O2 o GSH• heme oxigenasa (sólo P.b. and P.k.)

Hemozoína = b-Hematina

heme b-hematina

b-hematina forma cristales insolubles

'biocristalizacion' or 'biomineralización'

La vacuola digestiva Un lisosoma especializado

hemoglobin

+heme globinfragments

small fragments(6-8 amino acids)

hemozoinATP

ADP

ATP

ADP

H+

Fe3+

Fe2+O2

-O2 O2

?

plasmepsin

falcipain

plasmepsin

falcilysin

Pfmdr-1?

aminoacids

amino-peptidase· Fe se oxida después

de liberarse de la Hb· La oxidación

promueve la formation of ROI

· Estrés oxidativo

Nucleótidos

• No pueden sintetizar nucleótidos de purinas (A G) de novo

• Purinas y pirimidinas deben adquirirse en forma de bases o nucleósidos. No tienen transportadores de nucleótidos

• En kinetoplástidos adenosina es fuente más importante de síntesis de nucleótidos de purina

• Locus para transporte de nucleósidos• Ribonucleasas y nucleotidasas de superficie• Plasmodium: hipoxantina es fuente de purina

Transportadores de purinas en Plasmodium

Vías de salvataje de purinas en parásitos

Lípidos

• Transportadores para AG • Difusión pasiva para AG no disociados• Apicomplexa: transporte a través de vacuola

parasitófora• Apicoplasto: plástido no fotosintético encontrado

en apicomplexa adquirido por endosimbiosis secundaria

• Síntesis de AG e isoprenoides en apicoplasto

Metabolismo del colesterol en Toxoplasma gondii

METABOLISMO ENERGÉTICO EN PROTOZOARIOS PARÁSITOS

Generalidades Objetivos del metabolismo energético

• a)   Catabolizar sustancias orgánicas y acoplar el proceso a la conservación de energía

• b)   Formar y degradar biomoléculas requeridas en funciones específicas

Esquema de Metabolismo Energético

KINETOPLASTIDOS• Trypanosoma brucei como modelo:• a)     Depende únicamente de glicólisis para

producir ATP. Prefiere Glu, pero también Fru, Man y Glicerol

• b)    Mitocondria escasamente desarrollada sin Krebs ni CR en formas circulantes

• c)     Abundantes enzimas glicolíticas: 90% del glicosoma

• d)    Flujo glicolítico es relativamente alto• e)     Enzimas glicosómicas no glicolíticas

deprimidas

Glicólisis

• Glicosomas: Característicos de Tripanosomatidos. 0.3um, 4% del volumen celular. T. brucei=200.

• Glicólisis: De Glu a 3fosfoglicerato en glicosomas. Citoplasma: de 3GP a 3PEP – Piruvato. Termina en Piruvato (98%) y trazas de CO2 y Glicerol- Fermentación G3P pasa los equivalentes reductores a través de una oxidasa al O2 dentro de la mitocondria

• Alta eficiencia. Sobrevive aún en condiciones anaeróbicas a razón de 1ATP por 1Glucosa.

• Enzimas: sectores de carga + para ingresar al glicosoma.

• Formas procíclicas en vector: Cambio a metabolismo más mitocondrial, aumenta volumen mitocondrial, cristas desarrolladas. CR respiratoria convencional. PRO: metabolizada en CO2, ALA y ASP

 

Glicólisis y glicosomas

•

Metabolismo energético en formas circulantes y proçíclicas de T. brucei

Amebas Intestinales y Giardia

• Glicolisis via Embden-Meyerhof pero sin lactato deshidrogenasa. Piruvato se convierte en etanol y CO2 en anaerobiosis, en aerobiosis acetato y etanol

• Amitocondriados, por tanto sin Ciclo de Krebs ni fosforilación oxidativa

• Sin citocromos• Almacenan glucógeno• Toleran bajas concentraciones de oxígeno

Glucolisis

Glucolisis anaerobia

Mitosomas

- Descrito en E. histolytica, G. lamblia- El origen mitocondrial del mitosoma está

apoyado por:- i) Doble membrana- ii) localización de proteínas de la

maquinaria del clusters de Fe-S (ej. Ferredoxina)

- iii) Transporte al mitosoma por medio de secuencias N-terminales similares a las secuencias mitocondriales

Enzimas glicolíticas de Entamoeba histolytica

Trichomonas

• Glicólisis clásica hasta piruvato que se convierte en lactato y éste en acetato, CO2 y H2O

• La oxidación del piruvato se cataliza por decarboxilación oxidatica en reacciones ligadas a Ferredoxina, proteina sulfurada con Fe como transportador de electrones

• La reacción se produce en los hidrogenosomas donde el H+ es el aceptor final de los electrones

Hidrogenosomas

• Organelos de eucariotes anaeróbicos que generan hidrógeno molecular

• 1 um, doble membrana• Comparten ancestro con

mitocondrias• Tricomonas, ciliados

anaerobios, hongos

MalatePyruvateME

NAD(P)+NAD(P)H

2Fd-2Fd

PFOAcetyl-CoA Acetate

ASCT

Succinyl-CoASuccinate

ADP + PiATP

AAC

STK

[Fe]HydNAD(P)-FO

2H+

H2

Double membrane

hsp70

cpn60

Schematic Map of Hydrogenosomes (after Muller 1993)

CO2

CO2

ADPATP

Transitpeptides

Protein import

N

Enzyme found also in mitochondriaAlpha-proteobacterial ancestryUnknown ancestry

CoASH

Fungi and Trichomonas

Generación de ATP en Hidrogenosomas

Acidocalsomas

Organelos ácidosAlmacenan calcioEn varios microorganismosPrimero definidos en

tripanosomátidosAlta densidad electrónicaAlta concentración de

fosfatos, Ca++., Mg++

Apicoplastos

-Organelo cloroplasto-símil- Vias biosintéticas de origen

cianobacteriano-Producto de la endosimbiosis secundaria de una cianobacteria y un eucariote-En Apicomplexa-Semiautónomos, genoma propio reducido