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ACQUITY UPLCH-Class y H-Class Bio

para análisis de aminoácidos

Guía del sistema

Revisión B

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Marcas comerciales

ACQUITY UPLC, Millennium, UPLC y Waters son marcas registradas, y AccQ•Fluor, AccQ•Tag, eCord, Empower, MassLynx y “THE SCIENCE OF WHAT’S POSSIBLE.” son marcas comerciales de Waters Corporation.

MP35N es una marca registrada de Hamilton Precision Metals.

PEEK es una marca comercial de Victrex Corporation.

Teflon es una marca registrada de E. I. DuPont de Nemours and Company.

TRITON es una marca comercial de Union Carbide Corporation.

TWEEN es una marca comercial de ICI Americas, Inc.

Otras marcas comerciales o registradas pertenecen exclusivamente a sus respectivos propietarios.

Comentarios del cliente

El departamento de Comunicaciones del Servicio Técnico de Waters agradece la comunicación de cualquier error que se detecte en este documento, así como las sugerencias para mejorarlo. Su ayuda para conocer mejor lo que se espera

ii

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Tenemos muy en cuenta los comentarios enviados por nuestros clientes. Para ponerse en contacto con nosotros, enviar un mensaje a [email protected].

Contacto con Waters

Contactar con Waters® para presentar solicitudes de mejora o preguntas técnicas relativas al uso, el transporte, la retirada o la eliminación de cualquier producto de Waters. El contacto puede hacerse a través de Internet, teléfono o correo convencional.

Consideraciones de seguridad

Algunos de los reactivos y las muestras que se utilizan con los instrumentos y dispositivos de Waters pueden suponer un peligro radiológico, biológico o químico (o cualquier combinación de los mismos). Se deben conocer los efectos potencialmente peligrosos de todas las sustancias con las que se trabaja. Hay que seguir siempre las buenas prácticas de laboratorio y consultar las recomendaciones del responsable de seguridad de la organización.

Información de contacto de Waters:

Medio de contacto Información

Internet El sitio web de Waters incluye información de contacto de las filiales internacionales de Waters. Visitar www.waters.com.

Teléfono y fax Desde EE. UU. o Canadá, llamar al 800 252-HPLC o enviar un fax al 508 8721990.Desde otros países, consultar los números de teléfono y fax de las filiales internacionales en el sitio web de Waters.

Correo convencional Waters Corporation34 Maple StreetMilford, MA 01757EE. UU.

iii

Consideraciones específicas acerca de los sistemas para análisis de aminoácidos ACQUITY UPLC H-Class y H-Class Bio

Peligro de alto voltaje

Consejos de seguridad

Consultar el Apéndice A para ver una lista completa de advertencias y precauciones.

Símbolos aplicables

Advertencia: para evitar el riesgo de descargas eléctricas, no se deben quitar los paneles de protección de los sistemas ACQUITY UPLC H-Class y H-Class Bio. Estas cubiertas no cubren ningún componente que el usuario deba manipular.

Símbolo Definición

Fabricante.

Representante autorizado en la Comunidad Europea.

Garantiza que un producto fabricado cumple con todas las directivas aplicables de la Comunidad Europea.

Marca C de cumplimiento de CEM de Australia

Confirma que un producto fabricado cumple con todos los requisitos de seguridad aplicables en Estados Unidos y Canadá.

Consultar las instrucciones de uso.

iv

Uso previsto de los sistemas para análisis de aminoácidos ACQUITY UPLC H-Class y H-Class Bio

Los sistemas para análisis de aminoácidos (AAA) ACQUITY UPLC® H-Class y H-Class Bio se diseñaron junto con las químicas AccQ•Tag™ Ultra de Waters para el análisis de aminoácidos, el análisis de hidrolizados de proteínas y péptidos (para identificación y caracterización), el análisis de medios de cultivos celulares, el análisis de cisteína alquilada, y el análisis de la composición nutricional de alimentos y piensos. Los sistemas de AAA ACQUITY UPLC H-Class y H-Class Bio no están concebidos para utilizarse en análisis clínicos de aminoácidos fisiológicos. Se sabe que se produce la coelución de ciertos pares de picos.

Calibración

Para calibrar los métodos, se deben utilizar métodos de calibración adecuados y al menos cinco patrones para generar una curva de calibración. El intervalo de concentraciones de los patrones debe incluir la gama completa de muestras de control de calidad, muestras típicas y muestras atípicas.

Control de calidad

Analizar sistemáticamente muestras de control de calidad que representen el intervalo de concentraciones de aminoácidos que se desea analizar. Los resultados del análisis de estas muestras deberán encontrarse dentro de un rango aceptable y se deberá evaluar la precisión de un día a otro y después de cada análisis. Es muy posible que los datos obtenidos cuando las muestras de control de calidad estén fuera del rango no sean válidos. Dichos datos no se deben incluir en un informe hasta asegurarse de que el instrumento funciona satisfactoriamente.

Al analizar muestras obtenidas de una matriz compleja, como medios de cultivo, piensos, alimentos, etc., se debe tener en cuenta que los componentes de la matriz pueden influir negativamente en los resultados. Para minimizar estos efectos de la matriz, se recomienda utilizar procedimientos adecuados y validados para la preparación de las muestras.

v

Clasificación ISM

Clasificación ISM: ISM Grupo 1, Clase B

Esta clasificación se ha asignado según los requisitos para los instrumentos industriales científicos y médicos (ISM) de la IEC CISPR 11. Los productos del Grupo 1 contienen energía de radiofrecuencia acoplada conductivamente, generada o utilizada de forma intencionada, necesaria para el funcionamiento interno del propio equipo. Los productos de Clase B se pueden utilizar tanto en instalaciones comerciales como residenciales, y se pueden conectar directamente a la red de suministro eléctrico de bajo voltaje.

Representante autorizado en la CE

Waters Corporation (Micromass UK Ltd.)Floats RoadWythenshaweManchester M23 9LZReino Unido

Teléfono: +44-161-946-2400

Fax: +44-161-946-2480

Contacto: Gerente de calidad

vi

Contenido

Información sobre los derechos de autor (copyright) .................................. ii

Marcas comerciales .............................................................................................. ii

Comentarios del cliente ...................................................................................... ii

Contacto con Waters ........................................................................................... iii

Consideraciones de seguridad .......................................................................... iii

Consideraciones específicas acerca de los sistemas para análisis de aminoácidos ACQUITY UPLC H-Class y H-Class Bio ........................... iv

Consejos de seguridad ........................................................................................ iv Uso previsto de los sistemas para análisis de aminoácidos ACQUITY

UPLC H-Class y H-Class Bio ........................................................................ v Calibración ........................................................................................................... v Control de calidad ................................................................................................ v

Clasificación ISM ................................................................................................. vi Clasificación ISM: ISM Grupo 1, Clase B.......................................................... vi

Representante autorizado en la CE ................................................................ vi

1 Descripción general del sistema ......................................................... 1-1

Módulos de los sistemas ACQUITY UPLC H-Class y H-Class Bio .......... 1-2

Características de los sistemas ACQUITY UPLC H-Class y H-Class Bio AAA ........................................................................................................ 1-3

Usar el método AccQ•Tag Ultra .................................................................... 1-4 Descripción general de la química de derivatización..................................... 1-4

2 Configuración del sistema ................................................................... 2-1

Instalar los tubos del detector ....................................................................... 2-2

Conexiones de los tubos .................................................................................. 2-2 Recomendaciones para la instalación de los conectores ................................ 2-2 Conexión de los tubos del detector TUV ......................................................... 2-7

Contenido 1

Conexión de los tubos del detector PDA ......................................................... 2-9 Conexión de los tubos del detector FLR.......................................................... 2-9 Conectar los tubos del sistema de gestión de eluyentes y del sistema

de gestión de muestras ............................................................................ 2-10 Instalar la columna para la detección óptica................................................ 2-14 Conexión al suministro de eluyente.............................................................. 2-17

Conexiones Ethernet ...................................................................................... 2-18 Conexiones Ethernet ..................................................................................... 2-18 Conexiones del horno de columnas ............................................................... 2-18

Conexiones de señales ................................................................................... 2-19 Realizar las conexiones de señales................................................................ 2-19

Conexión a la fuente de alimentación ........................................................ 2-24

3 Verificar el funcionamiento del sistema .......................................... 3-1

Preparar el sistema .......................................................................................... 3-2

Preparar eluyentes ........................................................................................... 3-5 Configurar la fase móvil .................................................................................. 3-5 Preparar la fase móvil ..................................................................................... 3-6

Crear los métodos de prueba ......................................................................... 3-7 Método de prueba del detector TUV ............................................................... 3-9 Método de prueba del detector PDA ............................................................. 3-16 Métodos de prueba para el detector FLR...................................................... 3-22

Crear los métodos de secuencia de muestras ........................................... 3-29 Método de secuencia de muestras para el detector TUV............................. 3-29 Método de secuencia de muestras para el detector PDA ............................. 3-29 Método de secuencia de muestras para el detector FLR ............................. 3-29

Preparar la muestra de verificación del sistema .................................... 3-30

Realizar la prueba .......................................................................................... 3-30 Cromatogramas de ejemplo........................................................................... 3-31

2 Contenido

4 Preparar patrones y muestras ............................................................ 4-1

Reconstituir el reactivo en polvo AccQ•Tag Ultra ................................... 4-2

Preparar el patrón de calibración ................................................................ 4-3 Preparar el patrón de calibración: método externo........................................ 4-3 Preparar el patrón de calibración: método interno ........................................ 4-4 Derivatizar el patrón de calibración ............................................................... 4-5

Preparar las muestras ..................................................................................... 4-6 Determinar la cantidad de muestra................................................................ 4-6 Hidrolizar las muestras................................................................................... 4-7 Derivatizar las muestras ................................................................................. 4-8

5 Trabajar con el sistema ........................................................................ 5-1

Preparar el sistema .......................................................................................... 5-2 Preparar las fases móviles............................................................................... 5-2 Encender el sistema......................................................................................... 5-2 Supervisar las pruebas iniciales ..................................................................... 5-3 Supervisar los indicadores LED de los módulos del sistema......................... 5-3 Indicador LED de encendido ........................................................................... 5-3 Indicadores LED de estado.............................................................................. 5-3 Activar los sensores de fugas .......................................................................... 5-5 Puesta en marcha del sistema ........................................................................ 5-6 Conectar la columna ........................................................................................ 5-8

Configurar el software Empower .................................................................. 5-9 Interfaz QuickStart de Empower.................................................................... 5-9

Abrir Empower y restaurar proyectos ....................................................... 5-11

Cargar, modificar y procesar un método de secuencia de muestras ..................................................................................................... 5-13

Procesar datos ................................................................................................. 5-16 Procesar datos por lotes................................................................................. 5-17 Revisar los datos procesados ......................................................................... 5-19 Generar un informe ....................................................................................... 5-20

Contenido 3

6 Gestionar muestras especiales ........................................................... 6-1

Analizar la presencia de cisteína en muestras de proteínas .................. 6-2 Analizar las muestras...................................................................................... 6-2 Cromatogramas de ejemplo............................................................................. 6-3

Analizar el contenido nutricional de alimentos y piensos ...................... 6-6 Analizar las muestras...................................................................................... 6-6 Cromatogramas de ejemplo............................................................................. 6-7

Analizar medios de cultivo celular ............................................................. 6-10 Analizar las muestras.................................................................................... 6-10 Cromatogramas de ejemplo........................................................................... 6-10

7 Diagnosticar y corregir anomalías .................................................... 7-1

Principios generales ......................................................................................... 7-2

Chromatography (Cromatografía) ................................................................ 7-3 Problemas cuantitativos .................................................................................. 7-6 Problemas de derivatización ........................................................................... 7-8

Problemas de derivatización ........................................................................ 7-12 Reactivo insuficiente...................................................................................... 7-12 Reconstitución de las muestras..................................................................... 7-13

A Consejos de seguridad ......................................................................... A-1

Símbolos de advertencia ................................................................................. A-2 Advertencias de peligro asociadas con tareas específicas.............................. A-2 Advertencias específicas .................................................................................. A-3

Aviso de precaución ......................................................................................... A-6

Advertencias que se aplican a todos los instrumentos de Waters ......... A-6

Símbolos eléctricos y de manejo .................................................................... A-7 Símbolos eléctricos........................................................................................... A-7 Símbolos de manejo ......................................................................................... A-8

4 Contenido

B Materiales de fabricación y eluyentes que cumplen la normativa .................................................................................................... B-1

Prevenir la contaminación ............................................................................ B-2

Elementos expuestos a eluyentes ................................................................. B-2

Eluyentes utilizados para preparar fases móviles ................................... B-3

C Directrices para la derivatización ................................................... C-1

Introducción ...................................................................................................... C-2

Calcular la cantidad de muestra para la hidrólisis ................................. C-4

Calcular la cantidad de muestra para la derivatización ........................ C-7

Calcular la cantidad necesaria para la neutralización ........................ C-10 Consideraciones ............................................................................................. C-10

Confirmar que hay suficiente reactivo ..................................................... C-11

Términos del cálculo ..................................................................................... C-12

Ejemplos ........................................................................................................... C-13 Muestra de composición conocida y concentración en mg/mL..................... C-13 Ejemplo con una composición de muestra desconocida, concentración

en mg/mL.................................................................................................. C-17 Ejemplo con una composición de muestra desconocida, concentración

en mg/tubo................................................................................................ C-19 Ejemplo con una composición de muestra desconocida, concentración

en pmoles/tubo ......................................................................................... C-20 Ejemplo con una composición de muestra desconocida, concentración

en pmoles/µL ............................................................................................ C-21 Ejemplo con una composición de muestra desconocida, concentración

en µM........................................................................................................ C-22 Ejemplo con una composición de muestra desconocida, concentración

en % .......................................................................................................... C-23 Ejemplo con una composición de muestra desconocida, concentración

en mg% ..................................................................................................... C-25

Contenido 5

6 Contenido

1 Descripción general del sistema

Los sistemas ACQUITY UPLC H-Class y H-Class Bio para análisis de aminoácidos (AAA) de Waters combinan la tecnología de separación por UPLC con la química de derivatización AccQ•Tag™ Ultra. La combinación permite caracterizar proteínas, supervisar cultivos celulares, y realizar análisis nutricionales de alimentos y piensos en un tiempo considerablemente menor del necesario para las separaciones por HPLC convencional. Mediante el uso de las plantillas de proyecto y los cálculos personalizados suministrados en el CD del sistema, los sistemas AAA basados en la arquitectura de los sistemas ACQUITY UPLC H-Class y H-Class Bio permiten obtener fácilmente resultados exactos y proporcionan una resolución cromatográfica excepcional.

Para utilizar utilicen los sistemas, deben consultarse, además de esta guía, las siguientes fuentes de información:

• Documentación de los sistemas ACQUITY UPLC H-Class y H-Class Bio

• Documentación del usuario del software de tratamiento de datos Empower™

Contenido:

Tema Página

Módulos de los sistemas ACQUITY UPLC H-Class y H-Class Bio 1-2

Características de los sistemas ACQUITY UPLC H-Class y H-Class Bio AAA 1-3

Usar el método AccQ•Tag Ultra 1-4

1-1

Módulos de los sistemas ACQUITY UPLC H-Class y H-Class Bio

Los sistemas ACQUITY UPLC H-Class y H-Class Bio AAA pueden incluir los siguientes instrumentos y dispositivos:

• Uno de los siguientes sistemas de gestión de eluyentes:

– Sistema de gestión de eluyentes cuaternario (QSM)

– Sistema biológico de gestión de eluyentes cuaternario (bioQSM)

• Uno de los siguientes sistemas de gestión de muestras:

– Sistema de gestión de muestras de flujo a través de aguja (SM-FTN)

– Sistema biológico de gestión de muestras de flujo a través de aguja (bioSM-FTN)

• Módulo de horno para columnas A (CH-A)

• Uno de los detectores siguientes:

– Detector de ultravioleta/visible (TUV) variable con cubeta de flujo

– Detector de red de fotodiodos (PDA) con cubeta de flujo

– Detector de fluorescencia (FLR) con cubeta de flujo

• Kit de AAA:

– Paquete de química AccQ•Tag™ Ultra, con columna evaluada por QC y la química adecuada (eluyentes, reactivos de derivatización y patrones)

– Plantillas de proyecto de Empower

– Kit de filtro en línea de la columna

– Kit de tubos de PEEK® de 0,0025 pulg. de diámetro interno - entrada

– Manuales asociados

– Viales de recuperación total (Total Recovery) de Waters con tapones con septum no perforado

1-2 Descripción general del sistema

Características de los sistemas ACQUITY UPLC H-Class y H-Class Bio AAA

El kit de AAA incluye el paquete de química AccQ•Tag Ultra, que puede utilizarse para realizar hasta 250 análisis. El paquete de química incluye los siguientes materiales:

• Kit de reactivos AccQ• Tag Ultra (número de referencia 186003836)

– Tampón borato AccQ•Tag Ultra de Waters (1), 5 botellas

– Reactivo en polvo AccQ•Tag Ultra de Waters (2A), 5 botellas

– Diluyente de reactivo AccQ•Tag Ultra de Waters (2B), 5 botellas

• Columna para análisis de aminoácidos AccQ•Tag Ultra (número de referencia 186003837)

La columna separa los derivados de aminoácidos producidos por la reacción de derivatización del AccQ•Tag Ultra. La columna AccQ•Tag Ultra es una columna ACQUITY UPLC BEH C18 de 1,7 µm de alta eficiencia, certificada específicamente para su uso con el sistema de AAA. El uso y el cuidado adecuados de la columna se describen en el documento Manual de utilización y mantenimiento de la columna ACQUITY UPLC BEH, disponible en www. waters. com.

• Eluyente A concentrado AccQ•Tag Ultra (número de referencia 186003838)

Una solución tampón orgánica y acuosa premezclada concentrada.

• Eluyente B concentrado AccQ•Tag Ultra Eluent B (número de referencia 186003839)

• Patrón de aminoácidos hidrolizados, 10 ampollas de 1 mL (número de referencia WAT088122)

Cada ampolla contiene una mezcla de 17 aminoácidos hidrolizados, a una concentración de 2,5 mM cada uno (excepto la cistina, cuya concentración es de 1,25 mM).

• 6 tubos para muestra de 50 mm (para preparar muestras y patrones)

• Viales de recuperación total (Total Recovery) de Waters con tapones con septum no perforado (número de referencia 186000384C)

• CD del sistema de AAA de Waters (incluye la Guía del sistema de AAA ACQUITY UPLC H-Class y H-Class Bio, y las plantillas de proyecto de Empower)

Características de los sistemas ACQUITY UPLC H-Class y H-Class Bio AAA 1-3

Requisito: el sistema utiliza el software Empower para adquirir, procesar, generar informes y gestionar la información cromatográfica. Se admite el software Empower 2 (base) y Empower 3 (base) con los sistemas operativos Windows XP SP3 de 32 bits y Windows 7 Professional de 64 bits. El software y el firmware de control del instrumento compatible con los sistemas ACQUITY UPLC H-Class y H-Class Bio deben utilizarse con el paquete de controladores de junio de 2011 (número de referencia 667004296).

• Kit de tubos de PEEK (0,0025 pulg. de diámetro interno) - entrada (número de referencia 430001783)

• Filtro de entrada de la columna (número de referencia 205000343)

Consultar en el Manual de utilización y mantenimiento del AccQ•Tag Ultra las condiciones de almacenamiento y las especificaciones de vida útil de los suministros cromatográficos y de derivatización.

Usar el método AccQ•Tag Ultra

El método AccQ•Tag Ultra es una técnica de derivatización anterior a la columna para aminoácidos. El sistema, en combinación con el método AccQ•Tag Ultra, permite derivatizar aminoácidos, separar los derivados por UPLC de fase inversa, y cuantificar los derivados a partir de su absorbancia de UV o la intensidad de la fluorescencia.

El sistema ofrece una sensibilidad subpicomolar, con un alto grado de exactitud y facilidad de uso.

Descripción general de la química de derivatización

El método AccQ•Tag Ultra se basa en un reactivo de derivatización desarrollado específicamente para el análisis de aminoácidos. El reactivo AccQ•Tag Ultra de Waters (6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidilcarbamato o AQC) es un carbamato heterocíclico activado por N-hydroxisuccinimida, una clase de compuestos para derivatización de aminas.

Precaución: para mantener el nivel de pureza adecuado, manipular con cuidado todos los reactivos.


Reactivo AccQ•Tag Ultra de Waters:

Química del reactivo

El reactivo AccQ•Tag Ultra convierte los aminoácidos primarios y secundarios en derivados estables, como puede observarse en la siguiente figura. La estructura del grupo derivatizado es la misma para todos los aminoácidos, y les da un carácter tanto fluorescente como de absorbancia de UV.

El exceso de reactivo se hidroliza para producir 6-aminoquinolina (AMQ), un producto secundario que no interfiere con la reacción.

Nota: el pico de derivatización se etiqueta en el cromatograma y aparece siempre. Su tamaño y su cantidad varían de un lote a otro, y cambian con el tiempo. Debido a estas variaciones, el tamaño del pico no es significativo desde el punto de vista cuantitativo o diagnóstico.


Reacción AccQ•Tag Ultra:

Reacción con aminoácidos

El reactivo AccQ•Tag Ultra reacciona rápidamente con los aminoácidos primarios y secundarios, produciendo ureas sumamente estables. Los derivados resultantes son estables a temperatura ambiente durante una semana siempre que se impida la evaporación del eluyente de la muestra.

Hidrólisis del reactivo

En una reacción más lenta, el exceso de reactivo se hidroliza para producir 6-aminoquinolina (AMQ), N-hidroxisuccinimida (NHS) y dióxido de carbono (consultar la figura siguiente). El exceso de reactivo se destruye en un minuto.

El producto principal de la hidrólisis, el AMQ, produce un pico significativo que se resuelve fácilmente por cromatografía. La NHS y el dióxido de carbono no interfieren con el análisis.

Reactivo AQC

1º Aminoácido;

2º Aminoácido;

6-aminoquinolona (AMQ) bis-aminoquinolinurea (pico de derivatización)

Aminoácidos derivatizados

N-hidroxi-succinimida


Reacción AccQ•Tag Ultra en presencia de agua:



2 Configuración del sistema

En este capítulo se describe cómo realizar las conexiones de los tubos, y las conexiones Ethernet y de señales del sistema.

La información presentada en este capítulo parte del supuesto de que todos los componentes necesarios del sistema están instalados, configurados y apilados correctamente.

Contenido:

Tema Página

Instalar los tubos del detector 2-2

Conexiones de los tubos 2-2

Conexiones Ethernet 2-18

Conexiones de señales 2-19

Conexión a la fuente de alimentación 2-24

2-1

Instalar los tubos del detector

El sistema requiere el uso de tubos de bajo flujo para un análisis de aminoácidos preciso. Instalar la pieza con número de referencia 430001783, siguiendo el procedimiento descrito en la página 2-7.

Indicación: el mismo tubo se utiliza también para conectar los detectores PDA y FLR. El FLR se envía con este kit de tubos de serie. Seguir las instrucciones de conexión de los tubos descritas en la guía de iniciación correspondiente a cada detector para instalar los tubos de bajo flujo.

Conexiones de los tubos

Una vez apilados todos los componentes, realizar las conexiones de los tubos. Los tubos ya disponen de conectores de compresión y de férulas, pero es necesario asentarlos correctamente.

Recomendaciones para la instalación de los conectores

El sistema utiliza tornillos de compresión dorados y férulas de dos piezas. En el diagrama inferior se muestra la orientación del dispositivo.

Montaje de las férulas del tornillo de compresión:

Recomendaciones:

• Para evitar el ensanchamiento de la banda es necesario asegurarse de que el tubo está colocado al fondo del orificio del conector antes de apretar el tornillo de compresión.

Precaución: para evitar la contaminación, se recomienda utilizar guantes que no sean de látex, sin talco y sin partículas, para conectar los tubos del sistema.

TubosTornillo de compresiónFérula con anillo de bloqueo

2-2 Configuración del sistema

• Para facilitar el acceso, es conveniente utilizar tornillos de compresión largos para acoplar los tubos al inyector y a la válvula de purga.

• Realizar la prueba de fugas del sistema de gestión de eluyentes cada vez que se cambien o se aflojen los conectores durante las tareas de mantenimiento (consultar la ayuda en línea del sistema ACQUITY UPLC).

• Siempre que se aflojen los conectores durante el mantenimiento, examinarlos para comprobar que no tienen cuarteaduras, roscas barridas ni deformaciones.

• No reutilizar los conectores de acero inoxidable más de seis veces.

Material necesario

Guantes: sin talco, limpios y resistentes a compuestos químicos.

Al apretar los conectores del sistema, consultar la tabla siguiente.

Recomendaciones para la instalación de los conectores de los sistemas ACQUITY UPLC H-Class y H-Class Bio:

Conector Ajuste recomendado

Pri

mer

uso

o r

ein

stal

ado

Conector largo de 1/4-28 con férula sin ensanchamiento y anillo de bloqueo de acero inoxidable, instalado en un tubo de 3,175 mm (1/8 pulg. ) de diámetro externo

Ajustado con los dedos

TP03377

Anillo de bloqueo Férula

Extremo del anillo de bloqueo con diámetro interno más pequeño


Pri

mer

uso

o r

ein

stal

ado

Conector corto de 1/4-28 con férula sin ensanchamiento y anillo de bloqueo de acero inoxidable, instalado en un tubo de 0,062 pulg. de diámetro externo

Ajustado con los dedosP

rim

er u

so o

rei

nst

alad

o Conector de 5/16-24 con filtro y anillo de bloqueo de acero inoxidable

Ajustado con los dedos

Pri

mer

uso

Conector de acero inoxidable (chapado en oro) con caras planas largas y una férula de acero inoxidable de 2 piezas.

Ajustado manualmente, más 3/4 de vuelta con la llave

Recomendaciones para la instalación de los conectores de los sistemas ACQUITY UPLC H-Class y H-Class Bio: (continuación)


TP03379

Anillo de bloqueo Férula


TP03376

FiltroAnillo de bloqueo


TP03378

Caras planas largas Férula de 2 piezas

3/4 de vuelta


Rei

nst

alad

oConector de acero inoxidable (chapado en oro) con caras planas largas y una férula de acero inoxidable de 2 piezas.

Ajustado manualmente, y hasta 1/6 de vuelta más con la llave

Pri

mer

uso

Conector de acero inoxidable (chapado en oro) con caras planas cortas y una férula de acero inoxidable de 2 piezas.

Ajustado manualmente, más 3/4 de vuelta con la llave

Rei

nst

alad

o

Conector de acero inoxidable (chapado en oro) con caras planas cortas y una férula de acero inoxidable de 2 piezas.

Ajustado manualmente, y hasta 1/6 de vuelta más con la llave

Pri

mer

uso

ore

inst

alad

o PEEK LT135 10-32 con férula Ajustado con los dedos



TP02713

Caras planas largas Férula de 2 piezas

1/6 de vuelta

TP03375

Caras planas cortas Férula de 2 piezas

3/4 de vuelta

TP03374

Caras planas cortas Férula de 2 piezas

1/6 de vuelta


Pri

mer

uso

ore

inst

alad

o PEEK 10-32 de una pieza Ajustado con los dedosP

rim

er u

so

Ajustado con los dedos reutilizable Apretar con los dedos más 1/6 de vuelta

Rei

nst

alad

o

Ajustado con los dedos reutilizable Apretar con los dedos, más 1/6 de vuelta; si pierde, se aprieta 1/8 de vuelta más



TP02728

1/6 de vuelta

Herramienta de extracción de casquillo de ajuste

1/6 de vuelta

1/8 de vuelta más


Conexión de los tubos del detector TUV

Requisito: el sistema requiere el uso de tubos de bajo flujo (número de referencia 430001783) para un análisis de aminoácidos preciso.

Indicación: el mismo tubo se utiliza también para conectar los detectores PDA y FLR. El FLR se envía con este kit de tubos de serie. Seguir las instrucciones de conexión de los tubos descritas en la guía de iniciación correspondiente a cada detector para instalar los tubos de bajo flujo.

La conexión de los tubos del detector requiere el acoplamiento de la cubeta de flujo y la instalación del regulador de contrapresión.

Aunque el desgasificador en línea elimina la mayoría del gas (aire) de los eluyentes, se introduce algo de gas en el sistema durante las inyecciones del bucle parcial. Mientras está bajo presión, este gas permanece en la solución. Sin embargo, debido a que la presión postcolumna es por lo general muy inferior a la presión precolumna, el gas puede salir de la solución y producir

Pri

mer

uso

o r

ein

stal

ado

Conector de ajuste manual de doble rosca con tuerca tapón de acero inoxidable

1. Aflojar la tuerca tapón de acero inoxidable del conector dorado.

2. Apretar manualmente el conector dorado, con la férula, en la entrada de la columna.

3. Acoplar la columna y apretarla en el conector dorado.

4. Apretar la tuerca tapón de acero inoxidable sobre el conector dorado.

Precaución: para evitar la contaminación, se recomienda utilizar guantes que no sean de látex, sin talco y sin partículas, para conectar los tubos del detector.



TP03360ATapón de acero inoxidable

Conector dorado

Férula


una línea base inestable que se caracteriza por grandes picos inesperados. El regulador de contrapresión mantiene una presión poscolumna mínima de 1724 kPa (17 bar, 250 psi), con lo que se evita la eliminación de gas disuelto poscolumna y se garantiza una línea base plana.

Indicación: cuando el regulador de contrapresión está instalado, el sistema mantiene una contrapresión mínima de 1724 kPa (17 bar, 250 psi), independientemente de la configuración de los tubos de salida y el caudal, siempre y cuando exista un caudal positivo.

Para conectar los tubos del detector de absorbancia programable (UV variable):

1. Abrir la puerta del panel frontal del detector de absorbancia programable (UV variable) e instalar la cubeta de flujo de manera que los tres tornillos cautivos estén en línea con los orificios del plafón.

Requisito: asegurarse de que la cubierta contra el polvo se ha retirado del plafón antes de instalar la cubeta de flujo.

2. Apretar con la mano los tornillos cautivos.

Cubeta de flujo del detector TUV:

3. Retirar la cubierta protectora de los tubos de entrada de la cubeta de PEEK y conectarlos a la entrada de la cubeta de flujo.

TP03261

Lámparas

Sensor de fugas

Tubo de salida

Tubo de entrada

Regulador de contrapresión

Conector ID de la cubeta de flujo

Bloque de la cubeta de flujo

Asa

Tornillos de ajuste manual


4. Acoplar el trozo pequeño del tubo de salida del regulador de contrapresión a la salida de la cubeta de flujo.

Regla: no instalar el regulador de contrapresión si se va a conectar un segundo detector o un espectrómetro de masas.

Regulador de contrapresión:

5. Dirigir el extremo largo del tubo de salida del regulador de contrapresión a través de los clips del canal por el lado delantero derecho del sistema hasta un recipiente para desechos adecuado.

Conexión de los tubos del detector PDA

Si el sistema incluye un detector PDA, consultar las instrucciones para la conexión de los tubos en la Guía de iniciación del detector de fotodiodos en serie para ACQUITY UPLC.

Conexión de los tubos del detector FLR

Si el sistema incluye un detector FLR, consultar las instrucciones para la conexión de los tubos en la Guía de iniciación del detector de fluorescencia para ACQUITY UPLC.

Advertencia: para evitar derrames, vaciar el recipiente de desechos a intervalos regulares.

De la salida del detector

A desecho


Conectar los tubos del sistema de gestión de eluyentes y del sistema de gestión de muestras

Para conectar los tubos del sistema de gestión de eluyentes y del sistema de gestión de muestras:

1. Localizar el tubo de eluyente etiquetado como “Sample Manager Wash” (Lavado del sistema de gestión de muestras) o “Sample Manager 2” (Sistema de gestión de muestras 2), y quitarle el filtro de eluyente.

2. Dirigir el tubo de eluyente de lavado del sistema de gestión de muestras a través del canal de gestión de tubos del sistema de gestión de muestras; después, volver a acoplar el filtro de eluyentes e introducir el tubo en la botella etiquetada como "90% agua/10% acetonitrilo".

Alternativa: si el sistema incluye un detector FLR, introducir el tubo en la botella etiquetada como "100% acetonitrilo".

3. Dirigir los tubos de eluyente A,B,C y D a través del canal exterior e introducirlos en las botellas adecuadas:

• Tubos de eluyente A y C en la botella con 100% agua.

• Tubo de lavado de las juntas en la botella con 100% agua.

• Tubos de eluyente B y D en la botella con 100% acetonitrilo.

4. Conectar los tubos etiquetados como “Sample Manager Purge” (Eluyente de purga del sistema de gestión de muestras) o “Sample Manager 1” (Sistema de gestión de muestras 1) a cualquiera de los dos puertos SM SYRINGE del sistema de gestión de muestras.

5. Pasar el otro extremo del tubo de eluyente de purga del sistema de gestión de muestras a través de la guía del canal e introducirlo en la botella con 90% agua/10% acetonitrilo.

Precaución: para evitar la contaminación, se recomienda utilizar guantes que no sean de látex, sin talco y sin partículas, para conectar los tubos del sistema de gestión de eluyentes y del sistema de gestión de muestras.


6. Conectar el tubo de eluyente de purga al puerto SM SYRINGE disponible del sistema de gestión de eluyentes.

7. Pasar el tubo de desechos de la jeringa por detrás del clip de acero inoxidable del sistema de gestión de eluyentes.

8. Utilizar un cortatubos para cortar el tubo de desechos de la jeringa de forma que pueda conectarse al puerto de desechos de la bandeja de recogida del sistema de gestión de eluyentes.

9. Conectar el tubo de desechos corrugado al puerto de desechos del sistema de gestión de muestras y después pasarlo por el orificio de la bandeja de recogida del sistema de gestión de muestras.

10. Pasar el tubo de desechos del sistema de gestión de muestras por detrás del clip de acero inoxidable del sistema de gestión de eluyentes y después conectarlo al puerto de desechos de la bandeja de recogida del sistema de gestión de eluyentes.

11. Humedecer con metanol el conector dentado del tubo de drenaje situado en la parte inferior del sistema de gestión de eluyentes.

12. Sujetar la parte trasera de la cazoleta de drenaje y, a continuación, deslizar un conducto de desechos sobre la conexión del tubo de drenaje y dirigirlo hasta un contenedor de desechos adecuado.

TP03472


Acoplar el conector del tubo de drenaje al sistema de gestión de eluyentes:

Precaución: para evitar la acumulación de líquido, asegurarse de que los desechos se eliminan adecuadamente:• Colocar el recipiente para el desecho debajo del sistema. • Asegurarse de que los tubos de drenaje no presentan ondulaciones ni

dobleces. una ondulación o un doblez pueden impedir que el líquido fluya correctamente hasta el recipiente de desecho.

• Asegurarse de que la salida del tubo de drenaje no está cubierta de eluyentes de desecho. Si es necesario, acortar el tubo de desecho de manera que ninguna porción de él quede por debajo de la parte superior del contenedor de desecho (consultar la figura siguiente).


TP02479

Conector de drenaje


Colocación del tubo de drenaje:

13. Dirigir el conducto de purga del desgasificador hasta un recipiente para desechos adecuado.

14. Dirigir un conducto de desechos desde la conexión rápida situada en la parte posterior de la bandeja de eluyentes hasta un recipiente adecuado para el desecho.

Advertencia: para evitar la emisión de vapores de eluyentes a la sala, dirigir el tubo de evacuación del desgasificador en línea como se indica a continuación:• Hasta una campana extractora u otro sistema de evacuación

adecuado. • Hasta un recipiente de desechos adecuado, asegurándose de que el

extremo de salida del tubo se encuentre en todo momento por encima del nivel del líquido.


TP02709Correcta Incorrecta


Instalar la columna para la detección óptica

Para instalar la columna (detección óptica):

Material necesario

• Clips de soporte de la columna

• Guantes: sin talco, limpios y resistentes a compuestos químicos.

• Conexión de salida de alta temperatura

• Llave de la conexión de salida de alta temperatura

• Conexión reutilizable

Herramienta necesaria

Llave fija de 5/16 pulg.

Para conectar la unidad de filtro en línea de la columna a la entrada de la columna:

1. Retirar la junta tórica del extremo de salida de la unidad del filtro en línea de la columna.

Advertencia: para evitar lesiones por quemaduras, ajustar la temperatura de la columna en Off (Apagado) y, a continuación, dejar que el compartimento de columnas y sus componentes se enfríen durante 60 minutos antes de cualquier manipulación. Controlar la temperatura interna del compartimento de columnas para comprobar que todos los componentes están fríos.

Precaución: para evitar contaminar los componentes del sistema, se deben utilizar guantes limpios, sin talco y resistentes a los compuestos químicos al instalar la columna.

Precaución: para evitar daños en el conjunto del horno de precalentamiento activo,• girar la columna, no el conector, al instalar o extraer la columna para

evitar que el tubo del horno de precalentamiento activo gire con el conector,

• no sujetar y girar el conjunto,• no suspender ni colgar el tubo del horno de precalentamiento activo.


2. Extraer la conexión de la entrada de la columna.

3. Empujar el extremo de salida de la unidad del filtro en línea de la columna en la entrada de la columna hasta el tope.

4. Sujetar la conexión reutilizable de ajuste manual en su sitio, girar la columna sobre la conexión hasta que esté bien apretada y, a continuación, apretar hasta 1/6 de vuelta más.

Para instalar el tubo de PEEK en la salida de la columna:

1. Insertar hasta el tope el tubo PEEK en la conexión de salida de alta temperatura.

2. Sujetar el tubo PEEK y enroscar el conector de salida de alta temperatura en la salida de la columna hasta que quede apretado.

3. Sujetar la columna con la ayuda de la llave de 5/16 y utilizar la llave de conexión de salida de alta temperatura para darle 1/4 de vuelta a la conexión de salida.

4. Dirigir con cuidado el tubo PEEK a través del compartimento de columnas.

Precaución: para evitar dañar el tubo, utilizar solo los dedos para apretar las conexiones.

Precaución: para evitar el ensanchamiento de la banda, comprobar que el tubo está bien insertado en el orificio de conexión antes de apretarlo.

Precaución: para evitar daños en la conexión de salida, no se debe apretar demasiado con la llave de la conexión de salida.


Para conectar el tubo de PEEK al detector:

1. Retirar la cubierta protectora de los tubos de PEEK que salen de la entrada de la cubeta de flujo del detector.

2. Comprobar que la etiqueta del tubo de entrada de la cubeta de flujo coincide con el tipo de detector y la cubeta de flujo del sistema.

3. Acoplar el tubo de entrada de 0,0025 pulg. de diámetro interno (incluido con el kit de la cubeta de flujo) a la salida de la columna.

4. Encajar los clips de soporte de la columna en el cuerpo de la columna (uno entre el conector reutilizable y la columna) y girar los clips de forma que las aberturas queden dirigidas hacia delante.

5. Colocar la columna en el compartimento de columnas.

TP02952Tubo de entrada del detector (PEEK) proveniente de la columna

Salida

Entrada

Clip de soporte de la columna

eCord


6. Acoplar la lengüeta del eCord al receptáculo:

Conexión al suministro de eluyente

La bandeja de eluyentes situada en la parte superior del sistema puede recoger hasta 2 L de eluyente derramado. Se necesita un recipiente de desechos adecuado para recoger el eluyente derramado del conducto de desechos de la parte posterior de la bandeja.

Para conectar el suministro de eluyente:

1. Es aconsejable utilizar recipientes que encajen bien con las tapas suministradas con el kit de puesta en marcha. Waters recomienda utilizar botellas de 1L.

2. Insertar los tubos de eluyente en los recipientes de eluyentes de la bandeja situada encima del sistema de gestión de muestras o del detector opcional.

Advertencia: para evitar derrames, no colocar las botellas de eluyente sobre el organizador de muestras.

Precaución: para mantener la presión adecuada de eluyente en el cabezal de la bomba y asegurar su suministro correcto, se recomienda colocar los recipientes en la bandeja de eluyentes de la parte superior del sistema.

Receptáculo del compartimento del horno

Lengüeta eCord


Tubos de eluyente en los recipientes:

Conexiones Ethernet

Conexiones Ethernet

El sistema de gestión de muestras incorpora un interruptor Ethernet interno para conectar un PC (estación de trabajo) y un máximo de seis módulos ACQUITY UPLC H-Class. Conectar los cables Ethernet blindados de cada módulo en las conexiones electrónicas del panel posterior del sistema de gestión de muestras. El sistema de gestión de muestras está conectado internamente al interruptor Ethernet.

Conexiones del horno de columnas

El sistema de gestión de muestras alimenta al horno de columnas y se comunica con él. El cable de comunicaciones externo se debe conectar al panel posterior del horno de columnas y al sistema de gestión de muestras.

Recipientes de eluyentes

Tubo de eluyente

Bandeja de eluyentes


Para realizar las conexiones del horno de columnas:

1. Comprobar que el sistema de gestión de muestras y el horno de columnas están apagados.

2. Conectar el cable de comunicaciones externo al puerto de alta densidad (HD) del panel posterior del horno de columnas.

3. Conectar el otro extremo del cable de comunicaciones externo al puerto QSPI del panel posterior del sistema de gestión de muestras.

Conexiones de señales

Realizar las conexiones de señales

Consultar la ubicación de las conexiones de señales mostradas en la etiqueta serigrafiada del panel posterior de cada instrumento.

Material necesario

• Llave de tuercas de 9/32 pulg.

• Destornillador plano

• Conector

• Cable de señal

Precaución: para evitar daños en las piezas eléctricas, no se debe desconectar nunca un componente eléctrico mientras el módulo está conectado a la alimentación. Para interrumpir el suministro eléctrico a un módulo, situar el interruptor de encendido en la posición Off (Apagado) y después desenchufar el cable de alimentación de la toma de CA. Una vez desconectado de la alimentación, se debe esperar unos 10 segundos antes de desconectar cualquier componente.


Para realizar las conexiones de la señal:

1. Insertar el conector en el puerto de la parte posterior del instrumento.

2. Usar el desatornillador plano para conectar los extremos positivo y negativo del cable de señales al conector.

3. Acoplar el terminal de horquilla del cable de tierra al perno de tierra del panel posterior y asegurarlo con la tuerca de bloqueo.

Indicación: utilizar la llave de tuercas de 9/32 pulg. para apretar la tuerca de bloqueo hasta que el terminal de horquilla no se mueva.

Conector

Puerto del conector

Cable de señal

Conector

Tornillo


Conectores de señales I/O (E/S) del sistema de gestión de eluyentes cuaternario

El panel posterior del sistema de gestión de eluyentes cuaternario contiene un conector extraíble con bornes de tornillo para los cables de las señales de entrada y salida (E/S). Este conector está adaptado para que se pueda insertar sólo de una manera.

Conectores de señales I/O (E/S) del sistema de gestión de eluyentes cuaternario:

Consultar las especificaciones eléctricas en la Información de mantenimiento y descripción general del funcionamiento del sistema de gestión de eluyentes cuaternario para ACQUITY UPLC.

Terminal de horquilla

Tuerca de bloqueo

Terminal de tierra

Inic

io d

e g

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ente

+In

icio

de

gra

dien

te -

Tom

a de

tier

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ma

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ene

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jo +

Det

ene

r flu

jo -

1 2 3 4 5 6


Conectores de señales de I/O (entrada y salida) del sistema de gestión de muestras

El panel posterior del sistema de gestión de muestras contiene un conector extraíble con bornes de tornillo para los cables de las señales de entrada y salida (E/S). Este conector presenta unas ranuras determinadas para que sólo se puedan insertar los cables de señales de una manera concreta.

Conectores de señales de I/O (entrada y salida) del sistema de gestión de muestras:

Conexiones de entrada de eventos del sistema de gestión de eluyentes cuaternario:

Conexión de señal Descripción

Gradient Start (Inicio de gradiente)

Pone en marcha la bomba para comenzar la operación de gradiente debido a una entrada de cierre de contacto o bien a una de 0 voltios.

Stop Flow (Detener flujo)

Detiene el flujo proveniente del sistema de gestión de eluyentes cuaternario cuando recibe una entrada de cierre de contacto o una entrada de 0 voltios (por ejemplo, por una situación de error o un fallo del hardware de otro instrumento).

Sal

ida

de in

icio

de

inye

cció

n +

Sal

ida

de in

icio

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inye

cció

n -

Tom

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e la

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n -

1 2 3 4 5 6


Consultar las especificaciones eléctricas en la Información de mantenimiento y descripción general del funcionamiento del sistema de gestión de muestras de flujo a través de aguja ACQUITY UPLC.

Conectores de la señal del detector TUV

Si el sistema incluye un detector TUV, se recomienda consultar la ACQUITY UPLC Tunable Ultraviolet Detector Getting Started Guide (Guía de inicio rápido del detector UV variable ACQUITY UPLC) para obtener información acerca de los conectores de la señal.

Conectores de la señal del detector PDA

Si el sistema incluye un detector PDA, se recomienda consultar la ACQUITY UPLC Photodiode Array Detector Getting Started Guide (Guía de inicio rápido del detector de fotodiodos en serie ACQUITY UPLC) para obtener información acerca de los conectores de la señal.

Conectores de la señal del detector FLR

Si el sistema incluye un detector FLR, se recomienda consultar la Guía de inicio rápido del detector de fluorescencia ACQUITY UPLC para obtener información sobre los conectores de la señal.

Conexiones de salida de eventos/entrada de eventos del sistema de gestión de muestras:

Conexiones de señales Descripción

Inject Start (Inicio de inyección)

Indica (mediante una salida de cierre de contacto) que se ha iniciado una inyección.

Retener inyección Retrasa la siguiente inyección cuando el sistema de gestión de muestras recibe una entrada de cierre de contacto (proveniente de otro instrumento del sistema, por ejemplo).


Conexión a la fuente de alimentación

Cada módulo que compone el sistema requiere una fuente de alimentación independiente con conexión a tierra. La conexión a tierra de todas las tomas de corriente debe ser común y encontrarse cerca del sistema.

Para conectar a la fuente de alimentación:

Recomendación: usar un acondicionador de línea y un sistema de alimentación ininterrumpida (UPS) para lograr la máxima estabilidad posible del voltaje de entrada a largo plazo.

1. Conectar el extremo hembra del cable de alimentación al conector del panel posterior de cada módulo.

2. Conectar el extremo macho del cable a una toma de corriente adecuada.

Alternativa: si el sistema incluye el FlexCart opcional, conectar el extremo hembra de los cables eléctricos del FlexCart (que se incluyen en el kit de puesta en marcha) al conector del panel posterior de cada instrumento. Conectar el extremo macho encapuchado de los cables eléctricos del FlexCart a las regletas de la parte trasera del carro. Finalmente, conectar el cable de cada regleta a una toma eléctrica de pared que funcione con un circuito propio.

Advertencia: para evitar una descarga eléctrica:• Utilizar cable de alimentación del tipo SVT en los Estados Unidos y

del tipo HAR o superior en Europa. Para obtener información sobre los requisitos en otros países, contactar con el distribuidor local de Waters.

• Hay que apagar y desconectar cada sistema antes de realizar tareas de mantenimiento en el instrumento.

• Conectar cada instrumento del sistema a una toma de tierra común.


3 Verificar el funcionamiento del sistema

Es necesario limpiar y preparar el sistema para realizar un método de prueba de verificación del funcionamiento. También incluye ejemplos de la cuantificación e interpretación de los datos del análisis de aminoácidos.

La muestra que se utiliza para verificar el funcionamiento del sistema se incluye en el kit de AAA. También se proporciona como parte de la calificación del funcionamiento (PQ) opcional del sistema para AAA ACQUITY UPLC H-Class y H-Class Bio. Antes de comenzar el procedimiento de verificación, el sistema debe instalarse y configurarse como se describe en la Guía de funcionamiento del sistema ACQUITY UPLC H-Class.

Contenido:

Tema Página

Preparar el sistema 3-2

Preparar eluyentes 3-5

Crear los métodos de prueba 3-7

Crear los métodos de secuencia de muestras 3-29

Preparar la muestra de verificación del sistema 3-30

Realizar la prueba 3-30

3-1

Preparar el sistema

Los sistemas ACQUITY UPLC H-Class y H-Class Bio deben limpiarse antes de instalar el sistema de AAA. Preparar las mezclas de eluyentes necesarias según el procedimiento que se describe a continuación y después utilizar las mezclas para limpiar el sistema. El procedimiento de limpieza tarda varias horas.

Requisito: utilizar el método de hidrolizado para el detector seleccionado para verificar el funcionamiento del sistema.

Ejemplo: restaurar el proyecto “Hydrolysate_TUV_HClass1011” del CD del sistema en la estación de trabajo Empower.

Consultar también: para obtener información detallada sobre la restauración de proyectos, consultar la página 5-11.

Para preparar los eluyentes de limpieza:

1. Preparar una mezcla de metanol/agua 50:50:

a. Medir 500 mL de agua de calidad HPLC en una probeta graduada.

b. En una probeta graduada diferente, medir 500 mL de metanol.

c. Añadir el metanol al agua y mezclar durante 5 minutos.

2. Transferir la mezcla de metanol/agua 50:50 a un recipiente etiquetado de 1 L.

3. Preparar una mezcla de ácido fosfórico/agua 30:70:

a. Medir 700 mL de agua en una probeta graduada.

b. En una probeta graduada diferente, medir 300 mL de ácido fosfórico.

c. Añadir el ácido fosfórico al agua y mezclar durante 5 minutos.

4. Transferir la mezcla de ácido fosfórico/agua 30:70 a un recipiente para fase móvil de 1 L.

5. Llenar una botella de fase móvil de 1 L con un 100% de agua.

6. Llenar una botella de fase móvil de 1 L con un 100% de isopropanol.

Precaución: para evitar dañar los filtros de acero inoxidable o de titanio de los depósitos de eluyente, no permitir que pase ácido (que reacciona con los filtros) a través del tubo de lavado de las juntas.

3-2 Verificar el funcionamiento del sistema

Para preparar los viales de muestra para limpiar el sistema:

1. Añadir 1 mL de metanol/agua 50:50 a un vial de muestra.

2. Añadir 1 mL de la mezcla de ácido fosfórico/agua 30:70 a un segundo vial.

3. Añadir 1 mL de agua al 100% a un tercer vial.

4. Añadir 1 mL de isopropanol al 100% a un cuarto vial.

Para limpiar el sistema:

1. Colocar los extremos de todos los tubos (A,B,C,D, lavado, purga, lavado de las juntas) en la mezcla de metanol/agua.

2. Cebar cada tubo de eluyente durante 5 minutos.

3. Cebar la jeringa de lavado durante un minuto.

4. Cebar la purga durante 50 ciclos.

5. Conectar un limitador de flujo a la salida del conjunto del horno de precalentamiento activo en el horno para columnas con el fin de crear una contrapresión de aproximadamente 13 800 kPa (140 bar, 2 000 psi) en el sistema.

6. Conectar una línea de desechos desde la salida del limitador de flujo a un contenedor de desechos adecuado.

7. Transferir el contenido del vial de muestra que contiene 1 mL de metanol/agua 50:50 a un vial del inyector automático y colocarlo en la posición 1:A,1.

8. Crear un método de instrumento con los siguientes valores de parámetros:

• Caudal: 0,5 mL/min.

• Composición del gradiente:25% A, 25% B, 25% C, 25% D.

9. Fijar el tiempo de adquisición en 0,5 minutos y realizar 10 inyecciones del vial de muestra.



Indicación: este paso tarda aproximadamente 10 minutos.

10. Repetir del paso 1 al paso 9 usando un 100% de isopropanol como eluyente y la muestra.

Nota: el eluyente no debe pasar por el detector óptico en este paso del lavado. Dirigir el tubo de la salida del limitador de flujo a desechos.

11. Repetir del paso 1 al paso 9 usando un 100% de agua como eluyente.

12. Quitar los filtros de las botellas de eluyente.

13. Repetir del paso 1 al paso 9 utilizando la mezcla de ácido fosfórico/agua 30:70 como eluyente.

14. Repetir del paso 1 al paso 9 usando un 100% de agua como eluyente.

15. Dirigir el conducto de desechos al recipiente de desechos original.

16. Volver a conectar el tubo de eluyente al detector.

17. Volver a colocar los filtros de las botellas de eluyente en todos los tubos.

18. Colocar el tubo de lavado de las juntas en agua al 100%, junto con todos los demás tubos.

19. Repetir del paso 1 al paso 9 usando la mezcla de metanol/agua 50:50 como eluyente.

20. Retirar el limitador de flujo del conjunto del horno de precalentamiento activo en el horno para columnas.

Consultar también: los siguientes documentos para obtener más información sobre la preparación de la instalación y las pruebas iniciales:

• Guía para la preparación de la instalación (número de referencia 715003249)

• Lista de control de la instalación (número de referencia 15003250)



Preparar eluyentes

Es necesario preparar la fase móvil y la solución de lavado necesarias para los análisis de hidrolizados de proteínas, cultivos celulares, cisteína alquilada, alimentos y piensos en el sistema.

Recomendaciones:

No lavar el material de vidrio utilizado para preparar los eluyentes junto con el material de vidrio de uso general. No utilizar detergentes para lavar el material de vidrio. Aclarar el material de vidrio únicamente con los eluyentes de alta pureza que se utilizarán para la fase móvil.

Deben utilizarse únicamente eluyentes y aditivos de la máxima pureza (eluyentes de calidad HPLC o superior) debido a la elevadísima sensibilidad del método. De lo contrario, se producirá una alta contaminación de fondo, una baja relación señal-ruido y pérdida de sensibilidad.

Configurar la fase móvil

Los volúmenes de las soluciones pueden escalarse siempre que se mantengan las concentraciones finales.

En la tabla se describen las fases móviles para el análisis de hidrolizados de proteínas, cultivos celulares, cisteína alquilada, y alimentos y piensos.

Advertencia: para evitar los efectos perjudiciales del contacto personal con eluyentes, incluyendo su inhalación, hay que seguir las buenas prácticas de laboratorio cuando se manipulen. Consultar las hojas de datos sobre seguridad de materiales referentes a los eluyentes que se van a utilizar.

Tipos de fases móviles del sistema:

Tubo de eluyente Descripción

A Eluyente A concentrado al 100% AccQ•Tag Ultra

B Agua: eluyente B AccQ•Tag Ultra 90:10

C Agua de calidad HPLC 100%

D Eluyente B AccQ•Tag Ultra 100%

Preparar eluyentes 3-5

Preparar la fase móvil

Para preparar la fase móvil de eluyente A concentrado al 100% AccQ•Tag Ultra:

1. Transferir el eluyente A concentrado AccQ•Tag Ultra a una botella de fase móvil etiquetada según corresponda.

Alternativa: dejar el eluyente A AccQ•Tag Ultra en el envase en el que se suministra.

Indicación: tras abrir el envase de eluyente A concentrado AccQ•Tag Ultra, el eluyente es válido durante 3 días si se mantiene a temperatura ambiente. Si se conserva a 4 °C, en el envase original y herméticamente tapado, puede utilizarse durante 1 mes.

Para preparar la fase móvil de agua/eluyente B AccQ•Tag Ultra 90:10:

1. Medir 900 mL de agua en una probeta graduada de 1 L y transferir el agua a una botella para fase móvil etiquetada según corresponda.

2. En una probeta graduada diferente, medir 100 mL de eluyente B AccQ•Tag Ultra.

3. Añadir el eluyente B AccQ•Tag Ultra a la botella de fase móvil que contiene el agua y mezclar bien durante 5 minutos como mínimo.

Indicación: la solución de eluyente B AccQ•Tag Ultra y agua puede utilizarse durante 3 días si se conserva a temperatura ambiente.

Para preparar la fase móvil de agua:

Llenar una botella de fase móvil correctamente etiquetada con agua de calidad HPLC al 100%.

Indicación: si se conserva a temperatura ambiente, el agua de calidad HPLC al 100% puede utilizarse durante 3 días.

Para preparar el eluyente B AccQ•Tag Ultra concentrado al 100%:

Transferir el eluyente B AccQ•Tag Ultra a una botella de fase móvil etiquetada según corresponda.

Alternativa: utilizar el eluyente B AccQ•Tag Ultra como fase móvil en su envase original.


Indicación: tras abrir el envase de eluyente B concentrado AccQ•Tag Ultra, el eluyente es válido durante 3 días si se mantiene a temperatura ambiente. Si se conserva a 4 °C, en el envase original y herméticamente tapado, puede utilizarse durante 1 mes.

Para preparar la solución de agua/acetonitrilo 50:50 para el lavado de la aguja, lavado de las juntas y purga:

1. Medir 500 mL de agua en una probeta graduada y transferir el agua a una botella de vidrio de 1 L etiquetada según corresponda.

2. En una probeta graduada aparte, medir 500 mL de acetonitrilo.

3. Añadir el acetonitrilo a la botella de solución de lavado que contiene agua y mezclar bien durante 15 minutos como mínimo.

Crear los métodos de prueba

El CD del sistema incluye un conjunto de proyectos y métodos de prueba para los detectores TUV, PDA y FLR, y los cuatro tipos de muestras para cada detector.

• Hidrolizados de proteínas

• Cultivo celular

• Cisteína alquilada

• Alimentos y piensos

Los parámetros de detección de los detectores TUV, PDA y FLR son idénticos para todos los tipos de muestras. No obstante, las condiciones del instrumento son distintas para el sistema de gestión de eluyentes y para el sistema de gestión de muestras. Además, para alimentos y piensos, la composición de los eluyentes y la temperatura de la columna son distintas de las necesarias para el análisis de hidrolizados de proteínas, cultivos celulares y cisteína alquilada.

Recomendaciones:

• Restaurar los proyectos para el detector en uso (y para el tipo de muestra apropiado) en el PC.

Consultar también: la página 5-11 para obtener información sobre la restauración de proyectos.


• Los métodos de prueba están bloqueados para protegerlos de modificaciones accidentales. El método puede guardarse con un nombre nuevo para adaptarlo a los requisitos específicos del laboratorio.

• Utilizar el método de hidrolizado para el detector seleccionado para verificar el funcionamiento del sistema.

• el método de procesamiento actualiza automáticamente los tiempos de retención. Para evitar la deriva de los tiempos fuera del intervalo especificado, crear siempre un método nuevo a partir del método estándar suministrado con el sistema.

Empower lleva a cabo el análisis de las muestras ejecutando estos métodos:

Nombre del método Acción

Startup (Puesta en marcha)

Equilibra isocráticamente la columna a 0,2 mL/min, a la temperatura especificada en el método.

Run (Analizar) Analiza los patrones de aminoácidos aplicando los ajustes de los parámetros del instrumento.

ShortStop (Parada breve)

Apaga el detector y la lámpara, y reduce el caudal a de A:B:C:D 25:25:25:25 a 0,05 mL/min.

LongStop (Parada prolongada)

Se utiliza para el almacenamiento prolongado del sistema; apaga la lámpara del detector, el horno para columnas y la bomba.

General Método de procesamiento

IntStd (Patrón interno)

Método de procesamiento

Report (Informe) Método de informe

SmplSet (Secuencia de muestras)

Método de secuencia de muestras


Método de prueba del detector TUV

En las tablas siguientes se muestran los proyectos de Empower, los métodos de prueba y los valores de los parámetros para un sistema que incluya un detector TUV.

Abrir el proyecto y los métodos de prueba para la aplicación con el fin de verificar los valores de los parámetros para el detector TUV, el sistema de gestión de eluyentes y el sistema de gestión de muestras.

La siguiente tabla indica los métodos de prueba para el detector TUV.

Métodos de prueba para el detector TUV:

Nombre del proyecto Método de prueba

Hydrolysates_TUV_HClass1011 Métodos de instrumento:• StartUp_Hyd_TUV_HClass1011• Run_Hyd_TUV_HClass1011• ShortStop_Hyd_TUV_HClass1011• LongStop_Hyd_TUV_HClass1011

Métodos de procesamiento:• General_Hyd_TUV_HClass1011• IntStd_Hyd_TUV_HClass1011

Métodos de informe:• Report_Hyd_TUV_HClass1011

Conjunto de métodos:• StartUp_Hyd_TUV_HClass1011• Run_Hyd_TUV_HClass1011• ShortStop_Hyd_TUV_HClass1011• LongStop_Hyd_TUV_HClass1011

Secuencia de muestras:• SmplSet_Hyd_TUV_HClass1011


Alkylated_Cys_TUV_HClass1011 Métodos de instrumento:• StartUp_Cys_TUV_HClass1011• Run_Cys_TUV_HClass1011• ShortStop_Cys_TUV_HClass1011• LongStop_Cys_TUV_HClass1011

Métodos de procesamiento:• General_Cys_TUV_HClass1011• IntStd_Cys_TUV_HClass1011

Métodos de informe:• Report_Cys_TUV_HClass1011

Conjunto de métodos:• StartUp_Cys_TUV_HClass1011• Run_Cys_TUV_HClass1011• ShortStop_Cys_TUV_HClass1011• LongStop_Cys_TUV_HClass1011

Secuencia de muestras:• SmplSet_Cys_TUV_HClass1011

Métodos de prueba para el detector TUV: (continuación)



Cell_Culture_TUV_HClass1011 Métodos de instrumento:• StartUp_Cult_TUV_HClass1011• Run_Cult_TUV_HClass1011• ShortStop_Cult_TUV_HClass1011• LongStop_Cult_TUV_HClass1011

Métodos de procesamiento:• General_Cult_TUV_HClass1011• IntStd_Cult_TUV_HClass1011

Métodos de informe:• Report_Cult_TUV_HClass1011

Conjunto de métodos:• StartUp_Cult_TUV_HClass1011• Run_Cult_TUV_HClass1011• ShortStop_Cult_TUV_HClass1011• LongStop_Cult_TUV_HClass1011

Secuencia de muestras:• SmplSet_Cult_TUV_HClass1011




Foods_Feeds_TUV_HClass1011 Métodos de instrumento:• StartUp_Foods_TUV_HClass1011• Run_Foods_TUV_HClass1011• ShortStop_Foods_TUV_ HClass1011• LongStop_Foods_TUV_ HClass1011

Métodos de procesamiento:• General_Foods_TUV_HClass1011• IntStd_Foods_TUV_HClass1011

Métodos de informe:• Report_Foods_TUV_HClass1011

Conjunto de métodos:• StartUp_Foods_TUV_HClass1011• Run_Foods_TUV_HClass1011• ShortStop_Foods_TUV_ HClass1011• LongStop_Foods_TUV_ HClass1011

Secuencia de muestras:• SmplSet_Foods_TUV_HClass1011




Para verificar el funcionamiento de un sistema con un detector TUV:

1. Verificar los siguientes valores de los siguientes parámetros del detector TUV:

Parámetro Valor

Detection wavelength (Longitud de onda de detección)

260 nm

Sampling rate (Velocidad de adquisición) 10 puntos/s

Data mode (Modo de datos) Absorbancia

Constante de tiempo 0,200 s

Auto Zero on Wavelength Change (Puesta a cero automática al cambiar la longitud de onda)

Mantain Baseline (Mantener línea base)

Auto Zero on Inject Start (Puesta a cero automática al inicio de la inyección)

Sí

Sensitivity (Sensibilidad) 2,00 AUFS

Chart polarity (Polaridad del cromatograma) Positivo +

Voltage offset (Ajuste del voltaje) 0 mV

Enable chart mark (Habilitar marca en el gráfico)

Sí

Run events (Ejecutar eventos) Sí

Threshold (Umbral) 1,0000 AU

Threshold switch action (Modo de cambio de umbral)

Encendida


2. Verificar los siguientes valores del sistema de gestión de eluyentes:

Parámetro Valor

Low pressure limit (Límite de baja presión) 0 psi

High pressure limit (Límite de alta presión) 15 000 psi

Seal wash period (Periodo de lavado de las juntas)

5,00 min

Flow ramp rate (Elevación del caudal) 0,45 min

Pre-injector volume (Volumen antes del inyector)

100 µL

Caudal 700 µL/min

Tabla de gradientes para cultivos celulares, hidrolizados y cisteína alquilada:

PasoTiempo (min)

%A %B %C %DCurve (Curva)

1 0,00 10,0 0,0 90,0 0,0 N/A

2 0,29 9,9 0,0 90,1 0,0 11

3 5,49 9,0 80,0 11,0 0,0 7

4 7,10 8,0 15,6 57,9 18,5 6

5 7,3 8,0 15,6 57,9 18,5 6

6 7,69 7,8 0,0 70,9 21,3 6

7 7,99 4,0 0,0 36,3 59,7 6

8 8,59 4,0 0,0 36,3 59,7 6

9 8,68 10,0 0,0 90,0 0,0 6

10 10,20 10,0 0,0 90,0 0,0 6


3. Verificar las siguientes condiciones cromatográficas:

• Columna: columna AccQ•Tag Ultra de 2,1 × 100 mm, 1,7 µm

• Fase móvil A: eluyente A para AAA

• Fase móvil B: agua/eluyente B para AAA 10:90

• Fase móvil C: calidad HPLC

• Fase móvil D: eluyente B para AAA

4. Verificar los siguientes valores del sistema de gestión de muestras:

Tabla de gradientes para alimentos y piensos:

PasoTiempo (min)

Caudal (mL/min)


1 0,00 0,7 2,0 0,0 98,0 0,0 N/A

2 0,29 0,7 2,0 0,0 98,0 0,0 11

3 5,49 0,7 9,0 80,0 11,0 0,0 7

4 7,10 0,7 8,0 15,6 57,9 18,5 6

5 7,3 0,7 8,0 15,6 57,9 18,5 6

6 7,69 0,7 7,8 0,0 70,9 21,3 6

7 7,99 0,7 4,0 0,0 36,3 59,7 6

8 8,59 0,7 4,0 0,0 36,3 59,7 6

9 8,68 0,7 2,0 0,0 98,0 0,0 6

10 10,20 0,7 2,0 0,0 98,0 0,0 6

Parámetro Valor

Temperatura de la columna para cultivos celulares, hidrolizados y cisteína alquilada

43 °C

Temperatura de la columna para alimentos y piensos 49 °C

Temperatura de la muestra 20 °C

Pre-inject wash time (Lavado previo a la inyección) 0,0 s

Pre-inject wash time (Lavado posterior a la inyección) 6,0 s

Dilution needle placement (Posición de la aguja de dilución)

4 mm

Syringe draw rate (Velocidad de aspiración de la jeringa) Automática

Needle placement (Posición de la aguja) Automática


Método de prueba del detector PDA

En las tablas siguientes se muestran los proyectos de Empower, los métodos de prueba y los valores de los parámetros para un sistema con un detector PDA.

Abrir el proyecto y los métodos de prueba para la aplicación con el fin de verificar los valores de los parámetros para el detector PDA, el sistema de gestión de eluyentes y el sistema de gestión de muestras.

La siguiente tabla indica los métodos para el detector PDA.

Métodos de prueba para el detector PDA:


Hydrolysates_PDA_HClass1011 Métodos de instrumento:• StartUp_Hyd_PDA_HClass1011• Run_Hyd_PDA_HClass1011• ShortStop_Hyd_PDA_HClass1011• LongStop_Hyd_PDA_HClass1011

Métodos de procesamiento:• General_Hyd_PDA_HClass1011• IntStd_Hyd_PDA_HClass1011

Métodos de informe:• Report_Hyd_PDA_HClass1011

Conjunto de métodos:• StartUp_Hyd_PDA_HClass1011• Run_Hyd_PDA_HClass1011• ShortStop_Hyd_PDA_HClass1011• LongStop_Hyd_PDA_HClass1011

Secuencia de muestras:• SmplSet_Hyd_PDA_HClass1011


Alkylated_Cys_PDA_HClass1011 Métodos de instrumento:• StartUp_Cys_PDA_HClass1011• Run_Cys_PDA_HClass1011• ShortStop_Cys_PDA_HClass1011• LongStop_Cys_PDA_HClass1011

Métodos de procesamiento:• General_Cys_PDA_HClass1011• IntStd_Cys_PDA_HClass1011

Métodos de informe:• Report_Cys_PDA_HClass1011

Conjunto de métodos:• StartUp_Cys_PDA_HClass1011• Run_Cys_PDA_HClass1011• ShortStop_Cys_PDA_HClass1011• LongStop_Cys_PDA_HClass1011

Secuencia de muestras:• SmplSet_Cys_PDA_HClass1011

Métodos de prueba para el detector PDA: (continuación)



Cell_Culture_PDA_HClass1011 Métodos de instrumento:• StartUp_Cult_PDA_HClass1011• Run_Cult_PDA_HClass1011• ShortStop_Cult_PDA_HClass1011• LongStop_Cult_PDA_HClass1011

Métodos de procesamiento:• General_Cult_PDA_HClass1011• IntStd_Cult_PDA_HClass1011

Métodos de informe:• Report_Cult_PDA_HClass1011

Conjunto de métodos:• StartUp_Cult_PDA_HClass1011• Run_Cult_PDA_HClass1011• ShortStop_Cult_PDA_HClass1011• LongStop_Cult_PDA_HClass1011

Secuencia de muestras:• SmplSet_Cult_PDA_HClass1011




Para verificar el funcionamiento de un sistema con un detector PDA:

1. Verificar los siguientes valores del detector PDA:

Foods_Feeds_PDA_HClass1011 Métodos de instrumento:• StartUp_Foods_PDA_HClass1011• Run_Foods_PDA_HClass1011• ShortStop_Foods_PDA_HClass1011• LongStop_Foods_PDA_HClass1011

Métodos de procesamiento:• General_Foods_PDA_HClass1011• IntStd_Foods_PDA_HClass1011

Métodos de informe:• Report_Foods_PDA_HClass1011

Conjunto de métodos:• StartUp_Foods_PDA_HClass1011• Run_Foods_PDA_HClass1011• ShortStop_Foods_PDA_HClass1011• LongStop_Foods_PDA_HClass1011

Secuencia de muestras:• SmplSet_Foods_PDA_HClass1011

Parámetro Valor

2D Channels - Data mode (Canales 2D - modo de datos)

Absorbancia

2D Channels - Wavelength (Canales 2D - Longitud de onda)

260 nm

2D Channels - Wavelength (Canales 2D - Resolución) 4,8 nm

3D Data (Datos 3D) No habilitado

Sampling rate (Velocidad de adquisición) 10 puntos/s

Resolution (Resolución) 4,8 nm

Constante de tiempo Normal 0,2000 s

Exposure Time (Tiempo de exposición) Auto (ms)




2. Verificar los siguientes valores del sistema de gestión de eluyentes:

Parámetro Valor

Low pressure limit (Límite de baja presión) 0 psi

High pressure limit (Límite de alta presión) 15 000 psi

Seal wash period (Periodo de lavado de las juntas) 5,00 min

Flow ramp rate (Elevación del caudal) 0,45 min

Pre-injector volume (Volumen antes del inyector) 100 µL

Caudal 700 µL/min

Tabla de gradientes para cultivos celulares, hidrolizados y cisteína alquilada:

PasoTiempo (min)


1 0,00 10,0 0,0 90,0 0,0 N/A

2 0,29 9,9 0,0 90,1 0,0 11

3 5,49 9,0 80,0 11,0 0,0 7

4 7,10 8,0 15,6 57,9 18,5 6

5 7,3 8,0 15,6 57,9 18,5 6

6 7,69 7,8 0,0 70,9 21,3 6

7 7,99 4,0 0,0 36,3 59,7 6

8 8,59 4,0 0,0 36,3 59,7 6

9 8,68 10,0 0,0 90,0 0,0 6

10 10,20 10,0 0,0 90,0 0,0 6



• Columna: columna AccQ•Tag Ultra de 2,1 × 100 mm, 1,7 µm





4. Verificar los siguientes valores de tipo de muestra del sistema de gestión de eluyentes:

Tabla de gradientes para alimentos y piensos:

PasoTiempo (min)

Caudal (mL/min)


1 0,00 0,7 2,0 0,0 98,0 0,0 N/A

2 0,29 0,7 2,0 0,0 98,0 0,0 11

3 5,49 0,7 9,0 80,0 11,0 0,0 7

4 7,10 0,7 8,0 15,6 57,9 18,5 6

5 7,3 0,7 8,0 15,6 57,9 18,5 6

6 7,69 0,7 7,8 0,0 70,9 21,3 6

7 7,99 0,7 4,0 0,0 36,3 59,7 6

8 8,59 0,7 4,0 0,0 36,3 59,7 6

9 8,68 0,7 2,0 0,0 98,0 0,0 6

10 10,20 0,7 2,0 0,0 98,0 0,0 6

Parámetro Valor

Temperatura de la columna

Cultivos celulares, hidrolizados y cisteína alquilada

43 °C

Alimentos y piensos 49 °C


Pre-inject wash time (Lavado previo a la inyección) 0,0 s

Pre-inject wash time (Lavado posterior a la inyección) 6,0 s


4 mm

Syringe draw rate (Velocidad de aspiración de la jeringa) Automática



Métodos de prueba para el detector FLR

En las tablas siguientes se indican los proyectos de Empower, los métodos de prueba y los parámetros para un sistema equipado con un detector FLR y para los cuatro tipos de muestras.

Nota: abrir el proyecto y los métodos de prueba para la aplicación con el fin de verificar los valores de los parámetros para el detector FLR, el sistema de gestión de eluyentes y el sistema de gestión de muestras.

La siguiente tabla indica los métodos para el detector FLR.

Métodos de prueba para el detector FLR:

Nombre del proyecto Métodos de prueba

Hydrolysates_FLR_HClass1011 Métodos de instrumento:• StartUp_Hyd_FLR_HClass1011• Run_Hyd_FLR_HClass1011• ShortStop_Hyd_FLR_HClass1011• LongStop_Hyd_FLR_HClass1011

Métodos de procesamiento:• General_Hyd_FLR_HClass1011• IntStd_Hyd_FLR_HClass1011

Métodos de informe:• Report_Hyd_FLR_HClass1011

Conjunto de métodos:• StartUp_Hyd_FLR_HClass1011• Run_Hyd_FLR_HClass1011• ShortStop_Hyd_FLR_HClass1011• LongStop_Hyd_FLR_HClass1011

Secuencia de muestras:• SmplSet_Hyd_FLR_HClass1011


Alkylated_Cys_FLR_HClass1011 Métodos de instrumento:• StartUp_Cys_FLR_HClass1011• Run_Cys_FLR_HClass1011• ShortStop_Cys_FLR_HClass1011• LongStop_Cys_FLR_HClass1011

Métodos de procesamiento:• General_Cys_FLR_HClass1011• IntStd_Cys_FLR_HClass1011

Métodos de informe:• Report_Cys_FLR_HClass1011

Conjunto de métodos:• StartUp_Cys_FLR_HClass1011• Run_Cys_FLR_HClass1011• ShortStop_Cys_FLR_HClass1011• LongStop_Cys_FLR_HClass1011

Secuencia de muestras:• SmplSet_Cys_FLR_HClass1011

Métodos de prueba para el detector FLR: (continuación)



Cell_Culture_FLR_HClass1011 Métodos de instrumento:• StartUp_Cult_FLR_HClass1011• Run_Cult_FLR_HClass1011• ShortStop_Cult_FLR_HClass1011• LongStop_Cult_FLR_HClass1011

Métodos de procesamiento:• General_Cult_FLR_HClass1011• IntStd_Cult_FLR_HClass1011

Métodos de informe:• Report_Cult_FLR_HClass1011

Conjunto de métodos:• StartUp_Cult_FLR_HClass1011• Run_Cult_FLR_HClass1011• ShortStop_Cult_FLR_HClass1011• LongStop_Cult_FLR_HClass1011

Secuencia de muestras:• SmplSet_Cult_FLR_HClass1011




Foods_Feeds_FLR_HClass1011 Métodos de instrumento:• StartUp_Foods_FLR_HClass1011• Run_Foods_FLR_HClass1011• ShortStop_Foods_FLR_HClass1011• LongStop_Foods_FLR_HClass1011

Métodos de procesamiento:• General_Foods_FLR_HClass1011• IntStd_Foods_FLR_HClass1011

Métodos de informe:• Report_Foods_FLR_HClass1011

Conjunto de métodos:• StartUp_Foods_FLR_HClass1011• Run_Foods_FLR_HClass1011• ShortStop_Foods_FLR_HClass1011• LongStop_Foods_FLR_HClass1011

Secuencia de muestras:• SmplSet_Foods_FLR_HClass1011




Para verificar el funcionamiento del sistema con el detector FLR:

1. Verificar que estén establecidos los siguientes valores de los parámetros para el detector FLR:

2. Verificar que estén establecidos los siguientes valores de los parámetros para el sistema de gestión de eluyentes:

Parámetro Valor

Wavelength mode (UV detection), (Modo de longitud de onda [detección UV])

2D Channels (Canales 2D)

Wavelength Excitation ( ex), (Longitud de onda de excitación)

266 (nm)

Wavelength Emission ( em), (Longitud de onda de emisión)

473 (nm)

Sampling rate (Data rate), (Velocidad de adquisición [velocidad de datos])

10 (puntos/s)

Constante de tiempo 0,200 (s)

PMT Gain (Ganancia del PMT) 1,00

Data units (Unidades de datos) Emisión

Parámetro Valor

Low pressure limit (Límite de baja presión) 0 (psi)

High pressure limit (Límite de alta presión) 15,000 (psi)

Seal wash period (Periodo de lavado de las juntas) 5,00 (min)

Flow ramp rate (Elevación del caudal) 0,45 (min)

Pre-injector volume (Volumen antes del inyector) 100 (µL)

Caudal 700 (µL/min)


Tabla de gradientes para análisis de cultivos celulares, hidrolizados y cisteína alquilada:

PasoTiempo (min)


1 0,00 10,0 0,0 90,0 0,0 N/A

2 0,29 9,9 0,0 90,1 0,0 11

3 5,49 9,0 80,0 11,0 0,0 7

4 7,10 8,0 15,6 57,9 18,5 6

5 7,3 8,0 15,6 57,9 18,5 6

6 7,69 7,8 0,0 70,9 21,3 6

7 7,99 4,0 0,0 36,3 59,7 6

8 8,59 4,0 0,0 36,3 59,7 6

9 8,68 10,0 0,0 90,0 0,0 6

10 10,20 10,0 0,0 90,0 0,0 6

Tabla de gradientes para análisis de alimentos y piensos:

PasoTiempo (min)

Caudal (mL/min)


1 0,00 0,7 2,0 0,0 98,0 0,0 N/A

2 0,29 0,7 2,0 0,0 98,0 0,0 11

3 5,49 0,7 9,0 80,0 11,0 0,0 7

4 7,10 0,7 8,0 15,6 57,9 18,5 6

5 7,3 0,7 8,0 15,6 57,9 18,5 6

6 7,69 0,7 7,8 0,0 70,9 21,3 6

7 7,99 0,7 4,0 0,0 36,3 59,7 6

8 8,59 0,7 4,0 0,0 36,3 59,7 6

9 8,68 0,7 2,0 0,0 98,0 0,0 6

10 10,20 0,7 2,0 0,0 98,0 0,0 6



• Columna: columna AccQ•Tag Ultra de 2,1 x 100 mm, 1,7 µm





4. Verificar que estén establecidos los siguientes valores de los parámetros para el sistema de gestión de muestras:

Parámetro Valor


Cultivos celulares, hidrolizados y cisteína alquilada

43 °C

Alimentos y piensos 49 °C


Pre-inject wash time (Lavado previo a la inyección) 0,0 (s)

Pre-inject wash time (Lavado posterior a la inyección) 6,0 (s)


4 (mm)

Syringe draw rate (Velocidad de aspiración de la jeringa)

Automática



Crear los métodos de secuencia de muestras

El CD del sistema incluye un conjunto de métodos de secuencia de muestras para los detectores TUV, PDA y FLR. Seleccionar un método de secuencia de muestras para el detector que se esté utilizando.

Método de secuencia de muestras para el detector TUV

Para abrir el método de secuencia de muestras para el detector TUV:

1. Abrir el método de secuencia de muestras “Reproduc_Hyd_TUV_HClass1011” y confirmar las condiciones siguientes:

• El volumen de inyección está establecido en 1,0 µL.

• El tiempo de análisis está establecido en 10,2 minutos.

• El método está establecido en “Reproduc_Hyd_TUV_HClass1011”.

Método de secuencia de muestras para el detector PDA

Para abrir el método de secuencia de muestras para el detector PDA:

1. Abrir el método de secuencia de muestras “Reproduc_Hyd_PDA_HClass1011” y confirmar las condiciones siguientes:



• El método está establecido en “Reproduc_Hyd_PDA_HClass1011”.

Método de secuencia de muestras para el detector FLR

Para abrir el método de secuencia de muestras para el detector FLR:

1. Abrir el método de secuencia de muestras “Reproduc_FLR_TUV_HClass1011” y confirmar las condiciones siguientes:



• El método está establecido en “Reproduc_FLR_TUV_HClass1011”.

Crear los métodos de secuencia de muestras 3-29

Preparar la muestra de verificación del sistema

Un pipeteo correcto es fundamental para garantizar la calidad de las muestras. Seguir los procedimientos de la empresa para las técnicas de pipeteo adecuadas.

Para preparar la muestra de verificación del sistema (50 pmol/µL):

1. Utilizar una micropipeta para dispensar los siguientes componentes en un vial de recuperación completa:

a. Dispensar 70 µL de tampón boratos AccQ•Tag Ultra (reactivo 1).

b. Añadir 10 µL de patrón de 500 pmol/µL (consultar las instrucciones de preparación de los patrones en el Capítulo 4).

Requisito: mezclar bien durante varios segundos.

c. Añadir 20 µL de reactivo AccQ•Tag Ultra reconstituido.

2. Tapar el vial y agitar la mezcla en un vórtex durante varios segundos.

3. Dejar reposar durante 1 minuto a temperatura ambiente.

4. Calentar en la placa calefactora durante 10 minutos a 55 °C.

5. Retirar de la placa calefactora con la ayuda de pinzas.

Realizar la prueba

Cuando el sistema está preparado, se han verificado los métodos de prueba y se han derivatizado las muestras, se puede realizar la prueba.

Consultar las instrucciones para preparar los patrones en el Capítulo 4 y las instrucciones para preparar el sistema en el Capítulo 5.

Para realizar la prueba:

1. En Run Samples (Analizar muestras), abrir el proyecto para iniciar el análisis.

2. Seleccionar la secuencia de muestras “UPLC AAA Reproducibility” (Reproducibilidad del AAA por UPLC) y después, seleccionar Run and Report (Análisis e informe).


3. Cuando finalice la secuencia de muestras, introducir los resultados apropiados en la tabla que se muestra a continuación.

4. Revisar el informe de funcionamiento en gradiente. Comparar el cromatograma del informe con uno de los siguientes cromatogramas de muestras, en función del tipo de detector que se esté utilizando.

Cromatogramas de ejemplo

Patrón para hidrolizados de 25 pmol con la configuración recomendada del detector TUV:

Resultados de la secuencia de muestras:

ComponenteValor medio del tiempo de retención de los picos

Desviación estándar

Desviación estándar aceptable

Histidina (His) < 0,116

Alanina (Ala) < 0,116

Fenilalanina (Phe) < 0,116

0,10

0,05

0,00

0,00 2,50 5,00 7,50

Minutos

UA

Realizar la prueba 3-31

Patrón para hidrolizados de 25 pmol con la configuración recomendada del detector PDA:

Patrón para hidrolizados de 25 pmol con la configuración recomendada del detector FLR:

0,10

0,05

0,00

0,00 2,50 5,00 7,50

Minutos

UA

3000,00

1500,00

0,00

2,50 5,00 7,50

Minutos

EU

0,00


4 Preparar patrones y muestras

El paquete de química AccQ•Tag Ultra contiene los artículos necesarios para realizar hasta 250 derivatizaciones. Seguir los procedimientos que se describen en este capítulo para preparar los patrones y las muestras que se utilizarán en los análisis.

Contenido:

Tema Página

Reconstituir el reactivo en polvo AccQ•Tag Ultra 4-2

Preparar el patrón de calibración 4-3

Preparar las muestras 4-6

4-1

Reconstituir el reactivo en polvo AccQ•Tag Ultra

El kit de reactivos AccQ•Tag Ultra incluye reactivos preformulados y probados para garantizar una mínima contaminación de aminoácidos. El reactivo AccQ•Tag Ultra reconstituido es reactivo AccQ•Tag Ultra aproximadamente 10 mM disuelto en acetonitrilo.

Para reconstituir el reactivo AccQ•Tag Ultra:

1. Precalentar una placa calefactora a 55 °C.

2. Dar unos golpecitos suaves al vial 2A antes de abrirlo para asegurarse de que todo el reactivo en polvo AccQ•Tag Ultra está en el fondo del vial.

3. Aclarar una micropipeta limpia, aspirando y dispensando 1 mL de diluyente de reactivo AccQ•Tag Ultra del vial 2B. Repetir 2 veces este procedimiento.

Requisito: repetir dos veces el proceso de limpieza.

4. Aspirar 1,0 mL del vial 2B y transferirlo al reactivo en polvo AccQ•Tag Ultra del vial 2A. Tapar herméticamente el vial.

5. Agitar en vórtex durante 10 segundos.

Importante: no calentar el reactivo durante más de 10 minutos.

Indicación: el reactivo AccQ•Tag Ultra reconstituido se puede conservar en un desecador a temperatura ambiente durante 1 semana. El riesgo de contaminación con humedad aumenta cada vez que se abre el vial. Por lo tanto, no debe extraerse de cada vial más reactivo del necesario para llevar a cabo 3 experimentos de derivatización.

Advertencia: el acetonitrilo es inflamable y tóxico. Consultar la hoja de datos sobre seguridad del material.

Precaución: el reactivo AccQ•Tag Ultra reacciona con la humedad atmosférica. Cerrar herméticamente el vial cuando no se esté utilizando. No refrigerar. No utilizar un reactivo decolorado, especialmente si está amarillo o verde.

4-2 Preparar patrones y muestras

Preparar el patrón de calibración

En esta sección se describen los métodos para preparar patrones de calibración externos e internos, y el procedimiento para derivatizar el patrón de calibración.

Utilizar el patrón de calibración para calcular la composición de proteínas y péptidos en las muestras hidrolizadas, los valores molares porcentuales de los aminoácidos individuales en una muestra de hidrólisis y las cantidades absolutas inyectadas.

Equipo necesario

• Micropipetas ajustables (1, 10, 20, 200 y 1 000 L) y puntas

• Mezclador vórtex

• Viales de recuperación total (Total Recovery) de Waters con tapones con septum no perforado

• Placa calefactora

• Agua Mill-Q® o agua de 18 megaohmios

Preparar el patrón de calibración: método externo

El paquete de química AccQ•Tag de Waters incluye el patrón de hidrolizado de aminoácidos de Waters. La mezcla de patrones contiene una concentración de 2,5 mM de cada uno de los aminoácidos hidrolizados disueltos en HCl 0,1 N, con excepción de la cistina (1,25 mM).

asegurarse de que todo el material de vidrio esté limpio. Para los análisis de alta sensibilidad, pirolizar todo el material de vidrio a 500 °C durante un mínimo de 4 horas.

Para preparar el patrón de calibración:

Mezclar 100 L de patrón de hidrolizado de aminoácidos de Waters con 900 L de agua Milli-Q o de 18 megaohmios en un vial de recuperación total.

El patrón de calibración diluido contiene 250 pmol/L de cada aminoácido excepto cistina (125 pmol/L, equivalente a 250 pmol/L de cisteína).


Seguir estas directrices para conservar los patrones:

• Conservar el patrón de calibración diluido a -20 °C durante 1 mes como máximo.

• Transferir el patrón de hidrolizado de aminoácidos restante de la ampolla a un vial con tapa. Conservar el patrón restante durante un máximo de 3 meses a -20 °C. Proteger el patrón de la desecación y de la quemadura por congelación durante la conservación.

• Conservar las ampollas de patrón de hidrolizado sin abrir durante 1 año como máximo a 4 °C.

Proteger todos los patrones de la contaminación y la evaporación.

Preparar el patrón de calibración: método interno

Utilizar un patrón interno con el patrón de calibración añadido para corregir los errores volumétricos introducidos durante la preparación de las muestras. Utilizar un aminoácido estable que se eluya con un tiempo de retención único conocido. El patrón interno recomendado es norvalina. Una alternativa aceptable es el ácido -aminobutírico.

Preparar la solución concentrada de patrón interno

Utilizar la solución concentrada de patrón interno para preparar lo siguiente:

• Patrón de calibración con un patrón interno añadido

• Solución de patrón interno para añadir a la muestra

Para preparar una solución concentrada de patrón interno de norvalina 2,5 mM:

Añadir 2,94 mg of norvalina a 10 mL de HCl 0,1 N.

Para preparar una solución concentrada de patrón interno de ácido aminobutírico 2,5 mM:

Añadir 2,58 mg de ácido -aminobutírico a 10 mL de HCl 0,1 N.

Conservar la solución concentrada de patrón interno a -20 °C durante 6 meses como máximo.


Preparar un patrón de calibración que incluya un patrón interno

Para preparar un patrón de calibración con un patrón interno añadido:

Combinar los siguientes reactivos en un vial del inyector automático limpio:

• 100 L de solución concentrada de patrón interno

• 100 L de mezcla de patrón de hidrolizado de aminoácidos de Waters

• 800 L de agua Milli-Q o agua de 18 megaohmios

El patrón de calibración con patrón interno añadido contiene 250 pmol/L de cada aminoácido excepto cistina (125 pmol/L, equivalente a 250 pmol/L de cisteína).

Conservar el patrón de calibración a -20 °C durante 1 mes como máximo, tapando herméticamente el vial y protegiéndolo de la desecación.

Derivatizar el patrón de calibración

La derivatización convierte a los aminoácidos del patrón en derivados sumamente estables.

Para derivatizar el patrón de calibración:


2. Utilizar una micropipeta para añadir 70 L de tampón borato AccQ•Tag Ultra (reactivo 1) a un vial de recuperación total limpio.

3. Utilizar una micropipeta para dispensar 10 L de patrón de calibración en el vial y agitar brevemente en un mezclador vórtex.

4. Utilizar una micropipeta con una punta limpia para añadir 20 L de reactivo AccQ•Tag Ultra reconstituido al vial y agitar de inmediato en un mezclador vórtex durante varios segundos.

5. Dejar reposar la mezcla durante 1 minuto a temperatura ambiente.

6. Calentar el vial en un horno o placa calefactora durante 10 minutos a 55 °C.

Indicación: el calentamiento convierte un producto secundario de la tirosina (Tyr) en el compuesto monoderivatizado principal. La conversión se produce más lentamente a temperatura ambiente, con una vida media de aproximadamente 1 hora.


Una inyección de 1 L del patrón derivatizado contiene 25 pmol de cada derivado de aminoácido (excepto cistina, 12,5 pmol).

Conservar los derivados a temperatura ambiente durante 1 semana como máximo. Cerrar herméticamente los viales con septos no perforados para evitar la evaporación durante el almacenamiento.

Preparar las muestras

Para preparar una muestra para el análisis de aminoácidos con el método AccQ•Tag Ultra:

1. Determinar la cantidad de muestra necesaria.

2. Hidrolizar la muestra para obtener los aminoácidos que la componen (si es necesario).

3. Derivatizar los aminoácidos con el reactivo AccQ•Tag Ultra.

Consultar en el Apéndice A la discusión detallada de las cantidades de las muestras.

Los procedimientos de preparación de las muestras son los puntos más frecuentes de contaminación con aminoácidos. Para obtener más información sobre cómo minimizar la contaminación de fondo, consultar “Contaminación de fondo”.

Determinar la cantidad de muestra

La siguiente tabla indica los intervalos de cantidades de las muestras para la hidrólisis y el análisis con el método AccQ•Tag Ultra.

Intervalos de cantidades de las muestras:

Muestra Cantidad de muestraa

a. Basada en un peso molecular medio de 25 000 para las proteínas y de 1 000 para los péptidos.

Intervalo

Proteínas 0,1 a 5,0 g 4 a 200 pmol

Péptidos 0,02 a 1,0 g 20 a 1 000 pmol


Hidrolizar las muestras

El sistema es compatible con todos los procedimientos habituales de hidrólisis que se utilizan para proteínas purificadas, y para muestras de alimentos y piensos. Es necesario seguir las directrices del Apéndice A para asegurarse de que la cantidad de muestra está dentro del intervalo lineal del ensayo y de que hay un pH óptimo para la reacción.

Contaminación de fondo

La contaminación de fondo puede aportar fácilmente 10 pmol o más de ciertos aminoácidos a la muestra. Los contaminantes más abundantes suelen ser: glicina, serina, aspartato y glutamato.

Consultar también: para obtener información más detallada sobre cómo minimizar la contaminación, consultar el documento Controlar la contaminación en sistemas LC/MS.

A continuación se indican algunas fuentes potenciales de contaminación:

• Material de vidrio sucio

• Animales de laboratorio

• Humo de tabaco

• Polvo en el ambiente

• Huellas dactilares

• Kimwipes®

Para obtener resultados óptimos, seguir estas directrices:

• Manipular las muestras en una zona de trabajo limpia, con poco tráfico de personas.

• Utilizar guantes limpios, sin talco, y pinzas limpias.

• Utilizar material de vidrio desechable siempre que sea posible.

• Pirolizar todos los tubos de muestra y viales de reacción, calentándolos a 500 °C durante 4 horas.

• Considerar el procedimiento de hidrólisis ácida en fase de vapor para las proteínas puras. Utilizar ampollas de 1 mL de HCl de alta pureza (6 N).

• Comprobar la contribución del fondo mediante derivatizaciones del blanco y los controles apropiados.

• Utilizar un tubo de muestra vacío como blanco de hidrólisis de control.


• Tener en cuenta la posible contaminación de las pipetas, puntas desechables, jeringas y pinzas. Evitar la contaminación cruzada de las muestras y los patrones de calibración.

Derivatizar las muestras

La derivatización convierte a los aminoácidos de la solución de muestra en derivados de aminoácidos estables.

Reconstituir la muestra hidrolizada

Para reconstituir la muestra seca:

1. Preparar una solución de HCl 100 mM añadiendo 50 L de HCl (6 N) en ebullición constante a 2,5 mL de agua Milli-Q o agua de 18 megaohmios en un vial del inyector automático limpio.

2. Disolver la muestra en el volumen calculado a partir de las directrices del Apéndice C.

3. Tapar y agitar bien en un mezclador vórtex.

Para reconstituir la muestra para obtener un patrón interno:

1. Preparar una solución de HCl 100 mM añadiendo 50 L de HCl (6 N) en ebullición constante a 2,5 mL de agua Milli-Q o agua de 18 megaohmios en un vial del inyector automático limpio.

2. Preparar una solución de patrón interno añadiendo 20 µL de solución concentrada de patrón interno 2,5 mM a 980 mL de HCl 20 M.

Consultar también: para obtener más información para preparar una solución de patrón interno, consultar la página 4-4.

3. Disolver la muestra en el volumen calculado a partir de las directrices del Apéndice A.

4. Tapar y agitar bien en un mezclador vórtex.

Derivatizar una muestra

Para derivatizar una muestra:



2. Añadir la muestra, el tampón borato AccQ•Tag Ultra y el reactivo de neutralización al vial de recuperación total.

Requisito: el vial debe permanecer cerrado herméticamente durante toda la derivatización.

Indicación:

• Si resulta más cómodo, se puede llevar a cabo la derivatización en el tubo de hidrólisis.

• Se puede cambiar el volumen de boratos para compensar la neutralización de la muestra, tal como se describe en el Apéndice C.

3. Añadir 20 L de reactivo AccQ•Tag Ultra, agitar de inmediato en un mezclador vórtex durante varios segundos y después esperar 1 minuto.

Resultado: la derivatización ha finalizado y el exceso de reactivo se hidroliza a AMQ, terminando la reacción de derivatización.

4. Transferir el contenido del tubo a un vial de recuperación total (si es necesario).

5. Calentar el vial en la placa calefactora durante 10 minutos a 55 °C.

Indicación: el calentamiento convierte un producto secundario de la tirosina en el compuesto monoderivatizado principal. La conversión es más lenta a temperatura ambiente.

Derivatizar un blanco

Asegurarse de que todo el material de vidrio esté limpio. Pirolizar los tubos de muestra a 500 °C durante 4 horas como mínimo.

Para derivatizar un blanco:

1. Colocar 80 L de tampón boratos AccQ•Tag Ultra en un vial.

2. Añadir 20 L de reactivo AccQ•Tag Ultra y agitar en un mezclador vórtex.

3. Esperar 1 minuto a que el exceso de reactivo se hidrolice a AMQ.

4. Calentar el vial durante 10 minutos a 55 °C.



5 Trabajar con el sistema

Para realizar una calibración y empezar a adquirir datos es necesario preparar el sistema y configurar el software Empower.

Contenido:

Tema Página


Configurar el software Empower 5-9

Abrir Empower y restaurar proyectos 5-11

Cargar, modificar y procesar un método de secuencia de muestras 5-13

Procesar datos 5-16

5-1

Preparar el sistema

Preparar las fases móviles

Preparar los eluyentes tal como se describe en la página 4-1.

Encender el sistema

Para encender el sistema hay que encender la estación de trabajo y los módulos del sistema, cada uno de los cuales pita tres veces sucesivas y después lleva a cabo una serie de pruebas iniciales.

Indicación: si el sistema contiene un horno de columnas, se encenderá automáticamente al encender el sistema de gestión de muestras.

Consultar también: la página 5-3 para obtener información sobre cómo interpretar los modos de los indicadores LED de estado del flujo y de encendido de los módulos.

Para encender el sistema:

1. Encender la estación de trabajo del sistema.

2. Encender el sistema de gestión de eluyentes y el sistema de gestión de muestras pulsando el interruptor de encendido situado en la parte superior izquierda de la puerta de cada módulo.

3. Cuando los indicadores LED de encendido del sistema de gestión de eluyentes y el sistema de gestión de muestras se enciendan de color verde continuo, pulsar el interruptor de encendido situado en la parte superior izquierda del detector.

Requisito: encender el detector solo cuando la cubeta de flujo se haya mojado.

4. Iniciar el software del sistema de datos cromatográficos.

Indicación: se puede observar si aparecen mensajes e indicaciones de los indicadores LED en la ACQUITY UPLC Console (Consola ACQUITY UPLC).

5-2 Trabajar con el sistema

Supervisar las pruebas iniciales

Al encender la estación de trabajo del sistema se ejecutan las siguientes pruebas de puesta en marcha:

• Tarjeta CPU

• Memoria (RAM y ROM)

• Sistema de comunicaciones externo (Ethernet)

• Reloj

Si las pruebas de puesta en marcha indican un funcionamiento erróneo, consultar la ayuda en línea de la consola ACQUITY UPLC.

Supervisar los indicadores LED de los módulos del sistema

Los indicadores LED de que dispone cada módulo del sistema indican cuál es su estado de funcionamiento. Los indicadores LED son específicos para cada módulo, por lo que el significado de sus distintos colores y modos de funcionamiento puede variar de un módulo a otro.

Indicador LED de encendido

El indicador LED de encendido, situado del lado izquierdo del panel frontal de cada módulo, indica si el módulo está encendido o apagado. El indicador LED está de color verde cuando el módulo está recibiendo corriente y está apagado cuando el módulo no está recibiendo corriente.

Indicación: para proporcionar una ventilación adecuada, los ventiladores de refrigeración del sistema de gestión de muestras funcionan continuamente (incluso cuando el interruptor de encendido está en la posición de apagado). Los ventiladores solamente se apagan cuando se desconecta el cable de alimentación de la parte trasera del módulo.

Indicadores LED de estado

Indicador LED de caudal (sistema de gestión de eluyentes)

El indicador LED de flujo, situado a la derecha del indicador LED de encendido del sistema de gestión de eluyentes cuaternario indica el estado del caudal. Un indicador LED de flujo de color verde continuo indica que circula flujo a través del Sistema de gestión de eluyentes cuaternario.


Indicador LED de análisis (sistema de gestión de muestras)

El indicador LED de funcionamiento, situado a la derecha del indicador LED de encendido del sistema de gestión de muestras, indica el estado de funcionamiento. Un indicador LED de funcionamiento de color verde continuo indica que hay inyecciones en curso.

Indicador LED de la lámpara (detector)

El indicador LED de la lámpara, situado a la derecha del indicador LED de encendido del detector, indica el estado de la lámpara. Un indicador LED de la lámpara de color verde continuo indica que la lámpara está encendida.

Indicaciones del LED de estado:

Modo y color del indicador LED

Descripción

Apagado • Sistema de gestión de eluyentes y sistema de gestión de muestras: indica que el módulo está inactivo en este momento.

• Detector: indica que la lámpara está apagada.

Verde continuo • Sistema de gestión de eluyentes: indica que está fluyendo eluyente.

• Sistema de gestión de muestras: indica que el módulo funciona normalmente y está realizando las solicitudes restantes de muestras o funciones de diagnóstico. Cuando finalicen las funciones de diagnóstico y de análisis de muestras solicitadas, el indicador LED volverá a apagarse.

• Detector: indica que la lámpara está encendida.

Verde intermitente • Sistema de gestión de eluyentes y sistema de gestión de muestras: indica que el módulo se está inicializando.

• Detector: indica que el módulo se está inicializando o calibrando.


Activar los sensores de fugas

Regla: al encender el sistema, los sensores de fugas estarán desactivados por defecto a menos que se hayan activado previamente.

Para activar los sensores de fugas:

1. En la consola ACQUITY UPLC, seleccionar Control > Leak Sensors (Control > Sensores de fugas).

Cuadro de diálogo Leak Sensors:

Rojo intermitente Cualquier módulo: indica que un error ha detenido el módulo. Consultar la consola ACQUITY UPLC para obtener información sobre el error.

Rojo continuo Cualquier módulo: indica un fallo que impide que siga funcionando. Apagar el módulo y después volver a encenderlo. Si el indicador LED continúa de color rojo continuo, ponerse en contacto con un representante del Servicio Técnico de Waters.

Indicaciones del LED de estado: (continuación)

Modo y color del indicador LED

Descripción

Hacer clic para activar o desactivar cada uno de los sensores de fugas del instrumento.

Hacer clic para activar o desactivar todos los sensores de fugas del instrumento.


2. Para activar el sensor de fugas para un módulo concreto, hacer clic en el estado, a la izquierda de la descripción del módulo.

Indicación: para activar todos los sensores de fugas, hacer clic en Enable All (Activar todos).

Puesta en marcha del sistema

Utilizar la función “Start up” (Puesta en marcha) para cebar el sistema de gestión de eluyentes tras cambiar la fase móvil, la aguja de muestras o después de que el sistema haya estado inactivo durante un largo periodo de tiempo (por ejemplo, durante la noche).

Se debe comprobar que el sistema se encuentra correctamente configurado antes de realizar este procedimiento. Asimismo, hay que cebar el sistema de gestión de eluyentes cuaternario durante 5 minutos como mínimo si se va a realizar un cambio de eluyentes por otros que tengan una composición diferente a la de los que ya se encuentran en el sistema.

Para poner en marcha el sistema:

1. En la consola ACQUITY UPLC, hacer clic en Control > Start up system (Control > Puesta en marcha del sistema).

2. En la ficha Prime Solvents (Cebar eluyentes) del cuadro de diálogo System Startup (Puesta en marcha del sistema), revisar la configuración de los eluyentes: A,B,C y D.

Indicación: en el área A/B/C/D Solvents (Eluyentes A/B/C/D) se pueden seleccionar o desactivar algunos o todos los eluyentes. También se puede cambiar el valor del campo Duration of Prime (Duración del cebado). Todos los eluyentes seleccionados se cebarán durante el mismo tiempo.

Valores de los parámetros de cebado:

Intervalo 0,1 a 60,0 minutos

Valores predeterminadosTodos los eluyentes se ceban durante 2,0 minutos cada uno.

Recomendación:Cebar durante 3 minutos. Cebar durante 7 minutos después de cambiar los eluyentes.


3. Seleccionar o limpiar el cebado del lavado de juntas, el eluyente de lavado y el eluyente de purga.

4. Si es necesario, cambiar la duración especificada para cebar el lavado de las juntas y el eluyente de lavado, así como el número de ciclos especificado para cebar el eluyente de purga.

Valor predeterminado: el lavado de las juntas se ceba durante 2,0 minutos, el eluyente de lavado durante 15 segundos y el eluyente de purga durante 5 ciclos.

5. Seleccionar la pestaña Equilibrate to Method (Equilibrar al método) para comprobar los ajustes del caudal final, la fase móvil, la composición, las temperaturas y el estado de la lámpara.

6. En la ficha Equilibrate to Method (Equilibrar según método), cambiar los valores, según convenga, con el fin de que coincidan con los requisitos de equilibrado.

Valores de la ficha Equilibrate to Method:

Parámetros de la puesta en marcha del sistema

Valores predeterminados

Valores admitidos

Caudal inicial del método

0,500 mL/min De 0,1 a 2,0 mL/min

Composición de A, B, C y D (la suma debe ser 100%)

A, 100%B,C,D 0%

A; 0 a 100%B; 0 a 100%C; 0 a 100%D; de 0 a 100%


Desconectada Depende del tipo de compartimento de columnas

Temperatura de la muestra

Encendida Off (Desconectado), o de 4,0 a 40,0 ºC (de 39,2 a 104 ºF)


7. Si se ha cambiado la aguja de muestras, hacer clic en Change (Cambiar).

8. En el cuadro de diálogo Volume Configuration (Configuración del volumen), seleccionar el tamaño de la aguja nueva y, a continuación, hacer clic en OK.

9. Hacer clic en Start (Iniciar).

Resultado: se enciende la lámpara en el detector óptico, el software del sistema establece la temperatura de la muestra y de la columna, y comienzan todos los cebados. Después del cebado, el sistema de gestión de muestras caracteriza la aguja y la junta, si se ha especificado. Después, registra los resultados de la caracterización en la base de datos. Por último, el software del sistema establece el caudal del método, la selección de eluyentes y la composición.

Conectar la columna

Para obtener instrucciones detalladas para conectar la columna, consultar la página 2-14.

Lámpara Encendida Encendida o apagadaPara las cubetas de flujo con paso de luz, no se debe conectar la lámpara del detector, ni trabajar con ella o encenderla si no existe flujo a través de la cubeta o si la cubeta de flujo está seca.

Valores de la ficha Equilibrate to Method: (continuación)

Parámetros de la puesta en marcha del sistema

Valores predeterminados

Valores admitidos


Configurar el software Empower

El sistema requiere que el software Empower esté completamente instalado antes de intentar realizar un análisis. Si el software Empower no está instalado, hay que instalarlo utilizando el CD de Empower y, a continuación, configurarlo.

La siguiente información proporciona un método directo para comenzar a utilizar el sistema. Para ver una descripción completa de las funciones y opciones de Empower, consultar la documentación del software Empower que se suministra con el sistema.

Interfaz QuickStart de Empower

QuickStart es una interfaz de Empower que se facilita y se utiliza para analizar muestras de forma fácil y sencilla. La ventana Project (Proyecto) de QuickStart tiene tres áreas de visualización principales:

Áreas de visualización de la ventana Project (Proyecto) de QuickStart:

Área de la ventana Descripción

Barra de navegación

La barra de navegación, un panel vertical situado del lado izquierdo de la ventana principal, se utiliza para seleccionar tareas y funciones relacionadas con la adquisición, procesamiento, revisión y generación de informes de los datos cromatográficos. • Run Samples (Analizar muestras)• Browse Project (Examinar proyecto), (Sample Queue

[Cola de muestras], Control Panel [Panel de control])• View Data (Visualizar datos)• View Method (Visualizar método), (Method Set

[Conjunto de métodos], Instrument [Instrumento] y Processing [Procesamiento])

• View Acquisition (Ver adquisición)• Show me (Mostrar), proporciona ayuda interactiva

Configurar el software Empower 5-9

Ventana Project (Proyecto) de QuickStart

Área de trabajo El área de trabajo, situada a la derecha de la barra de navegación, muestra lo que se ha seleccionado en la barra de navegación. En el área de trabajo se configura la obtención, visualización y procesamiento de los datos, y se obtienen vistas preliminares de los informes.

View Acquisition (Ver adquisición)

En el área View Acquisition (Ver adquisición) se puede ver el estado del sistema, la adquisición en curso y los parámetros relacionados. El lado izquierdo de esta área ofrece varias herramientas para acceder a funciones asociadas a las adquisiciones; el lado derecho muestra el panel del cromatograma, con herramientas para las opciones de visualización y acceso a la ventana Review (Revisar).

Áreas de visualización de la ventana Project (Proyecto) de QuickStart:

Área de la ventana Descripción

Work AreaNavigation

Bar

ViewAcquisition

Work AreaNavigation

Bar

ViewAcquisition

Ventana View acquisition

Barra de navegación

Área de trabajo


Abrir Empower y restaurar proyectos

El sistema se entrega con un CD del sistema que contiene proyectos y métodos de prueba predefinidos para Empower. Consultar las descripciones de los archivos en el archivo Read Me (Léame) del CD.

Antes de empezar a utilizar la aplicación de software Empower en el laboratorio:

1. Encender los módulos cromatográficos y esperar a que finalicen sus pruebas diagnósticas internas.

2. Encender las impresoras y otros dispositivos periféricos, así como el ordenador.

Para iniciar Empower:

1. Hacer doble clic en el icono de inicio de sesión en Empower.

2. En el cuadro de diálogo Login (Iniciar sesión), introducir el nombre de usuario y la contraseña.

Requisito: es necesario utilizar la interfaz QuickStart. Si la interfaz Pro está establecida como predeterminada, hacer clic en Advanced (Avanzada) en la pantalla Login (Iniciar sesión) y seleccionar la interfaz QuickStart.

El administrador del sistema puede configurar los valores predeterminados del sistema para que no sea necesario elegir una interfaz.

3. Seleccionar un proyecto y un sistema, y hacer clic en OK.

Abrir Empower y restaurar proyectos 5-11

Regla: en el cuadro de diálogo Select Project and System (Seleccionar proyecto y sistema) solo aparecen los proyectos y los sistemas cromatográficos a los que el usuario tiene acceso. El sistema cromatográfico para el análisis de aminoácidos por UPLC debe haberse configurado en el momento de la instalación. Si no hay ningún sistema configurado, consultar al administrador del sistema.

4. Cargar el CD de la solución de sistema para análisis de aminoácidos por UPLC en la unidad.

5. En la ventana del proyecto QuickStart, seleccionar Manage > Restore Project (Gestionar > Restaurar proyecto).

6. En la pantalla Restore Project Wizard (Asistente para restaurar proyectos), hacer clic en Browse (Examinar).

7. Especificar la ruta a la carpeta (o carpetas) del proyecto para el detector del sistema y las aplicaciones que se utilizan en el laboratorio, y después hacer clic en Next (Siguiente).

Requisito: si se está restaurando un proyecto existente, se pedirá al usuario que le asigne un nuevo nombre de proyecto. Asimismo, si la restauración se lleva a cabo en Empower 2154, es posible que aparezca el siguiente mensaje. Si es así, hacer clic en OK y después continuar.

8. Cuando el cuadro Restore Display (Pantalla de restauración) indique “The import completed successfully” (La importación ha finalizado correctamente), hacer clic en Finish (Finalizar).

9. Hacer clic en Manage > Change Project/System (Gestionar > Cambiar proyecto/sistema).

10. Seleccionar “Switch Project/System in this window” (Cambiar de proyecto/sistema en esta ventana), seleccionar un proyecto y un nombre de sistema adecuados de las opciones disponibles, y después hacer clic en OK para cargar el proyecto recién restaurado en QuickStart.


Cargar, modificar y procesar un método de secuencia de muestras

Una secuencia de muestras es el grupo de archivos de datos vinculados que se obtiene como resultado del procesamiento de un método de secuencia de muestras. Un método de secuencia de muestras es un conjunto reutilizable de instrucciones que proporciona al software Empower la información necesaria para adquirir los datos. Esta información incluye la posición de los viales, los volúmenes de inyección, los nombres de las muestras, los conjuntos de métodos y los campos personalizados de tipo de muestra. Un método de secuencia de muestras también puede incluir instrucciones para imprimir informes resumen, eliminar informes, realizar cálculos personalizados con funciones de resumen, etc.

En cada proyecto se incluye un método de secuencia de muestras de ejemplo. La tabla de muestras de este proyecto puede modificarse para ajustarla al lote de patrones o muestras deseado.

Para cargar, modificar y procesar el método de secuencia de muestras:

1. Abrir el método de secuencia de muestras haciendo clic en el icono

del área de trabajo de la ventana QuickStart.

Alternativa: para futuros análisis, hacer clic en File > New Sample Set > Using Sample Set Method (Archivo > Nueva secuencia de muestras > Usar método para secuencias de muestras).

Indicación: para abrir un método de secuencia de muestras modificado con anterioridad, seleccionar un método adecuado y después hacer clic en Open (Abrir) para cargar el método.

Nota: el método de secuencia de muestras de ejemplo refleja los siguientes valores de los parámetros:

• Un valor de 15 minutos en la línea Condition Column (Acondicionar columna), que equilibra isocráticamente la columna a 0,2 mL/min en A:B:C:D 25:25:25:25 a la temperatura del método y después cambia a las condiciones iniciales del método de separación.

• Tres valores en Condition Column (Acondicionar columna) que ejecutan el método de gradiente utilizado para el análisis de muestras con el fin de preparar la columna para el análisis.


Requisito: los cuatro valores de las líneas Condition Column (Acondicionar columna) son esenciales para la reproducibilidad de las inyecciones de muestra. Por tanto, deben mantenerse en el método de secuencia de muestras modificado.

• Una inyección de muestra Gradient Blank (Blanco de gradiente) que comprueba la calidad de las fases móviles y los eluyentes de preparación de las muestras.

• Una inyección de muestra Reagent Blank (Blanco de reactivo) que comprueba la calidad del reactivo de derivatización.

• Una inyección de 25 pmoles del patrón utilizado para cuantificar las muestras.

• Una inyección de muestra.

• Un valor de 15 minutos en una línea Condition Column (Acondicionar columna) que prepara al sistema para un apagado breve. Este método apaga la lámpara del detector y el horno para columnas,y reduce el caudal a 0,05 mL/min de A:B:C:D 25:25:25:25. (Si está previsto el almacenamiento prolongado al final del análisis, cambiar el conjunto de métodos al método de parada prolongada. Después de lavar el sistema durante 15 minutos, ese método apaga la lámpara del detector, el horno para columnas y la bomba. )


2. Antes de realizar cualquier modificación en el método de secuencia de muestras, guardar el método con un nuevo nombre, asegurándose de que la información deseada no se sobrescriba.

3. Introducir muestras o patrones adicionales, especificando los parámetros correspondientes como se indica a continuación:

• Para añadir una fila, hacer clic con el botón derecho en una fila y seleccionar Insert Row (Insertar fila) o Add Row (Añadir fila).

Indicación: la función Insert Row (Insertar fila) inserta una fila que es una copia de la fila anterior en la posición del cursor.

Requisito: la función Add Row (Añadir fila) añade una fila al final de la tabla. Todas las especificaciones de la nueva fila son idénticas a las de la fila original, con excepción de la designación del vial. El software aumenta en uno la designación del vial de la nueva fila. Es importante señalar, sin embargo, que no cambia las designaciones de los viales de ninguna de las muestras de las filas siguientes a la nueva fila. Es necesario volver a numerar esas muestras.


• Para eliminar una fila, hacer clic con el botón derecho en ella y después seleccionar Delete Row(s) (Eliminar filas).

4. Al terminar las modificaciones, guardar los cambios en el método de secuencia de muestras.

Requisito: cuando se restauran proyectos desde el CD, los métodos se bloquean para evitar que se sobrescriban. Por esto es necesario guardar los métodos de secuencia de muestras con un nombre distinto.

5. En la lista que aparece en la parte superior del área de trabajo de la ventana de QuickStart, seleccionar Run and Report (Análisis e informe).

6. Comenzar el análisis de la secuencia de muestras haciendo clic en el

icono del área View Acquisition (Ver adquisición) o seleccionando Inject > Run (Inyectar > Analizar) en la barra de herramientas de la parte superior de la ventana QuickStart.

7. Asignar un nombre a la secuencia de muestras, seleccionar el modo de análisis y hacer clic en Run (Analizar).

Procesar datos

Al finalizar el análisis se pueden procesar los datos. el software Empower procesa los archivos de datos en el orden en que se seleccionan. Por ese motivo, al seleccionar archivos en la tabla Channel view (Vista de canal), hay que seleccionar los patrones antes que las muestras problema.

Para procesar manualmente los datos:

1. Hacer clic en la ficha Browse Project (Examinar proyecto) en la barra de navegación.

2. En la tabla del proyecto del área de trabajo, hacer clic en la ficha Sample Sets (Secuencias de muestras).

3. Hacer clic en el número de línea de la secuencia de muestras que se desea procesar y, a continuación, hacer clic en View > Channels (Ver > Canales).

4. En la tabla Channels (Canales), hacer doble clic en la muestra para revisar los datos que se van a procesar.


Resultado: el archivo de datos se abrirá en el área de trabajo, en el formato especificado por el método de procesamiento: cromatograma, tabla de resultados u otra vista.

5. Seleccionar la vista deseada en el menú Window (Ventana) de la ventana View Data (Ver datos).

6. En la ventana QuickStart, hacer clic en File > Open > Processing Method (Archivo > Abrir > Método de procesamiento), seleccionar el método de procesamiento deseado y después hacer clic en Open (Abrir).

7. Hacer clic en Integrate and Quantitate (Integrar y cuantificar)

para procesar las muestras o en Calibrate (Calibrar), para procesar los patrones.

8. Hacer clic en File > Save > Result (Archivo > Guardar > Resultado) para guardar los datos procesados.

Requisito: si se cambia el método de procesamiento, es necesario guardarlo como un método de procesamiento nuevo antes de guardar cualquier resultado.

Procesar datos por lotes

Los dos métodos utilizados para el procesamiento por lotes son: canales y secuencia de muestras.

Métodos de procesamiento por lotes:

Method (Método) Descripción

Channels (Canales) Cuando se procesan archivos de datos individuales de la tabla Channels (Canales), aunque se seleccionen todos los archivos de una secuencia de muestras, el software Empower procesa los archivos siguiendo las instrucciones del conjunto de métodos o del método de procesamiento.

Secuencia de muestras

El software Empower procesa los archivos de datos de una secuencia de muestras siguiendo las instrucciones del método de secuencia de muestras.

Procesar datos 5-17

El procesamiento de una secuencia de muestras genera un conjunto de resultados, al que el software Empower asigna el nombre de la secuencia de muestras. La base de datos relacional de Oracle asigna identificadores para los conjuntos, las inyecciones individuales, los canales y los resultados, y evita la duplicación asociando la fecha y la hora a cada resultado.

La única forma de generar un conjunto de resultados es procesando una secuencia de muestras. Si se seleccionan todos los canales individuales de una secuencia de muestras y se procesan por lotes, no se generará un conjunto de resultados.

Para procesar datos por lotes:

Indicación: el software Empower procesa los archivos de datos en el orden en que se seleccionan. Al seleccionar archivos en la tabla Channel view (Vista de canal), recordar que deben seleccionarse los patrones antes que las muestras problema.

1. Hacer clic en la ficha Browse Project (Examinar proyecto) de la barra de navegación y, en la tabla del proyecto del área de trabajo, hacer clic en la ficha Sample Sets (Secuencias de muestras).

2. Hacer clic en el número de línea de la secuencia de muestras que se desea procesar y, a continuación, hacer clic en Tools > Process (Herramientas > Procesar).

Resultado: el cuadro de diálogo Background Processing and Reporting (Procesamiento y generación de informes en segundo plano) ofrece las siguientes opciones de conjuntos de métodos.

Opciones de conjuntos de métodos:

Opción Descripción

Use Acquisition method set (Utilizar conjunto de métodos de adquisición)

Procesa la secuencia de muestras aplicando el conjunto de métodos utilizado para recopilar los datos.

Use the specified method set (Utilizar el conjunto de métodos especificado)

Requiere que el usuario elija un conjunto de métodos.

Use specified processing method (Utilizar método de procesamiento especificado)

Requiere que el usuario elija un método de procesamiento de la lista.


Nota: los sistemas equipados con un detector PDA o FLR pueden adquirir datos en 2D o 3D. Los métodos proporcionados en el CD del sistema solo especifican un canal 2D. La opción “Use specified processing method” (Utilizar el método de procesamiento especificado) procesa los datos adquiridos con estos métodos. Si se crean otros métodos en 3D, es necesario crear también un conjunto de métodos que defina la longitud de onda de extracción y el método de procesamiento.

Requisito: si se realizan cambios en el método de procesamiento, hay que añadir el nuevo método de procesamiento al conjunto de métodos. Esto garantiza que el software Empower aplique el nuevo método al procesamiento por lotes.

3. En la ventana Background Processing and Reporting (Procesamiento y generación de informes en segundo plano) de QuickStart, asegurarse de que la casilla de verificación Process (Procesar) esté seleccionada.

4. Seleccionar “Use specified method set” (Usar el conjunto de métodos especificado) y un conjunto de métodos del menú.

Requisito: seleccionar Clear Calibration (Borrar calibración) si existe una curva de calibración para el método de procesamiento y aún así, se desea generar una nueva curva. De lo contrario, los puntos de los patrones se añadirán a la curva de calibración existente.

5. Hacer clic en OK.

Revisar los datos procesados

Para revisar conjuntos de resultados:

1. Hacer clic en la ficha Browse Project (Examinar proyecto) en la barra de navegación.

2. En la tabla del proyecto del área de trabajo, hacer clic en la ficha Result Sets (Conjuntos de resultados).

3. Hacer clic en el número de línea del conjunto de resultados que se desea revisar y, a continuación, hacer clic en Tools > Review (Herramientas > Revisar).

Resultado: el área de trabajo se abrirá en la ventana Review (Revisar), con el esquema en árbol del conjunto de resultados del lado izquierdo.

4. Utilizar la ficha 2D Channels (Canales 2D) de la parte inferior de la ventana View Data (Ver datos) para seleccionar y ver los canales de datos procesados.

Procesar datos 5-19

5. Ver la tabla Peaks (Picos).

Indicaciones:

• La tabla Peaks (Picos) contiene información individual de cada pico, como el tiempo de retención, el área, la cantidad, la concentración, etc. para el canal seleccionado.

• Los canales 3D no aparecen con los métodos de AAA proporcionados.

Generar un informe

Para generar un informe:

1. En la barra de navegación, hacer clic en la ficha Browse Project (Examinar proyecto).

2. En la tabla Results (Resultados) del área de trabajo, hacer clic en el número de línea del resultado para el que se desea generar un informe.

3. Hacer clic en Tools > Preview (Herramientas > Vista preliminar).

4. Seleccionar “Use the Following Report Method” (Utilizar el siguiente método de informe).

5. Elegir el informe General suministrado u otro informe ya creado, y hacer clic en OK.

6. Si la presentación del informe es satisfactoria, hacer clic en File > Print (Archivo > Imprimir).


6 Gestionar muestras especiales

En este capítulo se describe cómo analizar muestras especiales y preparar soluciones concentradas de patrones. Seguir los procedimientos descritos en este capítulo para preparar los patrones necesarios para llevar a cabo los análisis y comparar los resultados con los cromatogramas representativos suministrados.

Contenido:

Tema Página

Analizar la presencia de cisteína en muestras de proteínas 6-2

Analizar el contenido nutricional de alimentos y piensos 6-6

Analizar medios de cultivo celular 6-10

6-1

Analizar la presencia de cisteína en muestras de proteínas

La cisteína se analiza como un derivado formado por la reducción y alquilación de la proteína antes de su hidrólisis. Existe un gran número de protocolos disponibles en la literatura científica. El sistema de AAA proporciona un método de ejemplo para estos dos derivados comunes. La carboximetilcisteína se produce por alquilación con ácido yodoacético o yodoacetamida. La hidrólisis ácida convierte a la amida formada con yodoacetamida en el mismo ácido libre que se forma con ácido yodoacético. La reacción con vinilpiridina produce piridoletilcisteína.

Analizar las muestras

Para analizar estas muestras, seleccionar el nombre del método que contiene “_AlkylatedCys. . . ” para el tipo de detector que se esté utilizando.

Para analizar las muestras:

1. Abrir el método de secuencia de muestras y verificar que especifique las condiciones siguientes:

• Injection volume (Volumen de inyección) = 1,0 µL

• Run time (Tiempo de adquisición) = 10,2 min

2. Abrir la secuencia de muestras en Run Samples (Analizar muestras), seleccionar la secuencia de muestras y, a continuación, Run and Report (Análisis e informe).

3. Cuando finalice la secuencia de muestras, revisar el informe de funcionamiento en gradiente.

4. Comparar el cromatograma del informe con el cromatograma de la muestra, que aparece a continuación.

El cromatograma representativo muestra la posición de elución de la cisteína, CM-cisteína y PE-cisteína. Solo uno de estos compuestos aparece en una muestra dada.

6-2 Gestionar muestras especiales


Patrón de cisteína alquilada 25 pmol con la configuración recomendada del detector TUV:

Patrón de cisteína alquilada 25 pmol con la configuración recomendada del detector PDA:

0,10

0,05

0,00

0,00 2,50 5,00 7,50

Minutos

UA

0,10

0,05

0,00

0,00 2,50 5,00 7,50

Minutos

UA


Patrón de cisteína alquilada 25 pmol con la configuración recomendada del detector FLR:

Nota: los cromatogramas muestran la posición de elución de varios aminoácidos que no están presentes en el patrón de hidrolizado de Waters.

Preparar la solución patrón necesaria de acuerdo con las siguientes tablas.

Preparación de la solución concentrada de patrón de cisteínas alquiladas:

Nombre del aminoácidoConcentración de la solución conc. (mM)

Volumen de HCl 0,1 N (mL)

Cantidad(mg)

Carboximetilcisteína(CM Cys)

5 10 8,9595

Piridiletilcisteína o S-[2-(4-Piridil)etil]-L -cisteína (PE Cys)

5 10 11,315

Norvalina (Nva) 5 10 5,8575

1600,00

800,00

0,00

2,50 5,00 7,50

Minutos

ETIQUETA

0,00


Cisteínas alquiladas:preparación de la solución patrón de trabajo, volumen deseado:

Concentración deseada (pmol/μL) Volumen deseado (μL)

250 1 000

Preparación de la solución patrón de trabajo de cisteínas alquiladas:

Nombre del patrónVolumen que hay que añadir (μL)

Volumen real añadido (μL)

Patrón H 100 100

CM Cys 50 50

PE Cys 50 50

Nva 50 50

Cisteínas alquiladas:preparación de la solución patrón de trabajo, volumen final:

Volumen final Cantidad (μL)

Solución concentrada 250

Volumen de diluyente que hay que añadir

750


Analizar el contenido nutricional de alimentos y piensos

Las muestras de alimentos y piensos se analizan con frecuencia utilizando dos métodos distintos de preparación de muestras. La mayoría de los aminoácidos proporcionan resultados exactos tras la hidrólisis ácida directa. Para los aminoácidos con azufre, sin embargo, es preferible convertirlos a ácido cisteico estable y metioninsulfona por oxidación con ácido perfórmico.


Para analizar ambos tipos de muestras, seleccionar el nombre del método que contiene “_Food_” para el tipo de detector que se esté utilizando. El método de separación para el análisis de alimentos se basa en la misma combinación de cuatro eluyentes que se utiliza en los otros métodos de AAA. Consultar en la página 6-2 las instrucciones para analizar una muestra específica.

El cromatograma representativo muestra la posición de elución del ácido cisteico y la metioninsulfona. Estos compuestos nunca se producen en la misma muestra que la metionina y la cisteína. El cromatograma también muestra la elución de taurina y los patrones internos alternativos ácido alfa-aminobutírico y norvalina.




Patrón de 25 pmol para alimentos y piensos, con la configuración recomendada del detector TUV:

Patrón de 25 pmol para alimentos y piensos, con la configuración recomendada del detector PDA:

0,10

0,05

0,000,00 2,50 5,00 7,50

Minutos

UA

0,10

0,05

0,00

0,00 2,50 5,00 7,50

Minutos

UA

Patrón de 25 pmol para alimentos y piensos, con la configuración recomendada del detector FLR:



Preparación de la solución patrón concentrada para alimentos y piensos:



Cantidad(mg)

Ácido cisteico (Cya) 5 10 8,458

Taurina (Tau) 5 10 6,257

Metioninsulfona (MetSO2) 5 10 9,0605

Ácido -aminobutírico o 2-1 aminobutanoico (AABA)

5 10 5,156


1800,00

900,00

0,00

2,50 5,00 7,50

Minutos

ETIQUETA

0,00


Alimentos y piensos, preparación de la solución patrón de trabajo, volumen deseado:


250 1 000

Alimentos y piensos, preparación de la solución patrón de trabajo:



Patrón H 100 100

Cya 50 50

Tau 50 50

MetSO2 50 50

AABA 50 50

Nva 50 50

Alimentos y piensos, preparación de la solución patrón de trabajo, volumen final:




650


Analizar medios de cultivo celular

Habitualmente se analiza la presencia de aminoácidos libres en los medios de cultivo celular. No se requiere hidrólisis, pero se incluyen muchos aminoácidos adicionales.


Para analizar el tipo de muestra medio de cultivo celular, seleccionar el nombre del método que contiene “_CellCult_” para el tipo de detector que se esté utilizando. El método de separación para el análisis de medios de cultivo celular se basa en la misma combinación de cuatro eluyentes que se utiliza en los otros métodos de AAA. Consultar “Para analizar las muestras:” en la página 6-2 las instrucciones específicas para analizar la muestra.


Nota: la posición de elución del ácido y-aminobutírico (GABA) está marcada solo como referencia en los cromatogramas siguientes. El GABA se omitió de esta preparación concreta de patrones para cultivo celular.

Patrón de 25 pmol para cultivos celulares con la configuración recomendada del detector TUV:

0,10

0,05

0,00

0,00 2,50 5,00 7,50

Minutos

UA


Patrón de 25 pmol para cultivos celulares con la configuración recomendada del detector PDA:

Patrón de 25 pmol para cultivos celulares con la configuración recomendada del detector FLR:

0,10

0,05

0,000,00 2,50 5,00 7,50

Minutos

UA

1600,00

800,00

0,000,00

2,50 5,00 7,50

Minutos

ETIQUETA




Preparación de la solución patrón concentrada para medios de cultivo celular:



Cantidad(mg)

Hidroxiprolina o trans-4-hidroxi-L-prolina (HyPro)

5 10 6,5565

Asparagina (Asn) 5 10 6,606

Taurina (Tau) 5 10 6,257

Glutamina (Gln) 5 10 7,307

Ácido y-Aminobutírico (GABA)

5 10 5,156

5-hidroxilisina HCl (HyLys) 5 10 9,9325

Ácido-aminobutírico o 2-aminobutanoico (AABA)

5 10 5,156

Ornitina HCl (Orn) 5 10 8,431


Triptofano (Trp) 5 10 10,2115

Preparación de la solución patrón de trabajo para medios de cultivo celular, volumen deseado:


250 1 000


Medios de cultivo celular, preparación de la solución patrón de trabajo:



Patrón H 100 100

HyPro 50 50

Asn 50 50

Tau 50 50

Gln 50 50

GABA 50 50

HyLys 50 50

AABA 50 50

Orn 50 50

Nva 50 50

Trp 50 50

Alimentos y piensos, preparación de la solución patrón de trabajo, volumen final:




400



7 Diagnosticar y corregir anomalías

Si se produce un error de funcionamiento, es necesario diagnosticar y corregir sistemáticamente las anomalías del sistema para aislar el problema.

Para diagnosticar y corregir anomalías específicas de los sistemas ACQUITY UPLC H-Class, ACQUITY UPLC H-Class Bio o del software Empower, consultar la documentación de estos productos.

Contenido:

Tema Página

Principios generales 7-2

Chromatography (Cromatografía) 7-3

Problemas de derivatización 7-12

7-1

Principios generales

Seguir estos principios generales para solucionar problemas de los sistemas de AAA ACQUITY UPLC H-Class y H-Class Bio.

• Definir detalladamente los problemas:

– Fallo del análisis completo

– Picos identificados incorrectamente

– Problemas cuantitativos (precisión o exactitud insuficientes)

• Analizar el patrón exactamente igual que durante la instalación:

– Utilizar una columna nueva y probada

– Utilizar diluyentes embotellados y probados

• Seguir estas directrices al evaluar el resultado del análisis de los patrones:

– Los tiempos de retención deben ser idénticos en la réplicas de inyección

– Los tiempos de retención deben coincidir con los especificados para el método

– Las áreas de los picos deben ser idénticas

– Las áreas de los picos deben coincidir con los resultados adquiridos durante la instalación

– Comparar las relaciones entre las áreas con el resultado obtenido durante la instalación

Advertencia: para evitar los efectos perjudiciales del contacto personal con eluyentes, incluyendo su inhalación, hay que seguir las buenas prácticas de laboratorio cuando se manipulen. Consultar las hojas de datos sobre seguridad de materiales referentes a los eluyentes que se van a utilizar.

Advertencia: para evitar la contaminación personal con materiales tóxicos o con riesgo biológico, es necesario utilizar siempre guantes limpios, sin talco, resistentes a compuestos químicos cuando se lleven a cabo procedimientos de mantenimiento. Para evitar extender la contaminación, evitar que los guantes contaminados toquen superficies no contaminadas y desechar los guantes inmediatamente después de terminar el procedimiento.

7-2 Diagnosticar y corregir anomalías

Chromatography (Cromatografía)

Antes de consultar las tablas de solución de problemas que aparecen a continuación, seguir estas directrices:

1. Registrar los tiempos de retención de los picos de los componentes clave: His, Ala, Phe, Arg, Gly, Cys y Lys.

2. Considerar las causas probables de un problema. Por ejemplo, que un módulo no responda puede deberse a que los cables de alimentación o de señales están desconectados o mal conectados. Una fuga de fluidos o de vacío puede indicar que hay tubos defectuosos o conexiones de válvulas defectuosas.

3. Buscar las causas menos evidentes de un problema:

• Confirmar que el horno para columnas funciona correctamente.

• Confirmar que la contrapresión del sistema es la adecuada.

• Determinar el caudal con ayuda de una probeta graduada.

• Determinar la exactitud del gradiente.

• Realizar una prueba de eficiencia de la columna, si está indicado

En las tablas siguientes se resumen los problemas cromatográficos y de retención más frecuentes.


Problemas cromatográficos:

Síntoma Posible causa Solución

Aumento del tiempo de retención de todos los picos

Gradiente incorrecto Consultar la tabla de gradientes.

Suministro bajo de un eluyente fuerte

Determinar el caudal y la composición del eluyente.

Baja temperatura de la columna

Confirmar el funcionamiento correcto del horno para columnas.

Suministro bajo de eluyente

Determinar el caudal.

Fugas Inspeccionar todas las conexiones.

Dilución incorrecta del eluyente B en la botella B

Determinar la dilución adecuada del eluyente B.

Aumento de los tiempos de retención de los picos que eluyen antes que la Cys

Temperatura de la columna demasiado baja

Confirmar el funcionamiento correcto del horno para columnas.

Disminución del tiempo de retención de todos los picos

Suministro excesivo de un eluyente fuerte

Confirmar el funcionamiento correcto de la bomba.

Temperatura de la columna demasiado alta

Confirmar el funcionamiento correcto del horno.

Baja reproducibilidad del tiempo de retención

Funcionamiento errático de la bomba

Determinar la contrapresión y cebar la bomba.

Todos los picos eluyen en el volumen muerto o cerca de éste

Se han cambiado los eluyentes

Corregir según sea necesario.


Todos los picos son polidispersos

Baja eficiencia de la columna

Determinar la idoneidad de la columna y sustituirla si es necesario.

Ensanchamiento de banda excesivo en el sistema

Diagnosticar y reducir el ensanchamiento de banda causado por el inyector, las conexiones de los tubos o la cubeta del detector.

Picos polidispersos en la primera mitad del cromatograma; la segunda mitad está bien

Baja eficiencia de la columna

Determinar la idoneidad de la columna y sustituirla si es necesario.

Ensanchamiento de banda excesivo en el sistema

Diagnosticar y reducir el ensanchamiento de banda causado por el inyector, las conexiones de los tubos o la cubeta del detector.

Volumen de inyección excesivo

Limitar las inyecciones a 1,0 L.

Equilibrado insuficiente de la columna

Utilizar el tiempo de adquisición del método especificado para realizar un equilibrado adicional.

Exceso de componente orgánico en la solución de muestra

Seguir el protocolo al pie de la letra.

División precoz de los picos (en particular el de His)

Volumen de inyección excesivo

Limitar las inyecciones a 1,0 L.

Problemas cromatográficos: (continuación)

Síntoma Posible Solución


Problemas cuantitativos

Consultar en el Apéndice C los comentarios detallados sobre la cantidad de muestra y otras directrices de derivatización.

Problemas cuantitativos:

Problema Posible solución o causa probable

El pH es demasiado bajo para la derivatización; solo reaccionan las aminas no protonadas

• El rendimiento de Asp, Glu, Lys y Ala es el que se ve más afectado

• Suele observarse un pico de lisina monoderivatizada entre la histidina y la serina

Exceso de reactivo insuficiente para la cantidad de muestra

• El pico de AMQ es más pequeño del que se observa con el patrón de 25 pmoles/µL



Degradación de los reactivos

• El pico de AMQ es igual que el que se observa con el patrón de 25 pmoles/µL



Problemas relacionados con una cantidad insuficiente de reactivo

• Errores de pipeteo• Mezcla inadecuada


Problemas relacionados con la hidrólisis ácida

• Descomposición del triptofano y la cisteína/cistina• Se espera una menor recuperación de tirosina,

treonina y serina debido a su descomposición parcial

• Menor recuperación de Ile y Val debido a liberación lenta

• Baja recuperación de Met debido a oxidación• Asn y Gln se hidrolizan a Asp y GluNota: muchos de los procedimientos de hidrólisis de aminoácidos que se describen en este documento se diseñaron principalmente para mejorar la recuperación de aminoácidos sensibles o difíciles de liberar. Ningún procedimiento proporciona resultados perfectos para todos los aminoácidos.

Problemas con la muestra

• Los aminoácidos no se encuentran completamente en solución

• Cálculo inexacto de la concentración de la muestra

Efectos cuantitativos del diluyente de la muestra, que generalmente se manifiestan como una mayor proporción o cantidad de picos de elución precoz, y una menor proporción o cantidad de los picos de elución tardía.

Determinar si se da cualquiera de las siguientes situaciones:• Si la concentración orgánica de la muestra

derivatizada es baja, los derivados más hidrófobos saldrán de la solución, reduciendo el tamaño de los picos del análisis. Esto ocurre cuando se añade muy poco reactivo.

• Si el diluyente de la muestra se evapora, disminuirá tanto el volumen como la concentración de acetonitrilo. Los picos de elución precoz serán más grandes, ya que se habrán concentrado por la evaporación. Los picos de elución tardía serán más pequeños, ya que se habrán precipitado al reducirse la concentración de acetonitrilo. La evaporación del diluyente se asocia a viales que no están herméticamente cerrados, al uso de septos preperforados o a la reinyección de un vial perforado al cabo de varias horas.

Problemas cuantitativos: (continuación)



Problemas de derivatización

Contaminación Cualquiera de los siguientes factores puede causar contaminación:• Entorno del laboratorio (los laboratorios pueden

ser una fuente abundante de aminoácidos y proteínas).

• Glicina, que puede proceder de muchas fuentes. • Serina, que es abundante principalmente en la

piel. • Aspartato y glutamato, que proceden del papel. • Prolina e hidroxiprolina, que proceden de la piel.

Problemas de derivatización y soluciones:


No aparece el pico del reactivo ni los picos de los aminoácidos

No se ha añadido reactivo Añadir reactivo y volver a inyectar.

No se realizó la inyección Diagnosticar y corregir anomalías del inyector automático y el inyector, y repararlos si es necesario.

Fallo del detector. Diagnosticar y corregir anomalías del detector, y repararlo si es necesario.

No aparece el pico del reactivo, pero sí los picos de los aminoácidos

Demasiada muestra Utilizar menos muestra.

Reactivo insuficiente Utilizar menos muestra.

Reactivo muy degradado Reconstituir reactivo nuevo.

Problemas cuantitativos: (continuación)



Valores bajos de Asp o Glu en las muestras, pico de reactivo <80% del pico de reactivo de un blanco derivatizado



Reactivo degradado Reconstituir reactivo nuevo.

División precoz de los picos (en particular el de His)

Exceso de reactivo Volver a preparar la muestra derivatizada, manteniendo una proporción de reactivo inferior al 20% de la composición final de la muestra.

Picos polidispersos en la primera mitad de la cromatografía; la segunda mitad es normal. Pico grande de AMQ presente.

Demasiado reactivo Volver a preparar la muestra derivatizada, manteniendo el reactivo en el 20% de la composición final de la muestra.

Picos de Lys monoderivatizada presentes, valores bajos de Lys, pico de reactivo <80% del pico de reactivo de un blanco de derivatización



Problemas de derivatización y soluciones: (continuación)



Picos de Lys monoderivatizada presentes, valores bajos de Lys, pico de reactivo >80% del pico de reactivo de un blanco de derivatización

Reactivo degradado Reconstituir reactivo nuevo.

Mezcla inadecuada Comprobar que el reactivo se mezcle bien con la muestra; agitar en vórtex inmediatamente después de la adición del reactivo.

Valores bajos de Arg, His o Lys en las muestras; el tamaño del pico del reactivo es normal

Reconstitución incorrecta de la muestra

Utilizar HCl 100 mM para las muestras y agitar bien en un mezclador vórtex.

Valores bajos de Asp o Glu en las muestras; el tamaño del pico del reactivo es normal

La muestra no está correctamente tamponada porque hay sales presentes

• Eliminar las sales de la muestra

• Limitar la cantidad de muestra presente

• Neutralizar como se describe en elApéndice C.

Exceso de HCl del paso de hidrólisis

Eliminar el HCl antes de la derivatización.




Derivatización insuficiente de la mayoría de los aminoácidos; la muestra se ve amarilla tras la adición del reactivo

La muestra no está correctamente tamponada porque hay sales presentes, pH ácido

• Eliminar las sales de la muestra o limitar la cantidad presente


Exceso de HCl del paso de hidrólisis

• Eliminar antes de la derivatización.


El agente de derivatización es demasiado viejo

Volver a preparar el AccQ•Tag Ultra siguiendo las instrucciones.




Problemas de derivatización

Reactivo insuficiente

Consultar las directrices para la derivatización en el Apéndice C. Un exceso apropiado de reactivo en una muestra debe producir un pico de AMQ con un área superior al 80% del pico de AMQ de un blanco de derivatización.

El efecto de la falta de reactivo es mayor para Asp, Glu y Lys. La Lys, que normalmente se derivatiza en dos posiciones (el grupo -amino y el grupo -amino de la cadena lateral) puede dar uno o los dos isómeros monoderivatizados posibles si hay poco reactivo o demasiada muestra. Estos monoderivados se manifiestan por la aparición de un pico entre la histidina y la serina.

Los problemas relacionados con una cantidad insuficiente de reactivo incluyen:

• Demasiada muestra.

• Errores de pipeteo.

• Reactivo degradado.

• Mezcla inadecuada.

Demasiada muestra

Consultar las directrices para la derivatización en el Apéndice C.

Errores de pipeteo

La dispensación de una cantidad insuficiente de reactivo tiene el mismo efecto que el uso de un exceso de muestra. El exceso de tampón reduce la concentración orgánica, ocasionando la precipitación de la mayoría de los derivados hidrófobos.

Reactivo degradado

El reactivo degradado puede producir un pico de reactivo AMQ de tamaño normal, pero el rendimiento de los aminoácidos puede ser bajo, y es posible que se observe uno o los dos picos de mono-Lys. La causa puede ser la hidrólisis del reactivo debido a una conservación inadecuada. Un reactivo muy degradado no produce ningún pico de AMQ.


Mezcla inadecuada

Mezclar cada muestra inmediatamente después de añadir el reactivo. No esperar hasta terminar de añadir el reactivo a todo el grupo de muestras. La mezcla inadecuada tras la adición del reactivo puede hacer que el reactivo se hidrolice antes de haber entrado en contacto con toda la solución de muestra.

Reconstitución de las muestras

Después de la hidrólisis, los aminoácidos básicos tienen una alta afinidad por el vidrio del tubo de la muestra. Para garantizar una buena recuperación, utilizar HCl 100 mM para reconstituir la muestra.

Soluciones tampón

El sistema de AAA ACQUITY UPLC H-Class es compatible con una amplia variedad de sales de tampón y detergentes de uso común. No obstante, la hidrólisis con HCl en presencia de ciertas sales produce ácidos no volátiles que no el tampón de derivatización no puede amortiguar correctamente.

Para garantizar una derivatización adecuada, el pH de la muestra debe estar entre 8,2 y 10. Si el pH es inferior a 6, la adición del reactivo puede producir un color amarillo y la derivatización será deficiente. Eliminar las sales de la muestra o aumentar la cantidad de solución tampón para superar la capacidad de amortiguación de los ácidos no volátiles.

• Si se aumenta el volumen de tampón, aumentar la cantidad de reactivo para mantener su concentración en el 20% (por volumen). El reactivo también se puede eliminar y destruir si el pH es demasiado elevado; por ejemplo, tras una hidrólisis alcalina. Seguir las directrices de neutralización que se describen en el Apéndice C.

Problemas de derivatización 7-13


A Consejos de seguridad

Los instrumentos de Waters muestran símbolos de peligro cuya finalidad es advertir al usuario de los peligros implícitos en relación con su funcionamiento y su mantenimiento. Estos símbolos aparecen también en las guías de funcionamiento correspondientes, acompañados de un texto que describe los riesgos y la manera de evitarlos. En este apéndice se describen todos los símbolos y advertencias de seguridad que se aplican a toda la línea de productos de Waters.

Contenido:

Tema Página

Símbolos de advertencia A-2

Aviso de precaución A-6

Advertencias que se aplican a todos los instrumentos de Waters A-6

Símbolos eléctricos y de manejo A-7

A-1

Símbolos de advertencia

Los símbolos de advertencia alertan del riesgo de muerte, lesiones o reacciones fisiológicas adversas y graves relacionadas con el uso correcto o indebido de un instrumento. Cuando se instale, se repare o se utilice un instrumento de Waters, se deben tener en cuenta todas las advertencias. Waters no asume ninguna responsabilidad por el incumplimiento de las precauciones de seguridad por parte de las personas que instalen, reparen o manipulen sus instrumentos.

Advertencias de peligro asociadas con tareas específicas

Los siguientes símbolos de advertencia avisan de los riesgos que se pueden producir durante el funcionamiento o el mantenimiento de un instrumento o componente. Estos riesgos incluyen quemaduras, descargas eléctricas, exposición a radiación ultravioleta y otros peligros.

Cuando estos símbolos aparecen en las descripciones o en los procedimientos de un manual, el texto adjunto identifica el riesgo específico y explica la manera de evitarlo.

Advertencia: (riesgo general de peligro. Si este símbolo aparece en un instrumento, se recomienda consultar la información importante sobre seguridad que se incluye en la documentación del usuario del instrumento antes de su utilización).

Advertencia: (riesgo de quemaduras producidas por contacto con superficies calientes).

Advertencia: (riesgo de descarga eléctrica).

Advertencia: (riesgo de incendio).

Advertencia: (riesgo de lesiones por objetos punzantes).

Advertencia: (riesgo de lesiones por aplastamiento de la mano).

Advertencia: (riesgo de exposición a radiación ultravioleta).

Advertencia: (riesgo de contacto con sustancias corrosivas).

A-2 Consejos de seguridad

Advertencias específicas

Las siguientes advertencias pueden aparecer en los manuales del usuario de determinados instrumentos, así como en las etiquetas de los instrumentos o de sus componentes.

Advertencia de reventón

Esta advertencia se aplica a los instrumentos de Waters con tubos no metálicos.

Advertencia: (riesgo de exposición a sustancias tóxicas).

Advertencia: (riesgo de exposición a radiación láser).

Advertencia: (riesgo de exposición a agentes biológicos que pueden suponer un grave peligro para la salud).

Advertencia: (riesgo de vuelco).

Advertencia: (riesgo de explosión).

Advertencia: los tubos no metálicos o de polímeros presurizados pueden reventar. Se recomienda tener en cuenta las precauciones siguientes cuando se trabaje cerca de estos tubos:• Utilizar protección ocular.• Apagar todas las llamas cercanas.• No utilizar tubos que se hayan doblado o sometido a tensiones.• No exponer los tubos no metálicos a compuestos incompatibles, como

tetrahidrofurano (THF), o los ácidos nítrico o sulfúrico.• Hay que tener en cuenta que el diclorometano y el sulfóxido de

dimetilo dilatan los tubos no metálicos, lo que reduce la presión de ruptura de los tubos.


Advertencia de eluyentes inflamables en el espectrómetro de masas

Esta advertencia se aplica a los instrumentos que se utilizan con eluyentes inflamables.

Peligro de descarga eléctrica del espectrómetro de masas

Esta advertencia se aplica a todos los espectrómetros de masas de Waters.

Esta advertencia se aplica a determinados instrumentos cuando están en funcionamiento.

Advertencia de peligro biológico

Esta advertencia se aplica a los instrumentos de Waters que se pueden utilizar para procesar materiales con posible riesgo biológico, como las sustancias que contienen agentes biológicos que pueden producir efectos nocivos en las personas.

Advertencia: cuando haya una cantidad importante de eluyentes inflamables, se requerirá un flujo continuo de nitrógeno en el interior de la fuente de ionización para evitar su posible ignición en este espacio cerrado.Es importante comprobar que la presión del suministro de nitrógeno no descienda nunca por debajo de los 690 kPa (6,9 bar, 100 psi) durante un análisis en el que se utilicen eluyentes inflamables. También es importante comprobar que haya una conexión de seguridad para el gas en el sistema de LC, con el fin de detener el flujo de eluyente de LC si falla el suministro de nitrógeno.

Advertencia: para evitar descargas eléctricas, se recomienda no retirar los paneles protectores del espectrómetro de masas. Estos paneles no cubren ningún componente que el usuario deba manipular.

Advertencia: puede haber voltajes altos en ciertas superficies externas del espectrómetro de masas cuando el instrumento está en funcionamiento. Para evitar una descarga eléctrica no mortal, asegurarse de que los instrumentos están en modo de espera antes de tocar cualquier pieza que tenga el símbolo de advertencia de alto voltaje.


Advertencia de peligro químico

Esta advertencia se aplica a los instrumentos de Waters que pueden procesar material corrosivo, tóxico, inflamable o cualquier otro tipo de material peligroso.

Advertencia: los instrumentos y el software de Waters se pueden utilizar para el análisis o procesamiento de productos de origen humano potencialmente infecciosos, microorganismos inactivados y otros materiales de origen biológico. Con el fin de evitar infecciones con estos agentes, se debe considerar que todos los líquidos biológicos son infecciosos, así como cumplir con las buenas prácticas de laboratorio, y consultar al responsable de seguridad biológica de la organización para obtener información sobre su uso y manipulación correctos. La última edición de la publicación Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) de los NIH (Institutos Nacionales de Salud) de Estados Unidos incluye precauciones específicas.

Advertencia: los instrumentos de Waters se pueden utilizar para analizar o procesar sustancias potencialmente peligrosas. Para evitar lesiones con cualquiera de estos materiales, el usuario debe familiarizarse con los materiales y sus riesgos, cumplir con las buenas prácticas de laboratorio (GLP), y consultar cualquier duda respecto a la utilización y la manipulación correctas de estos materiales al responsable de seguridad de la organización. La última edición de la publicación Prudent Practices in the Laboratory: Handling and Disposal of Chemicals, del Consejo Nacional de Investigación de Estados Unidos incluye indicaciones generales.


Aviso de precaución

Los avisos de precaución aparecen cuando un instrumento o dispositivo puede ser objeto de un uso o un uso indebido que pueda dañar el instrumento o afectar a la integridad de la muestra. El símbolo de admiración y el texto asociado alertan de este riesgo.

Advertencias que se aplican a todos los instrumentos de Waters

Al utilizar este dispositivo se deben seguir los procedimientos estándar de control de calidad y las indicaciones de uso del equipo detalladas en esta sección.

Precaución: para evitar dañar la cubierta del instrumento, no utilizar sustancias abrasivas ni disolventes para limpiarla.

Atención: todo cambio o modificación que se realice en este instrumento y que no cuente con la aprobación expresa del responsable de calidad y seguridad podrá anular la autorización del usuario para utilizar el equipo.

Advertencia: se recomienda precaución cuando se trabaje con tubos de polímero sometidos a presión:• El usuario deberá protegerse siempre los ojos cuando trabaje cerca de tubos

de polímero sometidos a presión.• Apagar todas las llamas cercanas.• No se debe trabajar con tubos que se hayan doblado o sometido a altas

presiones.• Es necesario utilizar tubos de metal cuando se trabaje con tetrahidrofurano

(THF) o ácidos nítrico o sulfúrico concentrados.• Hay que tener en cuenta que el diclorometano y el dimetilsulfóxido dilatan

los tubos no metálicos, lo que reduce su presión de ruptura.

Advertencia: si se utiliza este instrumento de forma distinta a la especificada por el fabricante, las medidas de protección que aquí se recomiendan podrían resultar insuficientes.


Símbolos eléctricos y de manejo

Símbolos eléctricos

Estos símbolos pueden aparecer en los manuales del usuario y en los paneles delantero o trasero de un instrumento.

Encendido

Apagado

En espera

Corriente continua

Corriente alterna

Terminal de protección del conductor

Terminal del chasis o armazón

Fusible

Símbolo de reciclaje: no desechar en los contenedores de residuos municipales.

Símbolos eléctricos y de manejo A-7

Símbolos de manejo

Los siguientes símbolos de manejo y su texto adjunto pueden aparecer en las etiquetas del embalaje exterior de un instrumento o componente de Waters.

Mantener en posición vertical

No mojar

Frágil

No utilizar ganchos


B Materiales de fabricación y eluyentes que cumplen la normativa

Advertencia: para evitar los riesgos asociados a un espectrómetro de masas con un sistema de evacuación de la fuente que no sea totalmente hermético al gas, solucionar de inmediato todos los problemas relacionados con el eluyente.

Contenido:

Tema Página

Prevenir la contaminación B-2

Elementos expuestos a eluyentes B-2

Eluyentes utilizados para preparar fases móviles B-3

B-1

Prevenir la contaminación

Para obtener información sobre cómo prevenir la contaminación, consultar Controlling Contamination in LC/MS Systems (Control de la contaminación en los sistemas LC/MS), n.º de referencia 715001307. Este documento se puede encontrar en http://www.waters.com; hacer clic en Services and Support (Servicios y soporte) y, a continuación, en Support Center (Centro de soporte).

Elementos expuestos a eluyentes

Los elementos que aparecen en la siguiente tabla pueden estar expuestos a eluyentes. Se deben evaluar los problemas de seguridad si los eluyentes que se utilizan en la aplicación son diferentes de los que se utilizan normalmente con estos elementos. Consultar la página B-3 para obtener información más detallada acerca de los componentes más frecuentes en la preparación de fases móviles.

Elementos expuestos a los eluyentes:

Elemento Material

Conjunto controlador de la lámpara APPI:

Eje de montaje Acero inoxidable

Electrodo repulsor Acero inoxidable

Aislante PEEK

Ventana de la lámpara Fluoruro de magnesio

Viales de ajuste automático HDPE

Contacto de montaje del electrodo de descarga en corona

PEEK

Conducto de salida de gases Aluminio

Tubos de gas FEP

Bloque de ionización Acero inoxidable

Soporte del bloque de ionización PEEK

Válvula de aislamiento Aluminio/bronce bañado en oro

Juntas tóricas Viton® o Viton con encapsulado de PTFE

B-2 Materiales de fabricación y eluyentes que cumplen la normativa

Eluyentes utilizados para preparar fases móviles

A continuación se detallan los componentes utilizados con más frecuencia en la preparación de fases móviles para LC/MS (API) de fase inversa:

• Agua

• Metanol

• Acetonitrilo

• Ácido fórmico (<0,1%)

• Ácido acético (<0,1%)

• Ácido trifluoroacético (<0,1%)

• Acetato de amonio (<10 mM)

• Formiato de amonio (<10 mM)

No se espera que estos eluyentes produzcan problemas con los materiales identificados en la página B-2.

Fuelles del regulador de la sonda PTFE/Viton

Regulador de la sonda Aluminio anodizado, acetal reforzado con fibra de vidrio y acero inoxidable

Eje de la sonda PEEK

Conectores de gas a presión Níquel/latón

Control de fugas/desecho de eluyente

Tubo de Tygon

Cubierta de la fuente Aluminio alocromado

Ventana de observación de la cubierta de la fuente

Cristal endurecido

Botella de desechos Polipropileno

Conectores a presión de la botella de desechos

NBR, SST, PBT y POM

Elementos expuestos a los eluyentes: (continuación)

Elemento Material

Eluyentes utilizados para preparar fases móviles B-3

B-4 Materiales de fabricación y eluyentes que cumplen la normativa

C Directrices para la derivatización

El reactivo de derivatización AccQ•Tag™ reacciona rápidamente, en milisegundos, con los grupos amino primarios y secundarios. Se pueden controlar sistemáticamente todos los factores relacionados con la reacción, excepto la contaminación.

Contenido:

Tema Página

Introducción C-2

Calcular la cantidad de muestra para la hidrólisis C-4

Calcular la cantidad de muestra para la derivatización C-7

Calcular la cantidad necesaria para la neutralización C-10

Confirmar que hay suficiente reactivo C-11

Términos del cálculo C-12

Ejemplos C-13

C-1

Introducción

En la planificación sistemática de los análisis de aminoácidos es particularmente importante la capacidad de disolver las muestras en una solución de aminoácidos que se pueda analizar. Para esto, es necesario determinar si la aplicación es para aminoácidos libres (es decir, libres en solución) o unidos (es decir, unidos en proteínas).

Las muestras de aminoácidos libres solo requieren, por lo general, un paso de dilución. En algunos casos, sin embargo, puede ser necesaria la desproteinización. Las muestras de aminoácidos unidos requieren la ruptura de los enlaces peptídicos para liberar los aminoácidos para su análisis. Para hidrolizar muestras de proteínas, hay que tener en cuenta en los cálculos tanto las soluciones tampón neutralizantes como los sólidos.

La hidrólisis ácida es el método que se utiliza con más frecuencia para la preparación de muestras de aminoácidos. Hay que calcular la cantidad de muestra y ácido que hay que añadir, teniendo en cuenta las directrices siguientes:

• Debe haber como mínimo 2 μg de proteína presente en la hidrólisis para minimizar los efectos de la contaminación.

• Hay que impedir que cualquier exceso de material sólido, sea proteico o no proteico, interfiera con el acceso a los enlaces peptídicos, ocasionando una hidrólisis incompleta. El método oficial para aminoácidos en piensos de la AOAC (994 12) recomienda aproximadamente 8 mg de sólidos en total por mL de ácido.

• La concentración neta de ácido en la hidrólisis debe ser de aproximadamente 6 N.

• El exceso de ácido (en peso) frente a la muestra en la hidrólisis líquida debe ser de 10 a 100 veces.

• Si hay tampones presentes en la muestra, debe haber un exceso molar de aproximadamente 25 veces de ácido frente a la cantidad valorable de tampón.

• Si además de proteínas hay otros sólidos presentes en la muestra, deben sumarse esos pesos al de la proteína para la concentración de sólidos por volumen de ácido.

• Es preferible añadir el patrón interno (NVa) antes de la hidrólisis. Puede añadirse durante la preparación de las muestras, si procede, o añadirse al ácido que se va a dispensar en los tubos de hidrólisis. Habitualmente,

C-2 Directrices para la derivatización

la cantidad de patrón interno se calcula de forma que coincida con la cantidad de patrón utilizada para la calibración.

• Es necesario añadir fenol al ácido que se utiliza para la hidrólisis, para secuestrar el oxígeno.

El reactivo de derivatización AccQ•Tag™ reacciona rápidamente, en milisegundos, con los grupos amino primarios y secundarios. El exceso de reactivo reacciona más lentamente con el agua, hidrolizando en décimas de segundos. Solo hay unas cuantas cosas que pueden ocurrir durante la derivatización y producir resultados inexactos en el análisis de aminoácidos:

a. El reactivo solo reacciona con las aminas no protonadas, por lo que el pH debe estar entre 8 y 10.

b. Debe haber un exceso de reactivo suficiente para que se complete la reacción de derivatización.

c. La concentración orgánica de la mezcla de derivatización debe ser lo suficientemente alta como para mantener al reactivo y los derivados en solución, pero no tan alta como para distorsionar la cromatografía.

d. El pH no debe ser tan bajo ni tan alto como para destruir el reactivo.

e. La concentración de aminoácido debe ser superior a los límites de sensibilidad requeridos.

f. La muestra no debe estar contaminada con aminoácidos, proteínas u otras aminas medioambientales.

El diseño de un análisis de aminoácidos consta de tres pasos.

Para diseñar un análisis de aminoácidos:

1. Calcular la cantidad mínima de una determinada muestra necesaria para una cuantificación adecuada, sin exceder los límites del método.

2. Calcular el requisito de neutralización.

3. Confirmar que haya suficiente reactivo presente.

Introducción C-3

Calcular la cantidad de muestra para la hidrólisis

A menos que la cantidad de muestra sea limitada, hidrolizar 20 μg de proteína. Esta cantidad garantiza, dentro de unos límites razonables, un enmascaramiento significativo de la contaminación ambiental y la ausencia de un exceso de material sólido en el tubo de 6 × 50 mm.

Las muestras deben someterse a hidrólisis en fase líquida o en fase de vapor. La hidrólisis en fase de vapor es el método preferido cuando se trabaja con cantidades pequeñas de proteínas puras. Sin embargo, no es un método adecuado para hidrolizar mezclas complejas, debido a los materiales sólidos adicionales que suele haber en este tipo de muestras.

Para calcular la cantidad de muestra para la hidrólisis:

1. Diluir las muestras si es necesario antes de hidrolizarlas, siguiendo estas directrices:

• Añadir 10 μL de muestra como mínimo al tubo de hidrólisis.

• No superar los 25 μg de proteína en la hidrólisis.

• En las hidrólisis líquidas, asegurarse de que haya un exceso de peso de ácido de aproximadamente 100 veces frente a los sólidos.

• Asegurarse de que haya un exceso molar de 25 veces de ácido frente a los tampones en la muestra. Multiplicar las moles de tampón fosfatos por 3, teniendo en cuenta los tres grupos valorables.

• El volumen total para la hidrólisis no debe superar el 50% de la capacidad total del tubo o del recipiente de hidrólisis. Para los tubos de 6 x 50 mm, el volumen máximo recomendado es de 100 μL.

2. Incluir los volúmenes de ácido y de patrón interno tal como se indica en el siguiente ejemplo. Añadir 10 μL de muestra como mínimo al tubo de hidrólisis. Para una solución de proteínas de 5 mg/mL en NaCl 150 mM, 10 μL de muestra requerirán 50 μL en el tubo de hidrólisis.

Ejemplo:

– La matriz de la muestra contiene otros sólidos.

5:1 diluciónμg5μL

μL20μg20

proteína de

m uestra dedeseadovolum en dedeseadaprote ína de

m uestra desólidos de total

m uestra muestra deproteína de

μLμg8 13

μmolesNaCldeμg 58,44

μLNaClde μmoles0,15

μL1μg5

de


3. Dispensar la muestra en el tubo de hidrólisis:

a. Dispensar el volumen necesario para hidrolizar y derivatizar aproximadamente 2 μg de proteína en el tubo de hidrólisis, o dispensar una cantidad mayor de muestra (hasta 25 μg de proteína) y reconstituir con un volumen suficiente de HCl 0,1 N para transferir aproximadamente 0,2 μg de proteína (de preferencia en 10 μL) a la derivatización.

b. Para la hidrólisis en fase de vapor, desecar la muestra como una fina película en el fondo del tubo.

Nota: el patrón interno se puede preparar y dispensar de distintas formas:

– Se puede preparar en la muestra (y dispensarlo con ella).

– Se puede preparar en el ácido (y dispensarlo con éste).

– Se puede añadir aparte de la muestra.

Ejemplo: para una solución de proteínas de 5 mg/mL en NaCl 150 mM, 10 μL de muestra requerirán 50 μL en el tubo de hidrólisis. La matriz de la muestra contiene otros sólidos.

4. Añadir el ácido a la hidrólisis:

• Fase de vapor:añadir 200 μL de HCl 6 N con un 0,1% – 0,5% de fenol al fondo del recipiente de hidrólisis.

• Fase líquida:

– Asegurarse de que la concentración final de ácido sea 6 N, con el fenol añadido.

– Asegurarse de que haya un exceso molar de ácido suficiente (de aproximadamente 25 veces) para neutralizar las soluciones tampón.

– Asegurarse de que haya un exceso de ácido suficiente (por peso) frente al total de sólidos (aproximadamente 100 veces). Incluir en este cálculo la matriz de la muestra y otros sólidos, además de la proteína.

sdispensadoμLISde pmoles1250

μL 20μL 100

μL 10μL 100

μLdepmol 25

sdispensado

reconst. hidrólisis de soluc. dereconst. hidrólisis de soluc. de

deriv. soluc. dedaderivatiza soluc. de

deseadoIS

dispenseddispensed mLNVamg0.146

mLμL10

pmol10mmol

NVammolNVamg117.15

μLNVapmoles1250 3

9 sdispensadomL

NVademg 0,146mLμL10

pmol10mmol

NVademmol NVademg 117,15

sdispensadoμLNVade pmoles250 1 3

9

Calcular la cantidad de muestra para la hidrólisis C-5

Ejemplo: para una proteína esto supone 2,1 mg/mL en Na/K2PO4 2 mM.

;

;

5. Realizar los procedimientos posteriores a la hidrólisis:

a. Centrifugar el hidrolizado si hay una gran cantidad de partículas o lípidos flotantes presentes.

Indicación: esto facilita la extracción de una alícuota de hidrolizado límpido.

b. Desecar y reconstituir las muestras antes de derivatizarlas para mejorar la cuantificación.

Indicación: esto elimina los cambios de volumen que puedan haber ocurrido durante la hidrólisis como resultado de la evaporación o de la condensación.

tubotampóndel ácido denmoles30

tubosdispensedo10μ0

sdispensadoμLnmoles6

valorables grupos3sdispensadoμLtampóndel ácido denmoles2

tuboHClμmol0,75

25tubo

tampóndel ácido denmol30

tampóndel ácidoel r neutraliza para necesariostubo

M 6HCl μL0,125HClμmol6

sdispensadoμLx

tuboHClμmol0,75

ssólido deμg24,9sdispensadoμL10)sdispensadoμL

POKμg0,17317sdispensadoμL

Naμg0,022992()

sdispensadoμLproteína deμg2,1

( 42

tuboHClμg490 2

100tubo

sólidos deμg24,9

ssólidolos sobre requiridotubo

M 6HCl μL11,4HClμmol6

μLHClμg36,46

HClμmoltubo

HClμg490 2


Calcular la cantidad de muestra para la derivatización

A continuación se incluyen algunas descripciones de concentraciones habituales de muestras:

• mg

• pmoles-nmoles-µmoles

• mg/mL

• pmoles-nmoles-µmoles/µL-mL;

• µM (micromolar, es decir, micromoles/litro)

• %

• mg%

La descripción típica de la sensibilidad del analizador de aminoácidos y el intervalo lineal es de pmoles en la columna.

Para calcular la cantidad de muestra para la derivatización:

1. Comenzar con las características conocidas del reactivo AccQ•Tag Ultra de Waters, siguiendo estas directrices:

– Asegurarse de que haya en la columna el límite de cuantificación (50 fmoles) de cualquier aminoácido. La cuantificación óptima se obtiene fácilmente con 1 pmol o más en la columna.

– El límite superior de cuantificación está definido por el detector y no por el exceso de reactivo.

– El volumen total de derivatización recomendado es de 100 µL.

– El volumen máximo de inyección es 1 µL.

– Un volumen de inyección de 20 ng de proteína en la columna es ideal.

2. Utilizar la concentración inicial de aminoácido (ya sea en el patrón o en la muestra) para determinar la cantidad total de aminoácido derivatizado. Las cantidades utilizadas para describir un cromatograma de análisis de aminoácidos se refieren a la cantidad de cada pico individual. Utilizar la siguiente tabla como guía:


3. Expresar la concentración de muestra en pmoles de aminoácidos, teniendo en cuenta las siguientes directrices de proporcionalidad:

– La concentración de la muestra es habitualmente la concentración de proteínas.

– La cantidad total de proteínas es la suma total de las cantidades de todos los aminoácidos.

– La hidrólisis de una proteína da 16 aminoácidos distintos.

– Dividir la cantidad total de proteína entre 16 para obtener la cantidad de cada aminoácido individual. Los aminoácidos nunca están presentes en cantidades iguales, por lo que habrá menos de 1/16 de la cantidad total en la muestra del aminoácido menos abundante. El aminoácido menos abundante es el que define el límite inferior de concentración.

– Si se conoce la composición de aminoácidos de una muestra específica, dividir el número de residuos del aminoácido menos abundante por el número total de residuos de aminoácidos. (Excluir de estos cálculos los aminoácidos lábiles triptófano, cisteína y metionina). Multiplicar la cantidad de proteína por este factor para calcular la cantidad del aminoácido menos abundante.

– En ausencia de otros datos, suponer que el aminoácido menos abundante constituye un 2-4% del total de aminoácidos. Multiplicar la cantidad de proteína por 0,03 para calcular la cantidad del aminoácido menos abundante.

Concentraciones de aminoácidos:

pmoles en la columna[pmoles/µL en la muestra derivatizada final]

pmoles derivatizados

Concentración inicial de la solución de aminoácidos[10 µL derivatizados]

0,05 5 0,5 pmoles/µL

0,50 50 5,0 pmoles/µL

1,00 100 10,0 pmoles/µL

10,00 1 000 100,0 pmoles/µL

25,00 2 500 250,0 pmoles/µL

50,00 5 000 500,0 pmoles/µL


4. Realizar un cálculo de la muestra, como se observa en el siguiente ejemplo.

Ejemplo: para una muestra con una concentración de proteína de 1,0 mg/mL en la que el aminoácido menos abundante tenga una concentración de 0,03 mg/mL, convertir el aminoácido en moles.

Nota: el peso molecular promedio de un residuo de aminoácido en una proteína es 110.

• Calcular el volumen final del aminoácido menos abundante de forma que haya 1 pmol en la columna. Dado que la inyección objetivo de patrón es de 1 µL del volumen total de 100 µL, tomar 100 pmoles del aminoácido menos abundante calculado.

• Debido a que puede resultar difícil pipetear 0,37 µL, diluir la muestra de una forma adecuada. Por ejemplo, es posible pipetear 10 µL con exactitud. Por tanto, dividir 10 µL (volumen deseado) entre 0,37 µL (volumen necesario) para determinar la dilución: en este caso, 27 veces. Después, pipetear con exactitud 5 µL de muestra y diluir con 27 veces de HCl 0,1 M, para poder pipetear con exactitud 10 µL en el vial de reacción.

Alternativa: en el cálculo anterior, una unidad de masa/volumen se convirtió en una cantidad molar/volumen. Para determinar el aminoácido menos abundante con otras unidades, seguir estas directrices:

– Utilizar pmoles/µL, nmoles/µL, mmoles/µL, µM/L cuando se conozca el peso molecular de la proteína y, por tanto, el número de aminoácidos. Un mol de proteína representa el número de moles de aminoácidos. Habitualmente, unos cientos de moles de aminoácidos forman un mol de proteína. Si se desconoce la proteína, suponer que tiene un peso molecular de 55 000 y 500 aminoácidos en total. El cálculo del peso molecular tendrá un error no superior a un factor de 3 (aproximadamente). Para una proteína desconocida, suponer también que el aminoácido menos abundante constituye aproximadamente un 3% del total.

pmoles/ μm 270μL 10

ml 1mg 10

gm 1molpmoles 10

AAgm101.1mol AA 1

mLmg 103

33

12

2

2

μL 0,37pmoles 270μL 1

pmoles 100


– Determinar el aminoácido menos abundante realizando el mismo cálculo que se describió en el ejemplo anterior. Tener en cuenta, sin embargo, que las unidades deben definirse con gran exactitud. El porcentaje se expresa habitualmente en gramos/100 gramos o en gramos/100 mL. El porcentaje de miligramos (mg%) es una medida inexacta que se observa con frecuencia en las descripciones de proteínas. Debido a que el peso molecular es tan elevado, la unidad se define habitualmente como mg/100 g.

Calcular la cantidad necesaria para la neutralización

La química de derivatización AccQ•Tag™ requiere aminas no protonadas con un pH de 8-10. Neutralizar las muestras de ácido asegurándose de que el pH se mantenga dentro del intervalo aceptable.

Consideraciones

Los siguientes principios son principios generales que pueden utilizarse para cualquier concentración de cualquier ácido. Es necesario, sin embargo, utilizar volúmenes iguales de concentraciones iguales.

Seguir estas directrices para calcular las cantidades necesarias para la neutralización:

• Si la solución de aminoácidos está disuelta en HCl 0,1 M, se pueden utilizar 10-20 µL de muestra en la mezcla de derivatización sin peligro de un pH bajo. Medir los reactivos para la derivatización utilizando una de las siguientes fórmulas:

– 10 µL de muestra:70 µL de borato: 20 µL de reactivo

– 20 µL de muestra:60 µL de borato:20 µL de reactivo

Asegurarse de no superar el reactivo disponible, tal como se describe a continuación:

• Si la solución de aminoácidos no está disuelta en HCl 0,1 M y la solución inicial tiene una concentración de ácido más elevada, neutralizar la solución con el mismo volumen de hidróxido de sodio de la misma concentración.

– La muestra puede neutralizarse durante el procedimiento de derivatización combinando estos reactivos en un vial de reacción.


Para esto, mezclar 10 µL de muestra en HCl 6 M, 10 µL de NaOH 6 M, 60 µL de borato y 20 µL de reactivo. También se puede neutralizar la mezcla a granel, aparte de la derivatización, combinando estos reactivos:500 µL de muestra en HCl 6 M mezclados con 500 µL de NaOH 6 M. Posteriormente, hay que medir los reactivos para la derivatización tal como se describió en el paso inicial de los requisitos para la neutralización.

Confirmar que hay suficiente reactivo

La química de derivatización AccQ•Tag es como cualquier reacción de derivatización. Debe haber más reactivo que grupos derivatizables. La cantidad típica es habitualmente un exceso molar de 2-5 veces de reactivo AccQ•Tag frente al total de aminas derivatizables.

Nota: el vial de reactivo AccQ•Tag estándar contiene 3-4 mg de reactivo, que equivalen aproximadamente a 10-14 µmoles de reactivo. El reactivo se disuelve en 1 mL de acetonitrilo y se emplean 20 µL por cada 100 µL de reacción de derivatización. Cada recipiente de reacción contiene, por tanto, 210-280 nmoles de reactivo de derivatización.

Para confirmar que hay suficiente reactivo:

1. Asegurarse de que no haya más de 40-140 nmoles de aminas en total en cada vial de reacción.

2. Calcular el total de aminas derivatizables determinando primero la cantidad de pmoles de cualquier aminoácido dado que hay en la columna, tal como se describe en la tabla “Concentraciones de aminoácidos:”. Hay 17 componentes derivatizables en el patrón y la inyección es de 1/100 de la cantidad derivatizada. Por tanto, hay que multiplicar por 1 700 para calcular el total de aminas derivatizables.

3. Asegurarse de que haya un exceso molar de reactivo de 2-5 veces frente a los grupos derivatizables. Un patrón de 25 pmoles tiene un total de 42,5 nmoles de aminas, lo que está claramente dentro de los límites del exceso de reactivo.

4. Calcular el exceso de reactivo necesario para una muestra de proteína, teniendo en consideración el peso de la muestra y el peso promedio de un aminoácido.

Confirmar que hay suficiente reactivo C-11

Ejemplo:

En este caso, el cálculo del mínimo necesario para la sensibilidad dio una estimación de aproximadamente 1/3 de µL de muestra, por lo que la cantidad total de aminas está claramente dentro de los límites de exceso de reactivo requerido.

Términos del cálculo

1 g = 103 mg = 106 µg

1 L = 103 mL = 106 µL

1 mol = 103 mmoles = 106 µmoles = 109 nmoles = 1012 pmoles

Cuando se trabaje con muestras de proteína de composición desconocida, seguir estas directrices para los cálculos de la muestra:

• Peso molecular promedio de una proteína =

• En promedio, una proteína tiene 500 aminoácidos.

• Peso molecular promedio de un aminoácido =

• Calcular un 3% de la cantidad total de proteína para determinar la cantidad del aminoácido menos abundante en la proteína.

• Las soluciones porcentuales representan g/100 g o g/100 mL

• Las soluciones mg% representan mg/100 g o mg/100 mL (se presupone una densidad de 1, si no se dispone de ella)

nmoles/ μm 9,1μL 10

ml 1mg10

gm 1molnmoles 10

gmAA 101,1mol AA 1

mLmg 1

33

9

2

l nmoles 3,3diluida sol. deμL 10diluida sol. deμL140conc. sol. deμL 5

stock μLnmoles 9,1

Lg enmolecular Peso

mol1

pLpmol1

nLnmol1

μLμmol1

mLmmol1

Lmol1

M 1 olución S

molg00055

molg 110


Ejemplos

Muestra de composición conocida y concentración en mg/mL

• 1,00 mg/mL de mioglobina en solución tampón

• Peso molecular 16 700

a Debido a la destrucción parcial o total durante la hidrólisis, no se considera el menos abundante para calcular el requisito de sensibilidad.

bDebido a la conversión a ácido glutámico y ácido aspártico durante la hidrólisis, sumar primero el ácido y la amida al identificar el menos abundante.

Formulaciones de soluciones tampón:

Formulación FW (mg/mL) (M)

Sacarosa 25

Cloruro sódico 58,44 0,15

Fosfato de sodio monobásico monohidrato

137,99 0,025

Fosfato de sodio dibásico anhidro

141,96 0,25

Tween 80 0,10

Residuos de aminoácidos de la mioglobina:

Ala 15 aCys 0 Asp 8 Glu 13

Phe 7 Gly 15 His 11 Ile 9

Lys 19 Leu 17 aMet 4 bAsn 2

Pro 4 bGln 6 Arg 2 Ser 5

Thr 7 Val 7 aTrp 0 Tyr 2

Ejemplos C-13

Cálculo de la cantidad de proteína para la hidrólisis

Para calcular la cantidad de proteína para la hidrólisis:

1. Calcular el total de sólidos en la muestra.

2. Calcular el total de sólidos en el tubo de hidrólisis.

3. Calcular la cantidad mínima de ácido necesaria para dispersar los sólidos.

4. Convertir el HCl mínimo necesario a una expresión molar.

5. Calcular la cantidad mínima de ácido necesaria para neutralizar los tampones.

muestra deμLNaClμg8,77

NaClμmolNaClμg58,44

muestra deμLNaClμmoles0,15

muestra deμLnformulació la de sólidos deμg33,87

muestra deμLsacarosa deμg25

muestra deμLTween deμg0,10

muestra deμLNaClμg8,77

muestra deμLtotales sólidos deμg34

muestra deμLnformulació la de sólidos deμg33,87

muestra deμL1mioglobina deμg1,00

totales sólidos deμg680μL20 deseado vol.muestra deμL

totales sólidos deμg34

HClμg6800ácido de exceso de10totales sólidos deμg680

HClμmoles186,5HCl36,46 μ6

HClμmolHClμg800 6

tampóndel ácido deμg103310PONaHμmol

PONaHμg137,99muestra deμL

PONaHμmoles0,025

42

4242

tampóndel ácido deμg106310NaHPOμmol

NaHPOμg141,96muestra deμL

NaHPOμmoles0,025

4

44


6. Convertir el HCl mínimo necesario a una expresión molar.

7. Calcular el volumen mínimo de ácido que hay que añadir a la hidrólisis.

Calcular la cantidad de muestra para la derivatización

Para calcular la cantidad de muestra para la derivatización:

1. Calcular el aminoácido menos abundante (LAAA) en la solución.

Ejemplo: arginina (Arg)

HClμg225 5ácido de exceso de25tampóndel ácido detotal μg209

HClμmoles143,3HCl36,46 μ6

HClμmolHClμg225 5

HClμL15,5

HClμLHClμmoles12

HClμmoles186,5

HCl6N~μL35,5muestra deμL20HCl12NμL15,5

1,34%100total en AAde residuos149

Argde residuuos2

muestra demL Argdemg0,0134

0,0134muestra demL

mg1,00

muestra deμL Argdepmoles 85,9

μL101ml

mg101gm

molpmoles10

Argdegm156,19 Argdemol1

muestra demL1 Argdemg101,34

33

122

tubo Argdepmoles718 1

tuboμL20

μL Argdepmoles85,9

tuboμL171,8

pmoles100μL10

tubopmoles 718 1

Ejemplos C-15

Indicaciones:

• El objetivo de 100 pmoles del aminoácido menos abundante es aproximado y puede aumentarse según corresponda para trabajar con cifras redondas.

• La adición de 100 μL de HCl 0,1 M sigue estando dentro del intervalo lineal de trabajo del método.

Consideraciones sobre el pH

Para resolver el pH final:

1. Calcular la concentración final de ácido de la dilución.

Indicaciones:

• Debido a que la concentración de ácido resultante es superior a HCl 0,1 M, es necesario añadir un volumen igual de NaOH 2,5 M a la mezcla de derivatización.

• Es razonable evaporar el hidrolizado a sequedad y después reconstituirlo con 100 μL de HCl 0,1 M.

• El volumen de borato debe ajustarse según corresponda. Por tanto, deben mezclarse 10 µL de muestra y 10 µL de NaOH 2,5 M con 60 µL de tampón borato antes de añadir el reactivo de derivatización.

Calcular el exceso de reactivo

Para calcular el exceso de reactivo:

1. Calcular el total de aminoácidos en el recipiente de reacción.

Resultado: 18 nmol está muy por debajo del límite de 140 nmol.

M2,46HCl oμL

HCl deμmoles2,46total disolución deμL100

HCl) deμmoles6HCl deμmoles(240total disolución deμL100

)μLμmoles0,1

(60μ6)μL

μmoles6(40μ4

nmoles18dilución deμL 10dilución deμL 100

conc. sol. deμL 20μL10

ml1mg10

gm1molnmoles10

AAde gm101,1 AAdemol 1

muestra demLmg 1,00

33

9

2


Ejemplo con una composición de muestra desconocida, concentración en mg/mL

Ejemplo: para una muestra con 11,2 mg de mAb/mL en NH4HCO3 50 mM

Cálculo de las cantidades para la hidrólisis

Para calcular las cantidades para la hidrólisis:

1. Calcular el total de sólidos en la muestra.

– Debido a que es difícil pipetear con exactitud 1,8 µL, diluir la muestra original a aproximadamente 1 mg/mL con HCl 0,1 M.

Cálcular la cantidad de muestra

Para calcular la cantidad de muestra:

1. Calcular el aminoácido menos abundante, a partir de la concentración de la muestra diluida.

μL1,8

muestra deμL1mAbμg11,2

objetivoμg20

mLmg0,03

0,03mL

mg1,0

L/LAAA depmoles 273μL10

1mlmg10

1gmmolpmoles10

gm110mol1

solución demL1LAAAmg0,03

33

12

tuboLAAA depmoles460 5

tuboμL20

μLLAAA depmoles273

tuboμL546

pmoles100μL10

tubopmoles5460

Ejemplos C-17

Indicaciones:

• El objetivo de 100 pmoles de LAAA es aproximado y puede aumentarse según corresponda para trabajar con números redondos.

• La adición de 500 μL de HCl 0,1 M sigue estando dentro del intervalo lineal de trabajo del método.




Indicaciones:

• Debido a que la concentración de ácido resultante es superior a HCl 0,1 M, es necesario realizar ajustes adicionales del pH antes de la derivatización. Añadir un volumen igual de NaOH 0,57 M.

• Es razonable evaporar el hidrolizado a sequedad y después reconstituirlo con 500 μL de HCl 0,1 M.

• El volumen de borato debe ajustarse según corresponda mediante la adición de NaOH. Por tanto, deben mezclarse 10 µL de muestra y 10 µL de NaOH 0,57 M con 60 µL de tampón borato antes de añadir el reactivo de derivatización.

Cálcular el exceso de reactivo



Resultado: 3,6 nmol está muy por debajo del límite de 140 nmol.

Los ejemplos restantes corresponden exclusivamente a cálculos para la derivatización.

M0,57HCl oμL

HCl deμmoles0.57total disolución deμL500

HCl) deμmoles46HCl deμmoles(240total disolución deμL500

)μLμmoles0,1

(460μ4)μL

μmoles6(40μ4

snmole3,6dilución deμL 10dilución deμL500

objetivoμL20μL10

ml1mg10

gm1molnmoles10

AAde gm101,1 AAde1mol

objetivomLmg1,0

33

9

2


Ejemplo con una composición de muestra desconocida, concentración en mg/tubo

Ejemplo: para una muestra con 1,2 mg de proteína por tubo



1. Calcular la proteína total por tubo.

2. Calcular el total de aminoácidos en la solución.

3. Calcular el LAAA en la solución.

4. Debido a que el volumen resultante es mayor de lo adecuado para diluir, utilizar una solución concentrada inicial con una concentración que pueda prepararse en un volumen de 1 000 µL.

tuboproteína denmoles21,8

molnmoles10

mg10

g1g 5000 5

moltubo

proteina demg 1,2 9

3

tuboAAnmoles900 10

proteínaAA500

tuboproteína denmoles21,8

tuboLAAA denmoles 327

0,03tubo

AAdenmoles900 10

tuboal añadir paraM 0,1HCl deμL 700 32pmoles10μL

nmolpmoles10

tubonmoles327 3

μLproteína depmoles21,8

nmolpmoles10

μL000 1proteína denmoles21,8 3

μL AAdepmoles900 10

proteínaAA500


μLLAAA depmoles 327

0,03μL

AAdepmoles900 10

Ejemplos C-19





Ejemplo con una composición de muestra desconocida, concentración en pmoles/tubo

Ejemplo: para una muestra con 28 pmoles de proteína por tubo





μL0,31pmoles327μL1

pmoles100 32x diluciónrequeridosμL0,31deseadosμL 10

conc. sol. ladiluir paraM 0,1HCl deμL 16032pipetear paraμL 5

snmole3,3dilución deμL 10dilución deμL 165

conc. sol. deμL 5μL10

ml1mg10

gm1molnmoles10

AAde gm101,1 AAde1mol

conc. sol. demLmg 1,

33

9

2

2

tubo AAdepmoles000 14

proteínaAA500

tuboproteína depmoles28

tuboLAAA depmoles 420

0,03tubo

AAdepmoles000 14

tuboal añadir paraM0,1HCl deμL42

μLdeseadospmoles10

LAAA depmoles420






Ejemplo con una composición de muestra desconocida, concentración en pmoles/µL

Ejemplo: para una muestra de 1 mL con 1,5 pmoles de proteína/µL en HCl 0,1 M





nmoles3,3proteína

AA50010μ0

pmoles10nmol1

μL42pmoles28

3

μL AAdepmoles750

proteínaAA500


μLLAAA depmoles 22,5

0,03μL

AAdepmoles750

μL4,44pmoles22,5μL1

pmoles100 2,25 diluciónrequeridoμL4,44deseadoμL 10

conc. sol. ladiluir para M 0,1 HCl deμL 22,5225pipetear paraμL 10

Ejemplos C-21





Ejemplo con una composición de muestra desconocida, concentración en µM

Ejemplo: para una muestra de 1 mL con una solución de proteína 4 µM en HCl 6 M




2. Calcular el aminoácido menos abundante en la solución.

nmoles2,3dilución deμL10proteína

AA500dilución deμL32,5

μL 10pmoles10nmol1


3

conc. sol. deconc. sol. de

μLproteína depmoles4

μmolpmoles10

μL10L1

Lμmoles4

μM46

6

μL AAdepmoles000 2

proteínaAA500

μLproteína depmoles4

μLLAAA depmoles 60

0,03μL

AAdepmoles000 2

μL1,67pmoles60μL1

pmoles100 x 6 diluciónrequeridoμL1,67deseadoμL 10

conc. sol. ladiluir para M 0,1 HCl deμL 606pipetear paraμL 10





Indicaciones:

• Debido a que la concentración de ácido resultante es superior a HCl 0,1 M, es necesario añadir un volumen igual de NaOH 1 M a la mezcla de derivatización.

• El volumen de borato debe ajustarse según corresponda. Por tanto, deben mezclarse 10 µL de muestra y 10 µL de NaOH 1 M con 60 µL de tampón borato antes de añadir el reactivo de derivatización.





Ejemplo con una composición de muestra desconocida, concentración en %

Ejemplo: para una muestra con una solución de proteína al 0,5% en HCl 1,5 M



1. Calcular el total de proteína en la solución.

M0,94HCl oμL

HCl deμmoles0,94total disolución deμL70

HCl) deμmoles6HClμmoles(60total disolución deμL70

)μLμmoles0,1

μL (60)μLμmoles 6

μL (10

nmoles2,9dilución deμL10proteína

AA500dilución deμL70

μL 10

pmoles10

nmol1μL

proteína depmoles43

conc. sol. de

conc. sol. de

mLproteinmg

gmg

mLg 510

1005.0%5.0

3

mLproteína demg5

gmg10

mL100g0,5

0,5%3

Ejemplos C-23





Indicación: debido a que la concentración de ácido resultante es aproximadamente equivalente a HCl 0,1 M, no es necesario ajustar con un volumen de base antes de la derivatización.





mLmg0,15

0,03mLmg5

LAAA/μA depmoles 364 1μL10

ml 1mg10

gm 1molpmoles10

gm110mol1

solución demL1LAAA demg0,15

33

12

μL 0,07pmoles 364 1μL 1

pmoles 100 136 diluciónrequeridoμL0,07deseadoμL 10

conc. sol. ladiluir para M 0,1 HCl depipetear para μL 680136μL 5

M0,11HCl oμL

HCl deμmoles0.11total disolución deμL685

HCl) deμmoles68HCl deμmoles(7,5total disolución deμL685

)μLμmoles0,1

μL (680)μLμmoles1,5

μL (5

nmoles3,3dilución deμL 10dilución deμL 685

μL 5μL10

ml1mg10

gm1molnmoles10

gmAA101,1 AAdemol 1

mLmg5

33

9

2

conc. sol. de

conc. sol. de


Ejemplo con una composición de muestra desconocida, concentración en mg%

Ejemplo: para una muestra con una solución de proteína de 36 mg% en NaOH 4 M.



1. Calcular el total de proteína en la solución.




La dilución de la muestra requiere 5 µL de NaOH 4 M, como puede observarse en el cálculo anterior.

1. Diluir la muestra con 50 µL de HCl 0,1 M.

Nota: 50 µL de HCl 0,1 M = 5 µL de HCl 1 M = 1,25 µL de HCl 4 M

2. Calcular la diferencia entre las cantidades de ácido y base.

5 µL de NaOH – 1,25 µL de HCl

mLproteína demg0,36

mL100mg36

%mg36

mLmg0,011

0,03mL

mg0,36

LAAA/ μA depmoles 100μL10

ml 1mg 10

gm 1molpmoles 10

gm110mol1

solución demL1LAAA demg0,011

33

12

μL 1pmoles 100μL 1

pmoles 100 10 diluciónrequeridoμL1

deseadoμL 10

conc. sol. ladiluir paraM 0,1HCl deμL 5010pipetear paraμL 5

Ejemplos C-25

3. La muestra contiene ahora un exceso equivalente a 3,75 µL de NaOH 4 M.

Indicaciones:

• Debido a que la concentración de base resultante es superior a NaOH 0,1 M, es necesario añadir un volumen igual de HCl 0,25 M a la mezcla de derivatización.

• El volumen de borato debe ajustarse según corresponda. Por tanto, deben mezclarse 10 µL de muestra y 10 µL de HCl 0,25 M con 60 µL de tampón borato antes de añadir el reactivo de derivatización.





M 0,27 NaOHtotal dilución deμL55

NaOHM4μL3,75

nmoles3,3dilución deμL 10dilución deμL 685

μL 5μL10

ml1mg 10

gm 1molnmoles 10

AAde gm 101,1 AAdemol 1

mLmg5

33

9

2

conc. sol. deconc. sol. de


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