Guia p. Bioquimica y Nutricion

BIOQUIMICA Y NUTRICION Página 1

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

GUIA DE PRÁCTICA

BIOQUÍMICA Y NUTRICION

III CICLO

SEMESTRE ACADÉMICO 2013-II


NORMAS PARA EL USO Y TRABAJO EN EL LABORATORIO

1. Realizar las prácticas de laboratorio con el debido interés y responsabilidad.

2. Presentarse vestido correctamente con su correspondiente guardapolvo y distintivo de la

Universidad.

3. Poner maletines y mochilas en el estante, llevar a las mesas solo lapiceros y cuadernos.

4. Está terminantemente prohibido beber o comer dentro del laboratorio.

5. Leer cuidadosamente la guía de práctica y tener en cuenta las indicaciones de los

profesores de práctica sobre el uso del material y equipos de laboratorio, así como el

orden, limpieza y seguridad que debe mantenerse.

6. Por cada práctica de laboratorio cada mesa de trabajo presentará un único informe, el cual

consta de las siguientes partes:

- Carátula.

- Objetivos.

- Marco Teórico.

- Desarrollo Experimental.

- Discusión de los resultados.

- Conclusiones.

- Cuestionario.

- Bibliografía

Dicho informe se presentará en la siguiente práctica en el horario y grupo

respectivo.

7. El inicio de la pràctica es en la hora exacta programada. Se tendrà una tolerancia de 10

minutos, luego de ese lapso de tiempo no se podrà ingresar al laboratorio, por lo tanto se le

considerarà como una inasistencia y no tendrà derecho a nota de informe de pràcticas.

8. Las inasistencias en las prácticas no son recuperables en ninguno de los grupos,

calificándose al alumno con nota cinco (05). Aquel alumno que acumule 30% de

inasistencias no tiene derecho a nota práctica.

9. Cada alumno será integrante de una mesa de trabajo, a la cual pertenecerá a lo largo del

semestre académico.

10. Por mesa de trabajo, será nombrado un responsable que se hará cargo del material y

equipos recibidos así como de la presentación de los informes.

11. En caso de daño, deterioro o pérdida del material y/o equipos, el responsable de mesa

informará del hecho al profesor de prácticas, TODO GRUPO ES RESPONSABLE DEL

DAÑO CAUSADO, y deberá repararlo a la brevedad posible, no más de una (01) semana

después del incidente.

12. Al final de la práctica, se procederá a limpiar el material usado, con el fin de entregarlo en

las mismas condiciones en las que fueron recibidos, caso contrario se le descontará un

punto en la nota de informe a todo el grupo.

13. Una vez limpio el material, el responsable de mesa lo devolverá a la persona encargada del

laboratorio.

14. El laboratorio deberá quedar completamente limpio, las mesas secas y limpias, debiendo

arrojar todos los desechos al tacho de basura.


PRACTICA No 1

ESPECTROFOTOMETRIA

GENERALIDADES:

Se denomina Análisis Colorimétrico al conjunto de métodos de análisis cuantitativos que se

fundamentan en la medición de la intensidad de la luz transmitida a través de una solución

coloreada, ya sea que se trate de sustancias naturalmente coloreadas ò que se han hecho de tal

calidad mediante reacciones químicas adecuadas.

Cuando una haz de luz (luz incidente, Io) atraviesa una solución, una parte de la radiación queda

absorbida por las moléculas del soluto coloreado, sufriendo una reducción de su intensidad (Luz

transmitida, It), proporcional a la capacidad de absorción de dichas moléculas.

Io It

Luz incidente Luz transmitida

Casi todas las sustancias en solución tienen la capacidad de absorber en forma selectiva

determinadas radiaciones luminosas unas más que otras dejándolas pasar. La longitud de onda en la

que las moléculas de dicha sustancia absorbe con mayor intensidad la luz, se denomina “longitud de

máxima absorción” o “lambda máximo”.

Si consideramos que cada molécula absorbe una determinada cantidad de luz, la intensidad de la luz

transmitida por una solución disminuirá en relación con el aumento del número de moléculas que se

interpongan entre la fuente luminosa y el observador. Este número varía de acuerdo con la

concentración del soluto y el espesor del recipiente que contiene la solución, estos factores estàn

considerados en la “Ley de Lambert y Beer”, que rige los principios de la colorimetría y cuyas

formas de expresión son:

Log (Io/It) = E. I. c = A = D.O.

Donde:

Io = Intensidad de la luz incidente.

It = Intensidad de la luz transmitida.

E = Coeficiente de extinción molar, valor constante dependiendo de la naturaleza de la

sustancia y de la longitud de onda

I = Espesor del recipiente en cm.

C = Concentración de la solución.

A = D.O. = Absorbancia (A) aumenta conforme disminuye la Tramitancia (T) y la relación entre

ambas es logarítmica.


CALCULO DE LA CONCENTRACIÓN DE UNA SOLUCION PROBLEMA:

Para calcular la concentración de una solución problema con el empleo de un fotocolorímetro,

existen dos formas:

- Método de la curva standard o curva de calibración.

- Factor de calibración.

a) CURVA STANDARD.- Este método consiste en utilizar varios standares de

concentraciones conocidas y progresivas para luego construir un gràfico en un sistema de

coordenadas en el que se colocan las lecturas en las ordenadas (Eje Y) y las

concentraciones en las abcisas (Eje X). En la recta obtenida (Función lineal), se puede

extrapolar la absorbancia o densidad óptica de la muestra problema, hallando la

concentración de la misma en el eje de las abcisas.

b) FACTOR DE CALIBRACIÓN.- (Fc), El factor de calibración es un término que se

relaciona con la concentración de una sustancia con su absorbancia, es decir la intensidad

que absorbe una sustancia de concentración conocida (Standard o Patrón).

A

sí tenemos:

Donde:

Fc = factor de calibración.

A = absorbancia del tubo standard.

[Standard ] = concentración del standard.

Con el factor de calibración se puede fácilmente determinar la concentración de una muestra

desconocida o problema (MP), conociendo su absorbancia.

Si la muestra problema y el standard son procesados de la misma manera (diluciones) se podrá usar

directamente la siguiente fórmula:

[ MP ] = A mp . Fc

Si la muestra problema sufre diluciones previas se encontrará el factor de dilución (Fd) que es

matemáticamente la inversa de la dilución (dil) y esta a su vez es:

Fc = [ Standard ] / A


Dil = Vol mp / Vol t

Dónde:

Vol mp = Volumen de la muestra problema tomada para hacer la dilución.

Vol t = Volumen total.

Para este segundo caso cuando se quiere saber la concentración de una muestra problema se

procederá usando la siguiente fórmula:

[ MP ] = A mp . Fc . Fd

Dónde:

A mp = Absorbancia de la muestra problema.

Fc = Factor de calibración.

Fd = Factor de dilución.

[ MP ] = Concentración de la muestra.

EXPERIMENTO

1. Preparar la siguiente batería de tubos:

Tubo I Tubo II Tubo III Tubo IV

Bicromato de potasio 1 ml 2 ml 3 ml 4 ml

Agua destilada 9 ml 8 ml 7 ml 6 ml

Concentración (mg %)

Solución stock: Bicromato de Potasio 40 mg%.

Calcular la concentración en mg% de bicromato de K en cada uno de los

tubos.

Leer las absorbancias de los cuatro tubos a 530 nm de longitud de onda (ג)

en el espectrofotómetro.

2. Con los datos obtenidos construir en un papel milimetrado la gráfica de absorbancia vs

concentración de bicromato de K .

3. Una vez obtenida la curva de calibración, medir la absorbancia de la muestra problema que

el profesor le hará entrega.

4. Obtener el factor de calibración (Fc) promedio con las soluciones standard utilizadas para

construir las curvas de calibración ajustadas.

5. Calcular la concentración de la muestra problema por los siguientes métodos:

- Gráficamente extrapolando su absorbancia en la curva de calibración.

- Analíticamente, multiplicando su absorbancia por el factor de calibración del standard.


CUESTIONARIO:

1.- Explique el mecanismo de funcionamiento de un espectrofotómetro.

2.- ¿Què diferencias existen entre un fotocolorímetro y un espectrofotómetro?.

3.- Grafique el espectro de luz, tanto en el rango visible como no visible con sus respectivas

longitudes de ondas.

4.- Qué relación matemática existe entre Absorbancia y Tramitación.

5.- Construya una curva de calibración con los siguientes valores:

Standard 1 Standard 2 Standard 3 Standard 4 Standard 5

Concentration 5 mg/dl 10 mg/dl 20 mg/dl 30 mg/dl 40 mg/dl

Absorbancia 0.025 0.050 0.100 0.150 0.200

Con la curva obtenida hallar la concentración de las siguientes muestras, sabiendo que sus

aborbancias fueron:

Muestra A........................0.015

Muestra B........................0.125

Muestra C........................0.350


PRACTICA No 2

LOS AMINOÁCIDOS Y LAS PROTEINAS COMO ELECTROLITOS:

SU CAPACIDAD AMORTIGUADORA EN EL ORGANISMO

HUMANO

FUNDAMENTO BIOQUIMICO:

Una propiedad importante de los aminoácidos, consecuencia del hecho de que todos ellos

tienen grupos carboxilo (-COOH) y grupos amino (-NH2) es su conducto como electrolitos.

Es costumbre considerar los grupos COOH como de naturaleza acìdica y los grupos NH2

como de carácter básico.

Hemos estudiado en las clases teóricas el comportamiento de los aminoácidos como iones

dipolares y la conducta de ellos durante su titulación con ácido y álcalis de modo que se

comportan como verdaderas sustancias tampones, amortiguadores ò buffers, para el

sostenimiento del pH del medio interno dentro de estrechos límites (7.35 a 7.45).

Explicamos también el comportamiento amortiguador del ion dipolar glicina al añadirle

iones H+ o al añadirle OH- impidiendo las variaciones bruscas del pH sanguíneo. La

representación de un aminoácido tal como la glicina por la fórmula NH2CH2COOH sugiere

que se trata de una sustancia en la que el grupo amino actúa como una base conjugada y el

grupo COOH como un ácido. Se ha observado, sin embargo, que esta formulación no es la

correcta del estado iónico de un aminoácido en solución acuosa. La verdadera

representación es aquella que dimos del ion dipolar (A) y que es la siguiente: (Estructura A)

H H

R C COO- R C COOH

Estructura (A) NH3 Estructura (B) NH2

Y que es la forma en la cual se encuentran en el torrente circulatorio, es decir, al pH

fisiológico (7.4) los grupos carboxilo existen como la base conjugada, esto es, como ión

carboxilato R-COO-; y al mismo pH, la mayoría de los grupos amínicos están

predominantemente en la forma protónica R-NH3+

La estructura (A) iónica es la prevalente en la sangre y en la mayoría de los tejidos. La

estructura (B) no puede existir a ningún pH. La conveniencia nos enseña sin embargo que

la estructura (B) se use por razones didácticas y para explicar la mayoría de las ecuaciones

que entrañan reacciones distintas a las de los equilibrios protónicos. La contribución más

importante a la conducta de una proteína como electrolito procede de los grupos ionizables

existentes en las cadenas laterales de los aminoácidos. La curva de titulación de una

proteína ò aminoácido con ácido ò álcali vendrá determinada en gran medida por el número

de cada uno de estos grupos ionizables de las cadenas laterales de sus unidades de

aminoácidos. Por estas razones las soluciones de proteínas tienen una poderosa capacidad

tampón.


Esta propiedad amortiguadora es de importancia decisiva en los sistemas biológicos y ha

sido estudiada con especial cuidado con relación a los amortiguadores de la sangre humana

cuyo pH es controlado dentro de estrechos límites, tal como les expliquè en la clase teórica.

Les dije que los valores de pH sanguíneo varían dentro de lo normal entre 7.35 a 7.45,

cuando la sangre alcanza valores por debajo de 7.35 se produce acidosis; y cuando los

valores de pH se elevan por encima de 7.45 se produce alcalosis. La sangre contiene otros

dos sistemas tampones que son:

1) El Sistema bicarbonato/Acido carbónico (pK: 6,1)

2) El sistema fosfato monosòdico/disòdico (pK: 6,8)

La proteína más importante de la sangre del ser humano es la Hemoglobina que tiene gran

capacidad tampón en la proximidad del pH 7.4, lo cual se debe a su elevado contenido de

histidina (grupo imidazol) Aproximadamente el 60% de la capacidad tampón de la sangre

total se debe a la Hb, y un 20% es atribuible a las proteínas del plasma (seroalbùminas y

globulinas).

Recordemos que según lo propuesto por Bronsted: un ácido es una sustancia que al

ionizarse genera iones Hidrógeno, H+, una base es toda sustancia capaz de aceptar estos

iones hidrógeno. Como los àcidos ceden protones y las bases los captan, a cada ácido le

corresponde, como es lógico, una base conjugada. Es decir, si un ácido cede un protón, el

ion, así formado, puede captarlo de nuevo comportándose como base. Por lo tanto, los

procesos de cesión ò captura de protones transcurren de forma reversible:

Cesiòn de protones

AH A- + H

+

Acido captación de protones Base

El ácido y la base conjugada forman un par ácido/base.

Las soluciones que contienen àcidos débiles y sus sales se llaman soluciones tampón,

buffers ò amortiguadores. Su finalidad es impedir ò amortiguar las bruscas variaciones del

pH.

El pH de una solución amortiguadora puede calcularse utilizando la ecuación de

Henderson-Haselbach:

SAL

pH = pK + log ------------

ACIDO

A partir de esta ecuación se deduce que el pH de una disolución tampón depende de la

naturaleza del àcido que la integra y de la proporción entre la sal y el àcido (logaritmo de la

relación entre ambos) y no de las concentraciones absolutas de cada uno de estos

componentes. La eficacia amortiguadora es máxima cuando el cociente de la relación

sal/àcido es próximo a la unidad.

El objetivo de la presente pràctica es demostrar la capacidad tampón de un sistema

amortiguador empleando un àcido débil y la sal del àcido débil y estudiar la curva de

titulaciòn ò valoración de un àcido débil HA, como el àcido acètico (0.1N) y una base

fuerte NaOH 0.1N y las variaciones del pH con respecto a diferentes proporciones relativas


entre la sal y el àcido de una solución tampón. (el pKa del àcido acètico es 4.76) antes de

agregar la base, el pH se debe solamente a la presencia del àcido. Pero tan pronto como se

añade algo de la base (NaOH 0.1N), ésta reacciona con una cantidad equivalente del àcido

y forma una cantidad equivalente de sal y agua. El àcido débil más su sal disuelta

constituyen una solución tampón (par amortiguador), cuyo pH puede calcularse mediante el

uso de la ecuación de H-H: pH = pK – log sal/àcido.

Se determinará el pH con el potenciómetro y se evaluarán los cambios en el pH con la

adición de volúmenes definidos de una base conocida (NaOH 0.1N).

Graficaremos en un sistema de coordenadas cartesianas los valores de pH vs los ml de base

agregados y obtendremos así la curva de titulaciòn para el àcido.

Se empleará el equipo potenciómetro para determinar el pH, instrumento que determina el

pH en función de la fuerza electromotriz (p de Nernst) de una celda formada por un

electrodo de referencia, la solución problema y un electrodo de vidrio muy sensible a los

hidrogeniones.

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS:

Potenciómetro.

Beakers de 50 ml de vidrio (11 para cada mesa de trabajo).

Baguetas de vidrio (3 por cada mesa).

Pipetas de 10 ml graduadas 1/10 (3 por cada mesa).

Agua destilada.

Solución de CH3-COOH 0.1N.

Solución de NaOH 0.1N.

Papel milimetrado ò cuadriculado.

PARTE EXPERIMENTAL:

Mezclar los volúmenes de CH3-COOH 0.1N y de NaOH 0.1N con agua destilada señalados

en la tabla siguiente, mezclar bien y luego medir el pH en cada uno de los 11 beakers con el

potenciómetro:

Beaker Nº Acido acètico

0.1 N (ml)

NaOH

0.1N (ml)

Agua destilada

(ml)

pH

1 20 0 20

2 20 2 18

3 20 4 16

4 20 6 14

5 20 8 12

6 20 10 10

7 20 12 8

8 20 14 6

9 20 16 4

10 20 18 2

11 20 20 0


En cada mesa los alumnos construirán su gráfica de valoración colocando en las

coordenadas los valores de pH en orden creciente y en el eje de las abscisas los volúmenes

de NaOH 0.1N añadidos en cada beaker.

pH

ml NaOH añadidos

CUESTIONARIO:

1.- Graficar la curva de valoración del àcido acètico 0.1N vs. NaOH 0.1N.

2.- Identificar el punto de semi-valoraciòn y máxima capacidad tampón.

3.- Explique que es un par tampón, como funciona y porqué las proteínas sanguíneas

son amortiguadores.

4.- Describa las principales sustancias amortiguadoras del organismo humano.


PRACTICA No 3

FACŢORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Los biocatalizadores específicos sintetizados por el organismo, llamados enzimas son proteínas que

intervienen en las reacciones biológicas, acelerando la velocidad de reacción hasta alcanzar su

punto de equilibrio. Las enzimas son sumamente específicas en las reacciones que catalizan y en los

compuestos (llamados sustratos) sobre los que actúan.

La cinética enzimática es el estudio del comportamiento de la velocidad en reacciones catalizadas

por enzimas. Las mediciones de la cinética proporcionan una herramienta bioquímica muy útil para

calcular la concentración de una enzima en una muestra biológica y comparar su actividad catalítica

con la de otras enzimas. Además, las mediciones cinéticas permiten describir de manera cuantitativa

el efecto de un veneno o medicamento sobre la actividad de una enzima.

La velocidad a la que procede una reacción enzimática está controlada en parte por las

concentraciones de la enzima y el sustrato. A medida que progresa la reacción, aumenta la

concentración de los productos a expensas de la desaparición de los correspondientes sustratos, en

tanto que la concentración de la enzima no se altere.

La actividad enzimática puede expresarse:

a) Por la desaparición del sustrato (S).

b) Por la aparición de productos (P).

c) Por modificación de cofactores (C).

El mecanismo de reacción enzima-sustrato puede simbolizarse así:

[E] + [S] [E] + [P]

C C'

Diversos factores modifican la actividad enzimática, tales como:

1) Concentración de sustrato [S]

2) Concentración de la enzima [E]

3) pH del medio

4) Influencia de la temperatura

5) Efecto de inhibidores y activadores

En la presente práctica estudiaremos el efecto de estos factores sobre la actividad enzimática de la

amilasa salival sobre el almidón.

La amilasa es una enzima que degrada moléculas hidrocarbonadas complejas en componentes más

pequeños, tiene un PM de 40,000 a 50,000 daltons. Es producida por el páncreas exocrino y las

glándulas salivales para ayudar a digerir el almidón. La amilasa humana se denomina “alfa-amilasa”

por su capacidad para romper los enlaces polisacáridos alfa-1,4 al azar. Los enlaces alfa-1,6 de los

puntos de ramificación no se alteran. El producto final de la acción de la alfa-amilasa sobre el

almidón es la formación de dextrinas, maltosas y algunas moléculas de glucosa. El ph óptimo al

cual actúa es 6.9 a 7 y se requiere cloro para su activación.

En la práctica la actividad enzimática se medirá por la desaparición del sustrato (disminución de la

turbidez en los tubos que contienen almidón), la cual se determinará en el espectrofotómetro a 650

nm.


EXPERIMENTO A

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA, DE LA TEMPERATURA Y DEL

ION CLORO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL

1) Preparar los siguientes tubos:

Tubos No. I II III IV V VI

Solución almidón 1% 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Buffer fosfato pH 6.6 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml

Solución salina (NaCl 1%) 2.8 ml 2.6 ml 2.4 ml 2.2 ml --- 2.2 ml

Agua destilada --- --- --- --- 2.2 ml ---

2) Colocar los tubos I al V en un baño de agua a 37°C, durante 5 minutos. El tubo VI servirá

de comparación para ver el efecto de la temperatura sobre la acción enzimática por lo que

se deja a temperatura ambiente.

3) Agregar la solución de enzima:


Solución amilasa 0.4 ml 0.8 ml 1.2 ml 1.6 ml 1.6 ml 1.6 ml

4) Colocar nuevamente los tubos I al V en baño de agua a 37°C durante 20 minutos, el tubo

VI se mantiene a temperatura ambiente.

5) Luego hacer el control final de la reacción con el reactivo de yodo, de la siguiente manera:


HCl 0.05 N 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml

de los tubos de reacción

correspondientes agregar

0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

Solución yodada 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

6) Mezclar y dejar en reposo por 10 minutos.

7) Leer las absorbancias al espectrofotómetro a 650 nm.

8) La diferencia de las absorbancias entre los tubos nos indicará la actividad enzimática para

cada tubo.

9) Graficar en papel milimetrado: Actividad enzimática en el eje Y vs concentración de la

enzima [E] en el eje X.


EXPERIMENTO B

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA

AMILASA SALIVAL


Tubos No. I II III IV V

Solución de almidón 1% 1 ml 2 ml 3 ml 4 ml 5 ml

Buffer fosfato pH 6.6 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

Solución salina (NaCl 1%) 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

Agua destilada 5 ml 4 ml 3 ml 2 ml 1 ml

2) Mezclar bien los tubos. Hacer un control con la solución yodada con todos los cinco tubos

de la misma manera que se hizo en el experimento anterior y leer las absorbancias de

dichos controles a 650 nm. Dichas absorbancias se tomarán como lecturas iniciales.

3) Luego añadir 1 ml de solución de enzima a cada tubo y colocarlos en el baño de agua a

37°C por 20 minutos.

4) Sacar los tubos y hacer un control con solución yodada de cada uno. Las lecturas de

absorbancia se tomarán ahora como lecturas finales.

5) Hacer la diferencia:

Actividad enzimática = Lectura inicial – Lectura final

El resultado de esta diferencia se considerará como actividad enzimática.

6) Determinar el Km experimental de la amilasa para el almidón a partir de una gráfica de

actividad enzimática contra [S] (Ecuación de Michaelis-Menten) y una gráfica de dobles

inversas: 1/actividad enzimática contra 1/[S] (Ecuación de Lineweaver-Burk). Graficar en

papel milimetrado.


EXPERIMENTO C

EFECTO DEL PH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL


Tubos No. I II III

Solución de almidón 1% 5 ml 5 ml 5 ml

Solución salina (NaCl 1%) 2 ml 2 ml 2 ml

Buffer fosfato pH 6.6 2 ml --- ---

Buffer fosfato pH 3.7 --- 2 ml ---

Buffer fosfato pH 8.0 --- --- 2 ml

2) Mezclar y colocar los tubos en baño de agua a 37°C por 5 minutos.

3) Añadir a cada tubo 2 ml de solución de enzima (amilasa).

4) Colocar nuevamente los tubos a 37°C por 20 minutos.

5) Extraer los tubos del baño y realizar el control mediante la solución yodada, como en el

experimento anterior.

6) Realizar el estudio crítico comparativo de ellos. Sacar conclusiones.

7) Graficar en papel milimetrado una curva de actividad enzimática vs pH.

CUESTIONARIO:

1.- Cuál es la importancia del Km.

2.- Qué efectos produce las altas temperaturas sobre las enzimas.

3.- Como se clasifican las enzimas?

4.- A que se llaman zimògenos e isoenzimas.

5.- Que son cofactores y mencione ejemplos.


PRACTICA No 4

EVALUACIÓN NUTRICIONAL BIOQUÍMICA Y

ANTROPOMETRICA

La evaluación nutricional es parte de la evaluación integral del estado de salud de un individuo. Es

un requisito indispensable siempre que se desea mejorar, promover o mantener un buen rendimiento

físico, un buen estado de salud y nutrición, además de dar una idea más exacta del nivel de

rendimiento que se tiene y que se puede alcanzar.

El objetivo general de la práctica es determinar el estado nutricional mediante un diagnóstico que

permita conocer el nivel nutricional actual y anterior, y los posibles factores socioalimentarios,

económicos y de composición corporal, que puedan afectar la participación y rendimiento de una

persona.

Otros objetivos de realizar esta evaluación son:

Detectar déficit de nutrientes específicos, riesgo de desnutrición o sobrepeso.

Brindar educación nutricional

Seleccionar personas de acuerdo a la composición corporal, orientar el trabajo físico y/o

reubicar al niño en una actividad física determinada

ESTADO NUTRICIONAL: Es la condición de salud resultante en el tiempo, del balance entre lo

consumido y lo requerido. Está determinado por la calidad y cantidad de los nutrientes consumidos

y por la utilización de estos en el organismo.

EVALUACIÓN NUTRICIONAL: Conjunto de datos antropométricos, dietarios, bioquímicos y

clínicos, que correlacionados entre sí, permiten dar un diagnóstico nutricional y por tanto orientar el

tratamiento o manejo nutricional. Una evaluación completa debe incluir:

1. Evaluación antropométrica: Estudio de la forma y composición corporal.

Determina y compara los diferentes componentes (hueso, músculo, grasa y residuo)

Analiza según patrones ideales o establecidos (edad, sexo, deporte, nivel de rendimiento)

Indispensable para intervenir en procesos de crecimiento, actividad física y estado

nutricional.

- Parámetros incluidos:

Talla actual, talla/edad,

Peso actual, peso usual, peso esperado, peso/talla (Ref. NCHS, Metropolitan life)

Circunferencias (Volumen muscular)

Diámetros (estructura ósea)

Pliegues (% grasa)

2. Evaluación bioquímica: Permite conocer los niveles sanguíneos de los parámetros bioquímicos,

indicadores del estado nutricional.

Confirma datos clínicos y dietarios

Susceptible a variaciones en la interpretación según edad, sexo, factores hereditarios o

consumo inmediato de alimentos.



Cuadro hemático (hemoglobina, hematocrito, leucocitos y linfocitos)

Proteínas totales y diferenciales (albúmina / globulinas)

Trasferrína y Ferritina

Glicemia y Perfil de lípidos

3. Evaluación Clínica: Basada en la evaluación médica.

Observa y analiza signos y síntomas clínicos que puedan indicar deficiencias nutricionales:


Sueño, fatiga, aspecto físico, piel, cabello, uñas, labios.

Apetito / hambre

Cambios de peso

Frecuencia cardiaca

Cicatrización

Lesiones frecuentes

Tiempo de recuperación de las lesiones

Comportamiento del deportista

4. Evaluación dietaría: Analiza cualitativa y cuantitativamente el consumo dietario actual,

comparándolo con la recomendación para la edad, sexo y gasto energético.

Permite orientar, prescribir, calcular y diseñar un plan alimentario adecuado, ajustado a las

necesidades nutricionales y calóricas, condición socioeconómica y hábitos del deportista.


Encuesta nutricional:

- Historia socioalimentaria

- Anamnesis alimentaria

- Conductas alimentarias

- Frecuencia de consumo de alimentos

- Antecedentes personales y familiares

Evaluación cualitativa

- Número de porciones diarias por grupos de alimentos

Evaluación cuantitativa

Cantidad de kcal y nutrientes (grs promedio) consumidos, promedio / día.

Determinación de la recomendación calórica y de nutrientes

- Comparar con el consumo para determinar excesos o déficit y diseñar fórmula dietaría

prescrita.


EXPERIMENTO “A”

DETERMINACIÓN DE PROTEINAS Y ALBÚMINA EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO:

Los enlaces peptìdicos de las proteínas reaccionan en un medio alcalino con el ion cúprico del

reactivo de Biuret, estabilizado por tartrato, para formar un complejo de color violeta cuya máxima

absorción se da a 540 nm.

NaOH

Cobre + proteína Complejo cupro-proteico

El dosaje de proteínas totales tiene poco valor como prueba aislada porque la alteración en una de

las fracciones puede ser balanceada por una alteración opuesta de otra fracción. Por lo tanto, es

importante que adicionalmente se determine la concentración de albúmina.

La albúmina también va a ser dosada por el método de Biuret, pero previamente al suero se le hace

un tratamiento con sulfato de sodio y eter etílico para lograr la separación de las globulinas y

permitir solo el dosaje de albúminas.

REACTIVOS:

1.- Reactivo para proteínas (Biuret):

Solución de sulfato de cobre, hidróxido de sodio y tartrato.

2.- Solución de sulfato de sodio al 22.6%.

3.- Eter etílico.

4.- Standard de proteínas:

Solución patrón calibrada y estabilizada equivalente a 10.4 g/dl de proteínas.

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEINAS EN SUERO: Preparar tres tubos y agregar en cada uno lo siguiente:

Blanco

(ml)

Standard (ml) Muestra

(ml)

Suero diluido 1/20 --- --- 1

Standard --- 1 ---

Reactivo Biuret 4 4 4

Agua destilada 1 --- ---

Mezclar y esperar 30 minutos.

Leer las absorbancias a una longitud de onda de 540 nm.

CALCULOS: Calcular la concentración de proteínas (en g/dl), utilizando el método del Factor de

Calibración.

La lectura del tubo blanco debe ser restada de la lectura de los tubos muestra y standard para

obtener una absorbancia neta, sin la intervención del color propio del reactivo.


PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE ALBÚMINA EN SUERO: Preparar un tubo de la siguiente manera:

- Suero sanguíneo.................................0.3 ml.

- Colocar 5 minutos al baño maría a 37ºC.

- Solución de sulfato de sodio................5.7 ml.

- Mezclar. Eter etílico............................4.0 ml.

- Mezclar. Tapar el tubo y centrifugar.

Inclinando el tubo, extraer con una pipeta el suero tratado que se aprecia como un líquido claro

que queda debajo del precipitado.

Blanco

(ml)

Standard (ml) Muestra (ml)

Suero tratado --- --- 1

Standard --- 1 ---

Reactivo Biuret 4 4 4

Sulfato de sodio 1 --- ---

Mezclar y esperar 30 minutos.

Leer las absorbancias a una longitud de onda de 540 nm.

CALCULOS: Calcular la concentración de albúmina (en g/dl) utilizando el método del Factor de

Calibración, en forma similar que para el caso de las proteínas totales.

VALORES NORMALES:

Proteínas: 6.0 – 8.0 g/dl.

Albúmina: 3.5 – 5.5 g/dl.

CUESTIONARIO.-

1.- Qué diferencias hay entre desnutrición y malnutrición?

2.- Describa todos los tipos de proteínas plasmáticas y cuáles son sus funciones.

3.- Cuáles son los tipos de desnutrición que existen y como se valoran?

4.- Que sòn la transferrina, prealbùmina y proteína transportadora de retinol y cual es su

rol en la valoración del estado nutricional?

5.- Qué es el índice de Masa Corporal, como se halla y cual es su interpretación?


PRACTICA No 5

DETERMINACIÓN DE LA GLICEMIA, INVESTIGACIÓN

DE GLUCOSURIA

El mantenimiento de la glicemia, o concentración plasmática de glucosa, en los organismos

superiores es fundamental para el funcionamiento de todos los órganos, al ser la glucosa un

metabolito energético principal. La coordinación de los procesos metabólicos implicados en

este cometido se lleva a cabo por la relación insulina/glucagón. La ingestión de glucosa o

sustancias que la produzcan (almidón, fructosa, galactosa, proteínas, pero no grasas) va

seguida, en las personas sanas, por un aumento de la glucosa en sangre. Este aumento

origina la puesta en marcha del mecanismo regulador: aumento de la utilización de glucosa

(por glucólisis, entre otras), aceleración de la glucogenogénesis y disminución de la

glucogenólisis; todo ello ocurre principalmente mediante la secreción de insulina, una

hormona pancreática de tipo polipeptídico. En el caso de que la producción de insulina esté

disminuida, la glucosa no puede ser utilizada por las células, lo cual ocasiona niveles

elevados de glucosa en sangre (hiperglicemia); así ocurre en las personas que sufren

diabetes del tipo denominado "dependiente de insulina" o "tipo I".

El diagnóstico de la diabetes dependiente de insulina es sencillo y se basa en antecedentes,

síntomas clínicos y comprobación de una hiperglicemia significativa.


Experimento A:

DETERMINACIÓN DIRECTA DE LA GLICEMIA

(concentración de glucosa en suero)

FUNDAMENTO TEÓRICO

Como se ha indicado, la diabetes dependiente de insulina cursa con un aumento de la

concentración de glucosa en sangre (glicemia), que se produce de manera repentina y además es

severa. Una hiperglicemia superior a 124 mg/dL detectada en más de una ocasión en ayunas,

además se considera también un valor mayor a 200 mg/dl en cualquier momento son indicativos de

posible diabetes, diagnóstico que debe confirmarse con otras pruebas.

La determinación de glucosa sanguínea es una prueba muy frecuente en bioquímica y se puede

llevar a cabo tanto por métodos químicos como enzimáticos, siendo estos últimos los más

específicos.

Hay dos tipos de métodos químicos:

1. Reducimétricos, que se basan en la capacidad reductora de la glucosa. Debido a la presencia

en la muestra de otros compuestos reductores, estos métodos dan cifras superiores a las

correspondientes a la glucosa verdadera. Ejemplos son el método de Folin-Wu y el de

Somogy-Nelson.

2. Furfurálicos: se basan en la capacidad de la glucosa para formar furfural al sufrir

deshidratación en un medio ácido. Un ejemplo es el método que emplea orto-toluidina.

En cuanto a los métodos enzimáticos:

a. Método de la hexoquinasa: emplea las enzimas hexoquinasa y glucosa-6-fosfato

deshidrogenasa. Por cada molécula de glucosa se forma una de NADPH, que puede medirse

espectrofotométricamente a 340 nm. Es el método de referencia recomendado por las

organizaciones internacionales.

b. Método de glucosa oxidasa y peroxidasa (GOD-POD): es el que se utiliza en esta práctica

para medir los niveles de glucosa sanguínea de la muestra problema y de los standares. Se

explica a continuación:

En el método GOD-POD, en un primer paso la glucosa oxidasa cataliza la oxidación de la D-

glucosa a ácido D-glucónico con formación de peróxido de hidrógeno. Éste es utilizado por la

peroxidasa para oxidar a la 4-aminofenazona y al fenol, dando lugar a una quinonaimina coloreada.

La intensidad de color será proporcional a la concentración de glucosa presente inicialmente. El

esquema de la reacción es el siguiente:


MATERIALES Y REACTIVOS

Tubos de ensayo de 10 ml.

Pipetas.

Espectrofotómetro.

Agua destilada.

Solución patrón de glucosa (100 mg/dl).

Reactivo de color de glucosa, que contiene: Glucosa oxidasa, peroxidasa, 4-aminofenazona,

fenol, tampón fosfato pH: 7.0

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

La muestra de sangre extraída del paciente será centrifugada y se separará el suero. Hacer una

dilución del suero midiendo exactamente en un tubo de ensayo 0.2 ml de suero y agregar 4.8 ml de

agua destilada, mezclar hasta homogenizar. Luego se preparan los siguientes tubos:

Tubos: Blanco Standard Muestra

Suero diluido (ml) --- --- 1

Estándar de glucosa (ml) --- 1 ---

Reactivo de glucosa (ml) 3 3 3

Incubar los tres tubos en Baño María de 37ºC por 15 minutos. Luego de retirar del Baño María,

agregar:

Agua destilada (ml) 2 1 1

Mezclar bien la solución. Leer las absorbancias para cada una de las muestras en el

espectrofotómetro a 520 nm.


CALCULOS

Encontrar la concentración de glucosa en la muestra utilizando el método del factor de calibración.

VALORES NORMALES

La glicemia normal en ayunas es de 70 a 110 mg/dl.

Para el diagnóstico de diabetes se considera un valor mayor de glicemia en ayunas de 124 mg/dl ò

mayor de 200 mg/dl en cualquier momento. Los pacientes cuyos niveles de glucosa se encuentren

entre lo normal y lo diabético, son clasificados en una categoría denominada “tolerancia alterada a

la glucosa” y requieren observación y pruebas confirmatorias.


Experimento B:

INVESTIGACIÓN CUALITATIVA DE GLUCOSA EN ORINA

FUNDAMENTO TEORICO

En estado normal no existen cantidades detectables de glucosa en orina, por lo menos con los

métodos habitualmente utilizados en el laboratorio. La glucosuria (presencia de glucosa en orina) se

presenta en la diabetes mellitus pero cuando se supera el umbral renal de glucosa que ocurre cuando

la glicemia es mayor de 180 mg/dl.

Para la detección cualitativa de glucosa en orina se basa en la acción de la glucosa, que reduce las

sales de cobre en medio alcalino por ebullición. Para ello utilizaremos el reactivo de Benedict el

cual contiene: sulfato de cobre, citrato de sodio y carbonato de sodio.



Pipetas.

Mechero de Bunsen.

Reactivo de Benedict.

Pinzas porta tubos.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Tubos: I II

Orina normal (gotas) VIII ---

Orina DM (gotas) --- VIII

Reactivo de Benedict (ml) 5 5

Calentar directamente a la llama de un mechero durante 2 minutos y se deja enfriar. Si la orina

contiene glucosa, se observa un precipitado color verde, amarillo ò rojo ladrillo dependiendo de la

cantidad en que se halle presente. De ser negativa la reacción permanecerá de color azul.

CUESTIONARIO: 1.- ¿Qué es la diabetes mellitus y como se diagnostica desde el punto de vista del laboratorio?

2.- Explique en que consiste el umbral renal y la tasa de reabsorción de la glucosa.

3.- Describa los métodos que existen para el dosaje de la glicemia.

4.- Explique el mecanismo de acción de los reactivos de Benedict y de Fehling.

5.- Que son la hemoglobina glicosilada y la fructosamina y cuál es su importancia en la diabetes?


PRACTICA No 6

TEST DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA Y GLUCOSA

POST PRANDIAL

Definición de DM

La diabetes mellitus es un grupo de enfermedades metabólicas caracterizadas por la presencia de

hiperglicemia resultante de un defecto en la secreción de insulina, en la acción insulínica, o en

ambas.

Clasificación de DM

Diagnóstico

Es muy importante el diagnóstico temprano de la enfermedad debido a que niveles elevados de

glucosa, aún cercanos al límite superior normal, producen daños en la microvasculatura de retina y

riñón


Existen otras entidades fisiopatológicas relacionadas con hiperglicemia que no llegan a cumplir los

criterios de diabetes pero que son muy importantes ya que deben ser vigiladas ya que estos

pacientes presentan riesgo elevado de evolucionar a diabetes. Estas son la tolerancia disminuida a la

glucosa y la glucosa en ayunas anormal.

Tolerancia disminuida a la glucosa es aquel caso cuando después de una prueba de tolerancia con

75 g de glucosa se obtienen a las dos horas valores mayores a 140 y menores a 200 mg/dl.

La glucosa anormal en ayunas es aquel caso en que los valores en ayunas son mayores a 110 pero

menores a 126 mg/dl.


Experimento A:

TEST DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA Y GLUCOSA

POSTPRANDIAL

FUNDAMENTO TEÓRICO

Las pruebas de tolerancia a la glucosa oral fueron utilizadas por mucho tiempo para

diagnóstico de Diabetes Mellitus o intolerancia disminuida, pero ya no se utilizan de rutina, pero si

pueden servir tanto para la Diabetes como para la intolerancia. Importante es recalcar que los

niveles importantes en ambos casos son los obtenidos a las dos horas, y que la cantidad de glucosa a

ingerir debe ser de 75 gramos. El disolver 75 gramos en por lo menos 300 ml de agua hace la

solución más agradable al paladar y por lo tanto tendrán más aceptación por parte del paciente.

Ayunas 70-110 mg/dl

30 min <200 mg/dl

1 hora <180 mg/dl

2 horas <140 mg/dl

En caso de la prueba de tolerancia de 75 gramos en adultos en niños se debe utilizar una

cantidad de glucosa correspondiente al peso del niño (1,75 g de glucosa por Kg de peso). Es de

suma importancia recordar que antes de iniciar cualquier prueba de tolerancia a la glucosa oral, se

debe pedir una muestra de orina al paciente, para hacerle un análisis cualitativo glucosa. Esto

debido a que si el paciente presenta glucosuria, no se debe realizar la prueba de tolerancia, ya que la

glucosuria indica en la gran mayoría de los casos, niveles sanguíneos de glucosa elevados y la

ingesta de altas concentraciones de glucosa le podría provocar al paciente un shock hiperglicémico.

Existen otras pruebas de tolerancia que son aceptadas tanto por la Organización Mundial de la

Salud como por la American Diabetes Association, estas son las relacionadas con la Diabetes

Mellitus Gestacional.

La curva de tolerancia a la glucosa para tamiz de la DMG consiste en la ingesta en ayunas de

50 gramos de glucosa, se mide la glicemia a la hora, si los niveles son menores a 140 mg/dl se

desecha la DMG, si los niveles son iguales o mayores a 140 mg/dl se debe proceder a hacer la

prueba confirmatoria para DMG. Esta consiste en ingerir en ayunas 100 gramos de glucosa y hacer

una curva de tres horas. Si dos de los niveles obtenidos en dicha curva sobrepasan los valores

indicados en la siguiente tabla, se hace el diagnóstico de DMG.

Ayunas 105 mg/dl

1 hora 190 mg/dl

2 horas 165 mg/dl

3 horas 145 mg/dl

La prueba de glucosa postprandial viene a ser una prueba de tolerancia a la glucosa acortada,

donde solo se considera el valor basal y el de las dos horas.

Ayunas 70-110 mg/dl

2 horas <140 mg/dl




Micropipetas automáticas de 10 uL.

Espectrofotómetro.

Solución patrón de glucosa (100 mg/dl).

Reactivo de color de glucosa, que contiene: Glucosa oxidasa, peroxidasa, 4-aminofenazona,

fenol, tampón fosfato pH: 7.0

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

Se determinará la glicemia en muestras obtenidas a una persona en forma basal, a los 30 min, 60

min y 120 min. Luego de tomar la muestra sanguínea basal se le dà de tomar al paciente 75 gr de

glucosa disuelto en 300 mL de agua con unas gotas de limón. Las muestras de sangre extraídas de la

persona serán centrifugadas y se separarán los sueros. Para la determinación de las glicemias se

utilizará el método de la glucosa oxidasa – peroxidasa (GOD-POD).

Tubos: Blanco Standard Muestra

(0’)

Muestra

(30’)

Muestra

(60’)

Muestra

(120’)

Suero (uL) --- --- 10 10 10 10

Estándar de glucosa (uL) --- 10 --- --- --- ---

Reactivo de glucosa (ml) 1 1 1 1 1 1

Incubar los tres tubos en Baño María de 37ºC por 5 minutos. Mezclar bien. Leer las absorbancias

para cada una de los tubos en el espectrofotómetro a 500 nm.

CALCULOS

Encontrar la concentración de glucosa en cada una de las muestras utilizando el método del factor

de calibración.

CUESTIONARIO:

1.- Con los datos de glicemia obtenidos en el experimento construir en un papel milimetrado una gràfica de tiempo vs.

Glicemia y apreciar la curva de tolerancia a la glucosa.

2.- Como sería esta curva en el caso de una persona normal, un diabético y un intolerante a la glucosa.

3.- Que importancia tiene la detección de microalbuminuria en una persona.

4.- Qué son y en que casos se hace un dosaje de péptido C y de insulina en un paciente diabético.

5.- Cuáles son las complicaciones agudas y crónicas de la diabetes?


PRACTICA No 7

DOSAJE DE AMILASA SERICA Y URINARIA

La amilasa, enzima del grupo de las hidrolasas, se produce principalmente en la fracción exocrina

del páncreas y en las glándulas salivales.

Su acción se dirige particularmente a escindir los enlaces alfa 1-4 glucosìdicos de los polisacáridos

como almidón y glucógeno.

En pacientes con pancreatitis aguda, la amilasa sérica empieza a elevarse en las primeras 2 a 3 horas

de la enfermedad, alcanzando los valores más elevados entre las 24 y 30 horas posteriores al ataque,

declinando luego para volver a los niveles normales entre el 3º y 6º día. También se ve aumentada

en este caso la excreción urinaria de la enzima, persistiendo la hiperamilasuria 3 a 5 días, luego de

que la actividad sérica ha alcanzado los niveles normales.

También es posible encontrar valores aumentados en pacientes con ulcera gástrica o duodenal

perforada, obstrucción intestinal, obstrucción de conductos biliares, pancreatitis crónica,

hipertiroidismo, carcinoma de cabeza de páncreas, administración de opiáceos y en general

cualquier caso de “abdomen agudo” o intervención quirúrgica en regiones próximas al páncreas.

Las parotiditis bacterianas y virales, que producen bloqueo de la secreción de amilasa salival, se

asocian también con elevaciones en los niveles de amilasa sérica.

PANCREATITIS AGUDA:

Definición: Es un desorden inflamatorio del páncreas, en el cual la función pancreática normal

debe ser restaurada una vez que la causa primaria del evento agudo es superado.

Causas:

- Pancreatitis por cálculos biliares: 60% (en nuestro medio)

- Pancreatitis alcohólica: 80% (en países Anglosajones)

- Pancreatitis de causa idiopática: 30%

- Pancreatitis por tumores ampulares-coledococele-Pán-creas Divisum

- Pancreatitis por condiciones metabólicas asociadas

- Hipertrigliceridemia

- Hiperparatiroidismo

- Hipercalcemia

- Hiperlipoproteinemia Tipo V; también tipos I y IV

- Pancreatitis por Toxinas (Insecticidas)

- Pancreatitis por picadura de escorpión en América del Sur y Central

- Pancreatitis por Metanol

- Pancreatitis traumática (Trauma abdominal)

- Pancreatitis Iatrogénica: ERCP, por corte esfínter de Oddi Cirugía pancreatobiliar,

transplante renal-Vasculitis- SIDA-Parasitosis


PANCREATITIS CRÓNICA:

Definición: Es un estado inflamatorio crónico que determina un daño irreversible de la estructura y

función pancreática. El curso clínico de la pancreatitis crónica puede consistir en ataques

recurrentes agudos o una relativa progresión de síntomas.

En 1988 la clasificación Marseilles - Roma de Pancreatitis reconoció la Pancreatitis Crónica

Obstructiva subsecuente a la pancreatitis crónica. Ésta es causada por la lesión obstructiva, es la

forma más común de pancreatitis, la que se caracteriza por cambios crónicos irreversibles.

Causas:

- Pancreatitis Alcohólica

- Pancreatitis Idiopática

- Pancreatitis Crónica Tropical

- Pancreatitis Hereditaria

- Pancreatitis por Hiperparatiroidismo

- Pancreatitis por Lesiones Traumáticas del Conducto Ductal

Experimento A:

DETERMINACIÓN DE AMILASA EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO: En este método el sustrato, almidón tamponado, se incuba con la muestra, produciéndose la

hidrólisis enzimática. Esta se detiene por el agregado de reactivo de yodo, que al mismo tiempo

produce color con el remanente de almidón no hidrolizado. La disminución de color respecto de un

sustrato control (sin muestra) es la medida de la actividad enzimática, que se expresa en Unidades

Amilolìticas (Smith & Roe)/decilitro (UA/dl), comparables con las Unidades Sacarogènicas

(Somogy)/decilitro.

MATERIALES Y REACTIVOS: - Espectrofotómetro.

- Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.

- Tubos de ensayo y cubetas de lectura.

- Baño maría a 37ºC.

- Reloj o timer.

- Sustrato: solución de almidón 500 mg/l, tamponada a pH 7 con buffer fosfato 0.1 mol/l en

NaCl 0.15 mol/l.

- Reactivo de yodo: solución 0.01 eq/l de yodo en HCl 0.02 mol/l.


PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: Preparar los siguientes tubos:

Control Muestra

Sustrato 1 ml 1 ml

Dejar unos minutos en baño de agua a 37ºC y agregar:

Muestra --- 20 uL

Incubar a 37ºC. A los 7’30” exactos, agregar:

Reactivo de yodo 1 ml 1 ml

Mezclar por agitación suave. Retirar los tubos del baño y agregar:

Agua destilada 8 ml 8 ml

Mezclar por inversión.

Leer en espectrofotómetro a 640 nm, llevando a cero el aparato con agua destilada.

Experimento B:

DETERMINACIÓN DE AMILASA EN ORINA

El procedimiento es igual que el caso anterior, solamente que en este caso la muestra en lugar de

suero es orina diluida la cual debe obtenerse de la siguiente manera:

El paciente debe orinar descartando esta micción, dos horas después vuelve a orinar y recoge toda la

orina. Esta muestra, que corresponde a dos horas de diuresis, se diluye a 200 ml con agua destilada.

La determinación se efectúa con 20 uL de esta dilución, obteniéndose el resultado directamente en

Unidades Amilolìticas/hora

CALCULO DE LOS RESULTADOS: Para ambos experimentos se empleará la siguiente fórmula:

Abs. Control - Abs. Muestra

Amilasa UA/dl = --------------------------------------- x 1000

Abs. Control

Unidades: Una Unidad Amilolìtica (UA) es la cantidad de enzima contenida en 100 ml de muestra,

que puede hidrolizar 10 mg de almidón en 30 minutos, en las condiciones de la reacción. En esta

técnica se incuban 20 uL de muestra con 0.5 mg de almidón contenidos en 1 ml de Sustrato durante

7 minutos y medio, lo que equivale a incubar 100 ml de suero con 10,000 mg de almidón durante 30

minutos. Si todo el almidón fuera hidrolizado, la actividad amilàsica de la muestra sería de 1000

UA/dl. Para obtener las unidades de actividad amilàsica, la fracción de almidón digerido se

multiplica por 1000.


VALORES DE REFERENCIA:

Suero

(UA/dl)

Orina

(UA/hora)

Normal <120 <260

Pancreatitis aguda 300 a 12000 Más de 900

Pancreatitis crónica Hasta 200 Más de 300

Parotiditis 200 a 350 350 a 750

Parotiditis con complicación pancreática Más de 350 Màs de 750

Procesos abdominales agudos (sin pancreatitis) Normal Normal

CUESTIONARIO: 1.- Explique como se produce la activación de las enzimas producidas por el páncreas

exocrino?

2.- En una pancreatitis que importancia tiene el dosaje de las enzimas: lipasa, tripsina,

elastasa y fosfolipasa A2?

3.- Explique como se produce la digestión completa del almidón en nuestro tubo

digestivo.

4.- Cuàl es el cuadro clìnico de una pancreatitis aguda?

5.- Què otros exámenes auxiliares se pueden realizar para confirmar el diagnóstico de

pancreatitis?


PRACTICA N°08

CETOACIDOSIS DIABÉTICA

BASE BIOQUÍMICA.

La Diabetes Mellitus se caracteriza por hiperglucemia y otros desarreglos que se deben a

una inadecuada acción de la Insulina sobre los tejidos corporales, ya sea porque exista un

reducido nivel circulante de Insulina ó una resistencia de los tejidos blanco a sus acciones

La Diabetes se divide en dos categorías:

a) Diabetes Tipo I ó Diabetes Insulina dependiente ó Diabetes juvenil (llamada así porque se

inicia en la juventud) y la Diabetes tipo II ó no insulino dependiente (diabetes de inicio en la

edad madura). Pueden haber tipos intermedios que se superponen.

(A) LA DIABETES TIPO I afecta al 10 % de los pacientes diabéticos y la dependencia de la

Insulina significa que no solamente que la insulina es necesaria para el óptimo control de la glucosa

sanguínea, que también podría ser cierto para la forma tipo II, sino que “sin Insulina exógena el

paciente es más proclive a desarrollar CETOACIDOSIS diabética.

1. Se sabe que esto refleja una completa ó casi ausencia de insulina en estos

pacientes, en contraste con la falta parcial de insulina ó la resistencia a la insulina

característica de los pacientes del tipo II.

2. Otra característica clave de los pacientes con Diabetes tipo I es su presencia en

niños y adultos jóvenes y su presencia en las personas mas bien delgadas que

obesas.

(B) LA DIABETES TIPO II común mente afecta a las personas de edad madura, y con sobrepeso.

1. Como algo de insulina es producida en estos pacientes, no se produce cetoacidosis.

2. Sin embargo puede ser necesario el tratamiento con insulina para prevenir la severa

hiperglicemia.

Debemos saber desde ahora que se puede producir Diabetes secundaria ó alterarse la

tolerancia a la glucosa de modo secundario a ciertas enfermedades que afectan la

producción ó la acción de la Insulina, tales como la pancreatitis crónica, el Síndrome de

Cushing, la acromegalia, la alteración de los receptores de insulina y otras.

El síntoma mas común que produce la hiperglicemia es la poliuria (Aumento del volumen urinario)

y la polidipsia (incremento en la ingesta de agua), lo cual se debe a la diuresis osmótica inducida

por la glucosa. El incremento en la ingesta de agua es una respuesta a deshidratación y sed. Se

produce disminución de peso corporal, debido a la pérdida de glucosa por la orina y a los efectos

catabólicos de la disminución de la acción de la insulina, a pesar de la mayor ingesta de alimentos

(Polifagia).La debilidad generalizada refleja las alteraciones metabólicas .Las infecciones de la piel,

vulva y tracto urinario son frecuentes sobre todo en los casos no controlados debido a que la

hiperglicemia disminuye la resistencia a las infecciones. Las alteraciones en la retina son precoces.


CETOACIDOSIS DIABETICA:

Se produce en los diabéticos insulinodependientes cuyo nivel de insulina circulante es insuficiente

para permitir una utilización de la glucosa por los tejidos periféricos y para inhibir la producción

de glucosa y el catabolismo tisular. El incremento del Glucagon y el aumento de las hormonas que

aumentan en respuesta al stress (como la adrenalina, noradrenalina, cortisol y hormona del

crecimiento) contribuyen a los desarreglos metabólicos. La insuficiente cantidad de insulina reduce

la utilización periférica de glucosa y junto con el exceso de glucagon incrementan la producción

hepática de glucosa a través de la estimulación de la gluconeogénesis y la glucogenolisis y la

inhibición de la glicólisis.La degradación de las proteínas en los tejidos periféricos suministra un

flujo de aminoácidos hacia el hígado como substrato para la gluconeogénesis. El resultado es la

hiperglicemia .La diuresis osmótica resulta de la elevación de la glucosa ( y cuerpos cetónicos ) y

genera hipovolemia, deshidratación y pérdida de sodio, fosfato de potasio y otras substancias por la

orina. La depleción del volumen estimula la liberación de catecolaminas lo cual se opone a la

acción de la insulina en el hígado y contribuye a la LIPOLISIS.

CETOGENESIS:

La lipòlisis acentuada que resulta de la falta de insulina y del exceso de catecolaminas moviliza los

acidos grasis libres desde sus depósitos en el tejido adiposo y en lugar de reesterificarse con el

glicerol para formar triacilgliceroles, el hígado desvía

sus rutas metabólicas hacia la producción de cuerpos cetónicos. El glucagon incrementa el nivel de

carnitina, que capacita a los ácidos grasos a entrar en la mitocondria, donde ellos sufren beta

oxidación hacia cuerpos cetónicos. Además el glucagon disminuye el contenido hepático de

malonil CoA, que es un inhibidor de la oxidación de acidos grasos.

ACIDOSIS: El incremento de la producción hepática de cuerpos cetónicos (acetoacetato y beta

hidroxibutírico) excede la capacidad corporal de metabolizarlos ó excretarlos. Sus H+ son

tamponados por el bicarbonato, conduciendo a una caída del bicarbonato sérico y del pH sanguíneo.

Se encontrará entonces: hiperglicemia, hipercetonemia, acidosis metabólica, disminución del

bicarbonato, disminución del pH sanguíneo y presencia en la orina de glucosa (glucosuria) y

cuerpos cetónicos ó cetonuria.

OBJETIVO DE LA PRACTICA.- Aprender a interpretar los niveles de bicarbonato sérico, pH sanguíneo y presencia de cuerpos

cetónicos en la orina en presencia de Cetoacidosis Diabética.


EXPERIMENTO A:

DOSAJE DE BICARBONATO SÉRICO

Reactivos y materiales:

HCl 0.01 N

Noah 0.01 N

Fenoltaleína 20 mg% solución alcohólica

Alcohol corriente ó caprílico.

Muestras problemas de bicarbonato para titularlas..

Pipetas de 5 ml graduadas al décimo

Pipetas de 1 ml graduadas al centésimo

Beakers de vidrio de 100 ó 50 ml

Baguetas de vidrio

Baño María de 37°C

Reloj de intervalos

Método:

En un beaker de vidrio colocar:

5 ml de HCl 0.01 N

1 ml de suero

2 gotas de alcohol

Agitar y luego reposo 2 min.

Añadir 3 gotas del indicador fenoltaleína.

Colocar a 37° C en Baño Marìa por 10 minutos.

Titular con NaOH 0.01N, hasta obtener un color rosado pálido.

Anotar la cantidad de NaOH gastado.

Cálculos:

(5 - X ml gastados de NaOH en la titulación) x 10 = mMol/ Litro de HCO3-

Considerar que:

a) 1ml de NaOH 0.01 N equivale 0.01 mEq HCO3 –

b) Vol. de muestra usada en la titulación: 1 ml

c) Expresar los valores de HCO3- en mMol/Litro

Valores Referenciales (Normales): 22 á 34 mMol/Litro


EXPERIMENTO B:

INVESTIGACION DE CUERPO CETONICOS en la ORINA

Test de Rothera.- Esta prueba depende de la la reacción entre la Acetona y el

nitroprusiato para formar un complejo coloreado púrpura rojizo. Indica la presencia de

acetoacetato y/o acetona.

Reactivos:

Cristales de sulfato de amonio

Solución de Nitroprusiato al 10% en solución acuosa, la cual deberá ser fresca.

Amoniaco solución (Hidróxido de amonio concentrado)

Muestra problema: orina

Tubos de prueba de vidrio de 13x 100 mm aproximadamente

Pipetas Pasteur capilares ó pipetas de vidrio de 1 ml terminales

Espátulas ó bajalenguas de madera.

Baguetas de vidrio.

Procedimiento:

NO SE DEBERA PIPETAR NINGUN REACTIVO CON LA BOCA. PROHIBIDO

HACERLO. Colocar aproximadamente 2 ml de orina en un tubo de prueba y añadirle con

la espátula aproximadam.0.5 g de sulfato de amonio en cristales. Disolver con bagueta.

Añadir 2 á 3 gotas de sol. Nitroprusiato 10%. Mezclar bien

Por la pared lateral del tubo de prueba, sin pipetear con la boca, lentamente, en zona

deslizar el amoniaco con una pipeta Pasteur ó pipeta de vidrio. Deberán quedar dos capas

bien definidas. Esperar unos minutos y ver la formación de un anillo morado en la intefase

en caso positivo para cuerpo cetónicos .Si no aparece este color la prueba es negativa.

CUESTIONARIO:

1.- Explique la formación de cuerpos cetònicos y porque se producen.

2.- Explique las diferencias entre cetoacidosis diabética y coma hiperosmolar.

3.- Como se diagnostica a un paciente que está en cetoacidosis diabética?.

4.- A qué se llama: exceso de bases y reserva alcalina.

5.- Explique los diferentes métodos de laboratorio que existen para el dosaje tanto de

bicarbonato en sangre como de cuerpos cetònicos en orina.


PRACTICA Nº9

PERFIL LIPIDICO: COLESTEROL TOTAL Y FRACCIONADO

El nivel sérico de colesterol ha sido objeto en los últimos años de numerosas investigaciones tanto en

individuos sanos como enfermos.

Desde un punto de vista médico la determinación de colesterol en forma aislada tiene utilidad diagnóstica

limitada. Sin embargo, su concentración varía de manera más o menos predecible en un gran número de

condiciones clínicas. Se ha visto que el colesterol es uno de los factores contribuyentes a la formación de

ateromas dado que las complicaciones arterioescleròticas prevalecen en individuos hipercolesterolèmicos.

Diversos estudios epidemiológicos han permitido observar además, que el riesgo de contraer enfermedad

cardíaca coronaria (ECC) para los individuos (varones de mes de 40 años) con colesterolemia menor ò igual

a 200 mg% es 3 veces menor que entre individuos con más de 230 mg% y 6 veces menor que entre

individuos con más de 260 mg%.

Sin embargo, actualmente se sabe que es necesario conocer además la distribución de las lipoproteínas

encargadas del transporte: HDL (lipoproteínas de alta densidad), considerada como el “factor protector” y

LDL (lipoproteínas de baja densidad), consideradas como el verdadero “factor de riesgo”. Las funciones

biológicas inherentes a los distintos grupos de lipoproteínas, las variaciones en su composición y los

resultados de los diversos estudios epidemiológicos, indican que los valores aislados de colesterol HDL y

colesterol LDL no pueden tomarse como índices predicitivos de riesgo, sino que es necesario conformar un

perfil lipìdico con los valores de colesterol total, colesterol LDL y colesterol HDL.

Experimento A:

DETERMINACIÓN DE COLESTEROL EN SUERO


El colesterol es oxidado enzimáticamente por la colesterol oxidasa (CHOD), previa hidrólisis enzimática de

los èsteres mediante una lipasa de origen fungal. El agua oxigenada generada en la oxidación, produce la

copulación oxidativa del fenol con la 4-aminofenazona (4-AF) mediante una reacción catalizada por la

peroxidasa. El producto es una quinonimina roja con absorbancia máxima a 505 nm.

Lipasa

Esteres de colesterol colesterol + ácidos grasos

CHOD

Colesterol + O2 colesten-3-ona + H2O2

POD

H2O2 + 4-AF 4-(p-benzoquinona monoimino)-fenazona + 4 H2O


REACTIVOS:

Standard: solución de colesterol 200 mg%

Enzimas: suspensión conteniendo lipasa fungal (300 U/ml), colesterol oxidasa (3 U/ml) y peroxidasa (20

U/l).

Reactivo 4-AF: solución de 4-aminofenazona (25 mmol/l).

Reactivo Fenol: solución de fenol (55 mmol/l).

Reactivo de trabajo: de acuerdo al volumen de trabajo colocar en una probeta 50 partes de agua destilada,

5 partes de reactivo 4-AF, 5 partes de reactivo fenol y llevar a 100 partes con agua destilada. Agregar 2

partes de enzimas previamente homogenizadas. Mezclar por inversión, sin agitar.

PROCEDIMIENTO:

En tres tubos colocar:

Tubos Blanco Standard Muestra

Standard --- 20 uL ---

Muestra --- --- 20 uL

Reactivo de trabajo 2 ml 2 ml 2 ml

Incubar 15 minutos en baño de agua a 37ºC.

Leer en el espectrofotómetro a 505 nm.

CALCULO DE RESULTADOS:

Calcular la concentración de colesterol total en suero, aplicando el método del factor de calibración.

Recordar que la concentración del standard de colesterol es de 200 mg%


Los valores de colesterol en sangre fluctúan según edad, sexo y hábitos de dieta y de ejercicio. Sin embargo,

es preferible no hacer referencia a valores “normales”, pues la norma promedio de una población no

necesariamente refleja ausencia de riesgo patológico en el caso de colesterol.

Menos de 200 mg% valor deseable

200 a 239 mg% valor frontera

Mayor de 240 mg% valor alto

Experimento B:

DETERMINACIÓN DE COLESTEROL HDL EN SUERO


Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) se separan proecipitando selectivamente las lipoproteínas de

baja y muy baja densidad (LDL y VLDL) mediante el agregado de Sulfato de Dextrán de PM 500,000 en

presencia de iones Mg++.

En el sobrenadante separado por centrifugación, quedan las HDL y se realiza la determinación del

colesterol ligado a las mismas, empleando el sistema más conveniente.

REACTIVOS:

REACTIVO PRECIPITANTE.- Contiene una solución de Sulfato de Dextrán y de Cl2Mg.H2O


PROCEDIMIENTO:

En un tubo medir 0.5 ml de muestra y agregar 0.05 ml de Reactivo Precipitante.

Homogenizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos.

Dejar 15 minutos en refrigeración. No colocar en el congelador.

Centrifugar a 3000 rpm.

Usar el sobrenadante como muestra.




Sobrenadante --- --- 100 uL




CALCULOS: De acuerdo al método del factor de calibración, considerando que la concentración del standard es de 45.7

mg%.

VALORES NORMALES:

30 – 65 mg%

Experimento C:

DETERMINACIÓN DE COLESTEROL LDL EN SUERO


Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) se separan del suero precipitándolas selectivamente

mediante el agregado de polímeros de alto peso molecular. Luego de centrifugar, en el sobrenadante

quedan las demás lipoproteínas (HDL y VLDL), el colesterol ligado a las mismas se determina

empleando el sistema más conveniente.

Por diferencia entre el colesterol total y el determinado en el sobrenadante, se obtiene el colesterol

unido a las LDL.

REACTIVOS:

REACTIVO PRECIPITANTE.- Solución de sulfato de polivinilo disuelto en polietilenglicol (PM

600).

PROCEDIMIENTO:

En un tubo, colocar 0.2 ml de suero problema y añadir 0.1 ml de Reactivo Precipitante.

Homogenizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos.

Dejar 15 minutos en un baño de agua a 20-25°C.

Centrifugar a 3000 rpm.

Usar el sobrenadante como muestra.





Sobrenadante --- --- 100 uL




CALCULOS:

LDL Colesterol = Colesterol total - (Abs muestra neta x factor de calibración)

La concentración del standard es de 62.4 mg%.

VALORES NORMALES:

Riesgo bajo o nulo: Menor de 140 mg%

Riesgo moderado : 140 a 190 mg%

Riesgo elevado : Mayor de 190 mg%

CUESTIONARIO:

1.- Què es RIESGO CORONARIO y como se calcula?

2.- Explique que diferencias hay entre la arterioesclerosis y la ateroesclerosis?

3.- Describa como se produce la biosíntesis de colesterol dentro del organismo.

4.- Explique que es el colesterol VLDL y como se calcula.

5.- Que rol cumplen los triglicéridos y como se realiza su metabolismo.


PRACTICA Nº10

PERFIL LIPIDICO II: TRIGLICERIDOS

Los triglicéridos forman la mayor parte del peso seco del tejido adiposo, constituyendo por lo

tanto una potente forma de almacenamiento de energía.

El movimiento de ácidos grasos entre los distintos compartimientos del organismo, se produce

con gran rapidez en respuesta a diversos estímulos (dieta, actividad física, stress, edad, etc.). Por

este motivo es de esperar que los triglicéridos (uno de los más importantes vehículos para el

transporte de ácidos grasos) varíen también su concentración en respuesta a estos factores

fisiológicos.

Sin embargo, el equilibrio de estos mecanismos puede verse alterado, conduciendo a niveles

anormales de triglicéridos circulantes. La persistencia de esta condición, se asocia con numerosas

patologías, tales como enfermedad hepática, renal, hiperlipidemias esenciales, etc.

Un caso que resulta de particular interés es el aumento de triglicéridos en individuos obesos, en

los cuales tiene importancia pronostica, respecto a la probabilidad de desarrollar enfermedad

cardíaca coronaria. Alrededor del 50% de los lípidos de las lesiones ateromatosas que ocurren en

las arterias coronarias son triglicéridos, por lo que es posible relacionar a los triglicéridos con la

patogénesis de la arteriosclerosis coronaria. Este punto de vista está sustentado por el hecho de

que un gran porcentaje de pacientes con infarto de miocardio también exhiben

hipertrigliceridemia.

Para la determinación de triglicéridos en suero se usará la determinación enzimática de glicerol a

partir de glicéridos.

Los métodos enzimáticos se basan en la determinación del glicerol contenido en las moléculas de

los triglicéridos, tras la hidrólisis (química ò enzimática) para remover los ácidos grasos. La

determinación enzimática del glicerol ha sido usada durante muchos años; sin embargo, en estos

métodos se empleaba la hidrólisis alcalina de los triglicéridos. El reciente desarrollo del uso de

enzimas (lipasa, usualmente combinada con una proteasa) para catalizar la hidrólisis, ha

posibilitado el empleo de métodos directos, rápidos y específicos. Los sistemas totalmente

enzimáticos eliminan el uso de reactivos cáusticos, extracción con solventes, baños de altas

temperaturas y mezclas de adsorción para la remoción de fosfolìpidos. Estudios recientes se han

concentrado en desarrollar reactivos con lipasas, que hidrolizan completamente los triglicéridos.


Experimento A:

DETERMINACIÓN DE TRIGLICERIDOS EN SUERO


Se producen reacciones químicas basadas en la determinación química de glicerol a partir de

glicéridos.

La primera etapa consiste en que los triglicéridos son hidrolizados enzimáticamente por una

lipoprotein lipasa específica, produciendo glicerol y ácidos grasos.

Lipoprotein lipasa

Triglicéridos Glicerol + 3 ácidos grasos

En una segunda etapa el glicerol se fosforila a glicerol-1-fosfato en presencia de glicerolkinasa.

Glicerol kinasa

Glicerol + ATP Glicerol-1-P + ADP

En una tercera etapa el derivado fosforilado se oxida mediante la glicerol fosfato oxidasa (GPO),

con producción de agua oxigenada.

GPO

Glicerol-1-fosfato + O2 H2O2 + dihidroxiacetonafosfato

Finalmente el agua oxigenada así formada produce la unión oxidativa del fenol y la 4-

aminofenazona, en reacción catalizada por la peroxidasa (POD), con formación de una

quinonimina roja.

POD

2 H2O2 + 4-AF + clorofenol 4-(p-benzoquinona monoimino)fenazona + 4 H2O

REACTIVOS PROVISTOS:

- Standard: solución acuosa de glicerol equivalente a 200 mg% de triglicéridos.

- Buffer: solución de buffer conteniendo clorofenol a pH 7,5.

- Enzimas: Viales conteniendo lipoprotein lipasa, glicerol kinasa (GK), glicerol

fosfato oxidasa (GPO), peroxidasa (POD), adenosina trifosfato (ATP) y 4-

aminofenazona (4-AF).


INSTRUCCIONES DE RECONSTITUCION Y MEZCLADO:

- Standard: listo para usar.

- Reactivo de trabajo: 5/10 x 20 ml: agregar 20 ml de Buffer a un vial de Enzimas.

Mezclar hasta disolución completa. Homogenizar y fechar.

4 x 50 ml: reconstituir el contenido de un vial de Enzimas con una porciòn de Buffer

y luego transferir al frasco de Buffer enjuagando varias veces. Homogenizar y

fechar.

MATERIAL REQUERIDO:

- Espectrofotómetro.

- Probeta, micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.

- Frasco de vidrio color ámbar.

- Tubos de fotocolorímetro o cubetas espectrofotométricas.

- Baño de agua a 37ºC.

- Reloj ò timer.

PROCEDIMIENTO:

Homogenizar la muestra antes de usar, especialmente frente a sueros lechosos.

En tres tubos de ensayo marcados B (Blanco), S (Standard) y M (Muestra), colocar:




Reactivo de Trabajo 1 ml 1 ml 1 ml

Mezclar.


Enfriar y leer en espectrofotómetro a 505 nm llevando el aparato a cero con agua destilada.

CALCULO DE LOS RESULTADOS:

Corregir las lecturas con el blanco y usar las lecturas corregidas para los cálculos.

Para hallar la concentración de triglicéridos en el suero problema, se debe utilizar el método del

factor de calibración.

Triglicéridos (mg%) = M x Fc

Fc = 200 / S

M = Abs muestra – Abs blanco

S = Abs standard – Abs blanco



El panel de expertos del National Cholesterol Education Program (NCEP) provee los siguientes

valores de triglicéridos:

Deseable: < 150 mg%.

Moderadamente elevado a elevado: 150 – 199 mg%.

Elevado: 200 – 499 mg%.

Muy elevado: > 500 mg%.

CUESTIONARIO: 1.- Describa las características principales de los lípidos y su clasificación.

2.- Explique la importancia biológica de los triglicéridos.

3.- Como se produce la digestión y absorción de los triglicéridos.

4.- Mencione la proporción de triglicéridos dentro de las lipoproteínas y la acción de la lipasa lipoproteìca.

5.- Enumere los diferentes métodos tanto químicos como enzimáticos para el dosaje de triglicéridos.


PRACTICA Nº11

MASA PROTEICA VISCERAL Y ESQUELÉTICA

Para evaluar el estado nutricional de una persona utilizamos el metabolismo proteico (síntesis y

degradación).

Las proteínas en el organismo se distribuyen didácticamente en dos compartimientos:

b) Compartimiento Proteico Visceral.

c) Compartimiento Proteico Somático ò esquelético.

Las proteínas del compartimiento visceral se evalúan mediante los niveles de Transferrina, Pre-

albúmina, Proteínas totales y Albúmina en suero, que por su relativamente corto tiempo de vida

(albúmina es de 20 días) rinde una estimación razonable del compartimiento proteico visceral. En

esta práctica utilizaremos la Proteína Total y la Albúmina sérica.

Las proteínas del compartimiento somático ò esquelético la evaluaremos mediante la relación entre

la excreción de la creatinina urinaria en 24 horas y la talla de la persona, relación que es un fiel

índice de la masa muscular esquelética.

Así mismo mediante el Peso y la Talla se evaluará la masa corporal total.

Experimento A:

DETERMINACIÓN DE PROTEINAS TOTALES Y ALBÚMINA

EN SUERO


Determinación de Proteínas Totales:

Los enlaces peptìdicos de las proteínas reaccionan con el ión cùprico, en medio alcalino, para dar un

complejo color violeta con máximo de absorción a 540 nm, cuya intensidad es proporcional a la

concentración de proteínas totales en la muestra.

Determinación de Albúmina:

La albúmina reacciona específicamente (sin separación previa) con la forma aniónica de la Bromo

Cresolsulfon Ftaleìna (BCF), en presencia de un exceso de colorante, en medio tamponado a pH 3,8. El

aumento de absorbancia a 625 nm respecto al blanco de reactivo, es proporcional a la cantidad de albúmina

presente en la muestra.

REACTIVOS:

Reactivo EDTA/Cu: complejo EDTA/Cu 13 mmol/l en NaOH 875 mmol/l y alquil aril polièter (AAP).

Reactivo BCF: solución de Bromo Cresolsulfon Ftaleìna (en polioxietilèn lauril éter).

Suero Patrón: solución de albúmina y globulinas en estado nativo con tìtulo conocido de proteínas (Biuret

ò Kjeldhal) y albúmina (unión BCF).


MATERIAL REQUERIDO:

Espectrofotómetro.

Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.

Tubos de ensayo.

Baño Marìa a 37ºC.

Reloj ò timer.

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEINAS TOTALES:


Blanco Standard Muestra

Agua destilada 50 uL --- ---

Suero Patrón --- 50 uL ---


Reactivo EDTA/Cu 3,5 ml 3,5 ml 3,5 ml

Mezclar los tubos.

Incubar durante 15 minutos en baño maría a 37ºC.

Leer en espectrofotómetro a 540 nm.

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE ALBÚMINA:



Suero Patrón --- 10 uL ---


Reactivo BCF 3,5 ml 3,5 ml 3,5 ml

Mezclar los tubos.

Mantenerlos a temperatura ambiente durante 10 minutos.



Proteínas totales (g/dl) = M x fc fc = P.T. (g/dl) / S

Albùmina (g/dl) = M x fc fc = Alb. (g/dl) / S

Albúmina (g/dl)

Relación A/G = ---------------------------------------

Prot. Tot. (g/dl) - Alb. (g/dl)


PROTEÍNAS TOTALES : 6,1 a 7,9 g/dl.

ALBÚMINA : 3,5 a 4,8 g/dl.

RELACION A/G : 1,2 a 2,2


Experimento B:

DETERMINACIÓN DE CREATININA URINARIA


La creatinina reacciona con el picrato alcalino en medio tamponado, previa desproteinizaciòn con àcido

pìcrico, obteniéndose un cromògeno que se mide a 510 nm.

REACTIVOS:

Reactivo 1: àcido pìcrico 41,4 mmol/l.

Reactivo 2: buffer glicina/NaOH 1 mol/l, pH final 12,4.

Standard: soluciòn de creatinina 2 mg%

MATERIAL REQUERIDO:

Espectrofotometro.

Tubos de ensayo.

Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.

Reloj ò timer.

PROCEDIMIENTO:

Recolectar orina de 24 horas.

Medir la diuresis, tomar una alícuota y efectuar una dilución 1:50 de la misma.

Luego en tres tubos de ensayo preparar lo siguiente:


Standard --- 0,5 ml ---

Orina diluìda (1:50) --- --- 0,5 ml

Agua 1 ml 0,5 ml 0,5 ml

Reactivo 1 2 ml 2 ml 2 ml

Reactivo 2 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml

Mezclar por inversión.

Incubar 20 minutos a temperatura ambiente.



M

Creatinina en orina (mg/24 horas) = ------ x 20 mg/l x 50 x V

S

Siendo:

V = volumen de la diuresis expresado en litros/24 horas.

M = Absorbancia neta del tubo muestra.

S = Absorbancia neta del tubo standard.


900 a 1,500 mg/24 horas.


VALORACIÓN DEL ESTADO NUTRICIONAL

PROMEDIO

POBLACIONAL

DESNUTRICIÓN

Relación CrU 24h / Talla

(mg 24h/m)

Hombres: 830

Mujeres: 680

Hombres: < 660

Mujeres: < 430

Relación Peso / Talla

(Kg/m)

Hombres: 37

Mujeres: 34

Hombres: < 30

Mujeres: < 29

Proteínas totales (g/dl) 7 < 6

Albúmina (g/dl) 4 < 3,5

CUESTIONARIO:

1.- Con los datos obtenidos en los experimentos, realizar la valoración nutricional de dicha

persona sabiendo que es varòn, pesa 60 Kg, su talla es 1,56 m y su volumen urinario en 24 horas

fuè de 1000 ml.

2.- Como hubiera sido la valoración nutricional en el caso que la persona hubiera sido mujer?

3.- Mencione las características generales de las proteínas y su clasificación.

4.- Què son las globulinas y cuáles son sus clases?

5.- Describa los métodos de dosaje tanto químicos como enzimáticos para proteínas totales,

albúmina, globulina y creatinina.


PRACTICA N°12

METABOLISMO DE LA BILIRRUBINA

Base Bioquímica.- La bilirrubina es un pigmento amarillo, que se produce en el ser humano a partir del

Núcleo HEM (que es una Protoporfirina Tipo IX ó Tetrapirrol macrocíclico, molécula que tiene

insertado un átomo de Hierro ).Sobre este núcleo HEM actúa la enzima Oxigenasa Heme de los

microsomas. Esta Oxigenasa rompe el enlace alfa meteno del anillo tetrapirrólico y se abre la

molécula, convirtiéndose en el pigmento verde Biliverdina, el cual es subsecuentemente

hidrogenado y forma Bilirrubina .Esta reducción la realiza la enzima citosólica biliverdina

reductasa que es una enzima NADPH dependiente. Por cada mol de HEME catabolizado por esta

ruta se produce un mol de bilirrubina, de CO2 y de ión férrico. La producción diaria de bilirrubina a

partir de todas sus fuentes en el hombre es de 250 a 350 mg. Aproximadamente el 85% de la

bilirrubina total producida se deriva de la molécula del HEM de la Hb liberada a partir de los

eritrocitos senescentes que son destruídos en el sistema retículo endotelial del hígado, bazo y

médula ósea. El 15% remanente se produce a partir de la destrucción de las células precursoras de

los eritrocitos en la médula ósea ( llamada “eritropoyesis inefectiva”) y también proviene del

catabolismo de otras proteínas que contienen núcleo Hem como la mioglobina, citocromos,

peroxidasas y que están distribuídas a través de todo el organismo

.

Después de su producción en los tejidos periféricos, la bilirrubina es transportada al hígado

asociada a la albúmina .La Bilirrubina es rápidamente captada por los hepatocitos , se transporta y

se conjuga al acido glucurónico ( UDP – glucuronilo transferasa) para producir mono y

diglucuronato de bilirrubina los cuales se excretan en la bilis.

Y después de ser excretados hacia el intestino delgado . En el tracto intestinal los glucorónidos de

bilirrubina se hidrolizan a la forma no conjugada por el pH al alcalino del intestino delgado, y por la

acción catalítica de la betaglucuronidasa del hígado, células epiteliales intestinales y las bacterias.

La bilirrubina no conjugada es posteriormente reducida por la flora bacteriana anaeróbica intestinal

para formar un grupo de tres tetrapirroles incoloros colectivamente llamados Urobilinógenos que

luego se reducen y forman tres productos: estercobilinógeno, mesobilinógeno y urobilinógeno.

Hasta el 20% de los urobilinógenos producidos diariamente son reabsorvidos desde el intestino

hacia la circulación pára ir al hígado (Circulación entero. hepática). La mayor parte del

urobilinógeno reabsorvido es capatado por el hígado y es re-excretado en la bilis y solamente un 2 a

5 % entra a la circulación general y aparece en la orina. En la parte mas baja del tracto intestinal,

los tres urobilinógenos se oxidan espontáneamente y producen los pigmentos estercobilina,

mesobilina y urobilina, y así estos pigmentos adquieren color marrón y que son los pigmentos que

le dan color a las heces. Existen enfermedades congénitas y enefermedades adquiridas que afectan

uno ó más de los pasos involucrados en la producción, capitación, depósito, metabolismo y

excreción de la bilirrubina y la hiprbilirrubinemia es frecuentemente el resultado de estos

transtornos. Esta bilirrubinemia puede ser a predominio No conjugado (Indirecta) ó Conjugado

(Directa) dependiendo del tipo de desorden.

La hiperbilirrubinemia causa Ictericia. Cuando la cifra de bilirrubina en la sangre excede del mg %,

existe hiperbilirrubinemia .La hiperbilirrubinemia puede deberse a la producción de mas bilirrubina

de la que el hígado normal puede excretar o a la insuficiencia de un hígado dañado para excretar la


bilirrubina producida en cantidades normales. Ante la ausencia de daño hepático, la obstrucción de

los conductos excretorios del hígado, previniendo la excreción de la bilirrubina, también causará

hiperbilirrubinemia. En todos estos transtornos, la bilirrubinase acumula en la sangre y cuando

alcanza una cierta concentración (aproximadamente de 2 a 2. 5 mg%) se difunde dentro de los

tejidos los cuales adquieren color amarillo, este transtorno se denomina ictericia. La concentracion

de bilirrubina en el suero es de gran valor, por eso en la presente practica la emplearemos.

Estado

Bilirrubina Sérica

Mg%

Urobilinogeno

Urinario

Bilirrubina

Urinaria

Urobilinógeno

fecal

NORMAL

Iictericia

Hemolítica

Hepatitis

Ictericia

Obstructiva

Conjug: 0.1 a 0.4 mg

No Conjug 0.2 a 0.7

Elevac. No Conjug

Elevaciones de

Ambas,con pred.Conjug

Elevación de ambas a

predominio

Conjugada

0.a 4 mg/24 hs

Aumentado

Disminuido

Ausente

Ausente

Ausente

Presente

Presente

40 a 280 mg/ 24

hs

Aumentado

Disminuido

Escaso o

ausente

Dentro de las causas de Ictericia Hemolítica tenemos:

Anemias hemolíticas, ictericia fisiológica neonatal (Inmedurez hepática para captación, conjugación

y secreción de la bilirrubina), Sindrme de Crigler-Najar ( Alteración de la conjugación de

bilirrubina),Enfermedad de Gilbert, Hiperbilirrubinemia tóxica(Agentes farmacológicos).

Experimento A:

DOSAJE DE BILIRRUBINA SERICA

FUNDAMENTO:

El suero sanguíneo es tratado con el reactivo diazoico (Acido Sulfanílico + Nitrito de sodio) y se

produce un complejo coloreado de color rojo violáceo debido a la presencia de bilirrubina

conjugada al ac. Glucurónico (Directa) color que desarrolla directamente. La Bilirubina no

conjugada (Indirecta) requiere además la presencia de cafeína ó alcohol metílico para que se

desarrolle el color. Entonces para obtener la producción de color debido a ambas bilirrubinas

debemos añadir cafeína ó metanol y tendremos la producción de un color debido a la suma de

ambas bilirrubinas que llamamos Bilirrubina Total. Estos colores son comparados

espectrofotométricamente con el color producido por una solución standard de bilirrubina de

concentración conocida.


REACCTIVOS NECESARIOS:

- Acido Sulfanílico en medio ácido

- Solución acuosa de nitrito de sodio

- Alcohol metílico ó solución de cafeína amortiguada

- Agua destilada

- Standard de Bilirrubina

- Preparación de reactivo Diazo (Sol. Nitrito de sodio + Sol ácido sulfanílico), según instrucciones

del profesor.

- Muestras problema

METODOLOGIA.-

Colocar los reactivos en tubos de prueba marcados, según la siguiente tabla:

Reactivos

Tubo

Blanco

( B )

Tubo

Bilir Directa

( D )

Tubo

Bilir Total

( T )

Tubo

Standard de

Bilirrubina

(mg %)

Muestra (suero) 200 uL 200 uL 200 uL ---

Agua destilada 2,5 ml 2.5 ml --- ---

Sol Cafeína --- --- 2.5 ml 2,5 ml

Acido

Sulfanílico

200 uL --- --- ---

Reactivo Diazo --- 200 uL 200 uL 200 uL

Standard 200 uL

Mezclar de inmediato, cada tubo por inversión.

Reposo 5 minutos a temperatura ambiente.

Lectura en espectrofotómetro en 530 nanómetros, colocando el espectrofotómetro en cero de

Absorbancia con Agua destilada.

Anotar los resultados de cada lectura.

CALCULOS:

Bilirrubina Total mg% = ( T - B ) x Factor

Bilirrubina Conjugada (Directa) mg % = ( D – B ) x Factor

Bilirrubina No Conjugada (Indirecta ó Libre) = (Bilirrub.Total – Bilirrub.Directa)


- Adultos = Directa: hasta 0.2 mg/%

Total: hasta 1.0 mg/%

- Recién nacidos =

Nacidos a término Prematuros

Sangre de cordón 2.5 mg%

Hasta las 24 horas 6.0 mg% 8.0 mg%

Hasta las 48 horas 7.5 mg% 12.0 mg%

Del 3º al 5º día 12.0 mg% 24.0 mg%

Loa valores comienzan luego a disminuir para alcanzar el nivel promedio del adulto al mes del

nacimiento.

En los prematuros, los niveles de Bilirrubina tardan màs en alcanzar la normalidad, dependiendo del

grado de inmadurez hepàtica


Experimento B:

INVESTIGACION DE UROBILINOGENO EN ORINA

El Urobilinógeno se forma en la fase intestinal del metabolismo de la bilirrubina y se encuentra en

todas las orinas normales en muy pequeñas cantidades, menores de 4 mg / 24 hs. Se forma en el

intestino como hemos señalado en las clases teóricas por la acción de las bacterias sobre los

pigmentos biliares excretados por el hígado. También dijimos que luego que se excreta la

bilirrubina conjugada al conductillo biliar llega al duodeno; la bilirrubina conjugada no es

reabsorvida sino que o bien se excreta como tal en la heces, o bien se transforma en

UROBILINOGENO ( y derivados asociados) por acción de las bacterias del colon. El

urobilinógeno se puede reabsorver en el intestino delgado (Ïleon) y en el colon y pasa a la

circulación portal , llega al Hígado y allí se re-excreta a la bilis y el resto llega al riñón y se excreta

con la orina .

Cuando existe una alteración en la captación y excreción hepática de urobilinógeno ( como en la

enfermedad hepatocelular) ó la síntesis de bilirrubina como en la hemólisis, la excreción diaria del

urobilinógeno aumentará en forma significativa Por el contrario,si no pasa bilis al intestino, como

en la colostasis u obstrucción biliar extra hepática interfieren en la fase final del catabolismo de la

bilirrubina y ocasiona un descenso notable en la producción y excreción urinaria del urobilinógeno.

Entonces, la medida del urobilinógeno en la orina resulta muy útil para diferenciar las posibles

causa de hiperbilirrubinemia como ocurre en la obstrucción completa de los conductos biliares, la

urobilina estará ausente en la orina.

La excreción se incrementará en todas aquellas condiciones en que exista una excesiva

destrucción de los eritrocitos y en aquellos casos de daño parcial del parénquima hepático. En las

nefritis muy avanzadas puede estar ausente la Urobilina

Fundamento de la prueba de Ehrlich para la investigación de Urobilinógeno en orina (Método

Cualitativo).:

Esta prueba se basa en la reacción entre el urobilinógeno y el reactivo de paradimetil

aminobenzaldehido, para rendir un complejo coloreado rojo cereza

Reactivo de Ehrlich:

Disolver 10 gm de Paradimetilaminobenzaldehido en una mixtura de 75 ml de agua y y 75 ml

de HCl concentrado.

Procedimiento: A 2 ml de orina en un tubo de prueba, añadirle 0.5 ml del Reactivo de Ehrlich y

mesclar bien. Observar el color de la mixtura.

Interpretación. Cantidades normales de Urobilinógeno en la orina no producirán color. Cantidades

aumentadas (patológicas) del pigmento urobilinógeno producirán un color rojizo cereza que se

observa bien mirando el tubo desde arriba del tubo(boca del tubo) contra un fondo blanco.

En la actualidad usamos para la investigación de Urobilina en orina el método de las tiras

reactivas que se introducen directamente en la muestra de orina. Estas cintas están impregnadas en

el área correspondiente de una sal de metoxibenceno diazonio estable que produce con el

urobilinógeno, casi instantáneamente un complejo de color rojo azoico. Se considera normal que en


la zona reactiva para urobilinógeno no se produzca decoloración alguna o que los colores que

aprezcan sean mas claros que los observados para l mg % .Esta prueba es específica para el

urobilinógeno.

CUESTIONARIO:

1.- Explique la formación de la bilirrubina.

2.- En que casos se produce una elevación de la bilirrubina total, tanto a expensas de la bilirrubina

directa como de la indirecta.

3.- Como se forma el urobilinògeno y qué importancia tiene?

4.- Què es la ictericia y como se evalúa.

5.- Cuáles son los métodos conocidos para el dosaje de bilirrubina.


PRACTICA Nº13

TRANSAMINACION

IMPORTANCIA CLINICA:

Las transaminasas son enzimas ampliamente difundidas en el organismo, que catalizan la

transferencia de un grupo amino de un aminoácido a un cetoàcido, en una de las más importantes

reacciones del metabolismo proteico. El interés clìnico está centrado especialmente en dos de ellas:

TGO (transaminasa glutámico oxalacètica) y TGP (transaminasa glutámico pirùvica).

Estas enzimas tienen acción eminentemente intracelular, por lo que la actividad sérica en

condiciones normales es baja o nula. Un aumento de la actividad será evidencia de un deterioro de

los tejidos en que se encuentran, de los cuales resultan particularmente importantes corazón e

hígado.

Se ha observado que luego de un infarto de miocardio se produce en suero un marcado aumento de

la actividad de la TGO, debido a la liberación al torrente sanguíneo de esta enzima, tan abundante

en músculo cardìaco.

En este caso no existirà aumento en la actividad sérica de TGP ò será mínimo.

En hepatitis virales y otras formas de enfermedad hepática que involucren necrosis de tejido, habrá

un incremento considerable de la actividad sérica de transaminasas, incluso antes de la aparición de

síntomas clínicos como ictericia.

En este caso, la TGP será el enzima predominante debido; a su gran concentración en el tejido

hepático.

Una elevada actividad de transaminasas puede detectarse también en traumas accidentales o

quirúrgicos y en distrofias musculares y miosis.


Una reacción de trasnominación consiste en la interconversión de un grupo amino (NH2-CH-

COOH) de un aminoácido, con un grupo cetónico (O=C-COOH) de un cetoácido. Este intercambio

está catalizado por enzimas conocidas con el nombre de transaminasas. En el suero humano, por lo

general, se determinan dos tipos principales: la Glutámico Oxalacética (TGO) y Glutámico Pirúvica

(TGP).

Ellas catalizan las siguientes reacciones: TGO

l-aspartato + -cetoglutarato oxalacetato + glutamato

TGP

l-alanina + -cetoglutarato piruvato + glutamato

El oxalacetato y el piruvato así formados, reaccionan con el reactivo 2,4-dinitrofenilhidrazina (2,4 –

DNFH), generando fenilhidrazonas, las cuales en medio alcalino (NaOH) producen un complejo

coloreado cuya intensidad es proporcional a la actividad enzimática de transaminasas en la

muestra.


REACTIVOS:

1.- Sustrato TGO:

Solución conteniendo 100 mmol/l de l-aspartato y 2 mmol-l de alfa-cetoglutarato en buffer

fosfatos 100 mmol/l, pH 7,4.

2.- Sustrato TGP:

Solución conteniendo 200 mmol/l de l-alanina y 2 mmol/l de alfa cetoglutarato en buffer

fosfatos 100 mmol/l, pH 7,4.

3.- Reactivo 2,4-DNFH:

Solución conteniendo 1 mmol/l de 2,4-dinitrofenilhidrazina en ácido clorhídrico

1 mmol/l.

Esta solución es corrosiva y debe guardarse en frasco oscuro.

4.- Standard de Calibración:

Solución de piruvato de sodio 2 mmol/l. Para efectuar la curva de calibraciòn.

Listo para usar en la curva de TGP. Diluir 1:2 con sustrato par la curva de

TGO.

5.- Hidróxido de Sodio para Enzimas:

Solución de hidròxido de sodio 4 mol/l

Antes de usarse, se deberá diluir el contenido de este frasco a 1 litro de agua destilada para así

alcanzar la concentración requerida de NaOH 0.4mol/l.

Es importante notar que el hidróxido de sodio debe conservarse en frasco de plástico y no de

vidrio. Conservar el frasco lejos del reactivo de color pues los vapores pueden contaminar

ambos reactivos.

EXPERIMENTO A

DETERMINACIÓN DE TRANSAMINASAS (TGO Y TGP) EN SUERO

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR TGO ò TGP EN SUERO:

Preparar los tubos:

Blanco Muestra

Sustrato (TGO ò TGP) 0.5 ml 0.5 ml

Colocar en baño de agua a 37ºC unos minutos y luego agregar:

Muestra (suero) --- 100 Ul

Agua destilada 100 uL ---

Mezclar por agitación suave e incubar exactamente 30 minutos y agregar:

Reactivo 2,4-DNFH 0.5 ml 0.5 ml

Mezclar. Dejar 10 minutos a 37ºC. Luego agregar:

NaOH 0.4 mol/l 5 ml 5 ml

Mezclar por inversión y retirar del baño. Después de 2 minutos leer en el espectrofotómetro a 505

nm, llevando el aparato a cero de absorbancia con agua destilada.

NOTA: Para el cálculo de resultados se debe emplear una curva de calibración.


EXPERIMENTO B

PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE LA CURVA DE

CALIBRACIÓN

Antes de utilizar por primera vez el juego de reactivos, preparar una curva de calibración para TGO

y otra para TGP, de acuerdo a las siguientes indicaciones:

Pipetear en dos series de tubos:

Tubo Agua destilada

(ml)

Sustrato (ml) Standard de

calibración (ml)

TGO

(U/l)

TGP

(U/l)

I 0.2 1.00 0.00 0 0

II 0.2 0.95 0.05 7 9

III 0.2 0.90 0.10 12 18

IV 0.2 0.85 0.15 20 25

V 0.2 0.80 0.20 28 37

VI 0.2 0.75 0.25 37 46

VII 0.2 0.70 0.30 48 56

VIII 0.2 0.60 0.40 81 79

IX 0.2 0.50 0.50 --- 113

Nota: Utilizar sustrato TGO para la curva de calibración de TGO y sustrato TGP para la curva de

calibración de TGP, respectivamente.

Mezclar y agregar a cada tubo, 1 ml de reactivo 2,4-DNFH.

Mezclar. Incubar 10 minutos a 37ºC.

Agregar 10 ml de hidróxido de sodio 0.4 mol/l a cada tubo.

Mezclar y esperar 10 minutos a temperatura ambiente antes de leer.

Leer la tramitancia a 505 nm usando agua destilada como blanco de lectura. El color es estable

durante solo 30 minutos.

Restar a cada lectura la obtenida con el tubo Nº1, obteniéndose las Absorbancias Netas.

Graficar en papel milimetrado los valores de absorbancias netas en el eje vertical, y en el eje

horizontal las U/l de TGO ó TGP según sea el caso, que se indica en la tabla superior.

Determinar en el gráfico los puntos correspondientes a cada tubo. Uniéndolos se obtienen las curvas

respectivas para TGO y TGP.

Tener en cuenta que para cada técnica debe utilizarse el gráfico correspondiente.


Se consideran valores normales de transaminasas (TGO y TGP) hasta 12 U/l. Si bien se han hallado

individuos normales con valores hasta 18 U/l, los niveles de transaminasas que se encuentren entre

12 y 18 U/l deben considerarse sospechosos.

CUESTIONARIO:

1.- Explique en que consiste el fenómeno de transaminaciòn y donde se realiza en el organismo?

2.- Que relación existe entre las transaminasas y las enfermedades hepáticas?

3.- Como se encuentran las transaminasas en el infarto agudo de miocardio?

4.- Señale cuáles son los métodos de análisis conocidos para dosaje de transaminasas?

5.- Existe variación de transaminasas con la edad?


PRACTICA Nº14

BALANCE NITROGENADO

El objetivo de esta práctica es evaluar el metabolismo proteico empleando el Balance Nitrogenado.

Explicaremos los parámetros más representativos de la excreta nitrogenada en general.

Se evalúa los egresos de N mediante el nitrógeno ureico urinario en 24 horas y la excreciòn de

nitrógeno creatinìnico urinario en 24 horas empleando la fórmula de nitrógeno total estimado

(NTE), según Ramírez Velazco.

FORMULA: BN = INGESTA N – (NTE + 2)

NTE = N. UREICO + N. CREATININICO

Excreciòn fecal : 2 gr/24 horas.

N Ingerido: gr de proteínas/6.25

Nota: Si el paciente presenta albuminuria, añadir a la excreta:

Proteína urinaria/6.25

EXPERIMENTO A :

DETERMINACIÓN DE CREATININA URINARIA

La creatinina se forma endógenamente en el metabolismo muscular y es removida de la sangre por

filtración glomerular y excretada en la orina sin ser reabsorbida en los túbulos. Por lo tanto, es el

riñón el que regula, como único órgano excretor, el nivel de creatinina en la sangre. Si se restringe

la función renal aumenta la creatinina en el plasma, proporcionalmente a la lesión orgánica. Un

aumento continuo aunque escaso del nivel de creatinina en suero debe considerarse como un signo

de pronóstico desfavorable, ya que puede tratarse de una irreparable restricción de la función renal.

Como se forma en el organismo, los factores exógenos no pueden influir su nivel sérico. Por este

motivo la determinación simultánea de la creatinina en suero y orina permite el càlculo del

clearence o depuración de creatinina y representa un método excelente de la medida de la filtración

glomerular.


En un medio alcalino que contiene picrato, la creatinina presente en la muestra, reacciona con éste

formando un complejo rojizo, cuya mayor absorción se dà a 530 nm.

Creatinina + picrato Complejo creatinina-picrato


REACTIVOS:

Reactivo 1.- Solución de ácido pícrico 0.05M

Reactivo 2.- Solución de hidróxido de sodio 0.75N

PROCEDIMIENTO:

Recolectar orina de 24 horas.

Diluir la orina completando a 2000 ml con agua destilada.

Nota: Si el volumen de la orina recolectada durante las 24 horas supera los 2000 ml la prueba debe

realizarse sin diluirla, pero en el momento de realizar los cálculos en vez de multiplicar el resultado

por 2000, debe multiplicarse por el volumen total (ml).

Preparar los siguientes tubos:

Blanco (ml) Standard (ml) Muestra (ml)

Orina diluida --- --- 0.02

Standard --- 1.0 ---

Agua 2.5 1.5 2.5

Reactivo 1 3.5 3.5 3.5

Reactivo 2 1.0 1.0 1.0

Mezclar bien.

Después de transcurridos 20 minutos leer la absorbancia a una longitud de onda de 530 nm contra el

blanco.

CALCULOS:

Abs muestra

Creatinina en orina (mg/24 h) = ------------------ x 2000

Abs standard

VALORES NORMALES: 500 – 1500 mg/24 h.

Dato: Creatinina x 0.37 = Nitrógeno creatinìnico.

EXPERIMENTO B :

DETERMINACIÓN DE UREA URINARIA

El producto final más importante del metabolismo proteico es la UREA. Esta es excretada en la

orina en mayor cantidad que cualquier otra sustancia.

Concentraciones elevadas de urea en sangre son indicador de una inadecuada función excretora y

por consiguiente de la función renal.

La urea sanguínea puede aumentar por otras razones además de excreciòn renal insuficiente, dichas

causas se clasifican en: Pre-renal, son los estados en los cuales se altera la circulación por el riñón y

Post-renal por obstrucción de las vías urinarias. Por ello la información más exacta con respecto a la

habilidad excretora de la urea por los riñones requiere de una comparación de la concentración de

urea en sangre (BUN) y en la orina. Fisiológicamente la urea se eleva debido a una dieta

hiperproteica o con la edad y disminuye durante una dieta de bajo valor proteico.



La urea presente en la muestra es hidrolizada hasta amoníaco y dióxido de carbono, mediante una

reacción catalizada por la enzima ureasa:

Ureasa

Urea + H2O CO2 + 2 NH3

El amoníaco en presencia de una base reacciona con fenol e hipoclorito de sodio formando azul de

indo fenol. La intensidad de color azul es proporcional a la cantidad de urea en la muestra.

REACTIVOS:

Reactivo 1.- Solución de fenol y nitroprusiato de sodio.

Reactivo 2.- Solución de hipoclorito de sodio en NaOH 0.625N

Enzima.- Solución de ureasa.

PROCEDIMIENTO:

Se diluye la orina a 1:50 con agua destilada.

Preparar los siguientes tubos:

Blanco (ml) Standard (ml) Muestra (ml)

Standard --- 0.01 ---

Orina diluida --- --- 0.01

Enzima 2 gotas 2 gotas 2 gotas

Mezclar e incubar los tubos en un baño maría a 37°C por 5 minutos.

Asegurarse que los reactivos no se hayan quedado en las paredes de los tubos.

Luego agregar en cada tubo, 1 ml del Reactivo 1, y posteriormente 1 ml del Reactivo 2.

Mezclar el contenido de los tubos e incubarlos en un baño de agua a 37°C por 5 minutos.

Transcurrido este tiempo agregar 4 ml de agua destilada en cada tubo.

Mezclar los tubos por inversión y proceder a leer la absorbancia en un espectrofotómetro a 540 nm

vs el blanco.

CALCULOS:

Abs muestra

Urea (mg/dl) = --------------------- x 60 x Factor de dilución

Abs standard

Dato: Urea x 0.466 = Nitrógeno ureico.


VALORES NORMALES:

Nitrógeno ureìco.- 7 a 14 gr/24 hrs.

Urea.- 15 a 30 gr/24 hrs.

BN = Ingesta nitrogenada – (N ureico + N creatinìnico + 2)

BN = ...................... gr/24 hrs.

CUESTIONARIO: 1.- Con los datos obtenidos en la práctica, calcular el balance nitrogenado del paciente

sabiendo que ingirió 8 gr de proteínas en 24 horas .

2.- De donde proviene la creatinina?

3.- A que se denomina uremia y que consecuencias trae?

4.- A que se llama BUN y que representa?

5.- Para que sirve la depuración de creatinina en orina de 24 horas?

Date post:	27-Nov-2015
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Guia p. Bioquimica y Nutricion

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