MATRICULA: €32340994
HORAS A L A SEMANA: 20 HOHhS
LUGAR:LABORATORIO DE DIGESTION ANAEROBIC1 DEL AREfi D E
MICROBIOLOGIA DEL DEPARTAMENTO DE EIOTECNOLOGIA.
FECHA DE INICIi3: 23 DE MFtYO DE 1971.
ll,A !B. EW4PALAPA BlBllOTECA
TITULO DEL PROYECTO
BLODEGRADACION CINAEROBIA DE LA ACETAMIlX
F a
. cj
4 L
7
entender- me j a r la comp:lej idad d e las inter-accj.oner
mict-obianas y b ioqu im ica5 en los s is temas donde se c ib i cc
este f clnomeno.
E n 1981, Mc Ine rney y col propusieron un esquema d i v i d i d o en
b u t i t - a t o l , y t a m b i e n e l e t a n o l . A es te n i v e l , e x i s t e tambicln
r ~ n a etapa d e h o m o a c e t a t o g C n e c i s p a t - t i c u l a r - que es la
í;Uz. E 5 . t ~ esquema d e s c r i b e l o s f e n b m e n o s p t - . i n c i p a l e s que
+ e t - m e n t a c i b n d e las biopolimetms h a s t a . l a i o r - m a c i o n d e l
m e t a n o .
2 . D e s c r i p c i b n de la Microbiologia d e la d i q e s t i c j n
a n a e t - o b i a.
2.1.- Las bacter ias h i d r o l i t i c a s y f e r m e n t a t i v a s .
Se sabe que l a s bacter ias c o n s u m i d o r a s de h i d r 6 g a n o t i e n e n
un papel provechozo (KI la formacibn de acetataL- a p a r t i r de ". "
los biopolimeros En si la f e r m e n t a c i h o rc idagCnes is n o es
~. ." ~
~. i-
y pr-odcrcen acetcltu e h i d m g ! P n o .
S e p u e d e c o n s i d e r a r que este yr-upo d e bactet-ias es e l paso
clave para la e f i c i e n c i a d e l a m e t ; a n o g @ n e s i s . A este ni'./el
d e d e g t - a d a c : t b n d e l a materia orq6nica -,e p r o p o t - c i s n a l a
mayat-ia d e l acetatn pat-a la r n e t a n o g @ n ~ s i s ; . E l a c e r a t o
p r o v i e n e d e l a u x i d a c i b n d e l o s a c l d o s qt-asos v o l a t i l e s
(AGV), d e los a%roholes, e t c .
b ) .- Bacter ias sulfato r-eductot-as (BSR) E s t a s b a c t e r i a s
u t i l i r a n p r i n c i p a l m e n t e $21 s c ! l . f - a t o como receptor f i n a l de
e l e c t r o n e s , y se d i v i d e n en d o s q t - a n d a s 9 r ~ 1 p o s :
G t - u p 0 1. Las bacterias que o x i d a n el l a c t a t o e n a c e t a t o y
CO2 a u n q u e , la mayoria de este gt-upo puede tambidn o x i d a r el
etanol. en acetata. .. .
. ~ . . .~
- El COZ es necesar io pat " e l crecimiento .
implicadas en la bltirna etapa de la d e g r - a d a c i 6 n anaer- .obia de
la materia or-gdnica ,en los digestores anaet-obios
So; b a c t e r i a s anaerobias estrictas que exigen ademas de la
a u s e n c i a de o x i g e n o condiciones de t-educcibn del medio
ambiente inferior a -300 mv para crecer-. La5 bacter-ids
metanoq6nicas tienen comd caracteristicas comune5 producir
metano el tener un rango de ~ u s t r a t o s muy 1 imitado, y el
tener tiempos de generaciones amplios. Se sabe que las
bacterias metanag6nicas utilizan sustratos muy específicos .. ~
como mas COZ , formato, acetato, metanol, y matil ~ ""
~ . .
aminar. En los digestores podemos d i s t i n g u i r a dos grwx3s
principales.
I . ;.u 7 ~. . . " L *-
.,,h" . ". , ,.T., ',V...' . h. 1 .A;,
-
l.Les bacterias metanogPnicas hidrogenof i l icar i "
3. OBJETIVO PRINCIPAL
E n c u n t t ~ a r - l a s v i a s de b i o d e g t - a d a c i b n de la acetamida ba jo
condicinnes anaet-obias e n dos t i p o s de lados.
4.-SUSTIFICACION
512 .sabe que la acetamida k i e n e unt! s e m e . j a n r ; a e s t t r c r c t u r - a I al
acetato ( p t - i n c i p a . 1 p r e c u r s o r - del m e t a n o ) y que puede e s t a r
Presente en .Los s u b p r o d u c t o s d e las i n d u s t r i a s ya que
presenta m u c h a s p r o p i e d a d e s que l a hace m u y u t i l i z a b l e en
las i n d u s t t - i a s Sus p t - i n c l p a l e s LISOS son d e C t - O S C Q p i a , es
muy e s t i m a d a como d i s o l v e n t e d e colorantes e n l a i n d u s t r i a
t e x t i l , a n . t i a r i d o en la i n d u s t r - l a d e lacas h u m e c t e n t e d e
p a p e l y t i n t o r e r i a , e: . :ploc,ivos y c o s m h t i c o s y materia pr.ima
en sintesis o r g A n i c a d e m e d i c a m e n t o s . Se tiene evidencia d e
que una d o s i s de 2.5% de acetamida a d m i n i s t r a d a por v i a at-al
en t-atas forma tumores c a n c e r i q e n o s .
.
O. METODOLOG I A
I n b c u l u .
F u n d a m e n t a l m e n t e se tt-aba.jo c o n dos t i ;?os de l u d n s ,
el pr-imet-o de e l las que se a n a l i z c j . f uC ei p v o v e n i e n t e de u n
N e u t r a 1 i z a d o r - irle un I n q e n i o S a n t a C:Lat-a e n el E s t a d o d e
m i c h o a c 6 n a l j m e n t a d a una v e z p o r s e m a n a c o n acetamida. El
s e g u n d o lado p t - a v e n i e n t e de los s e d i m e n t o s d e l e - ' : l u e n I : , ~ de!.
R i a blanco e n ( I r i z a b a Vet-act-li1.z c e r c a n o a u n a f a b r i c a d e
p a p e l y que a su v e r tamhlPn fctP a l i m e n t a d o f n n acetamida
mc1s s u l f a t o de s o d i o . T a h i . a 2. Fat-a l a c i n g t i c a se ernpleb
de c u l t i v o espec i f i co p a t - a b a c t e r i a s a n a e r o b i a s , c o n u n a
c o n c e n t r a c i u n cle IC1 mPf de zcetamida p a r a los lodos del
mas 20 mM d e ~ ~ 1 1 4 ' a t o de sodio para l o s s e d i m e n t o s . Fara
i n i c i a r la c i n h t i c a se d e j a r o n lo5 lodos d u r a n t e u n a n o c h e
anterior e n l a pt-ecamar-a de acceso a la camat-a anaerobia
bajo vac io con el f i n de agotar,., la mayor cantidad .de-: '*, . .
surtratos reriduales, el metano y atros gases disueltcri;~" " - _. ,
E l medio f u e p r e p a r a d o b a j o c o n d i c i o n e s e s t t - i t z t 3 . s d e
a n a e t - o b i o s i s y baja una atmozfet-a d e n i t t - b g e n o a e b u l l i c i c i n
pat -a l i b e r a r todo el o x i g e n o p r - e s e n t e , posteriormente se
e n f r i a aun con e l Slujo de n i t t - b g e n o , u n a VEZ ft-io se r e t i r a
e l flujo de n i t r b g e n o y e n este m o m e n t o se l e agrega l a
cisteina, se tapan p e t - f e c t a m e n t e los matraces con t a p o n d e
h u l e , se r e f o r - z a n c o n m a s k i n g tape, se i n t r o d u c e n d e n t r - 0 de
la precArnar-a, se p r a c t i c a n tres vacios d e 20 mm d e Hg par "
d e s p u d s i n t r o d u c i r l o s a l a cdmar-a a n a e r o b i a . d e i g u a l m a n e r a
se i n t r o d u j o el material que se ocupo d u t - a n t e e l e s t u d i a . Sr
p r - e p a v a n las b o t e l l a s con 16 m1 d e medio, se t a p a n con tapon
SUSTRFITCI:
La acetamida u t i - L i z a d a a t - a z o n d e 1 0 mM g r a d o r e a c t i v o
marca Baker . Se p r e p a r a r o n t u b o s d e H u n g a t e con 1 0 m 1 d e
agua r e d u c i d a : - -y :~- (> . 29 ~ g d e a c e t a m i d n , p o s t e r i o r m e n t e se
e s t e r i l i z a n en- fa.sS-~mismas c o n d i c i o n e s que el medio d e
c u l t i v o .
P a r a los p u n t o i I% r e a l i ~ z a d o s expuestos e n .el proyer to
i n i c i a l se d e b e a- que el a i s l a m i e n t o d e bacter ias
~.~~
"
- " ~. ~~ -
~~ ~ ~.
m e t a n o g h n i c a s e5 muy.. lento . M A T E R I A L :
determinacibn. FInexo l.
SULFUROS: ~ .~ ~ .
Se derminaron su l fu ros d isue l tos y pvecipitadcts en el media
pot- c a l o r i m e t r i a mediante 1,a t t l rn ica de 'Half Card--Ruwisch.
Anexo 2.
En l a gr6 f i ca n o . 2 Nos m u e s t r a ia c i n P t ~ c a d e l c o n t r o l s i n
s u s t r a t o del Ingenio como 5e puede v e r e l amonio q u e se
produce proviene d e l a h i d r a l i s i s d e l o s l o - d n s , y a que l a
c a n t i d a d d e a c e k a m i d a r - e s i d u a l n o - e s , c o n s i d e r a b l e el m e t a n o
se forma apartir delacertato r e s i d u a l o d e la h i d r - o 1 i a i s . d e
l o s micraorganismo%. 222767
e n u n m o m e n t o d e t e r m i n a d o p u d i e r - u n crecer- e n las b o t e l l a s d e
e n t - i q u e c i m i e n t o , dado que a este n.iveI no se l l e v o a cabo
Llna a n a p t - o b i o s i s e s t r i c t a . Se pt-eparo el medio b a j o
a n a e r a b i o s i s per -o la atmCisfer-a d u r a n t e l a i n c u b a c i b n e5
a i r e , y como e l medio no fr.(& a g i t a d o p u d o h a b e r s e formado
una z o n a a n b x i c a en e l - fondo d e l a b o t e l l a y u n a z o n a
s u p e r - f i c i a 1 , e n d o n d e 5e l l e v o a cabo el cc)nsumo de o x i g e n o
t-esultado de la d i f u s i b n del oxigeno d e l a i r e e n el l i q u i d o ,
parte d e l m e t a n o p r o d u c i d o como l o i n d i c a e l c o n t r o l
p r o v i e n e de las s u b s t a n c i a 5 e n d b g e n a s d e l lodo pero l a
d i f e r e n c i a d e l contr-o1 y la muestra p r u e b a c l a r a m e n t e que l a
pr-ecencia d e l m e t a n o es d e b i d a a l a d e q r a d a c i b n de l a
acetamida. La5 obser-vac i o n e s m i c r - o s c b p i c a s c o n
e p i f l u r e s c e n c i a d e estos lodos n o s demuestra la precencia d e
n u m e r o s a s bacter ias m e t a n o g d n i c a s . Por medio de estos
r -esul tados podemos d e c i r - que la r u t a d e biodegradacibn para
este e x p e r i m e n t o es:
L a CJratic3 no. 4
Nos muestra la c i n ~ t i c a d e acetamlda d e lodos d e l I n g e n i o
s i n f u e n t e n i t t - o g e n a d a . p o d e m o s vet- que l o s r-.esultados son
muv slmilat-es a las del e x p e r i m e n t o cuyo m e d i o d e CI-11 t i v o
c o n t i e n e n i t v b g e n o .
Las v e l o c i d a d e s d e d e g t - a d a c i d n de l a acetamida y d e l a
f o r - m a c l b n de m e t a n o son:
( 2 . 7 7 mM cicetaiht- O. 23 mrY M e t a n o / i t r - p a r - a e l e : . : p e r - i m e n t . o c o n
n j , t r . . b g e n o y d e ; O. 23 m i l A c e t a l h t - 0 . 2 3 mM M e t a n o / h r - para l a
muestt-a s i n n i t t - b g e n o .
La g t - a i f i c a no" 5. Se p r e s e n t a l a c i n c t i c a de los lodo5 d e
s e d i m e ~ t o s e s t e r i l i z a d o s c o n s u l + a t o y acetamida y como se
p u e d e apreciar- na hay ~sna d e g r A d a c i d n de acetamida, e l
a m o n i o y e l acetato p r o v i e n e n como r . .e - , idua d e los lodos y n o
hay for-maci bn d e metano e s t a s t-esi;l tados n o s d e m u e s t t - a n que
la d e g t - a d a c i b n de acetamida ef 1 leb2ada a cabo por los
m i c r o o r g a n i s m o s p r e s e n t e s en los lmdos.
En l a g t - A f i c a n o 7.Se pr-ec,enI:a a. 1,:~s l o d o l ; d e s e d i m e n t o c o n
s u l f a t o y se observa d u r a n t e ias 140 p r i m e r a s h o r a s de
i n c u b a c i b n u n a p r - c x i u c c i O n d e acetat(.-, h a s t a niveles simi lai-es
a l o s d e l c o n t t - o 1 desaparece la. acetamida y a u m e n t a la
p r - o d u c c i b n d e a m o n i o , e n e s t a etapa n o 5.e d e t e c t a l a
f o r - m a c i c i n de sul+t..cros pot- l o que l a d e p t - a d a c i b n de a c e t a m j d a
y l a p t - o d c r c c i o n d e a m o n i o , 1 ' 1 0 pat'ecen estar l i g a d a s al
f e n b m e n o d e s u l f a t o r - e d u c r i b n C..E i n i c i a a p r o x i m a d a m e n t e a
las 1rjO h t - s ; a l i n i c i a r s e 'La d e s a p a r i c i c 6 n d e a c e t a t o
I
r e d u c c i b n , s i n o q u e su f re primero u n 2 e t a p a de d e s a m i n a c i b n
a n t e r i o t - e s datos n o s d i c e n que hay un p e r i o d o d c l a t e n c i a d e
f u e r o n d e :
TI EMF0
TABLA & CINETICA DE DEGKADACION DE ACETAMIDA CONTROL LODOS DE SEDIMENTOS CON SULFATO
~ ~ ~ ~~ ~ - ,
1
2 2 2 7 6 7
TABLA 8 CINETIC6 DE DEGRADfXION DE ACETAMIDA
LODOS DE SEDIMENTOS CON SLJLFATO SIN WITROGEWO ~~~~ - - ~ ~
C
Lodos es ter i I i zados de sed i men tos con su 1 fa to
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CONCLUSIONES:
1 . la acetamida se degrada por digestibn anaerobia.
2. No hay degradaci6n abibtica de la acetamida
3. €1 amonio presente de las muestras control es producido por la actividad microbiol6gica.
4. La degradacibn de la acetamida por la v i a metanogCnica es mucho mas activa que por la via sulfato reduccibn.
5. La acetamida sirve como fuente de carbono y nitrbgeno ya que su biodegradaci6n puede llevarse a cabo sin agregar nitr6geno al medio.
6. De las hipdtesis propuestas se comprob6 que la via m6s factible para la degradacidn de la acetamida con los lodos que no contienen sulfato via metan6genica es:
CH3CONHz + HxCr """"_ CHzCUO + r\iH4
'" I
.
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MICROBIOL. 143: 313-318.
.. ~ .. Ir
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. .
- Agua d e s i o n i z a d a
- 5 o l u c i B n madre p a t r d n 1 L'
Fesar 3 .82 8 . de clot-ut-o
desionizada a 1 0 0 0 m 1
de amanio y aforar con agpa
mM NH3 m 1 sol Z m1 H z 0 Absot-hancia besviacion
desionirada p r o m e d i o e5 t ara ¡:.I 3 t-
4
5
6
7
8
7
1 C!