ACTIVACIÓN DE NF-B EN MACRÓFAGOS INFECTADOS CON Brucella abortus
Clave 20082270
INFORME FINAL
INTRODUCCIÓN
La brucelosis es una enfermedad infecciosa, causada por bacterias del
género Brucella, que está documentada en América Latina desde la década de
1900. Los miembros de la familia Brucellae son cocobacilos Gram negativos,
inmóviles, que no forman esporas ni tienen cápsula. El género Brucella está
constituido por 6 especies, cada una de las cuales infecta preferentemente a una
especie animal determinada. B. melitensis se aísla más frecuentemente de
ganado caprino, B. abortus de ganado vacuno, B. suis de ganado porcino, B. canis
de caninos, B. ovis de ganado ovino, y B. neotomae de ratas salvajes. Sin
embargo, cada especie de Brucella se ha aislado de muy diversas especies
animales (Corbel, M. M. J., 1991). Las cinco primeras especies de Brucella están
documentadas como patógenas para el humano, por lo que a esta infección se le
ubica entre las zoonosis (Fekete, A., 1992; Smith, R. III., 1990; Young, E. J., 1983;
Young, E. J., 1995). En la infección natural en el humano y en las demás especies
animales, la bacteria penetra por las mucosas del huésped (Akhtat, M., 1989).
Brucella invade órganos y tejidos del sistema fagocítico mononuclear, como el
bazo, el hígado y la médula ósea, donde queda secuestrada intracelularmente,
inaccesible al efecto de los antibióticos (Campbell, G. A., 1994; Corbel, M. J.,
1984).
Durante el curso de la infección, los fagocitos profesionales son los
primeros en ser infectados por Brucella, y la bacteria puede sobrevivir dentro de
esas células. Las cepas lisas virulentas de B. abortus, como la cepa 2308, se
replican intracelularmente con más eficiencia que B. abortus 19 (atenuada lisa) o
las cepas rugosas. Se ha propuesto que la inhibición de la fusión fagosoma
lisosoma es un mecanismo utilizado por B. abortus para la supervivencia
intracelular (Pizarro-Cerdá, J., 1998A).
La resistencia a patógenos intracelulares como Listeria monocytogenes,
Mycobacterium tuberculosis y Brucella abortus depende grandemente de la
inmunidad mediada por células T CD4+, que a través de mediadores como el IFN-
logran la activación de los macrófagos (Flynn, J. L., 2001; Jouanguy, E., 1999;
Stenger, S., 1999; Yang, J., 1997; Zhan, Y., 1993; Oliveira, S. C., 1998). La
activación de los macrófagos es un elemento esencial para evitar que la infección
causada por Brucella se haga crónica (Pizarro-Cerdá, J.,1998B; Delrue, R. M.,
2001; Samartino, L. E., 1994). Las citocinas producidas durante las fases
tempranas de la inducción de la respuesta inmunológica son esenciales para
definir el tipo de respuesta que se va a desarrollar, ya sea de tipo celular que
conlleva a la activación de los macrófagos infectados, o a una respuesta de
anticuerpos (Trinchieri, G., 1998).
Los macrófagos pueden ser activados por LPS, lo que resulta en un
aumento en su habilidad para matar microorganismos y células tumorales. Esta
activación está acompañada por una rápida inducción de genes que están directa
o indirectamente involucrados en la función antimicrobiana o antitumoral de los
macrófagos (TNF-, IL-1 y , IL-8 e iNOS). Una característica común de todos
estos genes inducibles por LPS es que cada uno de ellos contiene al menos un
motivo consenso decamérico para el factor nuclear B (NF-B) en su región
promotora/aumentadora (Ding, A., 1995).
La expresión de los genes es controlada por la frecuencia de la iniciación
transcripcional del promotor. En muchos casos la velocidad a la cual inicia la
transcripción está limitada por la disponibilidad o actividad de unión al DNA por los
activadores en la región promotora. Uno de tales activadores es el factor de
transcripción NF-B, mientras que la actividad de unión al DNA y la distribución
celular están controladas por las proteínas inhibidoras IB (Hay, R. T., 1999).
El NF-B es inducible en muchos tipos de células. En células pre-B, el NF-
B es inducible por LPS y ésteres de forbol. También se ha demostrado la
activación del NF-B en líneas de células T, células HeLa, macrófagos y en
monocitos durante su diferenciación (Vicente, M. P., 1992). El NF-B es, por sí
mismo, un activador transcripcional de citocinas crítico involucrado en la respuesta
inmune innata, incluyendo la producción de TNF- e IL-1 (Hatada, E. N., 2000).
El NF-B se encuentra en el citosol de muchos tipos de células como un
heterodímero inactivo compuesto de las subunidades de 50 kd (p50) y 65 kd (p65).
Este heterodímero está unido a una proteína, IB (Schütze, S., 1992). La
activación involucra la liberación de los dímeros del NF-B de la proteína IB por
la fosforilación de dicha proteína por las cinasas IB, IKK y , la ubiquitinación de
IBs por un complejo ligasa ubiquitina y la degradación por el proteasoma 26S
(Hatada, E. N., 2000). Una vez liberado, el NF-B se transloca hacia el núcleo
donde se asocia con las secuencias aumentadoras de transcripción apropiadas
(Vicente, M. P., 1992). Las cinasas que fosforilan a IBs en los residuos de serina
(Ser32 y Ser36 para IB, Ser19 y Ser23 para IB) en respuesta a LPS, TNF-,
IL-1 ó PMA fueron identificadas como IKK e IKK. IKK e IKK contienen
dominios de cinasa estrechamente relacionados, “zippers” de leucina y regiones
hélice-“loops”-hélice, y forman heterodímeros los cuales son parte de un gran
complejo de aproximadamente 800 kDa. Experimentos bioquímicos y de
transfección sugieren que las funciones de IKK e IKK no son equivalentes. IKK
es un activador del NF-B más potente y tiene mayor actividad de cinasa que
IKK (Hatada, E. N., 2000).
Los activadores más importantes del NF-B son las citocinas
proinflamatorias IL-1 y TNF- que son producidas en respuesta a una infección. El
papel del NF-B en la transmisión de señales desde el ambiente extracelular hacia
el núcleo de las células es para iniciar un nuevo programa de la expresión de
genes en la célula estimulada. Los genes activados por el NF-B incluyen
interferones y otras citocinas, proteínas de fase aguda, moléculas de adhesión,
receptores de citocinas y moléculas de histocompatibilidad (Hay, R. T., 1999).
Murphy y colaboradores han encontrado que algunas citocinas,
principalmente IFN- e IL-10, pueden ejercer su efecto sobre la respuesta de las
células T por el aumento o inhibición de la producción de IL-12 por el macrófago
respectivamente. También han demostrado la unión del factor nuclear NF-B a la
secuencia promotora del gen de IL-12 en macrófagos activados y que el IFN-
aumenta la transcripción de IL-12 p40 incrementando la unión del NF-B al sitio
promotor (Murphy, T. L., 1995).
Se ha demostrado que la combinación de IFN- e IL-2 induce o promociona
la transcripción de genes de citocinas inflamatorias en monocitos y en macrófagos,
incluyendo el TNF- y la IL-1 (Namuri, S., 1992). Namuri y col. evaluaron la
actividad del IFN- y de la IL-2 para activar proteínas nucleares en macrófagos
peritoneales, que sean capaces de unirse específicamente a las secuencias
consenso del NF-B, presentes en la región 5´ del sitio de inicio de la transcripción
de muchos genes de citocinas. Observaron que los macrófagos estimulados con
IFN- o IL-2 causaron poca activación de NF-B, la cual se evidenció por la
aparición de un complejo DNA-proteína característico en ensayos de retardo de la
movilidad electroforética; IFN- e IL-2 en combinación cooperaron para
incrementar la actividad de unión del NF-B al DNA, a un nivel equivalente que el
observado en los macrófagos estimulados con LPS, otro potente estimulador de la
expresión de genes de citocinas en los macrófagos (Namuri, S., 1992).
El TNF- es producido primariamente por macrófagos y funciona
inmunológicamente a través de la regulación transcripcional de los genes que
codifican moléculas de adhesión celular requeridas para el reclutamiento de
células inflamatorias y genes que codifican citocinas inflamatorias tales como IFN-
. El TNF- regula la expresión de genes que tienen un papel crítico durante la
respuesta inflamatoria mediada inmunológicamente. La activación del NF-B por
TNF- es esencial para montar una respuesta efectiva; desde luego muchos de
los genes regulados por TNF- contienen sitios de unión para NF-B (Cheshire, J.
L., 1997).
Datos de experimentos in vivo demuestran que se requiere de TNF- e IFN-
para la resistencia efectiva a la infección bacteriana. También se ha mostrado
que el TNF- y el IFN- juegan un papel crucial en la progresión de la respuesta
inflamatoria asociada con el choque séptico inducido por el LPS (Cheshire, J. L.,
1997). Cheshire y Baldwin demostraron que el IFN- aumenta la translocación
nuclear de NF-B inducida por TNF- en líneas celulares de endotelio vascular.
Los mecanismos involucran la degradación de novo de IB, conduciendo a la
activación persistente de NF-B y aumenta la respuesta transcripcional
dependiente de B. La activación sinérgica de NF-B por dos citocinas
proinflamatorias representa un mecanismo por el cual la expresión de genes
inducida por NF-B podría aumentar bajo condiciones inflamatorias y pueden
explicar un aspecto crítico del sinergismo entre TNF- e IFN- durante una
respuesta inmune efectiva (Cheshire, J. L., 1997).
OBJETIVO
Por todo lo anterior, los objetivos del presente proyecto fueron determinar el
papel del factor de transcripción NF-kB en la infección de macrófagos con dos
cepas de Brucella abortus de diferente virulencia y determinar la vía de activación
que ocurre en cuando los macrófagos son infectados con la cepa virulenta y la
cepa vacunal de Brucella abortus.
El esquema general de trabajo que se siguió en el presente estudio se ilustra en la
siguiente figura.
MATERIALES Y MÉTODOS
Cepas bacterianas y línea celular.
Para el trabajo se utilizaron la cepa vacunal B. abortus RB51 y la cepa
virulenta B. abortus 2308, ambas donadas amablemente por Gerhardt Schurig
(Virginia Tech, E.U.A.). Las cepas se crecieron y mantuvieron en agar de soya y
tripticaseína. Para su crecimiento se incubaron a 37°C. Previamente a su uso para
infectar a los macrófagos se cosecharon con PBS y se lavaron y resuspendieron
con medio RPMI suplementado.
Los macrófagos de la línea celular J774A.1, donada amablemente por Gerhardt
Schurig, se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Gibco BRL) suplementado con L-
glutamina 2 mM (Sigma Chemical) y suero de caballo al 7% (Gibco BRL), y
adicionado con antibióticos (100 U/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina) y
250 ng/ml de anfotericina B.
Infección de macrófagos con B. abortus.
Se distribuyeron 2.4 x 107 macrófagos J774A.1 en cada caja de petri para
cultivo celular (Nunc) de 144 x 21 mm, se infectaron con 2.4 x 109 ufc de B.
abortus RB51 ó de B. abortus 2308, y se incubaron durante diferentes tiempos a
370C en atmósfera de CO2. Para los tiempos mayores a media hora se incubó a
los macrófagos con las bacterias durante media hora, después se lavaron con
RPMI precalentado a 37°C, y se les agregó medio RPMI suplementado y sin
antibióticos. Las células se lavaron 3 veces con PBS y se extrajeron las proteínas
nucleares y citoplásmicas. Para el análisis de los genes expresados mediante RT-
PCR, se utilizaron 4x106 células que se infectaron con 4x108 ufc de B. abortus
RB51 ó 2308. Los tiempos de infección para esta evaluación fueron de 30 min,
1.5, 3, 6 y 24 h.
Estimulación de macrófagos con B. abortus RB51 ó 2308 inactivadas por
calentamiento.
Se colocaron 2.4 x 107 macrófagos J774A.1 en cajas de petri para cultivo
celular y se les agregaron 2.4 x 109 ufc de B. abortus RB51 ó de la cepa 2308,
inactivadas por calentamiento a 70oC durante 30 min; las células se incubaron a
diferentes tiempos a 370C en atmósfera de CO2. Para los tiempos mayores a
media hora los macrófagos se incubaron con las bacterias muertas durante media
hora, después se lavaron y se les agregó medio RPMI suplementado, sin
antibióticos, y se incubó el tiempo restante. Las células se lavaron 3 veces con
PBS y se extrajeron las proteínas nucleares y citoplásmicas. Para el análisis de los
genes expresados mediante RT-PCR, se utilizaron 4x106 células a las que se les
agregaron 8x108 ufc de B. abortus RB51 ó 2308, los tiempos de incubación
utilizados para esta evaluación fueron de 30 min, 1.5, 3, 6 y 24 h.
Preparación de extractos citoplásmicos y nucleares de macrófagos.
Los macrófagos lavados con PBS frío, se desprendieron con un raspador
de células, y se centrifugaron durante 5 min a 1500 x g a 8oC (Eppendorf,
Westbury, NY). Las células se resuspendieron en el amortiguador A (HEPES 10
mM, KCl 10 mM, MgCl2 1.5 mM, DTT 1 mM, pH 7.9), y se congelaron en un baño
de hielo seco-acetona. Posteriormente, se descongelaron en baño de hielo, y se
centrifugaron a 1200 x g, a 4oC, durante 10 min. Se recolectaron los
sobrenadantes como extractos citoplásmicos, y la pastilla conteniendo a los
núcleos se resuspendió en el amortiguador C (HEPES 20 mM, NaCl 0.4 M, MgCl2
1.5 mM, 25% de glicerol, EDTA 0.2 mM, DTT 1mM, pH 7.9), adicionado con el
inhibidor de proteasas PMSF 0.5 mM. Esta mezcla se incubó a 4oC durante 30 min
con agitación suave en una plataforma angular, y se centrifugó a 20,000 x g a 4oC
por 20 min. El sobrenadante se recolectó como el extracto nuclear. A los extractos
citoplásmicos y nucleares se les agregó el amortiguador D (HEPES 20 mM, KCl 50
mM, 25% de glicerol, EDTA 0.2 mM, DTT 1 mM, inhibidor de proteasas PMSF 0.5
mM, pH 7.9), para su almacenamiento a –70oC. La concentración de proteínas se
midió mediante la reacción con el ácido bicinconínico (Pierce), utilizando albúmina
sérica bovina como estándar.
Análisis de las proteínas MyD88, pNIK, pIB, NF-B y pStat1 por
Inmunoblot.
Los extractos de proteínas citoplásmicas y nucleares fueron sujetos a
electroforesis en gel de poliacrilamida al 10%, con dodecil sulfato de sodio (SDS-
PAGE), y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, que se bloqueó
durante 1 h a temperatura ambiente con 3% de leche descremada en
amortiguador de TBS (Tris 20mM, NaCl 0.14M, pH 7.6) adicionado de 0.05% de
Tween 20 (TBS-T),. Las membranas se lavaron con TBS-T y se incubaron durante
toda la noche a 4°C con los anticuerpos de conejo específicos para las proteínas
MyD88, pNIK, pIB, NF-B y pStat1 (Santa Cruz Biotechnology, INC., Santa
Cruz, California) diluidos 1:1000 en el amortiguador TBS con 3% de leche.
Después de lavar con TBS-T, las membranas se incubaron con el anticuerpo
secundario IgG de cabra anti IgG de conejo conjugado con peroxidasa de rábano
(HRP, Santa Cruz Biotechnology) durante 1 h a temperatura ambiente. Se agregó
el sustrato Luminigen PS-3 (Amersham, Biosciences, Buckinghamshire, England),
preparado de acuerdo a las indicaciones del fabricante, sobre la membrana
dejando actuar durante 5 min. Se eliminó el exceso de reactivo y la membrana se
envolvió en plástico autoadherente y se puso en contacto con una placa
radiográfica, exponiendo durante 5 min. La placa se reveló y se fijó.
Ensayo de retardamiento de la movilidad electroforética (EMSA).
Las proteínas citoplásmicas o nucleares se incubaron con un
oligonucleótido de doble cadena marcado con [-32P] ATP. Para marcar el
oligonucleótido, se colocaron en un tubo de microcentrífuga 2 l (1 g) del
oligonucleótido de doble cadena, 1 l del amortiguador de la enzima T4
polinucleotidilcinasa (Gibco BRL), 1 l de la enzima T4 (Gibco BRL), 1 l de [-32P]
ATP (Amersham Biosciences) y 6 l de agua inyectable; se incubó 1 h a
temperatura ambiente y se llevó a un volumen final de 100 l, para almacenar a –
20oC. El oligonucleótido marcado se incubó con el extracto citoplásmico o el
extracto nuclear, colocando 5 g de proteína con 0.05 g/l de poli (dI-dC), se
incubó durante 15 min en hielo y se agregaron 2 l del oligonucleótido marcado
con[-32P] ATP. La mezcla se incubó 30 min a temperatura ambiente. Los
oligonucleótidos (BioSynthesis) contenían las siguientes secuencias: para unión
de NF-B: 5´-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3´; para unión de pSTAT1:
5´- GTG CAT TTC CCG TAA ATC TTG TCT ACA-3´; y para unión de AP1: 5´-
CGC TTG ATG ACT CAG CCG GAA-3´. Los complejos DNA-proteína se corrieron
electroforéticamente en un gel de poliacrilamida (29:1) al 6% en amortiguador de
TBE 0.5x (Tris 40 mM, ácido bórico 40 mM, EDTA 1 mM).
Aislamiento de RNA celular total y RT-PCR.
La evaluación del mRNA de TLR2 y TLR4 se realizó mediante RT-PCR
semicuantitativo. A 2 g del RNA celular total extraído de los cultivos de
macrófagos infectados o estimulados con la bacteria inactivada por calentamiento,
se les realizó la transcripción inversa. Las amplificaciones mediante PCR se
realizaron utilizando los iniciadores sentido y antisentido para los mRNA de cada
TLR.
I. OBTENCIÓN DE RNA TOTAL. Los macrófagos infectados o estimulados se
colocaron en tubos de microcentrífuga (6 x 106 células), a los que se les
adicionaron 2 ml de Trizol (Gibco), después se distribuyeron en dos tubos de
microcentrífuga, y se agitaron en agitador Vortex durante 30 s. Las muestras de
cada uno de los tiempos de incubación se guardaron a –20ºC para procesarlas
simultáneamente. A cada tubo se le agregaron 200 l de cloroformo, se agitó en
agitador Vortex 15 s y se centrifugó en frío a 11,300 x g durante 15min. Se separó
la fase acuosa colocándola en otro tubo de microcentrífuga al cual se le agregaron
500 l de alcohol isopropílico incubándose 10 min a temperatura ambiente; se
centrifugó a 11,300 x g durante 15 min y se eliminó el sobrenadante; al RNA
precipitado se le adicionó 1 ml de etanol al 80% y se centrifugó a 7,060 x g
durante 5 min. Se retiró el sobrenadante, y el líquido remanente se secó durante
6-10 min.
II. RETROTRANSCRIPCIÓN (OBTENCIÓN DE cDNA). El RNA de cada muestra
se resuspendió en 15 l de agua-DEPC, y se tomaron 2 l que se diluyeron 1:200
para determinar la concentración de RNA. A 2 g de RNA, se le agregaron 11 l
de agua inyectable y 2 l de la solución concentrada de oligo-dT (0.5 g/l, Gibco),
y se incubó a 65ºC durante 10 min en el termociclador (Perkin Elmer, London).
Después se adicionaron 15 l de la mezcla de reacción para obtener el cDNA
(volumen final de 30 l), que consistió en lo siguiente:
Volumen Concentración final
Agua-DEPC 3.8 l
5x-StBuffer 6.0 l 1x
dNTP´s 10 mM 1.2 l 400 M
MMLV-RT 200 U/ml 1.0 l 0.2 U/l
DTT 100 mM 3.0 l 10 M
La reacción continuó en el termociclador a 37ºC durante 1h, y 5min a 95ºC. Una
vez terminada la reacción, se agregaron 70l de agua-DEPC para tener un
volumen final de 100 l.
III. PCR. En la última etapa del proceso, se determinó la presencia del cDNA para
TLR2 y tlr4, y para la enzima gliceraldehído 3-fosfato deshidrogensa (G3PDH).
Para ello se preparó la mezcla de reacción que consistió en lo siguiente:
Volumen
Agua-DEPC 35.3 l
Regulador PCR 10x 5.0 l
MgCl2 50 mM 2.5 l
dNTP´s 10 mM 1.0 l
Iniciador 5´ 20 mM 0.5 l
Iniciador 3´ 20 mM 0.5 l
Taq polimerasa 5 U/ml 0.2 l
cDNA 5.0 l
Volumen final de reacción 50.0 l
Los iniciadores utilizados tenían la siguiente secuencia de bases:
Iniciador Secuencia Tamaño
(pb)
G3PDH 5´Primer: 5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’ 452
3’ antisense: 5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG T-3’
TLR2 5´Primer: 5´-TCT AAA GTC GAT CCG CGA CAT-3´ 343
3´Primer: 5´-TAC CCA GCT CGC TCA CTA CGT-3´
TLR4 5´Primer:´5´-CAA GAA CAT AGA TCT GAG CTT CAA-3´ 277
3´Primer: ´5´-GCT GTC CAA TAG GGA AGC TTT CTA GAG-3´
La PCR se efectuó en el termociclador, con los siguientes ciclos:
Temperatura Tiempo
30 ciclos: 94oC 45 s
60oC 45 s
72oC 90 s
1 ciclo: 72oC 7 min.
Análisis estadístico.
Se emplearon las pruebas de análisis de varianza (ANOVA) unifactorial y
ANOVA bifactorial, utilizando comparaciones con la prueba de Tukey para
determinar la significancia estadística, según se indica en cada experimento. Para
los ensayos de TLR, se utilizó la prueba de t de Student para analizar los dos
grupos (B. abortus RB51 y 2308) en cada uno de los tiempos estudiados.
RESULTADOS
B. abortus RB51 y B. abortus 2308 inducen la activación del factor nuclear
NF-B mediante la vía dependiente de MyD88.
Para determinar el efecto de la infección con B. abortus sobre la
señalización que lleva a la activación del factor NF-B se infectaron macrófagos
de la línea celular J774A.1 con B. abortus RB51 ó con B. abortus 2308 y se
determinó la activación de las proteínas MyD88, NIK y IB, así como la
translocación nuclear de NF-B. Aunque la infección con ambas cepas
bacterianas indujo la activación de MyD88, pNIK y pIB, los tiempos en que esto
ocurrió fueron diferentes (Fig 1). En las células infectadas con B. abortus RB51 las
proteínas activadas se detectaron a los 5 min postinfección (p.i.), mientras que las
células infectadas con B. abortus 2308 mostraron un retraso en la activación de
estas proteínas. MyD88 y pNIK se detectaron hasta los 30 min p.i., y pIB se
detectó a los 15 min. Debido a que NF-B debe translocarse hacia el núcleo para
activar la transcripción génica de las citocinas pro-inflamatorias, se investigó el
efecto de la infección por B. abortus sobre la translocación de este factor. Como
se muestra en la Fig. 1, el NF-B se translocó al núcleo de las células infectadas
con B. abortus RB51, desde los 5 min p.i., y es detectable hasta los 30 min (Fig. 1,
NF-B (EN)).
Se observó una segunda fase de liberación y translocación de NF-B a los
90 min, y una tercera fase de respuesta a las 6 h. En las células infectadas con B.
abortus 2308 se observó translocación nuclear del NF-B a partir de los 5 min,
manteniéndose hasta los 90 min, y una segunda fase de respuesta de las 2 a las 6
h p.i. Estos resultados indican que las dos cepas de B. abortus indujeron la
liberación y translocación nuclear del NF-B.
FIGURA 1. Señalización a través de la vía dependiente de MyD88 en macrófagos infectados con
B. abortus RB51 ó con B. abortus 2308 y translocación nuclear del factor NF-B. Las proteínas
totales citoplásmicas o nucleares (60 g) se separaron electroforéticamente en SDS-PAGE y se
transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron con el anticuerpo
específico para las proteínas MyD88, pNIK, pIB y NF-B y el anticuerpo unido fue visualizado
por quimioluminiscencia. Los resultados muestran uno de tres experimentos, con resultados
similares. EC: extracto citoplásmico, EN: extracto nuclear.
B. abortus RB51 y 2308 inactivadas por calentamiento activan NF-B.
La estimulación con B. abortus RB51 inactivada por calentamiento activó al
NF-B así como la translocación de este factor hacia el núcleo (Fig. 2). El mismo
comportamiento se observó en células estimuladas con la cepa 2308 inactivada
por calentamiento. En ningún caso se detectó la proteína pNIK lo que indica que
tal vez esté involucrada otra vía en la activación del factor NF-B.
FIGURA 2. Señalización a través de la vía dependiente de MyD88 y translocación nuclear del
factor NF-B en macrófagos estimulados con B. abortus RB51 ó con B. abortus 2308 inactivadas
por calentamiento. Las proteínas totales citoplásmicas o nucleares (60 g) se separaron
electroforéticamente en SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las
membranas se incubaron con el anticuerpo específico para las proteínas MyD88, pNIK, pIB y
NF-B y el anticuerpo unido fue visualizado por quimioluminiscencia. Los resultados muestran uno
de tres experimentos, con resultados similares. EC: extracto citoplásmico, EN: extracto nuclear.
B. abortus RB51 y 2308 inducen la translocación nuclear de STAT1.
Para caracterizar el efecto de la infección con las dos cepas de B. abortus
sobre la señalización mediada por JAK-STAT, se examinó la fosforilación de
STAT1, y, debido a que STAT1 fosforilada debe dimerizarse y translocarse desde
el citoplasma hacia el núcleo para activar la transcripción, se investigó el efecto de
la infección con las cepas de B. abortus sobre la translocación hacia el núcleo de
STAT1. Como muestra la figura 3, B. abortus RB51 indujo la fosforilación intensa
de STAT1 desde los 5 min. p.i. en el extracto citoplásmico A partir de este tiempo
la activación de STAT1 fue disminuyendo hasta desaparecer a los 90 min. Una
segunda fase de respuesta se observó a las 2 h p.i. La translocación de pSTAT1
hacia el núcleo fue aparente a los 45 min p.i., con un máximo a las 2 h. En las
células infectadas con la cepa 2308 no se observó fosforilación de STAT1. A pesar
de ello se observó translocación de pSTAT1 hacia el núcleo en menor cantidad a
partir de los 105 min.
FIGURA 3. Fosforilación de STAT1 en macrófagos J774A.1 infectados con B. abortus RB51 o B.
abortus 2308. Las proteínas totales citoplásmicas y nucleares (60 g) se separaron
electroforéticamente por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las
membranas se incubaron con el anticuerpo específico para pSTAT1 y el anticuerpo unido fue
visualizado por quimioluminiscencia. Los resultados muestran uno de tres experimentos, con
resultados similares. EC: extracto citoplásmico, EN: extracto nuclear
B. abortus RB51 inactivada por calentamiento induce la fosforilación de
STAT1 pero no su translocación hacia el núcleo.
La estimulación con la cepa B. abortus RB51 inactivada por calentamiento
indujo la fosforilación de STAT1 (Fig. 4). La proteína activada se observó en el
citoplasma a partir de los 30 min y hasta las 6 h p.i., pero no se observó
B. abortus 2308
0 5 15 30 45 60 75 90 105 2 3 6 12 24
min h
B. abortus RB51
pSTAT1 (EC)
pSTAT1 (EN)
0 5 15 30 45 60 75 90 105 2 3 6 12 24
min h Tiempo
translocación nuclear. En las células estimuladas con la cepa 2308 inactivada por
calentamiento no se observó fosforilación de STAT1 y por tanto no translocó hacia
el núcleo (Fig. 4). El hecho de haber observado que la estimulación con cualquiera
de las cepas de B. abortus inactivadas por calentamiento no conlleva a la
activación y translocación nuclear del STAT1, sugiere que la respuesta vía STAT1
de las células requiere de una participación activa de la bacteria.
FIGURA 4. Fosforilación de STAT1 en macrófagos J774A.1 estimulados con B. abortus RB51 ó
con B. abortus 2308, inactivadas por calentamiento. Las proteínas totales citoplásmicas y
nucleares (60g) se separaron electroforéticamente por SDS-PAGE y se transfirieron a
membranas de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron con el anticuerpo específico para
pSTAT1 y el anticuerpo unido fue visualizado por quimioluminiscencia. Los resultados muestran
uno de tres experimentos, con resultados similares. EC: extracto citoplásmico, EN: extracto nuclear
B. abortus RB51 induce la translocación del NF-B hacia el núcleo y no
afecta su unión al DNA.
Debido a que el NF-B se activa y se transloca hacia el núcleo para activar
la transcripción, nosotros investigamos el efecto de la infección por las cepas
RB51 y 2308 de B. abortus sobre la translocación nuclear de NF-B. Como
muestra la figura 5, el NF-B libre está presente en el citoplasma y el núcleo de los
macrófagos infectados con B. abortus RB51, indicando que esta cepa induce la
activación y translocación del NF-B hacia el núcleo. Esos resultados demuestran
que la infección con B. abortus RB51 no afecta la habilidad de NF-B de
pStat1 (EC)
pStat1 (EN)
B. abortus RB51 B. abortus 2308
0 0.5 1.5 3 6 24
Tiempo (h)
0 0.5 1.5 3 6 24
translocarse al núcleo y unirse a las secuencias específicas de DNA. En el caso
de la cepa virulenta 2308 de B. abortus (Fig. 5) se observaron dos bandas en las
muestras de extracto citoplásmico, lo que indica que se presentan dos dímeros del
factor NF-B que por su peso molecular corresponderían a los dímeros p50-p50 y
p65-p50. Sin embargo en las muestras de extracto nuclear se observó solamente
una banda que corresponde al dímero p65-p50. La banda observada en las
muestras citoplásmicas y nucleares de los macrófagos infectados con la cepa
RB51 corresponde al peso molecular del heterodímero p65-p50.
FIGURA 5. Análisis por retardamiento de la movilidad electroforética (EMSA) de la liberación y
translocación nuclear del factor NF-B en macrófagos J774A.1 infectados con B. abortus RB51 ó
con B. abortus 2308. Después de cada tiempo de infección se extrajeron las proteínas
citoplásmicas y las nucleares a partir de igual número de células y se analizaron por EMSA
utilizando un oligonucleótido marcado con [-32P] ATP. Se muestra la porción del gel con el
retardamiento. EC: extracto citoplásmico, EN: extracto nuclear.
Actividad de unión al DNA inducida en macrófagos estimulados con B.
abortus RB51 ó con B. abortus 2308 inactivadas por calentamiento.
La estimulación de los macrófagos con B. abortus RB51 inactivada por
calentamiento indujo un aumento en la formación de complejos de NF-B en los
extractos citoplásmicos y nucleares (Fig. 6). Estos resultados demuestran que la
estimulación con la cepa RB51 inactivada por calentamiento induce la activación,
translocación y la unión al DNA del NF-B. En las células estimuladas con la cepa
2308 inactivada por calentamiento el NF-B se translocó al núcleo, aunque no se
logró detectar en el citoplasma (Fig. 6).
FIGURA 6. Análisis por retardamiento de la movilidad electroforética (EMSA) de la liberación y
translocación nuclear del factor NF-B en macrófagos J774A.1 inoculados con B. abortus RB51 ó
con B. abortus 2308, inactivadas por calentamiento. Después de cada tiempo de infección se
extrajeron las proteínas citoplásmicas y las nucleares a partir de igual número de células y se
analizaron por EMSA utilizando un oligonucleótido marcado con [-32P] ATP. Se muestra la porción
del gel con el retardamiento. EC: extracto citoplásmico, EN: extracto nuclear.
La actividad de unión al DNA de STAT1 se incrementa en los macrófagos
infectados con las cepas RB51 ó 2308 de B. abortus.
Debido a que la infección con las cepas RB51 ó 2308 de B. abortus no
inhibieron la fosforilación y la translocación de STAT1 hacia el núcleo, se examinó
el efecto de la infección por las dos cepas sobre la actividad de unión al DNA de
STAT1 mediante EMSA. El tratamiento de los macrófagos con ambas cepas
bacterianas indujo la formación de los complejos de STAT1 en el citoplasma, y por
tanto su translocación al núcleo (Fig. 7). La infección de los macrófagos con
cualquiera de las cepas de B. abortus resultó en un aumento en la formación del
complejo DNA-proteína, reflejando un incremento en la cantidad de STAT1
citoplásmica y nuclear. La cepa 2308 indujo una mayor translocación de STAT1
que la cepa RB51.
FIGURA 7. Análisis por retardamiento de la movilidad electroforética (EMSA) de la activación y
translocación nuclear de pSTAT1 en macrófagos J774A.1 infectados con B. abortus RB51 ó con B.
abortus 2308. Después de cada tiempo de infección se extrajeron las proteínas citoplásmicas y las
nucleares a partir de igual número de células y se analizaron por EMSA utilizando un
oligonucleótido marcado con [-32P] ATP. Se muestra la porción del gel con el retardamiento. EC:
extracto citoplásmico, EN: extracto nuclear.
Actividad de unión al DNA de pSTAT1 en macrófagos estimulados con B.
abortus RB51 ó 2308 inactivadas por calentamiento.
B. abortus RB51 y 2308 inactivadas por calentamiento incrementaron la
actividad de unión de STAT1 al DNA (Fig. 8). En el caso de las células
estimuladas con B. abortus RB51 muertas, el incremento se observó a partir de los
30 min post-infección, manteniendose así hasta las 3h, posteriormente disminuyó
a las 6h y después desapareció totalmente la unión al DNA. En los macrófagos
estimulados con B. abortus 2308 inactivada por calentamiento se observó la
translocación al núcleo así como la actividad de unión de STAT1 al DNA a partir
de las 3h aumentando con respecto al tiempo de estimulación (Fig. 8).
pSTAT1 (EC)
pSTAT1 (EN)
B. abortus RB51
0 5 15 30 45 60 75 90 105 2 3 6 12 24
min hTiempo
B. abortus 2308
0 5 15 30 45 60 75 90 105 2 3 6 12 24
min h
FIGURA 8. Análisis por retardamiento de la movilidad electroforética (EMSA) de la activación y
translocación nuclear de pSTAT1 en macrófagos J774A.1 estimulados con B. abortus RB51 ó con
B. abortus 2308 inactivadas por calentamiento. Después de cada tiempo de infección se extrajeron
las proteínas citoplásmicas y las nucleares a partir de igual número de células y se analizaron por
EMSA utilizando un oligonucleótido marcado con [-32P] ATP. Se muestra la porción del gel con el
retardamiento. EC: extracto citoplásmico, EN: extracto nuclear.
Las cepas RB51 y 2308 de B. abortus inducen la activación del factor AP1.
El factor AP1 es activado a través de la vía de las MAPK, que es una de las
vías que se activa a través de los TLR, además de que participa en la activación
del gen de IL-6 junto con el factor NF-B. En este estudio se demostró que la
infección con B. abortus RB51 ó con B. abortus 2308 indujo la activación del factor
AP1, y por consiguiente su unión a la secuencia de DNA específica. La cantidad
de AP1 activo en macrófagos infectados con B. abortus RB51 incrementó desde
los 5 minutos p.i., y alcanzó un máximo de respuesta a las 2 h. Si bien en los
macrófagos infectados con B. abortus 2308 se vio activación de AP1, la
concentración aparente no se modificó a lo largo del tiempo analizado (Fig. 9).
pSTAT1 (EC)
pSTAT1 (EN)
B. abortus RB51 B. abortus 2308
0 0.5 3 6 12 24
Tiempo (h)
0 0.5 3 6 12 24
Figura 9. Análisis por retardamiento de la movilidad electroforética (EMSA) de la activación y
translocación nuclear de AP1 en macrófagos J774A.1 infectados con B. abortus RB51 ó con B.
abortus 2308. Después de cada tiempo de infección se extrajeron las proteínas citoplásmicas y las
nucleares a partir de igual número de células y se analizaron por EMSA utilizando un
oligonucleótido marcado con [-32P] ATP. Se muestra la porción del gel con el retardamiento. EC:
extracto citoplásmico, EN: extracto nuclear.
Las cepas RB51 y 2308 de B. abortus inactivadas por calentamiento no
inducen la activación del factor AP1.
La estimulación de los macrófagos con ambas cepas de B. abortus
inactivadas por calentamiento no indujeron la activación del factor AP1 ya que no
se observó retardamiento del movimiento electroforético al unirse a su secuencia
específica de DNA (Fig. 10). Comparando estos resultados con los obtenidos con
las bacterias vivas es posible concluir que debe existir un elemento producido por
la bacteria viva durante la infección el cual induce la activación del factor AP1.
AP1 (EN)
B. abortus RB51
0 5 15 30 45 60 75 90 105 2 3 6 12 24
min. hTiempo
B. abortus 2308
0 5 15 30 45 60 75 90 105 2 3 6 12
min. h
Figura 10. Análisis por retardamiento de la movilidad electroforética (EMSA) de la activación y
translocación nuclear de AP1 en macrófagos J774A.1 estimulados con B. abortus RB51 ó con B.
abortus 2308 inactivadas por calentamiento. Después de cada tiempo de infección se extrajeron
las proteínas citoplásmicas y las nucleares a partir de igual número de células y se analizaron por
EMSA utilizando un oligonucleótido marcado con [-32P] ATP. Se muestra la porción del gel con el
retardamiento. EN: extracto nuclear.
IMPACTO.
Por lo que podemos concluir que B. abortus RB51 indujo la formación de
heterodímeros p65-p50 del factor NF-B que se unió al DNA; en cambio, B.
abortus 2308 indujo preferentemente la formación del homodímero p50-p50 en
mayor proporción que el heterodímero p65-p50, por lo que compitió en la unión de
la secuencia del DNA. Ambas cepas de B. abortus indujeron la fosforilación de
STAT1 y su unión al DNA, pero la cepa 2308 ejerció un mecanismo regulador
sobre STAT1, ya que no indujo la expresión del gen de IFN-.
Por otro lado, B. abortus RB51 inactivada por calentamiento indujo la
expresión de TLR4, no así la cepa 2308, aunque ésta cepa (B. abortus 2308) viva
e inactivada por calentamiento no fue reconocida por TLR2 ni por TLR4, y por
tanto hay otro tipo de TLR involucrado en su reconocimiento por la célula huésped.
AP1 (EN)
B. abortus RB51 B. abortus 2308
0 0.5 3 6 12 24
Tiempo (h)
0 0.5 3 6 12 24