La oveja Dolly
1996
Premio Nobel de Química (2008), Shimomura, Martin Chalfie, Prasher
Aequorea victoria
Sistemas de restricción-modificación (M-R)
• análogo a un “sistema inmune”
• usado in vivo por bacterias para protegerse de ataques de DNA exógenos
• ¿Cómo defenderse del DNA exógeno ?
• ¿Cómo proteger el DNA propio?
• Restricción: reconocimiento de DNA exógeno “extraño” y destrucción del mismo
• Modificación: El DNA propio es “marcado” químicamente (adición de grupos metilo)
Par endonucleasa + metilasa
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Sistemas de restricción TIPO I:
Complejos multi-proteicos que
contienen:
• Dos subunidades REasas (R),
cortan el ADN
•Dos subunidades
metiltransferasas MTasas (M)
que metilan al ADN.
•Cortan al DNA aleatoriamente
en sitios lejanos (1000 pb) del
sitio de reconocimiento
RE
MT
ATP y Mg 2+
-CH3
Los sistemas R-M tipo I son ampliamente distribuidos en procariotes, se han
descubierto aproximadamente 600 genes putativos.
TIPO II:
Complejos multi-proteicos que
contienen:
• Dos subunidades que forman
la REasa (R), corta el ADN
•Tienen las REasas y MTasas
por separado
•Una subunidad específica (S)
que reconoce la secuencia que
va a cortar. Corta en el sitio de
reconocimiento.
RE
MT
Enzima Origen Bacteriano Sitio de Reconocimiento
Resultado del Corte
EcoRI Escherichia coli 5'GAATTC 3'CTTAAG
5'---G AATTC---3‘ 3'---CTTAA G---5'
BamHI Bacillus amyloliquefaciens
5'GGATCC 3'CCTAGG
5'---G GATCC---3' 3'---CCTAG G---5'
DpnI Diplococcus pneumoniae
5'GATC 3'CTAG
5'---GA TC--3' 3'---CT AG---5’
HindIII Haemophilus influenzae
5'AAGCTT 3'TTCGAA
5'---A AGCTT---3' 3'---TTCGA A---5'
TaqI Thermus aquaticus 5'TCGA 3'AGCT 5'---T CGA---3' 3'---AGC T---5'
NotI Nocardia otitidis 5'GCGGCCGC 3'CGCCGGCG
5'---GC GGCCGC--3' 3'---CGCCGG CG--5'
XbaI Xanthomonas badrii 5'TCTAGA 3'AGATCT
5'---T CTAGA---3' 3'---AGATC T---5'
Secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción TipoII
Secuencias palindrómicas de 4 a 8 pb
http://rebase.neb.com/rebase/
Nomenclatura Ejemplo Corresponde a:
E Escherichia Género de la bacteria
co coli Especie de la bacteria
R RY13 Cepa de la bacteria
I La primera enzima identificada Orden de identificación de la enzima en la bacteria
ANITA LAVA
LA TINA
TIPO III:
Complejos multi-proteicos que
contienen:
• subunidades REasas (R), cortan
el ADN
•subunidades MTasas (M) que
metilan al ADN.
•Cortan cerca del sitio de
reconocimiento.
•La modificación requiere SAM y la
restricción Mg2+ y ATP.
ATP, Mg 2+
RE
MT
-CH3
Sistemas de restricción
Tipo I Tipo II Tipo III
Complejos multisubunidad Actividad de endonucleasa y metilasa en el mismo complejo
Enzimas endonucleasa Complejos multisubunidad Actividad de endonucleasa y metilasa en el mismo complejo
Cortan al DNA aleatoriamente en sitios lejanos (1,000 pb) del sitio de reconocimiento
Cortan en la secuencia de reconocimiento
Cortan cerca (25 a 27 pb) del sitio de reconocimiento, dejando extremos cohesivos
Requieren ATP, para moverse desde el lugar de reconocimiento, hasta la de corte
Requieren ATP, para moverse desde el lugar de reconocimiento, hasta la de corte
Tipos de corte
APLICACIONES:
•ADN recombinante
•Estudio de deleciones
•Estudio de mutaciones
•Diagnostico de enfermedades genéticas
•Entre otros…
VECTORES DE CLONACIÓN
Vectores de clonación y/o expresión • En procariontes:
– Plásmidos bacterianos – Bacteriófagos – Cósmidos – BACs
• En eucariontes – levaduras
• YACs
Tamaño de inserto para las clonación en diferentes plásmidos
Tipo de Vector DNA Clonado (kb)
Plásmido 20
Fago λ 25
Cósmido 45
BAC (bacterial artificial chromosome)
300
YAC (yeast artificial chromosome) 1000
CARACTERISTICAS DE LOS VECTORES DE CLONACIÓN
• Vector de clonación- molécula de DNA transportadora
1. Replicación independiente (ori*)
2. Sitios de corte únicos
3. Marcador de selección
4. Recuperación sencilla
Bacteriófagos
El tercio central de su cromosoma puede ser reemplazado por ADN foráneo, sin afectar la capacidad del fago de infectar células y formar calvas. 25 kb
Cósmidos
Vectores híbridos, tiene
secuencias COS, un origen
de replicación y sitos de
restricción (45 kb)
BAC (cromosoma bacteriano artificial)
•OriS: origen de replicación del factor F •parA, B, E: control de la replicación •CMr: gen de resistencia a cloranfenicol •Polilinker en su interior.
300 kb
YAC (cromosoma artificial de levadura)
•ARS1: secuencia de replicación autónoma •CEN4: centrómero del cromosoma , permite la segregación del plásmido durante la división celular •TELs: secuencias teloméricas. •HIS3, TRP1, URA3: marcadores de selección en levadura confieren prototrofía para histidina, triptófano y uracilo
1000 kb
PROYECTO
DEL
GENOMA
HUMANO
PCR (REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA)
Fue desarrollada en 1983 por Kary Mullis, el objetivo de esta
técnica es obtener un gran número de copias de un fragmento de
ADN.
Sus aplicaciones:
•Clonación de ADN para secuenciación
•Filogenia basada en ADN
•Análisis funcional de genes
•Diagnóstico de transtornos hereditarios
•Identificación de huellas génicas
•Entre otros…
•Se usan: DNA pol (pol Taq), cebadores, iones monovalentes, DNA
molde, buffer, los 4 desoxirribonucleósidos.
Secuenciación Método Sanger
1.- Fraccionamiento de los
polinucleótidos a secuenciar.
2.- Secuenciación de los
fragmentos pequeños.
3.- Orden de los nucleótidos
A T C G G G G C C T T A T C G C
T A G C C C C G G
A
H H A
OH H
A
OH H
A
OH H
T
OH H
T
OH H
A
OH H
A
H H
G
OH H
G
OH H
Secuenciación Método Sanger
MUESTRAS SECUENCIAS DE DNA NUCLEOTIDO
ATCCACGTGACCGTATATGCCTGAGATCCCTTCGT 35
*TAG
TAGG* 1 5
---------TGCAC* 2 10
-------------------TGGCA* 3 15
-----------------------------TA* 4 17
---------------------------------TACGGAC* 5 24
-----------------------------------------------TC* 6 26
-------------------------------------------------TAGGGAAGCA 7 35
TAGGTG* 8 7
------------CA* 9 9
----------------CTGG* 10 13
------------------------CATATA* 11 19
------------------------------------CGGA* 12 23
--------------------------------------------CT* 13 25
------------------------------------------------CTAGGGAAG* 14 34
-------------------------------------------------------------------CA 15 35
TAG* 16 4
------GT* 17 6
----------GCACT* 18 11
--------------------G* 19 12
----------------------GCATATAC* 20 20
--------------------------------------G* 21 21
----------------------------------------GACTCTA* 22 28
------------------------------------------------------G* 23 29
--------------------------------------------------------G* 24 30
----------------------------------------------------------GAA* 25 33
-----------------------------------------------------------------GCA 26 35
TAGGTGC* 27 8
--------------ACTGGC* 28 14
--------------------------AT* 29 16
------------------------------AT* 30 18
----------------------------------ACGG* 31 22
------------------------------------------ACTCT* 32 27
----------------------------------------------------AGGG* 33 31
-------------------------------------------------------------A* 34 32
-------------------------------------------------------------- AGC* 35 35
Con ddT
Con ddC
Con ddG
Con ddA
SANGER ROCHE 454 ILLUMINA SOLID
LONGITUD PRECIO
6 Mb/día $ 500/Mb
750 Mb/día $ 20/Mb
5, 000 Mb/día $ 0.50/Mb
5000 Mb/día $ 0.50/Mb
FUNDAMENTO •Uso de didesoxiribonucleótidos no poseen el OH en el extremo 3´. •Síntesis in vitro de ADN usando cadena molde. •Primers •Polimerasa •desoxiribonucleótidos
Determinación de ADN mediante luminiscencia
Técnica similar a la Sanger. •Se usan terminadores reversibles. •Se usa fluorescencia.
Se basa en la ligación de octámeros marcados de la secuencia conocida de ADN y se detecta la señal fluorescente tras cada ligación.
APLICACIONES •Pequeñas muestras •Genomas pequeños
Genomas completos cortos Pequeños RNAs mRNAs Análisis de metilación
Genomas completos Pequeños RNAs mRNAs SNP
Genomas completos Pequeños RNAs mRNAs SNP
PROBLEMAS •Unión no específica del cebador al ADN •Fidelidad de la polimerasa y amplificación •Contaminación de las muestras
•Amplificación •Mezcla de las cuentas •Intensidad •Desfase
•Amplificación •Interferencia •Desfase
•Amplificación •Mezcla de cuentas •Desfase •Mala señal
Bibliotecas de DNA
Las bibliotecas de ADN son
colecciones de vectores
recombinantes, que representan
secuencias de ADN extrañas o
insertadas.
Cromosomal (genómico) cDNA
cDNA ó DNA
DNA complementario = cDNA
Obtención de proteínas de interés médico y
económico
• antibióticos
• enzimas
• hormonas: insulina, hormona del
crecimiento, eritropoyetina…
• vacunas
• proteínas sanguíneas: factores de
coagulación…
El gen para el Activador Tisular de Plasminógeno (TPA), es una proteína
para disolver los coágulos sanguíneos.
Mejora genética de vegetales y animales para obtener una
mayor producción y mejor calidad nutricional
Con el mejoramiento genético de los vegetales, se espera
conseguir:
Mayor adaptación a diversos ambientes.
Mejores características agronómicas (resistencia, desgrane,
etc.).
Resistencia a plagas, enfermedades o insecticidas.
Resistencia a la sequía, temperaturas bajas o altas, etc.
Para incrementar la calidad de los
productos se persigue:
Alto valor nutritivo (proteínas y vitaminas).
Mayor coloración, sabor y/o tamaño de los
frutos.
Resistencia al transporte y
almacenamiento.
Reducción de la cantidad de ciertas
sustancias indeseables en los productos,
etc.
Terapia génica a) Células germinales, es decir, espermatozoides u óvulos, lo que origina un cambio
permanente de todo el organismo y generaciones posteriores.
b) Somática celular y es análoga a un transplante de órganos.
Terapia génica para
el tratamiento de la
inmunodeficiencia
combinada grave
(SCID), una
enfermedad mortal
del sistema
inmunitario causada
por la falta de la
enzima adenosina
desaminasa (ADA).