INMUNOFLUORESCENCIA

Inmunofluorescencia

Consiste en conjugar colorantes fluorescentes con anticuerpos, exponiendo después este conjugado a los anticuerpos o antígenos correspondientes en cortes de tejidos, frotis de microorganismos o de células, o cultivo de tejidos en capa única.

Cuando la reacción es positiva y se expone a la luz ultravioleta se producirá fluorescencia observable bajo el microscopio de inmunofluorescencia.

Se realiza un acople a un anticuerpo de un fluoróforo o una enzima que cataliza una reacción por la cual se emite fluorescencia.

fluoróforo

• Generalmente son compuestos heterocíclicos o hidrocarburos poliarómaticos: moléculas rígidas

Rodamina 6GRodamina B

Cada fluorocromo tiene un espectro de emisión y excitación característicos; si se utilizan dos con el mismo espectro de excitación pero distinto espectro de emisión, se pueden medir dos características al mismo tiempo (fluorescencia de dos colores).

Fluoresceína

Las moléculas fluorescentes tienen la particularidad de que emiten luz de una determinada longitud de onda al ser excitadas con luz de otra determinada longitud de onda.

La Inmunofluorescencia es una técnica de biología molecular que consiste en incubar una muestra con un anticuerpo que detecte la molécula o componente que queramos detectar. Dicho anticuerpo lleva unida una molécula fluorescente (inmunofluorescecnia directa) o bien es reconocido por un segundo anticuerpo marcado fluorescentemente (inmunfluorescencia indirecta).

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA:

Esta técnica se vale de un anticuerpo primario marcado con un fluorocromo que reacciona con el antígeno dentro de la muestra. Es un procedimiento de un solo paso y comprende un solo anticuerpo marcado. La visualización de estructuras no es ideal a causa de la poca emisión de la señal.

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

Esta prueba tiene una sensibilidad mayor que los métodos directos y con frecuencia recibe el nombre de técnica del emparedado o de la capa doble. En vez de conjugar un fluorocromo con un anticuerpo específico dirigido contra el antígeno de interés, el fluorocromo se conjuga con un anticuerpo secundario dirigido contra el anticuerpo primario.

Por lo tanto, cuando la fluoresceína se conjuga directamente con el anticuerpo primario el método es directo y cuando la fluoresceína se conjuga con un anticuerpo secundario el método es indirecto.

El método indirecto aumenta en forma considerable la señal fluorescente emitida por el tejido.

Una ventaja adicional del método de marcación indirecta es que es un solo anticuerpo secundario puede usarse para localizar la unión histoespecífica de varios anticuerpos primarios diferentes.

Para los estudios microscópicos el anticuerpo secundario puede conjugarse con colorantes fluorescentes distintos de modo que en el mismo corte de tejido aparezcan marcas múltiples.

Las desventajas de la inmunofluorescencia indirecta son que es cara, que requiere mucho trabajo y que no se adapta con facilidad a los procedimientos automatizados.