INSTITUTO POLITECNICO NACIONALESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS
DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGIA
INFORME FINAL PROYECTO SIP-20070610“La macropinocitosis como vía de entrada de las
micobacterias a las células endoteliales”
DIRECTOR: DRA. BLANCA ESTELA GARCIA PEREZ
RESUMEN
Mycobacterium tuberculosis (MTB) es un patógeno intracelular y es el agente
causal de la tuberculosis, que invade inicialmente a los macrófagos alveolares.
Esto ya es un hecho bien estudiado, sin embargo, cada vez es más evidente
que otras estirpes celulares de tipo no fagocítico tienen una participación
relevante en la etiopatogénesis de la enfermedad. Estudios previos de nuestro
grupo de trabajo han demostrado que diversas líneas celulares de naturaleza
no fagocítica (fibroblastos, células epiteliales, linfocitos B, osteoblastos), se
infectan con diversas especies micobacterianas. Por lo tanto, en este trabajo se
abordó el estudio básico de la infección de tuberculosis en un tipo de células no
fagocíticas (cultivos primarios de células endoteliales de cordón umbilical
humano, HUVEC) con el fin de conocer si las células endoteliales pueden ser
también infectadas con micobacterias y de igual manera analizar uno de los
mecanismos de defensa innata que exhiben estas células como respuesta a la
infección: producción de óxido nítrico (NO). Esto se llevó a cabo infectando a
las HUVEC con tres cepas de micobacterias de diferente virulencia:
Mycobacterium smegmatis (no tuberculosa, no patógena), M. abscessus (no
tuberculosa, patógena) y Mycobacterium tuberculosis H37Rv (patógena),
estudiando las características de la interiorización de las micobacterias y la
capacidad de multiplicación intracelular de las mismas en las HUVEC, así como
la observación in situ de la producción de óxido nítrico (NO) por las HUVEC
por microscopia de fluorescencia y su cuantificación mediante el método
colorimétrico de Greiss. Los ensayos de interiorización y multiplicación
intracelular demostraron que las tres cepas de micobacterias son capaces de
infectar a las HUVEC pero de manera diferencial siendo M. smegmatis la que
mostró la menor capacidad infectiva siendo eliminada eficientemente por las
células; M. abscessus mostró la mayor eficiencia de infección y multiplicación
intracelular y por último la infección por M. tuberculosis no la resuelven ya que
no se multiplicó intracelularmente y tampoco fue eliminada por las HUVEC
manteniéndose viable durante todo el tiempo de observación. Por este último
punto, se podría especular que las HUVEC podrían estar actuando como
hospederas de MTB ya sea creciendo activamente, o como reservorio de estas
bacterias en estado de latencia. En cuanto a la producción de NO por las
HUVEC, se observó que lo producen igualmente de manera diferencial siendo
M. smegmatis la que indujo una producción discreta y sostenida de NO durante
todo el tiempo de infección, M. abscessus indujo la mayor producción de NO la
cual alcanzó un máximo que cesó rápidamente y por último M. tuberculosis
presentó un patrón similar de producción de NO inducido por M. abscessus,
aunque fue más tardío el pico máximo de producción de NO. La inducción
temprana de NO y su pronta disminución parece ser una característica
distintiva de las micobacterias patógenas. Esta evidencia sugiere que la
modulación ejercida por la micobacteria sobre los mecanismos bacterianos de
eliminación exhibidos por las células no fagocíticas repercute en su
sobrevivencia o en su eliminación intracelular y así mismo se podrían entender
algunos de los mecanismos de evasión que la micobacteria exhibe para
modular o interferir con algunos procesos de eliminación bacteriana con los que
cuentan las células no fagocíticas y que a la fecha no han sido bien
reconocidos.
INTRODUCCIÓN
TUBERCULOSIS
La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecto-contagiosa causada por
diversas especies del género Mycobacterium, todas ellas pertenecientes al
Complejo Mycobacterium tuberculosis. La especie más importante y
representativa es Mycobacterium tuberculosis o bacilo de Koch. La TB es la
segunda enfermedad infecciosa mas prevalente en el mundo.
En 1999 la OMS cifró en 3.689.833 nuevos casos de tuberculosis en el
mundo, aunque este organismo cifró en 8.500.000 casos totales con una tasa
global de 141/100.000 habitantes. En el informe de la OMS del año 2003, se
estima en 8 millones (140/100.000) de nuevos casos de TB. La tuberculosis
mantiene una prevalencia de 245/100.000 habitantes, y una tasa de
mortalidad de 28/100.000. En el informe de la OMS del año 2006, se calcula
que 1,6 millones de personas murieron por tuberculosis en 2005. La
tendencia epidemiológica de la incidencia de TB sigue aumentando en el
mundo, pero la tasa de mortalidad y prevalencia están disminuyendo. La
infección ataca preferentemente a los pulmones, pero puede también
enfermar a otros órganos como lo son los riñones, el hígado, la piel,
meninges, etcétera. Es más grave en los niños y ancianos, siendo los
pacientes que mayor mortalidad presentan (OMS, 2006).
La TB se trasmite a través de partículas expelidas con la tos, estornudo,
hablando, etcétera. De esta manera, el bacilo inhalado es fagocitado por los
macrófagos alveolares. En un 30% de los casos, estos macrófagos son
incapaces de destruirlo. Entonces se genera la infección, que se caracteriza
por el crecimiento en el interior de los macrófagos infectados. Ello es debido a
que el bacilo es capaz de frenar la unión fago-lisosoma entre otros mecanismos
de evasión (Comstock, 1994). Histopatológicamente, en el foco de infección se
genera un granuloma, que se caracteriza por la presencia de tejido necrótico
intragranulomatoso y que se estructura finalmente con la adquisición de la
repuesta inmune específica. Con la inmunidad, los macrófagos infectados
pueden activarse y destruir el bacilo, de manera que se controla la infección.
Aunque la mayor parte de la investigación científica relacionada a la
tuberculosis se ha centrado en el estudio de los macrófagos como las células
principales en la respuesta inmune contra M. tuberculosis, reportes recientes
han dado relevancia a otras estirpes celulares como participantes importantes
en la patogénesis de la enfermedad.
CÉLULAS NO FAGOCÍTICAS Y TUBERCULOSIS
Hernández-Pando y col. (Hernández-Pando, 2000), buscando la presencia de
bacterias latentes en tejido pulmonar de individuos que murieron por causas
diferentes a la tuberculosis, describieron la presencia de DNA micobacteriano
en macrófagos alveolares e intersticiales, así mismo encontraron el mismo
material genético en células de tipo no fagocítico como son los neumocitos tipo
II (células epiteliales), células endoteliales y fibroblastos pulmonares;
observaciones similares se encontraron en ratones con tuberculosis latente
(Arriaga et al. 2002).
La interacción de M. tuberculosis con células del epitelio respiratorio fue
descrito primeramente por Bermúdez y Goodman, los cuales utilizando como
modelo la línea celular A549, demostraron la capacidad de la micobacteria para
infectar y replicarse dentro de estas células (Bermúdez, 1996).
De acuerdo con estos hallazgos se puede inferir que en la infección
micobacteriana, las células no fagocíticas (epiteliales, endoteliales, fibroblastos)
colaboran de manera importante en la respuesta inmune, contribuyendo quizá
en el establecimiento de poblaciones bacterianas persistentes o en el estado
de latencia.
MECANISMOS DE DESTRUCCIÓN
Cuando los patógenos invaden al huésped, la primera línea de defensa son
las reacciones de inmunidad innata, seguidas de la respuesta adaptativa
(Oppenheim et al. 2005). La inmunidad innata consiste en un amplio rango de
defensas de movilidad rápida preexistentes del huésped, las cuales incluyen
neutrófilos y macrófagos, células epiteliales, células cebadas, eosinófilos y
células asesinas naturales (Hoffmann et al. 1999; Medzhitov y Janeway,
1997).
Estas células expresan una amplia variedad de receptores de patrones de
reconocimiento, como son los receptores tipo toll (TLRs), receptores tipo
lectina C y receptores scanvenger, los cuales son activados por componentes
de patógenos microbianos. Esto deriva en la liberación y/o activación de
numerosas moléculas efectoras y mediadores de la respuesta del huésped
incluyendo la cascada de complemento, citocinas, quimiocinas, superóxidos,
óxido nítrico (NO), prostaglandinas, proteínas de fase aguda y péptidos
antimicrobianos (Oppenheim et al. 2005).
Destrucción a través de intermediarios reactivos del nitrógenoEl óxido nítrico era considerado un destacado mediador fisiológico, cuando se
demostró que era idéntico al factor de relajación derivado del endotelio, pero
se ha demostrado que ésta es sólo una de sus funciones ya que también
participa en los mecanismos de transducción, neurotransmisión, citotoxicidad y
de defensa (Barnes, 1993). Las diversas funciones del óxido nítrico son de
relevante importancia, sin embargo la presencia de la óxido nítrico sintasa
inducible (iNOS), dentro de la mayoría de las células, sobre todo en
macrófagos y neutrófilos humanos genera un papel de vital importancia como
un poderoso sistema antimicrobiano. La iNOS se expresa después de la
exposición a ciertas citocinas y endotoxinas, esta forma no requiere de la
calmodulina (Kwan, 1997). Los substratos para la producción de óxido nítrico
mediado por la NOS son el aminoácido arginina, el oxígeno molecular y la
NADPH oxidasa. Los cofactores que se requieren para la generación de NO
son la tetrahidrobiopterina, el dinuocleótido flavina adenina y el
mononucleótido flavina.
El mecanismo del NO puede operar contra microorganismos que invaden el
citosol; por lo tanto, no sorprende que la mayoría de las células no fagocíticas
que son infectadas estén dotadas de iNOS. La enzima se asemeja a la
NADPH oxidasa en su estructura y puede ser inhibida por el análogo de
arginina N- monometil- L- arginina (L- NMMA). Se forma por el rompimiento de
la L-arginina para dar NO y L-citrulina, esta reacción es catalizada por la
sintasa del óxido nítrico (NOS). La combinación de NO con anión superóxido
produce el muy tóxico radical peroxinitrito (ONOO), que se escinde al aceptar
un protón y forma moléculas reactivas como el radical hidroxilo (OH) y NO2. El
NO puede formar complejos mononucleares ditioldinitrosos, lo que trae como
consecuencia el agotamiento de los depósitos de hierro y la inhibición de
varias enzimas de los microorganismos (Roitt, 2001).
También el NO puede asociarse a daño de membranas y esta acción se ha
demostrado con el peroxinitrito. Este compuesto media la peroxidación lípidica
de las preparaciones liposomales a través de un mecanismo que no requiere
hierro. Un estudio mostró que el NO ejerce efectos inmunomoduladores sobre
la adherencia y función celular, la proliferación celular y la producción de
citocinas (Wei et al. 1995).
Además de que puede estar en forma inducible (iNOS o NOS2), también
puede estar presente de manera constitutiva (cNOS). La forma constitutiva se
expresa principalmente en células endoteliales (eNOS o NOS3) y en células
neuronales (nNOS) y depende de Ca2+ - Calmodulina. En el caso de la eNOS,
la enzima contiene sitios de unión para el grupo hemo y la calmodulina, que
son elementos indispensables para la actividad enzimática, además contiene
un motivo de unión del Zinc. Cada dímero de eNOS contiene un ión Zinc que
contribuye con la estabilización de la molécula dimérica (Govers and Rabelink,
2001). La eNOS se activa en respuesta a una gran variedad de estímulos, la
estimulación agonista de los receptores de las células endoteliales activa a
una o más isoformas de la Fosfolipasa C, con lo cual se incrementa la
formación del inositol-1,4,5-trifosfato. La elevación de este inositol incrementa
los niveles de Ca2+ intracelular y en consecuencia la activación de la eNOS a
través de interacción con Ca2+- Calmodulina. Sin embargo las interacciones
moleculares que regulan esta actividad son más complejas que una simple
unión reversible del Ca2+ a la calmodulina, ya que por ejemplo, la proteína de
choque térmico 90 (Hsp90) también parece ser un efector alostérico positivo
de la eNOS. Otros factores que contribuyen a la regulación de la actividad
enzimática de la eNOS son los efectores alostéricos negativos como la
caveolina-1, la cual interactúa con la eNOS e inhibe su actividad catalítica
(Govers et al, 2001).
Como se mencionó anteriormente, el NO es una molécula gaseosa que
participa en diferentes fenómenos biológicos, incluyendo la relajación del
músculo liso, la neurotransmisión, la homeostasis de los tejidos, los procesos
de aprendizaje y memoria y la inhibición de la agregación plaquetaria.
Además, ya es bien conocido que durante infecciones microbianas producidas
por casi todos los patógenos, incluyendo bacterias, virus, parásitos y hongos,
se producen grandes cantidades de NO como una medida de defensa (Nathan
et al. 1991, Umezawa et al. 1997, James, 1995).
En el caso de las infecciones ocasionadas por Mycobacterium, diferentes
especies de Mycobacterium han mostrado variaciones en cuanto a su
susceptibilidad al NO y a los intermediarios reactivos del nitrógeno. Se encontró
que la relativa resistencia in vitro de varias cepas de M. tuberculosis al nitrito de
sodio correlacionó con la virulencia de las cepas en los cobayos (O´Brien et al.
1994). También se demostró que el NO puede matar al bacilo de la
tuberculosis en una manera dependiente del tiempo y la concentración,
observándose una reducción de dos logaritmos en las UFC después de la
exposición de M. tuberculosis a 90 ppm de NO durante 48 h en donde la
máxima concentración de NO que se alcanza en la fase acuosa es
aproximadamente de 150 nM (Long et al. 1999). El NO es la única molécula
que puede matar in vitro al bacilo tuberculoso con una potencia molar
comparable a la de los quimioterapéuticos.
En el modelo murino de la tuberculosis, el NO participa importantemente en la
muerte del bacilo por las células mononucleares (Chan et al. 1995). La
administración intratraqueal de la cepa virulenta de M. tuberculosis a ratas
estimula la producción de NO por la activación de la iNOS en los macrófagos
alveolares. El papel protector del NO en la tuberculosis murina fue demostrado
por la cepa de ratones genéticamente modificada (iNOS -/-), en donde la
infección por M. tuberculosis se asoció con un riesgo significativamente
elevado de diseminación y mortalidad comparada con los ratones de la cepa
silvestre (C57BL/6). Comparando in vitro, la capacidad de los macrófagos
B10R (resistente) y B10S (susceptible) para inhibir la cepa H37Rv de M.
tuberculosis y la producción de NO en respuesta a la infección y al INF-γ,
encontraron que los macrófagos B10R produjeron altas cantidades de NO y los
B10S no (Arias et al. 1997).
También se demostró que la inhibición de M. tuberculosis por los macrófagos
B10R revirtió cuando se uso un inhibidor del NO (N(G)-monomethyl-L-arginine
(N(G)MMA) y se incrementó cuando la producción de NO se restauró usando
L-arginina. De esta manera se llegó a la conclusión de que el gene
Bcg/Nramp1 puede regular la resistencia o susceptibilidad a M. tuberculosis
por la capacidad diferencial de estas células para producir NO (Arias et al.
1997).
En un estudio realizado en monocitos de sangre periférica aislados de
pacientes con tuberculosis activa, mostraron un incremento en la expresión de
NOS2 y también un incremento espontáneo en la liberación de NO en el
medio de cultivo (Wang et al. 2001). Esto sugiere dos hipótesis en los
pacientes con tuberculosis activa. Primero, que la producción de NO se puede
incrementar con la finalidad de eliminar la infección, ya que grandes cantidades
de NO e intermediarios reactivos del nitrógeno producidos por los pacientes
pueden inhibir la proliferación de M. tuberculosis. Segundo, que la producción
de NO puede verse disminuida porque estos pacientes no pueden producir
apropiadamente NO en respuesta a la estimulación micobacteriana. Esto
significa que la tuberculosis puede desarrollarse en individuos que no pueden
inducir una respuesta inmune efectiva en respuesta al bacilo tuberculoso.
La mayor parte de los estudios que se han realizado con respecto a la
producción de NO y a su papel en la defensa contra M. tuberculosis, han sido
usando como modelo celular a las células fagocíticas (principalmente
macrófagos). Sin embargo, hay algunos trabajos que reportan que la
producción de NO también puede inducirse en células del epitelio pulmonar
infectadas con M. tuberculosis (Kwon et al. 1998). Otro estudio demostró que
las células A549 infectadas por M. tuberculosis producen niveles significativos
de NO y que expresan el RNAm de la iNOS hasta las 48 h de infección (Roy et
al. 2004).
Otras células en donde se ha estudiado la producción de NO, son las células
dendríticas y los macrófagos de ratones C57BL/6 con leishmaniasis cutánea
aguda en donde hubo un incremento en la actividad de la iNOS (Stenger et al.
1996).
De igual manera se demostró por técnicas histológicas e inmunológicas la alta
expresión de TNF-α, iNOS, IL-2 e INF-γ en los granulomas de animales con
infección experimental latente, y por PCR in situ demostraron que el DNA
micobacteriano se encontró preferentemente en los macrófagos alveolares e
intersticiales de los animales con infección latente, pero también se encontró
señal positiva en las células endoteliales y en los fibroblastos (Arriaga et al.
2002). Aunque se ha documentado de manera abundante la participación del NO
durante la infección micobacteriana en modelos murinos, su papel en la
tuberculosis humana aún es controversial.
Por todo lo mencionado anteriormente, las micobacterias tienen la capacidad
de infectar a células de naturaleza no fagocítica. La infección de estas estirpes
celulares podría favorecer el establecimiento de la infección micobacteriana
favoreciendo el estado de latencia de las micobacterias dentro de las células
epiteliales y esta capacidad podría estar directamente relacionada a la
patogenicidad de la micobacteria. La invasión de las micobacterias a células
epiteliales podría crear un ambiente favorable para la multiplicación bacteriana
y el establecimiento de la infección, evitando así el ambiente hostil de los
macrófagos. La importancia de las células no fagocíticas radica en que juegan
un papel muy importante en la tuberculosis debido a que pueden funcionar
como reservorios permitiendo la latencia de las micobacterias.
En conjunto estos resultados nos han llevado a plantear que las micobacterias
pueden modular los mecanismos de respuesta bactericida con los que cuentan
las células no fagocíticas para favorecer su sobrevida o su muerte intracelular.
Uno de los mecanismos de la respuesta inmune con los que cuentan las
células hospederas para controlar la replicación intracelular micobacteriana
está la producción de óxido nítrico y la producción de citocinas inflamatorias.
JUSTIFICACIÓN
Se ha demostrado que las micobacterias son interiorizadas a células de
naturaleza no fagocítica en líneas celulares por un proceso de macropinocitosis,
pero aun se desconoce el mecanismo de interiorización de las micobacterias en
cultivos primarios de células endoteliales humanas así como los mecanismos de
defensa ante la infección con las micobacterias. Por lo que en este trabajo se
decidió establecer y analizar las características de la infección de células
endoteliales con micobacterias de diferente virulencia así como la participación
de óxido nítrico en la probable eliminación de las mismas.
OBJETIVOS E HIPÓTESIS
Objetivo general
Caracterizar los eventos involucrados en la infección, multiplicación intracelular
y producción de oxido nítrico de cultivos primarios de células endoteliales
humanas infectadas con micobacterias de diferente virulencia.
Objetivos particulares
• Establecer las características de la interiorización de las micobacterias a
las células endoteliales humanas, mediante microscopía óptica.
• Determinar la capacidad de multiplicación intracelular de las
micobacterias en los cultivos primarios de células endoteliales.
• Observación in situ de la producción de óxido nítrico mediante
microscopia de fluorescencia (DAF).
• Cuantificar la producción de óxido nítrico mediante el método
colorimétrico de Greiss.
Hipótesis
Las micobacterias son interiorizadas por las células endoteliales humanas y
dependiendo de la virulencia de la micobacteria las especies patogénicas
sobrevivirán mientras que las no patogénicas serán eliminadas. La producción
de óxido nítrico por las células endoteliales será modulado de igual manera por
las diferentes micobacterias.
MATERIAL
A. Cultivo primario de células endoteliales humanas
Los cultivos primarios de células endoteliales humanas se obtuvieron a partir de
cordones umbilicales desechados de partos normales o cesáreas, los cuales se
colectaron al momento del alumbramiento. Una vez colectados los cordones, se
transportaron en condiciones asépticas y en frío al laboratorio de postgrado de
la Escuela Nacional de Medicina del IPN, en donde fueron procesados por el M.
en C. Israel Ramírez, quien amablemente nos donó las células, las cuales
obtuvo de la siguiente manera: cada cordón se pinzó por ambos extremos
después de agregarle una solución de tripisina al 0.125% en HBSS,
incubándose durante 15 min a 37º C. Una vez transcurrido este tiempo se
colectó el contenido del cordón y se agregó un volumen de 0.1 de suero fetal
bovino (SFB). Las células fueron cosechadas y centrifugadas a 2700 rpm
durante 15 min. Posteriormente el botón celular fue resuspendido en medio M-
199 suplementado con 10% de SFB. Dependiendo del experimento las células
se colocaron directamente en cajas de cultivo de 24 pozos o en cubreobjetos de
vidrio colocados sobre los pozos de dichas cajas, incubándose a 37º C en una
atmósfera con 5% de CO2. Una vez alcanzada la confluencia requerida, las
células se utilizaron en los diferentes ensayos. La pureza del cultivo celular se
estableció evaluando la morfología celular y la expresión del factor von
Willebrand mediante una técnica inmunohistoquímica. (Ramírez-Sánchez,
2005).
B. Cepas micobacterianas
Se utilizaron tres cepas micobacterianas con diferente virulencia, las cuales
fueron cultivadas en los medios convencionales para crecimiento
micobacteriano de la siguiente manera:
• Cepa H37Rv de Mycobacterium tuberculosis (MTB): fue obtenida y
cultivada hasta alcanzar la fase logarítmica en medio Middlebrook 7H9
adicionado con 10% de enriquecimiento OADC (ácido oleico, albúmina,
dextrosa y catalasa) y Tween 80.
• Micobacteria no tuberculosa: Mycobacterium smegmatis obtenida y
cultivada hasta alcanzar la fase logarítmica en medio Middlebrook 7H9
adicionado de Tween 80.
• Cepa de Mycobacterium abscessus: cultivada en medio Middlebrook 7H9
adicionado de Tween 80.
Para todos los ensayos las cepas bacterianas en fase logarítmica fueron
centrifugadas a 10,000 rpm por 5 min, los paquetes bacterianos fueron lavados
dos veces con HBSS. Después del último lavado, las micobacterias fueron
resuspendidas con HBSS y transferidas a tubos de vidrio de 13x100 estériles
para ser ajustadas al tubo No.1 del nefelómetro de Mc Farland. De estas
suspensiones se realizaron diluciones 1:5 para alcanzar una relación
bacteria:célula 10:1 aproximadamente.
MÉTODOS
1.- Ensayo de cinética de infección por microscopía óptica.
Monocapas de células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVEC)
preparadas en placas de 24 pozos con cubreobjetos de vidrio con una
confluencia del 90 al 100%, se lavaron tres veces con HBSS para eliminar las
células no adheridas. Las monocapas se infectaron con las cepas
micobacterianas ajustadas al tubo No. 1 del nefelómetro de Mc Farland y
posteriormente diluidas 1:5 en medio M.199 sin antibióticos y con 1% SFB,
alcanzando una relación bacteria:célula 10:1 aproximadamente. En otros
experimentos se prepararon suspensiones de levaduras de pan muertas por
calor resuspendidas en el medio M-199 adicionando 8 millones de levaduras
por pozo; este ensayo se realizó para establecer la capacidad endocítica de las
células endoteliales. Una vez adicionadas las suspensiones bacterianas (o de
levaduras), las células se incubaron a 37º C en una atmósfera con 5% de CO2,
y se siguió una cinética de 1h, 3h y hasta 6h de infección, continuando con
tiempos de post-infección de 24h, 48h y 72h. Transcurrido el tiempo de
incubación las monocapas se lavaron tres veces con HBSS para eliminar los
microorganismos no interiorizados y se les adicionó medio M-199
suplementado de 1% de SFB con amikacina a una concentración de 20 µg/ml
incubándose durante 1 h. Posteriormente se retiró el medio de cultivo y las
monocapas se lavaron una vez más con HBSS adicionándoles M-199
suplementado de 1% de SFB con amikacina a una concentración de 5 µg/ml,
incubándose nuevamente hasta que concluyera el tiempo post-infección
establecido. Al irse cumpliendo cada uno de los tiempos de post-infección, las
monocapas se lavaron una vez con HBSS y se retiraron los cubreobjetos con
las monocapas infectadas para fijarlas con metanol frío durante 30 min.
Posteriormente se tiñeron por la técnica de Ziehl-Neelsen como se describe en
el apéndice.
2.- Ensayo de multiplicación intracelular determinado por UFC.
Las monocapas de células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVEC)
preparadas en placas de 24 pozos con una confluencia del 90 al 100%, se
lavaron tres veces con HBSS para eliminar las células no adheridas. Las
monocapas se infectaron con las cepas micobacterianas ajustadas al tubo No.
1 del nefelómetro de Mc Farland y diluidas 1:5 en medio M-199 y se incubaron
a 37º C en una atmósfera con 5% de CO2. Se siguió una cinética de 1h, 3h y
hasta 6h de infección, continuando con tiempos de post-infección de 24h, 48h y
72h. Transcurrido el tiempo de incubación las monocapas se lavaron tres
veces con HBSS para eliminar las bacterias extracelulares y se les adicionó M-
199 suplementado de 1% de SFB con amikacina a una concentración de 20 µ
g/ml incubándose durante 1 h; posteriormente se retiró el medio y las
monocapas se lavaron una vez más adicionando 1 ml de medio M-199
suplementado de 1% de SFB con amikacina a una concentración de 5 µg/ml,
incubándose nuevamente hasta que concluyera el tiempo de post-infección
establecido. Al irse cumpliendo cada uno de los tiempos de post-infección, las
células se lavaron una vez con HBSS, posteriormente se lisaron con solución
de SDS al 0.25% por 5 min y se neutralizaron con albúmina sérica bovina
estéril al 5%, los lisados se congelaron hasta su siembra. Para determinar las
unidades formadoras de colonia, los lisados se sembraron en cajas de petri
conteniendo agar Middlebrook 7H11 con enriquecimiento OADC (Apéndice)
para el caso de M. tuberculosis, y sin OADC para el caso de M. smegmatis y
M. abscessus; 100 µl de los lisados diluidos 1:10 o 1:100 en HBSS, se
esparcieron homogéneamente en el agar Middlebrook, permitiendo que se
absorbiera a totalidad. Una vez sucedido esto, las placas se incubaron a 37º C
hasta obtener las unidades formadoras de colonias (UFC).
3.- Ensayo para la observación in situ de la producción de óxido nítrico mediante microscopía de fluorescencia.
Las monocapas de células endoteliales preparadas en placas de 24 pozos con
una confluencia del 70 al 80%, se lavaron tres veces con HBSS para eliminar
las células no adheridas. Las monocapas se refrigeraron durante 30 minutos
para sincronizar el metabolismo celular. Cumplido este tiempo, a cada pozo se
le adiciono 1ml de la solución de DAF (Diacetato de diaminofluoresceína) a
una concentración de 5Mm en HBSS, permitiendo la interiorización del reactivo
durante 1 h a 37º C en una atmósfera con 5% de CO2. Posteriormente las
monocapas se infectaron con las cepas micobacterianas, y se siguió una
cinética de infección de 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 75 min, 90 min, 105
min, 2h, 6h y 24h, observando en cada tiempo la emisión de fluorescencia en
un microscopio de fluorescencia invertido acoplado a una cámara fotográfica.
4.- Ensayo colorimétrico para la cuantificación del óxido nítrico por el método de Greiss.
Monocapas de células endoteliales de cordón umbilical humano preparadas en
placas de 24 pozos con una confluencia del 70 al 80%, se lavaron tres veces
con HBSS para eliminar las células no adheridas, posteriormente se
refrigeraron durante 30 minutos para sincronizar el metabolismo celular.
Cumplido este tiempo, se infectaron con las cepas micobacterianas ajustadas
al tubo No. 1 del nefelómetro de Mc Farland y diluido 1:5 en HBSS, y se realizó
una cinética de infección de 40, 90 y 240 min, al irse cumpliendo cada uno de
los tiempos de infección, se colectaron los sobrenadantes en microtubos de 1.5
ml, congelándolos hasta su ensayo, para lo cual se tomaron 250 µl de los
sobrenadantes y se colocaron en microtubos de 1.5 ml, posteriormente se les
adicionaron 50 µl de una suspensión con 200 unidades klett de Escherichia
coli ATCC 1775 transgénica. Se utilizó esta bacteria ya que es una fuente de
nitrato reductasa que permite que el óxido nítrico producido por las HUVEC sea
reducido a nitritos. (Ramírez–Sánchez, 2005). Una vez adicionada la bacteria,
los sobrenadantes se incubaron en agitación en baño maría a 37º C durante 1
hr a 100 rpm. Cumplido este tiempo se centrifugaron a 3000 rpm por 5 min.
Posteriormente se tomaron 250 µl de los sobrenadantes, se colocaron en
microtubos y a cada uno se les adicionó 50 µl de sulfanilamida y 50 µl de N-
naftil etilendiamina para determinar los nitritos presentes, los microtubos se
agitaron durante 1 min, y se colocaron en celdas para leer su absorbancia a
554 nm, contra un blanco de reactivos. Simultáneamente se realizó la curva de
calibración utilizando una solución de Nitrito de Sodio a las concentraciones de
0.32 µg/ml, 0.16 µg/ml, 0.08 µg/ml, 0.04 µg/ml, 0.02 µg/ml, 0.01µg/ml, 0.005 µ
g/ml y 0.001 µg/ml. Posteriormente se interpolaron las absorbancias de los
sobrenadantes para determinar la concentración de nitritos en cada tiempo de
infección expresando los resultados en µg/ml.
RESULTADOSMeta 1.- Determinar si las micobacterias entran a las células endoteliales
1.1. Cinética de infección de las HUVEC por Mycobacterium smegmatis.
Para comprobar si Mycobacterium smegmatis induce su interiorización a las
HUVEC, se realizó una cinética de infección de 1h, 3 h y 6 h y se evaluó la
sobrevida micobacteriana a las 24 h, 48 h y 72 h post-infección. Durante los
tiempos de 1h y 3 h de infección no se encontraron células infectadas ni
células con bacterias adheridas a la superficie celular. A las 6 h de infección se
observaron pocas células con bacterias interiorizadas y/o adheridas a la
membrana celular. La infección a las 6 h no indujo cambios significativos en la
morfología celular, las monocapas celulares mantuvieron su apariencia
morfológica similar a las células sin infectar. En los tiempos post-infección ya
no se observaron células infectadas (Fig. 1).
1.2. Cinética de infección de las HUVEC por Mycobacterium abscessus.
La capacidad de infección de Mycobacterium abscessus sobre las HUVEC se
evaluó siguiendo la misma cinética que para M. smegmatis. A la hora de
infección no se observaron micobacterias adheridas ni interiorizadas, a las 3 h
de infección ya se observaron algunas células con más de una bacteria
interiorizada, con 6 h de infección se observó una considerable cantidad de
bacilos infectando a las células. A las 24 h de post-infección se observaron
células con una mayor cantidad de bacilos interiorizados, a las 48 h de post-
infección se observó una multiplicación intracelular micobacteriana importante
y se comenzaron a observar cambios morfológicos en las células, a las 72 h
post-infección ya fue más evidente la multiplicación intracelular, se observó una
gran cantidad de bacilos ocupando todo el citoplasma celular, la morfología de
la célula solo fue evidente por la gran cantidad de bacilos en el citoplasma
(Fig.1).
1.3. Cinética de infección de las HUVEC por la cepa H37Rv de Mycobacterium tuberculosis.
Para comprobar la capacidad de interiorización de Mycobacterium tuberculosis
a las HUVEC, se infectaron monocapas de éstas células con la cepa H37Rv,
siguiendo los mismos tiempos de infección y post-infección descritos
previamente. Como se observó en los ensayos de infección de M. smegmatis y
M. abscessus, la infección por 1 h con M. tuberculosis no mostró bacterias
adheridas y/o interiorizadas, a las 3 h de infección se observaron células con 2
ó 3 bacilos presentes contenidos en vacuolas endocíticas en la citoplasmática
de la célula, la infección por 6 h mostró un mayor número de bacilos
interiorizados e igual que lo observado a las 3 h de infección, la presencia de
bacilos contenidos en vacuolas endocíticas fue más evidente en la región
perinuclear. Los tiempos post-infección, mostraron resultados similares, no se
observó multiplicación intracelular, pero la presencia de bacilos dentro de las
células fue evidente hasta el último tiempo de la cinética evaluado. En todos
los tiempos, tanto de infección como en los tiempos post-infección se
observaron a los bacilos contenidos en vacuolas endocíticas y en estrecho
contacto con el núcleo celular, la presencia de éstos no causó cambios
morfológicos en las células (Fig. 1).
Fig. 1. Infección de las HUVEC por Mycobacterium smegmatis, M. abscessus y M. tuberculosis A) HUVEC infectadas por M. smegmatis; B) HUVEC infectadas por M. abscessus; C) HUVEC infectadas por M. tuberculosis.
A
Meta 2.- Determinar la multiplicación o eliminación de las micobacterias
En la figura 2 se muestra el destino intracelular de las tres micobacterias
evaluadas en las HUVEC. Es evidente que el comportamiento de las
micobacterias dentro de las células fue diferente, en la infección por M.
smegmatis se observó claramente una disminución en la carga bacteriana que
culminó con la eliminación total de la bacteria. La infección inducida por M.
abscessus presentó una multiplicación intracelular considerable, estos
resultados correlacionan con lo observado en los ensayos de microscopía
óptica y finalmente, en la infección por M. tuberculosis se observó de manera
clara la permanencia de la micobacteria durante todos los tiempos post-
infección, sin que se presentará eliminación o multiplicación intracelular.
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
Tiempo (h)
UFC/
ml
M. smegmatis M. tuberculosis M.abscessus
Figura 2. Multiplicación intracelular de diferentes cepas de micobacterias en las HUVEC
2.2. Determinación del porcentaje de infectividad de las tres micobacterias. Para determinar cuál de las tres micobacterias tuvo mayor capacidad para
interiorizarse a las HUVEC, se determinó el porcentaje de infectividad. Para
determinar el porcentaje de infectividad en los ensayos de microscopía óptica
(MO), se contaron 200 células y de estas se cuantificaron las células con
bacilos interiorizados, para cada una de las tres cepas. En el caso de las UFC,
el porcentaje se determinó cuantificando a las UFC de los inóculos
correspondientes y se determinó el porcentaje de entrada de cada una de las
micobacterias. Para ambos ensayos, el porcentaje de infectividad se determinó
a las 6 h de infección (Tabla I). En esta tabla se observa que la bacteria que
tuvo una mayor capacidad infectiva fue M. abscessus, M. tuberculosis tuvo un
menor porcentaje de infectividad que M. abscessus y M. smegmatis fue la
micobacteria que tuvo el menor porcentaje de infectividad.
Micobacteria % Infectividad(MO)
% Infectividad(UFC)
M. abscessus 4.17 4.5
M. tuberculosis 1.28 3.6
M. smegmatis 0.20 1.2Tabla I. Tabla comparativa de los porcentajes de infectividad de las cepas
micobacterianas por UFC y MO
Meta 3.- Ensayo para la observación in situ de la producción de óxido nítrico mediante microscopía de fluorescencia.
3.1. Oxido nítrico producido por las HUVEC infectadas por Mycobacterium smegmatis.
Siguiendo la técnica descrita previamente se determinó por microscopía de
fluorescencia la producción de óxido nítrico, inducida por la infección con M.
smegmatis. De manera constitutiva las células sin infectar no presentaron
producción de óxido nítrico. Cuando las HUVEC se infectaron con la
suspensión de M. smegmatis, a los 15 min de infección se comenzaron a
observar a las células fluorescentes, el mismo nivel de fluorescencia se
mantuvo durante toda la cinética de infección, sin que fuera evidente un
incremento significativo. La producción de óxido nítrico de las HUVEC inducida
por M. smegmatis inició a los 15 min de infección y se mantuvo constante
durante todos los tiempos evaluados (Fig 3).
3.2. Oxido nítrico producido por las HUVEC infectadas por Mycobacterium abscessus.
De la misma manera que el procedimiento mencionado anteriormente, las
monocapas de células endoteliales se infectaron con la cepa de
Mycobacterium abscessus siguiéndose la misma cinética. La producción de
óxido nítrico inició desde los 15 min de infección y en mayor proporción
comparada con M. smegmatis, a los 30 min de infección se observó una célula
con una fluorescencia muy intensa indicando la alta producción de óxido
nítrico. A los 45 min de infección se observó la intensidad de fluorescencia de
manera homogénea en todas las células presentes en la monocapa. El tiempo
en donde se observó la mayor intensidad de fluorescencia fue a los 60 min de
infección, indicando un pico máximo en la producción de óxido nítrico, en este
tiempo también se observaron cambios significativos en la morfología celular,
las células presentaron grandes extensiones citoplasmáticas de manera más
evidente. Después de los 60 min de infección se observó una disminución de la
intensidad de fluorescencia, indicando una disminución también en la
producción del óxido nítrico, misma que no llego a ser nula, ya que hasta el
último tiempo evaluado pudieron observarse células fluorescentes (Fig. 3).
3.3. Oxido nítrico producido por las HUVEC infectadas por la cepa H37Rv de Mycobacterium tuberculosis.
Se siguió el mismo procedimiento, las monocapas de células endoteliales se
infectaron con la cepa de Mycobacterium tuberculosis realizando la misma
cinética. Se observó que a los primeros tiempos de infección que van desde los
15 min hasta la primera hora, hay una baja producción de óxido nítrico con
respecto en lo observado con M. abscessus. Posteriormente a los 75 min se
observó un aumento en la producción de óxido nítrico por las células
endoteliales, las cuales emitieron una gran fluorescencia permitiendo ver
extensiones citoplasmáticas. A los 105 min de infección, la producción de óxido
nítrico disminuyó, manteniéndose constante hasta el final de la cinética (Fig.3).
A
B
C
Figura 3. Producción de NO por las HUVEC inducido por las diferentes micobacterias a 1h de infección. A) M. smegmatis, B) M. abscessus, C) M. tuberculosis. Imágenes tomadas al mismo aumento con el objetivo de 20x en el microscopio invertido de fluorescencia (aumento 200)
Meta 4.- Ensayo colorimétrico para la cuantificación del óxido nítrico por el método de Greiss.
Para cuantificar el óxido nítrico producido por las células endoteliales en
respuesta a la infección con las diferentes cepas micobacterianas, se realizó
una curva de calibración utilizando una solución de Nitrito de Sodio a las
concentraciones de 0.32 µg/ml, 0.16 µg/ml, 0.08 µg/ml, 0.04 µg/ml, 0.02 µg/ml,
0.01µg/ml, 0.005 µg/ml y 0.001 µg/ml. y se midió la absorbancia de cada una a
554 nm.
En la tabla II se muestran las lecturas obtenidas.
Concentraciónµg/ml
Absorbencia(554nm)
0.32 1.87
0.16 1.010
0.08 0.532
0.04 0.326
0.02 0.260
0.01 0.181
0.005 0.098
0.001 0.027
Tabla II. Lecturas de absorbencia para la curva tipo.
Con estos resultados se graficaron las absorbencias de las diluciones contra
las concentraciones, con lo cual se obtuvo la curva tipo (Figura 4)
45 min
y = 5.5949x + 0.0932R2 = 0.9961
00.20.40.60.8
11.21.41.61.8
2
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35
Concentración de nitritos ( µ g/ml)
Abso
rban
cia
Posteriormente se interpolaron las lecturas de las absorbencias de cada uno
de los ensayos realizados con las cepas micobacterianas y de esta manera se
cuantificó la concentración de nitritos que es directamente proporcional a la
cantidad de óxido nítrico que se produjo durante la infección
En la figura 5 se muestra una comparación de la producción de óxido nítrico
por las HUVEC infectadas con las tres cepas micobacterianas a los diferentes
tiempos de infección.
Figura 4. Curva tipo para determinación de la concentración de nitritos por el método de Greiss.
-0.05
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
Control M.smegmatis M.abscessus MTB
40 m in 90 m in 240 m in
Con
cent
raci
ón d
e ni
trito
s(µ
g/m
L)
* **
* *
*
**
* p < 0.05
Figura 5. Producción de óxido nítrico por las HUVEC infectadas con las tres cepas micobacterianas
En donde observamos que las tres cepas micobacterianas inducen la
producción de óxido nítrico de manera diferencial, siendo M. abscessus la que
induce la mayor producción de NO por las HUVEC, seguida por M.
tuberculosis y por último M. smegmatis que es la que induce la menor
producción de NO. En cada uno de los tiempos en los que se cuantificó el NO
se determinó que tienen diferencia significativa con respecto al NO producido
por las células sin infectar, esto se calculó por el valor de p que se obtuvo por
medio de la prueba t de student. Los valores de p en cada uno de los tiempos
de infección con las tres cepas micobacterianas se muestran en la tabla III:
Tiempo (min) M. smegmatisValor p
M. abscessusValor p
M. tuberculosisValor p
40 min 0.026508457 0.026741949 0.03964971
90 min 0.027899137 0.048242126 0.06952771
240 min 0.004994624 0.013516418 0.00539882
Tabla III. Valor de p de cada tiempo de infección con las micobacterias.
DISCUSIÓN Aproximadamente un tercio de la población mundial está infectada por
micobacterias del complejo tuberculosis, sin embargo sólo un porcentaje bajo
de dichos individuos desarrolla la enfermedad; una respuesta inmune íntegra
es responsable de la eliminación y el control eficiente de la dicha carga
bacteriana. Se sabe que el sitio principal de infección de M. tuberculosis es el
pulmón y los macrófagos las células primordiales que albergan a estas
bacterias: dependiendo de su grado de activación, los macrófagos pueden
eliminar eficientemente a las micobacterias, contrariamente, si su activación es
baja, estas células no solo fallan en contener el crecimiento bacteriano, sino
que las alojan permitiéndoles su crecimiento irrestricto. La biología de la
relación macrófago-micobacteria ha sido un hecho ampliamente estudiado, sin
embargo recientemente se ha empezado a reconocer la participación de otras
células, de tipo no macrofágico, en la etiopatogénesis de esta enfermedad,
como son los pneumocitos tipo II, fibroblastos pulmonares y células
endoteliales entre otras (Hernández-Pando, 2000). De igual manera diversos
estudios in vitro han demostrado la capacidad de las micobacterias para
infectar y multiplicarse en fibroblastos o células epiteliales (García-Pérez,
2003), siendo así probables reservorios de micobacterias creciendo
activamente o en estado de latencia. La infección activa es en muchos casos
el resultado de la reactivación de la micobacteria que se encuentra presente
en el individuo en un estado de latencia. Por otro lado, las células no
fagocíticas son fuentes importantes de una variedad de citocinas, dentro de las
que se encuentran: IL-6, IL-8, TNF-alfa, MCP-1, etc., (Ohyama et al. 2002; Makinde et al. 2007). De esta manera la relevancia de estas células se puede
dar por su contribución en el balance global de citocinas producidas durante la
infección micobacteriana, de su posible participación como reservorios de la
bacteria y finalmente para reconocer y entender los mecanismos de defensa
para la eliminación bacteriana desarrollados por las células no fagocíticas.
En este trabajo se abordó el estudio básico de la infección de tuberculosis en
un tipo de células no fagocíticas, siendo estas los cultivos primarios de células
endoteliales de cordón umbilical humano (HUVEC), asimismo analizamos uno
de los mecanismos de defensa innata que estas células pueden exhibir
durante la infección: la producción de óxido nítrico, dentro de nuestro
conocimiento este es el primer trabajo en su tipo (con cultivos primarios),
aunque un trabajo reciente demostró la entrada y replicación intracelular de
Mycobacterium tuberculosis en una línea de células endoteliales
microvasculares humanas (Mehta, 2006).
Lo primero que se hizo fue establecer la capacidad endocítica de las HUVEC,
para lo cual se utilizaron partículas irrelevantes que se sabe que estirpes
fagocíticas interiorizan de manera eficiente, siendo estas las levaduras de pan
muertas por calor, observamos que las HUVEC no son capaces de interiorizar
a dichas levaduras en ninguno de los tiempos de estudio, por lo que podemos
decir que las HUVEC no poseen la capacidad de endocitar de manera
espontánea a partículas. Posteriormente analizamos si las HUVEC se
infectaban con las 3 especies micobacterianas seleccionadas, una de baja
virulencia (M. smegmatis), una no tuberculosa de alta virulencia (M.
abscessus) y la cepa virulenta de M. tuberculosis H37Rv, la interiorización la
evaluamos mediante tinción y observación microscópica (Zielh-Neelsen) y
mediante la cuantificación de unidades formadoras de colonias, encontrando
por ambos métodos que las tres especies micobacterianas eran capaces de
infectar a las HUVEC, pero de manera diferencial dependiendo de la
micobacteria, siendo la más infectiva M. abscessus, seguida de M.
tuberculosis y M. smegmatis. De momento no contamos con evidencias que
permitan suponer cual es el proceso de responsable de la interiorización,
mismo que pudiera ser macropinocitosis, considerando lo observado en otras
células no fagocíticas (García-Pérez, 2003), para probar esta hipótesis es
necesario realizar una serie de ensayos que se encuentran actualmente en
proceso en nuestro laboratorio.
De acuerdo a la primera observación, las HUVEC son infectadas por las
micobacterias de estudio independientemente de su virulencia, sin embargo, la
sobrevivencia intracelular de las micobacterias si correlacionó con dicha
propiedad. Así, la micobacteria no virulenta M. smegmatis fue eliminada rápida
y eficientemente por las células endoteliales, iniciando su eliminación tan
pronto como a las 6 hrs post-infección, y después de las 24 horas la carga
bacteriana disminuyó importantemente para no ser detectada después de las
48 hrs. En comparación, M. abscessus fue la micobacteria que mostró no
sólo la mayor eficiencia de infección, sino la que presentó la mayor
multiplicación y sobrevivencia intracelular, con un crecimiento logarítmico a lo
largo de la cinética de observación, y observándose microscópicamente
células repletas de bacilos al final de tiempo de estudio. M. tuberculosis mostró
un comportamiento diferente a los descritos anteriormente ya que no se
multiplicó intracelularmente y tampoco fue eliminada por las HUVEC,
presentando así un estado similar a la latencia. Es importante resaltar que este
comportamiento no se observó en otros modelos de infección de células no
fagocíticas, como el de la línea celular A549 (neumocitos tipo II) o el de la
línea celular de fibroblastos pulmonares (MLg) (García-Pérez, 2004).
Decidimos estudiar la producción de intermediarios reactivos del nitrógeno,
específicamente el óxido nítrico (NO) como uno de los posibles mecanismos
de defensa a la infección micobacteriana exhibidos por las HUVEC. Existen
diversas variedades de la enzima óxido sintasa expresadas en diferentes
estirpes celulares; así existe la óxido sintasa inducible (iNOS o NOS2),
producida por macrófagos y neutrófilos humanos, otra de las isoformas
producida de manera constitutiva por las células endoteliales es la eNOS o
NOS3 y finalmente las células neuronales producen la denominada nNOS que
es dependiente del complejo Ca2+ - Calmodulina (Govers et al. 2001). De las
isoformas, la de mayor importancia en este trabajo es la eNOS ya que se
encuentra en las células endoteliales de manera constitutiva y se sabe que se
activa en respuesta a una gran variedad de estímulos como el estiramiento
celular (Ramírez-Sánchez, 2007), de tal forma que el NO generado por eNOS
pudiera tener la relevancia que se le ha conferido en diversas infecciones
microbianas siendo este uno de los metabolitos importantes en la defensa
contra dichas infecciones (Nathan et al. 1991; Umezawa et al. 1997; James,
1995). Por otro lado existen diversos estudios que han demostrado que el
óxido nítrico participa de manera importante en infecciones causadas por M.
tuberculosis en modelos celulares de células fagocíticas, y también ya se ha
reportado que el NO puede inducirse en células no fagocíticas como el epitelio
pulmonar (Kwon et al. 1998), y células A549 (Roy et al. 2004), también por la
infección con MTB.
En este trabajo se analizó la producción de NO in situ y en tiempo real
mediante microscopia de fluorescencia y utilizando el reactivo DAF, el cual
fluoresce conforme se produce el NO. Se observó que las tres cepas
micobacterianas modularon de manera diferencial la producción de óxido
nítrico por las HUVEC, siendo M. smegmatis la micobacteria que indujo una
producción discreta y sostenida de NO durante todo el tiempo de observación;
M. abscessus indujo la mayor producción de NO la cual alcanzó un máximo de
producción a los 40-60 min post-infección, esta producción cesó rápidamente
(15 min después del pico máximo). En el caso de M. tuberculosis se observó
un patrón similar de producción de NO al de M. abscessus, aunque el pico de
producción máxima fue más tardío (a los 75 min). Cabe resaltar que la
producción de NO fue tan significativa y evidente que la producción de
fluorescencia llegó a emitir un color blanco en lugar del verde característico del
DAF. La tinción con DAF también permitió observar algunos cambios celulares
sugerentes de que un proceso de interiorización se estaba llevando a cabo,
evidenciando cambios membranales que eventualmente se recuperaron a su
estado original. También fue notable observar que aquellas células que de
manera importante produjeron NO, eventualmente dejaron de producirlo, como
si por efecto de la infección se modulara su producción, siendo esta
observación especialmente importante en el caso de la infección por M.
tuberculosis y M. abscessus.
La última parte del trabajo consistió en cuantificar el óxido nítrico producido
durante la infección temprana con las tres cepas micobacterianas por el
método colorimétrico de Greiss. Los resultados obtenidos corroboraron y
fueron congruentes con las observaciones obtenidas con DAF; de las tres
micobacterias, la que indujo la menor producción de NO, fue M. smegmatis,
sin embargo esta producción fue constante, no encontrándose la inhibición
observada con las otras micobacterias. En el caso de M. abscessus, la
producción de NO fue la más alta llegando a producir hasta 0.25085 µg/ml, sin
embargo, esta producción fue suprimida rápidamente, de manera que los
datos cuantitativos corroboraron las observaciones cualitativas obtenidas con
DAF. En comparación con las otras especies micobacterianas, la infección de
las HUVEC por M. tuberculosis indujo la producción intermedia de óxido
nítrico, y al igual que lo observado con M. abscessus, la infección con M.
tuberculosis alcanzó un pico máximo de producción de NO (0.07355 µg/ml),
que rápidamente disminuyó, de igual manera hubo concordancia entre los
resultados cuantitativos y cualitativos de producción de NO.
Por todo lo anterior, podemos postular que la infección de HUVEC constituye
un modelo interesante de estudio de la patogénesis de la tuberculosis ya que
permite la expresión de un estado de “latencia” debido a que estas células
sólo contienen el crecimiento bacteriano sin llegar a eliminarlo, funcionando
así como un reservorio de la micobacteria y explicando las observaciones
obtenidas por Hernández-Pando y col., quien reconoce la infección de células
endoteliales en humanos y ratones (Hernández-Pando, 2000, Arriaga et al.
2002). Es conveniente reforzar esta observación evidenciando por ejemplo la
expresión de proteínas de latencia características de este estado como por
ejemplo la proteína alfa-cristalina (Yuan et al. 1996). Interesantemente, la
infección micobacteriana con M. tuberculosis, inicialmente despierta una
respuesta “explosiva” de NO, probablemente la producción elevada de este
intermediario despierte a su vez una respuesta micobacteriana que conduzca
al estado de latencia, hecho reportado por diferentes grupos dentro de los
cuales sobresale el de Steyn y col, quien propone que niveles altos de NO
activan a “detectores” micobacterianos como el (WhiB3) o el DosT,
responsables de modificaciones metabólicas de la micobacteria y que permite
su reversión al estado de latencia (Steyn et al. 2007). Curiosamente, M.
abscessus igualmente dispara un “estallido” de producción de óxido nítrico, de
mayor intensidad que el inducido por tuberculosis, y su eficacia se observa ya
que en el lapso de las primeras horas de infección, hay una disminución
significativa del número de bacterias intracelulares (figura 15), misma que se
recupera logaritmicamente hasta invadir completamente a la célula; de esta
forma es probable que M. abscessus no presente ni los detectores de NO, ni la
capacidad de entrar en latencia exhibida por M. tuberculosis (o por lo menos
no en estas condiciones). De esta manera, en nuestro modelo observamos el
comportamiento diferencial de tres patógenos, dos que establecen una
relación hospedero-bacteria destructiva, representada por M. abscessus (en
la que la célula hospedera es destruida) y por M. smegmatis (en la que la
bacteria es destruida), y otro que establece una relación tipo “simbiótica” en
donde M. tuberculosis no destruye a la célula pero tampoco se elimina. La
infección por M. abscessus o M. tuberculosis induce una alta producción de
óxido nítrico que rápidamente es “apagada”, los factores responsables de
dicha modulación pueden ser: a) producidos por las micobacterias; b)
producidos por la misma célula endotelial. Esta última posibilidad es altamente
pausible ya que la HUVEC es una célula con mecanismos de regulación
sofisticados y cuya producción de NO es responsable de múltiples funciones;
probablemente los niveles de NO alcanzados por la infección micobacteriana
constituyen un “peligro” para la integridad celular, hecho que despierta su
pronta inhibición, como sucede en el caso del estiramiento físico (Ramírez-
Sánchez, 2007). Hasta el momento, no se ha descrito con precisión que la
micobacteria sea capaz de inhibir específicamente la actividad de la óxido
nítrico sintasa inducible, únicamente se ha establecido que de manera
indirecta los macrófagos inadecuadamente activados por citocinas tipo TH2 no
producen niveles adecuados del metabolito (Gil et al. 2003) y el papel del NO
es aún controversial en el humano (Jagannath, 1998); sobre la participación y
modulación de la eNOS no hay nada descrito por lo que este trabajo abre una
línea de trabajo muy interesante. El último punto que resalta este trabajo es el
establecer qué tipo de sintasa de óxido nítrico (NOS) es la que se activa por la
infección micobacteriana, nosotros atribuimos la producción del NO por la
activación de la eNOS, que es la que se encuentra en mayor proporción en el
endotelio, además de ser una enzima constitutiva y de que su activación es
más rápida que la de la iNOS (Govers et al. 2001); por esto es necesario
establecer y estudiar el tipo de NOS que las diferentes micobacterias activan
al infectar a las HUVEC, así como otros mecanismos de defensa que pueden
estar involucrados en la misma.
IMPACTO
La realización de este trabajo nos permitió generar nuevos conocimientos
sobre la participación de células no fagocíticas en las infecciones por
micobacterias. Los resultados obtenidos nos permiten proponer que las células
endoteliales pueden funcionar como modelo interesante para la expresión de
latencia ya que pueden estar funcionando como reservorios durante la
infección por M. tuberculosis. En este aspecto, este trabajo fundamenta futuros
estudios encaminados a evidenciar la participación del óxido nítrico como
posible inductor de la latencia observada en la tuberculosis y refuerza la
hipótesis de que otras estirpes celulares (no macrófagos) tienen una
participación importante en los procesos infecciosos.