Estudio teórico-experimental del mecanismo de transferencia de hidruro entre
Ferredoxina-NADP reductasa (FNR) de Anabaena y NADP+
ISAIAS LANS VARGAS
Application of Ensemble-Average Transition State Theory with Multidimensional Tunneling to the Study of Hydride Transfer between Anabaena Tyr303Ser FNR and
NADP+/H
Isaias Lans, José Ramón Peregrina y Milagros Medina
José M. Lluch, Mireia Garcia-Viloca and Àngels Gonzàlez-LafontDepartament de Química y Institut de Biotecnologia i de Biomedicina, Universitat Autònoma de Barcelona, 08193 Bellaterra (Barcelona), España.
Citosol
Lumen tilacoidal
La Cianobacteria Anabaena PCC 7119
FNR2Fldox + NADPH2Fldrd + NADP+ + H+
Mecanismo de transferencia de hidruro
N
N
N-
NH
O
O
C
CHO
C
C
CH2
HO
HO
H
H
H
O
P
O
P
O
O
-O
-O O CH2O
HO OH
N
N
N
N
NH2
N+
NH2
O
O
OHHOPO2
-
O
PO2-
CH2O
HO OPO2H-
N
N
N N
NH2
1 2
34aC
O
4
10a
5
10
5a
9a
6
98
7
1' HH
H H 12
34
5
6
7
5'
H
HN5
FADH- NADP+
Se propone la transferencia neta de hidruro desde el átomo N5 del anillo de Flavina hacia el átomo C4 del anillo de Nicotinamida
C-I C-II C-III Y303
S
C-III* ¿Tyr303?
?
Y303
Hermoso et al. J. Mol. Biol. 319, 1133-1142 (2002) Nogués et al. Biochemistry 44, 11730-11740 (2005).Bortolotti et al. Biochem. Biophys. Acta-Proteins and Proteomics 1794, 199-210 (2009)
C4
N5
H-
La transferencia de hidruro entre FNRhq y NADP+
Obtener un conocimiento más amplio del mecanismo de transferencia de hidruro al NADP+ catalizado por la FNR (Tyr303Ser). Lo cual podría dar una indicación del papel de la Tyr303 en la FNR nativa
Objetivos
Por medio de un estudio teórico-experimental
Estudio Experimental
Determinar las constantes cinéticas del proceso de transferencia de
hidruro y efecto isotópico
Estudio Teórico
Obtener detalles estructurales del proceso de transferencia de hidruro en
FNR (Tyr303Ser)
Determinar las constantes de reacción y efecto isotópico
del proceso de transferencia de hidruro en FNR
(Tyr303Ser)
Resultados Experimentales
FNRrd + NADP+ FNRox + NADPH
kB C
[FNRrd-NADP+] [FNRox-NADPH]
Tiempo muerto
CTC-2 CTC-1
WT FNR
kHT
kHT-1
Tiempo muerto
FNRrd + NADP+ FNRox + NADPH
kB C
[FNRrd-NADP+] [FNRox-NADPH]CTC-2 CTC-1
Tyr303Ser FNR
kHT
Tiempo muerto
Tiempo muerto
El equilibrio es desplazado hacia la producción de NADPH
El remplazo de Tyr303 por Ser elimina la capacidad de reducción de NADP+
Lans et al. J. Phys. Chem. B. 114, 3368-3379 (2010)
La Disposición estructural entre la flavina y la nicotinamida en el mutante parece ser adecuada para que se de la
transferencia de hidruro en ambas direcciones
Anabaena Tyr303Ser FNR:NADP+ complex 2BSA
Dinámica molecular
Términos de Campos de Fuerza más comunes:
QMH-
Métodos mecánico-cuánticos (QM)-Pueden tratar reacciones químicas-No pueden tratar sistemas muy grandes
Métodos de mecánica molecular (MM)-No pueden tratar reacciones químicas-Pueden tratar sistemas muy grandes
QM/MM
Parte del sistema más involucrada en
la reacción
Resto del sistemaParte más alejada del
sitio de reacción
Programas Usados
CHARMM GAUSSIANCHARMMRATE
A B
FAD
Y303
NADP+
NADP+
FAD
FNR(1GJR) Y303S FNR(2BSA)
Estructura cristalográfica de FNR
Dinámica Molecular QM/MM del complejo Y303S FNR:NADP+
QM H-
N
N
N-
NH
O
O
C
CHO
C
C
CH2
HO
HO
H
H
H
O
P
O
P
O
O
-O
-O O CH2O
HO OH
N
N
N
N
NH2
N+
NH2
O
O
OHHOPO2
-
O
PO2-
CH2O
HO OPO2H-
N
N
N N
NH2
1 2
34aC
O
4
10a
5
10
5a
9a
6
98
7
1' HH
H H 12
34
5
6
7
5'
H
HN5
FADH- NADP+
Centro de reacción en la FNRModelo del Sistema Biológico Coordenadas Cartesianas de PDB 2BSA.
Estado de protonación: PROPKA. Adición de átomos de H:HBUILD/CHARMM.Neutralización con 7 Na+
Solvatación TPI3PTotal número de átomos: 41896(4800 átomos de proteína)
Equilibrado Campo de fuerza CHARMM22 Dinámica Molecular NPT (270 K, 1 atm) Condiciones de límite periódico Particle Mesh Ewald method.
58 átomos QM; 2 Átomos frontera (GHO); 41838 Átomos MM
RD RA
Coordenada de reacción (z) = RD- RA
Definición de la coordenada de reacción
Potencial de Fuerza Media (PMF)
Muestreo sesgado: umbrella samplingSe Obliga al sistema a explorar zonas de alta energía
V´(x) = V(x ) + W(x) Wi(x) = 1/2k(x - xo)2
Para la eliminación del sesgo se hace uso del método WHAM
Wi
x
Nº
Con
form
acio
nes
))(ln()( xPTkxW B
-2 -1 0 1-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
PM
F(k
cal/m
ol)
z(Å)
Proceso endoérgico, con barrera de energía potencial de ~35 kcal/mol
Potencial de fuerza media (AM1)
R (CTC-2)P (CTC-1)
TS
Evaluación del método QM usado
AM1 describe mal la contribución de la energía de dispersión al apilamiento y favorece la formación de puentes de hidrógeno
Usando el nivel MPWB1K/6-31+G(d,p) la lumiflavina y 1-metilnicotinamida presentan interacción de apilamiento.
MPWB1K/6-31+G(d,p) describe mejor las interacciones de apilamiento que B3LYP (6 kcal/mol de diferencia en energía de formación del complejo)
AM1
MPWB1K/631g(d,p)
PES de Y303SFNR:NADP
Corrección a doble nivel del PMF
RPAM
AMcQM
RPAM
KMPWBcQM
CMAMCMDL zVzVzWzW 11
111
AM1 MPWB1K/631g(d,p) Corrección a doble nivel
FNRrd + NADP+ [FNRrd-NADP+] [FNRox-NADPH] FNRox + NADPH
FNRrd + NADP+ [FNRrd-NADP+] [FNRox-NADPH] FNRox + NADPH
NT FNR
Y303S FNR
AM1
•La corrección de energía con MPWB1K cambia la endoergicidad de la reacción
•La localización del estado de transición se desplaza levemente hacia los productos.
34.9 kcal/mol 35.8 kcal/mol
3.6 kcal/mol
14.9 kcal/mol
R (CTC-2)P (CTC-1)
TS
R (CTC-2) P (CTC-1)
Lans et al. J. Phys. Chem. B. 114, 3368-3379 (2010)
Interacción del centro de reacción con la proteína
Variación del ángulo entre los anillos de flavina y nicotinamida en la reacción
•El ángulo N5 – hidruro – C4N se aproxima a 180º y el átomo aceptor y donador se aproximan entre sí.
• Deformación del par iónico FNRrd-NADP+, y pérdida parcial de la interacción de apilamiento π
•La penalización energética incrementa el costo energético del estado de transición
β=120º β=170º
α = 10º
HH
α = 60º
N5 C4
HH
N5 C4
TSR (CTC-2)
R (CTC-2)
P (CTC-1)TS
Lans et al. J. Phys. Chem. B. 114, 3368-3379 (2010)
+-
CMFTRR
CMCMCMact GzWzWzG ,,
zWzWzW vibCMQC
RvibCM
FTRRCMQCQC
act WGzWzWzG ,,,
Corrección vibracional
-2 -1 0 1-5
0
5
10
15
20
25
30
35
PM
F(k
cal/
mo
l)
z(Å)
PMF H/DVi (s)Para cada configuración i.
Coordenada de reacción z
R SP PZ1
Z2
Aproximación a zona secundaria estática(Frozen Bath)
Coeficiente de transmisión neto promedio γ
Por cada configuración de estado de transición vibracional Por cada configuración de estado de transición vibracional i i a a zz**
QCQC::
1) AM1/CHARMM22 SP localización 2) AM1/CHARMM22 MEP3) Corrección a doble nivel del MEP (interpolación usando ISPE).4) Factor de transmisión Quasiclásico Γi5) Coeficiente de transmisión Semiclásico κi
Coeficiente de Transmisión
Coeficiente de Transmisión:
/
/
E kT
E kT
P E e dET
e dE
0
≠TE
2
1
1 EP E
e
P(E) : permeabilidad (o probabilidad de transmisión):
)exp( */
RT
zG
h
TkTk
QCQCactBMTVTSTEA
T T T
2
1
2/12/1
])([)2(
s
s
Ga dsEsVE
8 estructuras optimizadas
-2 -1 0 1-5
0
5
10
15
20
25
30
35
PM
F(k
cal/
mo
l)
z(Å)
R
P
TS
Cálculo del Coeficiente de Transmisión: γ
T T T
i(T) = exp{-Gi}
PMF
Vi (s)Para cada configuración i.
Coordenada de reacción z
Gi
tunel
I(T)
)exp( */
RT
zG
h
TkTk
QCQCactBMTVTSTEA
Cálculo de la constante de reacción
Lans et al. J. Phys. Chem. B. 114, 3368-3379 (2010)
FNRrd + NADP+ FNRox + NADPH
kB C
[FNRrd-NADP+] [FNRox-NADPH]CTC-2 CTC-1
Tyr303Ser FNR
kHT
Tiempo muerto
Tiempo muertokHT-1
Comparación Teórico Experimental
Parámetro Teórico Experimental
kHT (279k) 92.8 s-1 190 s-1
kDT (279 K) 3.5 s-1 16.3 s-1
KIE 26.3 11.6
AH/AD12.5
Lans et al. J. Phys. Chem. B. 114, 3368-3379 (2010)
FNRrd + NADP+ FNRox + NADPH
kB C
[FNRrd-NADP+] [FNRox-NADPH]CTC-2 CTC-1
Tyr303Ser FNR
kHT
Tiempo muerto
Tiempo muertokHT-1
• La transferencia de hidruro en la dirección fisiológica desde Tyr303Ser FNRrd hacia NADP+ no es posible. Sin embargo, la reacción inversa, la transferencia de hidruro de NADPH hacia Tyr303Ser FNRox, ocurre.
• Las constantes de reacción teórica y experimental están en concordancia.
• En la zona de reactivos la distancia N5-C4N es compatible con la transferencia de hidruro, pero el ángulo entre los átomos N5-hidruro-C4N no es colineal, y por lo tanto, la transferencia de hidruro es ineficiente.
• La transferencia de hidruro involucra una importante cantidad de efecto Túnel.
• Las deformaciones geométricas que incluyen pérdida parcial de interacción de apilamiento π involucran una gran penalización de energía libre para poder alcanzar el estado de transición.
Conclusiones
WT FNR
Posible papel de Tyr303 en WT FNR
Cualquier factor capaz de romper la interacción de apilamiento entre el par iónico FADH-:NADP+ podría desestabilizar los reactivos, incrementando la constante de reacción.
α = 10º
HH
α = 60º
N5 C4
HH
N5 C4
AGRADECIMIENTOSGrupo de Biología Estructural
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular
Universidad de Zaragoza
Prof. Dra. Milagros Medina Prof. Dr. Carlos Gómez-Moreno Dra. Marta Martínez Dra. Patricia FerreiraDra. Susana Frago José Ramón Peregrina Guillermina Goñi Ana Serrano Beatriz Herguedas Ana Sánchez Raquel Villanueva
Departament de Química
Institut de Biotecnologia i de Biomedicina,
Universitat Autònoma de Barcelona, Dr. José M. Lluch, Dra. Mireia Garcia-VilocaDra. Àngels Gonzàlez-Lafont
Grupo de interacción proteína- proteína y transferencia de electrones (UZ)
Gracias por su atención
Corrección Vibracional
-4 -2 0 2
-4
-2
0
2
B
A
B Gauss Fit of B
-4 -2 0 2-3
-2
-1
0
1
C
A
C Gauss Fit of C
Corrección vibracional H Corrección vibracional D
Ajuste a una curva gaussiana
z
E(k
cal/m
ol)
z
A B
FAD
Y303
NADP+
NADP+
FAD
E3E2E1
Hipótesis del mecanismo de reconocimiento del NADP+ en la FNR
FNR(1GJR) Y303S FNR(2BSA)
Simulación NT FNR:NADP
sims
sims
N
jBjbiasjj
N
iii
TkxwFn
xPxnxP
1,
1
'
/]exp([
)()(
Weighted Histogra Analysis Method (WHAM)
dx)(exexp /)(/xPp TkxwTkF
Bibi
))(ln()( xPTkxW B
Modelo de partida para la simulación del complejo NT FNR:NADP+.
Equilibrado del Modelo
Dinámica Molecular con la restricción del movimiento de la Arg 264
Dinámica Molecular con restricción del movimiento de FADH- y NAD+
Simulación del complejo FNR:NADP+
R264
Fluctuación de residuos de FNR durante la dinámica molecular
PES partiendo del modelo de WT
Plantilla Y303SER
24kcal/mol
Z(Å)
V(k
cal/m
ol)
N1-C4N
N10 N1N
-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
B
A
W(k
cal/m
ol)
Z(Å)
Corrección a doble nivel del PMF WT
-2 -1 0 1 2-50
-40
-30
-20
-10
0
10
Z(Å)
V(k
cal/m
ol)
pKa Glu301: 5.11 pKa Glu301: 8.04
PES con Glu301 protonado
-3 -2 -1 0 1 2 3-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
-3 -2 -1 0 1 2 3
V(k
ca
l/m
ol)
Z(Å)
75kcal/mol
PES partiendo de reubicación de TYR
-3 -2 -1 0 1 2 3-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
V(k
cal/
mo
l)
Z(Å)
35kcal/mol
Modelos de FNR WT obtenidos con el servidor Geno3D
Plantilla: estructura de FNR PDB (1qga)
-3 -2 -1 0 1 2
0
10
20
30
40
50
V(k
cal/
mo
l)
Z(Å)
PES partiendo de un modelo obtenido usando el servidor Geno3D
Plantilla: estructura de FNR de guisante
25kcal/mol
N
N
N
NH
R
O
O
N
N
N
NH
R
O
O
N
N
N
NH
R
O
O
-
+*
-
H H
e- + H+ e-
2
3
1
44a
10a
5
109a5a6
987
QN NEUTRA SQ NEUTRA HQ ANIÓNICA
Puntos a tener en cuenta para la simulación de la FNR WT
Glu301Ser80