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ACIÓN
ii
CERTIFICACIÓN
Ingeniero
Juan Carlos Romero Benavides
DIRECTOR DEL TRABAJO DE FIN DE TITULACIÓN
De mi consideración:
El presente trabajo de fin de titulación: “Obtención de extractos, aislamiento y
caracterización de metabolitos secundarios de Passiflora cumbalensis, P. manicata y P.
indecora con actividad citotóxica”, realizado por Karina Noemí Torres García, ha sido
orientado y revisado durante su ejecución, por cuanto se aprueba la presentación del
mismo.
Loja, agosto de 2013
Ing. Romero Benavides Juan Carlos
CI: 1103018477
iii
DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE DERECHOS
Yo, Karina Noemí Torres García, declaro ser autor del presente trabajo de fin de titulación:
“Obtención de extractos, aislamiento y caracterización de metabolitos secundarios de
Passiflora cumbalensis, P. manicata y P. indecora con actividad citotóxica”, de la titulación
de Bioquímica y Farmacia, siendo el Ing. Juan Carlos Romero Benavides, director del
presente trabajo; y eximo expresamente a la Universidad Técnica Particular de Loja y a sus
representantes legales de posibles reclamos o acciones legales. Además certifico que las
ideas, conceptos, procedimientos y resultados vertidos en el presente trabajo investigativo
son de mi exclusiva responsabilidad.
Adicionalmente declaro conocer y aceptar la disposición del Art. 67 del Estatuto Orgánico de
la Universidad Técnica Particular de Loja que en su parte pertinente textualmente dice:
“Forman parte del patrimonio de la Universidad la propiedad intelectual de investigaciones,
trabajos científicos o técnicos, o tesis de grado que se realicen a través, o con el apoyo
financiero, académico e institucional (operativo) de la Universidad.
Karina Torres García
Nº 1104440316
iv
DEDICATORIA
El presente trabajo va dedicado a mi madre Lcda. Noemí García Álvarez, por ser mi
ejemplo, mi compañera, mi amiga y apoyo incondicional; a mi niño Ian Yariel Pullaguari
Torres el motivo de culminar mi carrera profesional; a mi padre Lcdo. Julio Torres Jiménez
(+) y mi hermana Cristina (+), por las bendiciones recibidas día a día; a Santiago Pullaguari
y su familia por todo el apoyo brindado; a toda mi familia y compañeros por compartir estos
años de valiosos recuerdos.
Karina Torres.
v
AGRADECIMIENTO
Le agradezco a Dios por haberme acompañado y guiado a lo largo de estos cinco años, por
ser mi fortaleza en los momentos de debilidad y por brindarme una vida llena de
aprendizajes y experiencia, a mi madre por apoyarme en todo momento, por los valores que
me han inculcado, y por haberme dado la oportunidad de tener una excelente educación en
el transcurso de mi vida y por ser mi ejemplo de vida a seguir; a mi hijo Ian Yariel por llenar
mi vida de alegría y amor, y ser el motivo para seguir adelante; a mi familia y compañeros
por compartir grandiosos momentos.
Le agradezco la confianza, apoyo y dedicación de tiempo al Ing. Juan Carlos Romero
Benavides, por haber compartido conmigo sus conocimientos y amistad; a la vez al
departamento de Química Aplicada de la Universidad Técnica Particular de Loja y todos sus
integrantes por el apoyo y facilidades otorgadas para el desarrollo del presente trabajo
investigativo.
Karina Torres
vi
ÍNDICE DE CONTENIDOS Página
CARATULA i
CERTIFICACION ii
DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE
DERECHOS
iii
DEDICATORIA iv
AGRADECIMIENTO v
ÍNDICE DE CONTENIDOS vi
LISTADO DE TABLAS, GRÁFICAS Y FIGURAS viii
ABREVIATURAS xi
RESUMEN Y PALABRAS CLAVE 1
ABSTACT AND KEY WORDS 2
INTRODUCCIÓN 3
CAPITULO I
1. Fin, propósito y componentes del proyecto 5
CAPITULO II
2. Aspectos generales 7
2.1. Medicina Tradicional. 7
2.2. Productos Naturales, fitoquímica y cáncer. 7
2.3.Fitoesteroles y Aldehídos. 9
2.3.1.Fitoesteroles. 9
2.3.2. Aldehídos. 11
2.4. Antecedentes. 11
2.4.1. Género Passiflora y cáncer. 11
2.5.Características botánicas y taxonómicas de
las especies a estudiar.
14
2.5.1.Passiflora cumbalensis. 14
2.5.2.Passiflora manicata. 15
2.5.3.Passiflora indecora. 16
CAPITULO III
3. Materiales y métodos 18
vii
3.1. Recolección de material vegetal. 19
3.2. Evaluación de la actividad inhibitoria del
crecimiento celular de los extractos y
compuestos identificados mediante MTT.
20
3.3. Cromatografía en columna. 20
3.4.Cromatografía en capa fina. 22
3.5.Recristalización. 22
3.6. Caracterización de los MS. 22
CAPITULO IV
4. Resultados y análisis 24
4.1. Rendimiento del material utilizado. 24
4.2. Inhibición de crecimiento de tres líneas
celulares de cáncer humano.
24
4.3. Fraccionamiento mediante cromatografía
en columna.
27
4.4. Identificación y caracterización de
metabolitos secundarios.
27
4.5. Porcentaje de inhibición de crecimiento
celular de los compuestos identificados.
33
4.6. Extracto de P. cumbalensis en acetato de
etilo, se aisló e identifico 1 compuesto
35
4.7.Extracto metanólico de P. cumbalensis, se
obtuvo 2 compuestos.
36
4.8. Extracto hexánico de P. manicata se
obtuvo dos mezclas de compuestos.
36
CONCLUSIONES 39
RECOMENDACIONES 40
BIBLIOGRAFIA 41
ANEXOS 46
viii
LISTA DE TABLAS Página
Tabla 1. Taxonomía de P. cumbalensis. 14
Tabla 2. Taxonomía de P. manicata. 15
Tabla 3. Taxonomía de P. indecora. 16
Tabla 4. Proporción y peso de cada uno de los
extractos de las especies P. cumbalensis, P.
manicata y silica gel, utilizados en cromatografía en
columna abierta.
20
Tabla 5.Peso de extractos obtenidos, rendimiento de
las especies P. cumbalensis, P. manicata y P.
indecora
23
Tabla 6.Número de fracciones obtenidas en el
fraccionamiento por cromatografía en columna de los
extractos P. cumbalensis y P. manicata.
27
LISTA DE GRAFICAS
Gráfica 1. Porcentaje de inhibición del crecimiento
celular en la línea de cáncer de colon RKO; de los
extractos de P. cumbalensis, P. manicata y P.
indecora.
24
Gráfica 2. Porcentaje de inhibición del crecimiento
celular en la línea de cáncer de mama MCF7; de los
extractos de P. cumbalensis, P. manicata y P.
indecora.
24
Gráfica 3.Porcentaje de inhibición del crecimiento
celular en la línea de astrocitoma cerebral D384; de
los extractos de P. cumbalensis, P. manicata y P.
indecora
25
Gráfica 4. Porcentaje de inhibición del crecimiento
celular en la línea RKO de los fitoesteroles
identificados.
33
Gráfica 5. Porcentaje de inhibición del crecimiento 34
ix
celular en la línea D384 de los fitoesteroles
identificados. LISTA DE FIGURAS Página
Figura 1. Mecanismo anti - cancerígeno de los
fitoesteroles 10
Figura 2. Resumen de la metodología utilizada en el
estudio de las tres especies del género Passiflora. 18
Figura 3. Mapa del cantón Loja, ubicando los sitios
de recolección de las especies (San Cayetano Alto y
Uritusinga).
19
Figura 4. Compuesto 1. Estructura molecular de
dodecanal. 28
Figura 5. Compuesto 2. Estructura molecular de
hexacosanal. 29
Figura 6. Compuesto 3. Estructura molecular de 5,
22 dien – 3 estigmasterol. 30
Figura 7. Compuesto 4. Estructura molecular de
gamma sitosterol. 31
Figura 8. Compuesto 5. Estructura molecular de
beta sitosterol. 32
Figura 9. Compuesto 6. Estructura molecular de
ergosterol. 33
Figura 10. Compuesto 7. Estructura molecular de
nonadecanal. 36
LISTA DE FOTOGRAFIAS Fotografía 1. Fotografía de Cromatografía en
columna: a cromatografía en columna del extracto
hexánico de P. cumbalensis; b: cromatografía en
columna del extracto de acetato de etilo de P.
cumbalensis, c: cromatografía en columna del
extracto de metanol de P. cumbalensis; d:
21
x
cromatografía en columna del extracto hexánico de
P. manicata. LISTA DE FORMULAS Fórmula 1. Rendimiento del extracto obtenido y
peso de la materia vegetal seca. 20
xi
ABREVIATURAS MS
AcOEt
Hex
MeOH
DCM
CC
TLC
UV
Pf
RMN
RMN 1H
RMN 13C
EM
CDCl3
CMI
P
RKO
MFC7
D384
MTT
Metabolito secundario
Acetato de Etilo
Hexano
Metanol
Diclorometano
Cromatografía en Columna
Cromatografía en capa fina
Ultravioleta
Punto de fusión
Resonancia Nuclear Magnética
Resonancia Nuclear Magnética de Hidrogeno
Resonancia Nuclear Magnética de Carbono
Espectrometría de masas
Cloroformo deuterado
Concentración mínima inhibitoria
Passiflora
Línea celular humana de cáncer de colon
Línea celular humana de cáncer de mama
Línea celular humana de astrocitoma cerebral
Metiltetrazolium
1
RESUMEN
P. cumbalensis, P. manicata y P. indecora se recolectaron en Uritusinga y San Cayetano
Alto (Loja); de las partes aéreas se obtuvieron extractos en Hex, AcOEt y MeOH, se realizó
un estudio de inhibición de crecimiento celular en tres líneas de cáncer humano RKO, MCF7
y C384 mediante MTT; los más activos se los fraccionó por CC, los extractos con mayor
actividad fueron hexánico de hojas de P. manicata (60%), hexánico de P. cumbalensis
(50%); de éste se aislaron seis MS: cuatro fitoesteroles (estigmasterol; gamma-sitosterol;
beta-sitosterol y ergosterol) cuya actividad fue 50-60% en D384 y 15-20% en RKO y dos
aldehídos (dodecanal y hexacosanal); todos identificados por primera vez en esta especie;
del extracto AcOEt de P. cumbalensis se aisló e identificó un aldehído (nonadecanal); todos
los compuestos se identificaron utilizando: RMN: 1H, 13C; y EM, la caracterización de los MS
se efectuó por medio de comparación con datos espectroscópicos previamente informados;
del extracto metanólico de P. cumbalensis se obtuvo dos compuestos que no se lograron
caracterizar, y del extracto hexánico de P. manicata se obtuvo dos mezclas de compuestos.
PALABRAS CLAVE: Passiflora, fitoesteroles, MTT, inhibición del crecimiento celular.
2
ABSTACT
P. cumbalensis, P. manicata and P. indecora were collected in Uritusinga and San Cayetano
Alto (Loja),the aerial parts extracts were obtained in Hex, EtOAc and MeOH, a study of
inhibition of cell growth of three human cancer cell lines: RKO, MCF7 and C384 by MTT; the
more active they are fractionated by CC, the most active extracts were hexane from leaves
of P. manicata (60%), hexane from P. cumbalensis (50%) of it is isolated six MS: four
phytosterols (stigmasterol, gamma-sitosterol, beta-sitosterol and ergosterol) whose activity
was 50-60% in D384 and 15-20% in RKO and two aldehydes (dodecanal and hexacosanal),
all identified for the first time in this species, the AcOEt extract of P. cumbalensis was
isolated and identified an aldehyde (nonadecanal); all compounds were identified using:
NMR: 1H, 13C, and MS, the MS characterization was effected by means of spectroscopic data
compared to previously reported, the methanol extract of P. cumbalensis was obtained two
compounds which characterize not achieved, and the hexane extract of P. manicata was
obtained two mixtures of compounds.
KEY WORDS: Passiflora, phytosterols, MTT, cell growth inhibition
3
INTRODUCCION
El desarrollo alcanzado en las técnicas de aislamiento e identificación de productos y el nivel
de las investigaciones mundiales hacen que el área de los productos naturales es la de
mayor crecimiento dentro del campo de la química orgánica, en la actualidad se reportan
cerca de un millón de productos naturales aislados a partir de diferentes especies. Han
surgido novedosos y sofisticados métodos y técnicas de aislamiento, dependientes del
creciente desarrollo de la biotecnología y la bioingeniería y la aparición de nuevas
demandas en la terapia humana (Krishnaswamy, 2000). Aproximadamente el 53% de los
fármacos de uso clínico actual proceden de una fuente natural o sus derivados sean
sintéticos o semisintéticos (Chamba, 2012); la zona sur del Ecuador es considerada uno de
los 10 lugares sobresalientes de diversidad biológica a nivel global, y de gran valor ancestral
debido a la presencia de dos grupos étnicos: Saraguro y Shuar, en donde la medicina
tradicional sobresale destacando algunas especies de gran interés (Pineda et al., 2010).
Todas las especies vegetales cuentan con el metabolismo, que es el conjunto de reacciones
químicas que realizan las células de los seres vivos para sintetizar sustancias complejas a
partir de otras más simples o para degradar las complejas y obtener las simples. Las
plantas, organismos autótrofos, además del metabolismo primario presente en todos los
seres vivos, poseen un metabolismo secundario que les permite producir y acumular
compuestos de naturaleza química diversa, estos compuestos derivados del metabolismo
secundario se denominan metabolitos secundarios, se distribuyen diferencialmente entre
grupos taxonómicos, presentan propiedades biológicas, muchos desempeñan funciones
ecológicas y se caracterizan por sus diferentes usos; un grupo relevante son los fitoesteroles
que son esteroles de origen natural, son moléculas orgánicas que conforman parte de las
células vegetales, además del efecto hipocolesterolemiante, algunos estudios
experimentales sugieren que puedan también ejercer un cierto efecto preventivo sobre el
desarrollo de distintos tipos de cáncer, como: de colon, estómago, pulmón, mama, y de
próstata; además se les puede atribuir funciones en la resolución de procesos patológicos
crónicos mediados por anormalidades de la respuesta inmune (infecciones virales crónicas,
tuberculosis, alergias, artritis reumatoide), incluso, algunas investigaciones en animales han
demostrado que algunos poseen una actividad antiinflamatoria y antipirética (contra la
fiebre) aunque todavía estas nuevas propiedades de los fitosteroles se encuentran en
estudio y presentan controversia entre los diferentes autores(Giménez, 2012).
4
CAPITULO I
5
1. Fin, propósito, y componentes del proyecto.
1.1. Fin del proyecto. Contribuir con el estudio de metabolitos secundarios de Passiflora cumbalensis, P. manicata
y P. indecora, y su acción inhibitoria en el crecimiento de líneas celulares de cáncer
humano.
1.2. Propósito del proyecto. Obtener extractos, purificar y caracterizar metabolitos secundarios de Passiflora
cumbalensis, P. manicata y P. indecora con actividad inhibitoria en el crecimiento de líneas
de cáncer humano.
1.3. Componentes del proyecto. Seleccionar y recolectar las especies vegetales.
Obtener extractos de acuerdo a la polaridad con diversos disolventes: hexano (Hex), acetato
de etilo (AcOEt) y metanol (MeOH).
Determinar la actividad inhibitoria del crecimiento celular mediante MTT de los extractos
obtenidos, en líneas de cáncer humano.
Realizar el fraccionamiento de los extractos por cromatografía en columna.
Obtener, purificar y caracterizar metabolitos secundarios y determinar su actividad inhibitoria
en líneas celulares de cáncer humano.
6
CAPITULO II
7
2. Aspectos generales.
2.1. Medicina tradicional.
La organización mundial de la salud (OMS) define a la Medicina Tradicional como un
conjunto de prácticas, enfoques, conocimientos y creencias diversas que incorporan
medicina de origen animal, mineral y vegetal; también incluye terapias espirituales, técnicas
manuales o ejercicios practicados de forma individual o grupal con la finalidad de mantener
el bienestar del individuo y en algunos casos para tratar, diagnosticar y prevenir
enfermedades (OMS, 2010).
2.2. Productos naturales, fitoquímica y cáncer.
Los productos naturales hacen referencia a los extractos o sustancias obtenidas de materia
vegetal, en especial de las que se conoce un uso medicinal o nutricional, en la década de
los cincuenta México fue pionero en el desarrollo de productos naturales con la producción
de esteroides a partir de la “cabeza de negro” y el “barbaso” (Lara et al,. 1996).
Desde tiempos ancestrales, el hombre utilizó diversas plantas para satisfacer sus más
urgentes necesidades como la alimentación y la medicina, originando de esta manera el
interés de algunos por el estudio químico de las plantas, permitiendo la formación de la
fitoquímica, una disciplina científica que emplea diversas técnicas que le permiten aislar
extractos y fraccionarlos sucesivamente hasta obtener metabolitos secundarios (Badawy et
al., 1999), que son sustancias ecológicamente eficaces, frente a los metabolitos primarios
que son biológicamente efectivos, estos son el resultado de la biosíntesis, transformación y
degradación de compuestos endógenos mediante proteínas de especialización, las cuales
se han formado como resultado de los procesos de diferenciación y se los puede clasificar
según su significación biológica y función en la célula protectora (Valdés y Valbín, 2000); en
los organismos vivos se conocen tres rutas biosintéticas por la que se los puede producir:
ruta del sikimato, ruta del acetato-malonato y la ruta acetato-mevalonato; los metabolitos
secundarios se encuentran presentes en pequeñas cantidades, sin embargo, en base a las
técnicas espectroscópicas es posible reconocer su estructura molecular (Olmedo et al
2009).
Los estudios fitoquímicos en las últimas décadas, han seguido el modelo de fraccionamiento
biodirigido; los extractos crudos y parcialmente purificados, así como los metabolitos
secundarios aislados, son probados frente a la actividad biológica esperada, de estas
actividades las de mayor interés son la antioxidante y la anticancerígena (Benjamin, 2012).
El cáncer es una enfermedad producida por la división y crecimiento descontrolado de
determinadas células, las cuales no sólo poseen la capacidad de invadir el órgano donde se
8
originaron, sino de viajar por la sangre y el líquido linfático hasta otros órganos y
desarrollarse, se calcula que sería el causante de la muerte de 84 millones de personas
entre 2005 y 2015 (Laza et al., 2006), entre los principales fármacos utilizados en la
quimioterapia del cáncer está la doxorrubicina, que es un antibiótico que actúa en la
intercalación del ADN inhibiendo algunos ácidos nucleicos dificultando el avance de algunas
enzimas, su administración por lo general es intravenosa, o el placlitaxel que es una droga
citoesquelética, las células tratadas con ésta sufren disfunción en el ensamblamiento de los
microtúbulos alterando su mitosis, al ser fármacos muy agresivos causan elevados efectos
secundarios por lo que se pretende encontrar anticancerígenos naturales y con menores
repercusiones al paciente (Callacondo, et al 2008) ante esto en los últimos años se han
investigado diversas especies vegetales y sus componentes para combatirla: reportes en
mangos donde se aisló el lupeol y la mangiferina que contienen importante actividad anti
cáncer (Croweel 1997), los isotiocianatos presentes en el Brassica oleracea italica son
capaces de eliminar la proteína del gen p53 defectuoso y dejar libres las proteínas sanas
para suprimir el desarrollo de tumores; el licopeno presente en el Solanum lycopersicum es
capaz de inhibir la proliferación celular, al tiempo que posee un efecto anti-carcinogénico y
anti-aterogénico; el resveratrol presente en las uvas para la fabricación de vino reduce un
50% el riesgo de cáncer de próstata, y los fitoesteroles presentes en las nueces son
capaces de desacelerar el crecimiento del cáncer, en especial el de mama (Sanz 2011). A
todo el grupo de Symphytum spp, se le otorgan características cicatrizantes,
antiinflamatorias y para aliviar el cáncer, mientras que la Beta vulgaris (remolacha) se la
utiliza para ayudar en las lesiones provocadas por las radioterapias aplicadas en pacientes
con presencia de tumores, que los efectos sean mejor tolerados (Navarro, et al 2011).Una
de las especies que ha revolucionado el mundo de la fitoterapia contra el cáncer es la fruta
de Annona muricata considerada 10.000 veces más potente que la quimioterapia: sus
extractos revelaron que destruye las células malignas en 12 tipos de cáncer, entre ellos:
colon, pecho, próstata, pulmón y de páncreas, los compuestos de este árbol demostraron
una mejor inhibición en el crecimiento de las células de cáncer que la adriamiacina, una
droga quimioterapéutica, normalmente usada en el mundo y lo más destacado es que solo
destruye las células malignas del cáncer y no afecta las células sanas (Street, 2006).
Medicamentos hechos en base a plantas presentan una inmensa ventaja con respecto a los
tratamientos químicos. En las plantas los principios activos se hallan siempre biológicamente
equilibrados por la presencia de sustancias complementarias, que van a potenciarse entre
sí, de forma que en general no se acumulan en el organismo, y sus efectos indeseables
están limitados. Sin embargo, a pesar de que han aumentado las investigaciones y los
9
estudios científicos de las plantas medicinales, todavía no se conoce a fondo muchos de los
principios activos a los que deben las plantas sus extraordinarias cualidades (Hua K, 2002).
Existen gran cantidad de tipos de metabolitos secundarios en plantas una de las
clasificaciones se basa en la presencia o no de nitrógeno en su composición, no obstante,
los tres grupos de metabolitos secundarios más importantes en plantas son los terpenoides
(o isoprenoides), fenil propanoides (o compuestos fenólicos) y los alcaloides (este último
grupo lleva nitrógeno en su estructura) (Olmedo, 2009), sin embargo en el presente trabajo
se logró aislar los fitoesteroles y aldehídos.
2.3. Fitoesteroles y aldehídos.
2.3.1. Fitoesteroles. El grupo de los fitoesteroles comprende esteroles y estanoles de origen vegetal, que
cuentan con una estructura casi idéntica a la del colesterol, difieren únicamente en la
presencia de grupos metilo o etilo en la cadena lateral de la molécula (Higdon, at al 2008).
Están considerados como compuestos antiinflamatorios, antitumorales, bactericidas y
fungicidas, aunque su propiedad más estudiada es su efecto hipocolesterolémico, el cual se
ha observado tanto en el colesterol total, como en el colesterol-LDL (Rodríguez, et al 2008).
Los fitoesteroles se encuentran disponibles en todas las plantas, por lo que los vegetarianos
son los que cuentan con un mayor consumo de estos compuestos, sin embargo, pueden
encontrarse en mayor concentración en aceites vegetales no refinados, nueces, semillas,
granos enteros, legumbres y germen de trigo (Ostlund, 2002).
Dentro de las principales funciones que se atribuyen a los fitoesteroles está la de ser
antiinflamatorio aunque limitada, hay un poco de información acerca de cómo los
fitoesteroles podrían atenuar las reacciones inflamatorias del sistema inmunológico, en
algunos estudios se observó que el tratamiento de células con fitoesteroles reducía la
producción de prostaglandinas, compuestos involucrados en la respuesta
inflamatoria (Woyengo, et al 2009); también juegan papeles importantes en enfermedades
cardiovasculares gracias a su influencia en el nivel de colesterol en la sangre, los
fitoesteroles pueden jugar un papel importante en la prevención de arterioesclerosis y
enfermedades coronarias (Jenkins, et al 2005). Y actúan en hiperplasia prostática benigna,
que se refiere a un crecimiento no canceroso de la próstata, y se ha encontrado que la
administración de fitoesteroles ayuda al tratamiento de síntomas de presión en la
uretra (Bergues, et al 1995).
Se han encontrado algunas evidencias de que los fitoesteroles, particularmente el sitosterol,
podrían inducir apoptosis en células de cáncer de próstata, de mama y de colon mediante el
incremento en la actividad de la caspasa-3, enzima proteasa que participa en la cascada de
10
la apoptosis, los fitoesteroles también pueden interferir en el crecimiento y la multiplicación
celular aunque se desconoce la forma en que se lleva acabo. En las etapas de angiogénesis
y metástasis, estos compuestos parecen reducir la capacidad de las células cancerígenas,
finalmente, el sitosterol participa en la activación de enzimas antioxidantes como la
superóxido dismutasa y la glutatión peroxidasa, con esto se reducen los agentes oxidantes y
potenciales carcinogénicos (Honey, 2012) en la Figura 1, se puede observar las actividades
inhibitorias y activación en la carcinogénesis. Figura 1. Diversos mecanismos anti-cancerígenos de los fitoesteroles.
Fuente: Modificado de Honey, 2012
De forma similar al colesterol, para que se lleve a cabo su absorción, los fitoesteroles deben
ser incorporados a micelas, mezclas de sales biliares, lípidos y esteroles, que pueden ser
absorbidas por los enterocitos del intestino (Jong, et al 2009), una vez en las células del
intestino, deben ser incorporados a lipoproteínas conocidas como quilomicrones, estos
complejos son liberados al torrente sanguíneo, y al ser ricos en triglicéridos y colesterol van
distribuyendo estos compuestos al cuerpo, hasta llegar al hígado (Plat y Mensink, 2003).
11
En algunos estudios en ratones y conejos se ha observado que en grandes cantidades los
fitoesteroles pueden alterar las propiedades de la membrana y el metabolismo de la
testosterona (Jones, et al 2005); además son fácilmente tolerados, sólo en algunas
ocasiones se han asociado a casos de nausea, indigestión, diarrea y constipación (Bergues,
et al 1995).
Aunque no se trate directamente de un efecto negativo sobre la salud, cabe mencionar que
se ha visto una correlación entre el consumo de alimentos enriquecidos con fitoesteroles y
una reducción de la concentración plasmática de α-caroteno, β-caroteno y licopeno (Ntanios,
et al 2002). En cuanto a su interacción con otros compuestos, además de lo ya mencionado
sobre los carotenoides, no se han encontrado reducciones importante en la absorción de
otros compuestos liposolubles como son las vitaminas A, D, E y K (Katan, et al 2006).
2.3.2. Aldehídos.
Los aldehídos son compuestos orgánicos caracterizados por poseer el grupo funcional –
CHO; se utilizan principalmente para la fabricación de resinas, plásticos, disolventes,
pinturas, perfumes y esencias (Olmedo, et al 2009).
Los aldehídos están presentes en numerosos productos naturales y grandes variedades de
ellos son de la propia vida cotidiana, como la glucosa que existe en una forma abierta que
presenta un grupo aldehído, o el acetaldehído formado como intermedio en la
metabolización se cree responsable en gran medida de los síntomas de la resaca tras la
ingesta de bebidas alcohólicas y causante del 15.6% cáncer de esófago, sin embargo existe
la aldehído deshidrogenasa 2 (ALDH2), que es responsable de descomponer el
acetaldehído en una sustancia no tóxica, por lo tanto de disminuir la incidencia de cáncer;
sin embrago los no bebedores carecen de la ALDH2, por lo que su estudio es controversial
(Espinoza et al., 2005), se los ha identificado y caracterizado en diversas especies entre las
principales tenemos Eucaliptus citriodora, Lippis citriador y Melissa officinalis, en donde se
les otorgan funciones como antiinflamatorio, antiinfeccioso, ansiolíticohipotérmicos,
inmunoestimulantes y antialérgico (Garbarino, et al 2003); el principal uso que se les otorga
a los aldehídos aislados de especies vegetales es la hidrogenación selectiva de estos,
utilizando catalizadores metálicos, con el propósito de satisfacer el mercado de
saborizantes, de fragancias químicas y de productos farmacéuticos (Espinoza, et al 2005).
2.4. Antecedentes.
2.4.1. Género Passiflora y cáncer.
12
El género Passiflora (P.) conocida comúnmente como Pasiflora, pertenecen a la familia de
Passifloraceae, cuenta con 18 géneros y alrededor de 630 especies distribuidas en zonas
tropicales y subtropicales de todo el mundo, en América la mayoría de las especies se
hallan en Centro y Sudamérica (Labardén 2005). Extractos de pasiflora se han clasificado en
varias categorías de la actividad química: ansiolíticos, espasmolítico, hipnóticos, sedantes,
narcóticos (Ozarko 2001) estos extractos son parte de un tratamiento que ha tratado con
éxito a pacientes ambulatorios con trastorno de adaptación y estado de ansiedad (Bourin
1997).
Dentro de las investigaciones en especies de este género sobresalen:
P. quadrangularris es utilizada tradicionalmente por los curanderos para mordeduras de
serpientes, ya que esta especie causa la coagulación sanguínea evitando la hemorragia
(Worldnet, et al 2001). Cuando un extracto de las hojas y ramas de P. quadrangularis se
administra por vía oral, ya sea antes o después de una inyección de veneno, la
neutralización de la hemorragia se reduce por debajo de 25% en ratones (Otero, et al 2000)
P. incarnata L. es el miembro más ampliamente investigado del género, sus extractos tienen
propiedades sedantes en ratones, demostrado en la disminución de pasos en una escalera,
lo que explica por qué los extractos de Passiflora se utilizan ampliamente como “remedios
del sueño”, varios flavonoides han sido aislados a partir de P. incarnata L. como: crisina y
apigenina, (Zanoli 2000) junto con orientin, isoorientin, vitexina y isovexin (Soulimani, et al
1997).Las mayores acumulaciones de flavonoides en P. incamata se encuentran en las
hojas entre las etapas de prefloración y floración de la planta (Menghini 1998). La crisina y la
apigenina combinadas son utilizadas para reducir la capacidad del aparato locomotor (Zanoli
2000). La crisina y la apigenina han demostrado inhibir el crecimiento de células de
carcinoma de mama (Yin 2001), células de cáncer de tiroides en humanos (Yin 1999), y los
tumores de próstata humanos (Knowles, 2000). La apigenina se considera anti-mutagénica,
ya que reduce los efectos mutagénicos en ratas (Nakasugi 2000). Los flavonoides presentan
actividad hormonal significativa (Zand 2000); la apigenina y la luteolina (otro flavonoide)
resultaron ser eficaces en la prevención del embarazo por lo que se los encuentra en los
anticonceptivos orales comúnmente prescritos, además demostraron ser citotóxicos contra
las bacterias resistentes a la meticilina, Staphylococcus aureus (Sato, 2000).Los extractos
de las partes aéreas de P. incamata L. contienen las β-carbolinas: harman, hamun, hannalin,
harmol y harmalol (Soulimani 1997). La -carbolina, aislado de P. incamata L., inducen al
consumo voluntario de etanol en ratas (Baum 1996). Algunas personas pueden estar
interesados en el hecho de que la harman se ha identificado en la cerveza, el vino (Bosin
1988) y el humo del cigarrillo (Totsuka 1999). Se ha descubierto que las β-carbolinas puede
prevenir el daño a las neuronas del cerebro de ratones, por actuar como un antioxidante
13
(Lee, et al 2000). Harman actúa como un vasodilatador (reduce la inflamación o edema),
funciona mediante la liberación de GABA, serotonina y noradrenalina (Dolzhenko 1997).
Harman y compuestos relacionados son mutagénicos y se vuelven más mutagénicos en
condiciones ácidas del estómago (Lin, et al 1986). El Maltol es un compuesto aromático que
tiene propiedades antioxidantes en la inhibición de la oxidación del hexanal en un 84% (Lee
2000). Además es responsable del desarrollo de enfermedades relacionadas con la
disfunción renal y el desarrollo de ciertos trastornos neurodegenerativos (Ginkel, et al 1993).
Shatfocide es un glucósido de apigenina, se aisló de P. incamata L. (Li 1991); experimentos
realizados con brotes de trigo sugieren que es responsable de propiedades antimutagénicas
(Peyrt, et al1992). Extractos de P. morifolia contienen el glucósido cianhidrina, y la
linamarina (Jaroszewski 1996). La linamarina provoca un aumento de ácido láctico y el
colesterol total en el hígado y cerebro además del agotamiento de los fosfolípidos cerebrales
en conejos (Padmaja 1989).Varios compuestos monoterpenoides (compuestos con 10
carbonos) se han aislado de P. quadrangularis (Osorio 2001); algunos monoterpenos
dietéticos han demostrado actividad quimioprotectora contra el cáncer mamario de rata
(Crowell 1997).4-Hidroxi-2-ciclopentenona es responsable de la actividad anti-bacteriana de
un extracto de hojas de P. tetrandra contra las bacterias: Escherichia coli, Bacillus subtilis, y
Pseudomonas aeruginosa, también encontró que la 4-hidroxi-2-ciclopentenona fue
citotóxica para las células de leucemia (Perry 1991) P. mollissima se caracteriza por poseer
un alto contenido de compuestos polifenólicos hidrofílicos y lipofílicos con propiedades
antioxidantes determinados por métodos fluorescentes ORAC (oxygen radical absorbance
capacity), determinando que en su extracto acuoso tiene un alto potencial nutracéutico,
debido al contenido de polifenoles, que inciden directamente en su capacidad para atrapar
radicales y especies reactivas de oxígeno (Rojano et al,. 2012). En P. edulis se aisló e
identificó cianidina-3-O-β-D-glucopiranosido como antocianina mayoritaria, a la que se
atribuyen funciones como antioxidante, actividad contra alergias, inflamación, diferentes
virus, hipertensión, artritis, diabetes y cáncer (Jiménez, 2010).
Junto con todos estos usos terapéuticos de los extractos de Passiflora vienen algunos
efectos secundarios negativos y propiedades recientemente reportadas P. alata puede
inducir enfermedades alérgicas ocupacionales en los seres humanos (Giavina-Bianchi
1997).
De las especies estudiadas en el presente trabajo: P. cumbalensis, P. manicata y P.
indecora no hay reportes de estudios de aislamiento y caracterización de metabolitos
secundarios.
14
La mayoría de estudios sobre el género Passiflora se enfoca a buenos resultados sobre
inflamaciones por ende al cáncer, debido a que en los seres humanos en diversas partes del
organismo con inflamación crónico es más frecuente la aparición de tumores, hecho que
indica que el proceso irritativo favorece a la carcinogénesis; la inflamación actúa como un
agente genotóxico e indirectamente favorece la aparición de tumores y rompe el control
celular, permitiendo la división celular con el ADN dañado y al mismo tiempo frena la
apoptosis (Espinosa, 2009).
2.5. Características botánicas y taxonómicas de las especies a estudiar.
2.5.1. Passiflora cumbalensis.
Comúnmente conocida como coruba roja, son plantas trepadoras con zarcillos filamentosos
enrollados, sus hojas son alternas, miden hasta 14 cm de largo, tienen tres lóbulos más o
menos triangulares; los bordes son aserrados, sus flores son solitarias y colgantes se
encuentran distribuidas desde el Sur Colombia al Centro de Perú, y en Ecuador localizada
en Tungurahua y Ambato(Torsten et al., 2004)..
Tabla 1. Taxonomía de P. cumbalensis
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Subclase: Dilleniidae
Superorden: Violanae
Orden: Violales
Familia: Passifloraceae
Subfamilia: Passifloroideae
Tribu: Passifloreae
Género: Passiflora
Subgenero: Passiflora
Sección: Tacsonia
Especie: Cumbalensis Fuente: (Torsten et al., 2004).
15
2.5.2. Passiflora manicata.
Planta trepadora con los tallos más o menos pubescentes, redondeados, estriados sus
estípulas son reniformes, de 0,5-2,5 cm de longitud, glandular-aserradas, sus hojas
trilobadas, de 4-11 x 4,5-14 cm, glabras en el haz y algo pubescentes en el envés, de
margen aserrado. Pecíolo de 1-3 cm de longitud, con 4-9 glándulas, poseeflores solitarias,
sobre pedúnculos robustos de 5-10 cm de largo, con brácteas ovadas, de 2-4 cm de largo,
libres o unidas en la base, son de color rojo, de 6-9 cm de diámetro, con los sépalos rojos en
la cara superior y verdosos en la inferior, sus pétalos rojos, oblongos, de 2,5-4 cm de
longitud con una corona con 3-4 series de filamentos, los de las dos series externas de 0,2-
0,4 cm de largo, de color púrpura oscuro, su fruto de ovoide a ovoide-oblongo, de 3,5-5,5 x
2-3,7 cm, verdoso, con semillas ovoides, reticuladas, negruzcas, de unos 4-5 mm de largo,
se cultiva entre los 1.800 y 3.500msnm, su floración se caracteriza por ser en verano y otoño
y puede soportar hasta temperaturas de 5ºC; su fruto es muy apreciado en la alimentación
por su sabor y aroma, por el contenido de vitaminas A, B y C, calcio, fósforo y hierro, tiene
un amplio mercado, especialmente en Colombia, Perú, Venezuela y al Sur del Ecuador,
(Torsten et al., 2004). Tabla 2. Taxonomía de P. manicata
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Subclase: Dilleniidae
Superorden: Violanae
Orden: Violales
Familia: Passifloraceae
Subfamilia: Passifloroideae
Tribu: Passifloreae
Género: Passiflora
Especie: manicata
Fuente: (Torsten et al., 2004).
16
1.5.3. Passiflora indecora.
Es endémica se puede encontrar en el sureste de Ecuador, especialmente en las provincias
de Loja y El Oro, esta especie prospera en los bosques remanentes pequeños (Torsten et
al., 2004).
Tabla 3. Taxonomía de P. indecora
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Subclase: Dilleniidae
Superorden: Violanae
Orden: Violales
Familia: Passifloraceae
Subfamilia: Passifloroideae
Tribu: Passifloreae
Género: Passiflora
Especie: indecora .
Fuente: (Torsten et al., 2004)
17
CAPITULO III
18
3. Metodología.
En la figura 2. se indica la metodología utilizada en el presente estudio.
Figura2. Resumen de la metodología utilizada en el aislamiento y caracterización de metabolitos
secundarios de P. cumbalensis, P. manicata y P. indecora con actividad inhibitoria de líneas de
cáncer humano.
Fuente: Autor
19
3.1. Materia vegetal.
De la especie P. cumbalensis se recolectó 5.56 Kg en Uritusinga ubicada a 17 kilómetros al
suroeste de la Provincia de Loja, entre las parroquias de El Tambo, Malacatos y San
Sebastián coordenadas: 04o02´21” -04º 08´09” Latitud Sur; 79º12´21” -79º14´47” Longitud
Oeste.; de P. manicata se recolectó 7.023 Kg y de P. indecora se recolectó 1.789 Kg, ambas
especies fueron recolectada en el barrio San Cayetano Alto – UTPL coordenadas 3º49´53”
Latitud Sur; 79o14´58” a 79º04´38” Longitud Oeste. Una vez identificadas las especies se
depositó una muestra de cada una en el herbario de la UTPL.
Figura 3. Mapa del cantón Loja, priorizando la ubicación de San Cayetano Alto y Uritusinga.
El extracto fue preparado a partir de las hojas y tallos (muestra seca) mediante maceración
estática empleando disolventes de polaridad creciente (Hex, AcOEt, MeOH); la materia
vegetal se colocó en maceración por dos días, y se realizó tres repeticiones de cada
extracto, el rendimiento de los extractos se evaluó en relación al peso del extracto obtenido
y al peso de la materia vegetal seca, como se indica en la fórmula 1.
20
(Formula 1)
A los extractos obtenidos se les hicieron pruebas de inhibición de crecimiento mediante MTT
en tres líneas RKO, MCF7 y D384; los extractos que presentaron la mayor actividad fueron
analizados mediante cromatografía en columna.
3.2. Evaluación de la actividad inhibitoria del crecimiento celular de los extractos y compuestos aislados mediante MTT.
Se utilizaron 3 líneas celulares de cáncer humano: RKO (cáncer de colon), MCF-7 (cáncer
de mama) y D384 (SNC), para el estudio de los extractos, y 2 líneas celulares de cáncer
humano: RKO y D384 para los compuestos; cada línea celular se cultivó en medio RPMI
(GIBCO) a 37°C, humedad del 95%, en una atmósfera con un 5% de CO2. Todas las líneas
celulares fueron expuestas por 48 horas a todos los extractos y compuestos a dosis de
50μg/mL y compuestos a 50 uM respectivamente, determinándose el efecto inhibitorio
empleando el método de MTT, siguiendo el siguiente protocolo: en un caja multidish de 96
pocillos se sembró 3000 células con 100uL de medio de cultivo por pocillo, se incubó por 24
horas; se aplicó tratamiento con cada uno de los derivados disueltos en DMSO (0,5%) y
medio de cultivo , también se aplicó DMSO 0,5% como control negativo y Doxorrubicina 2μM
como control positivo; en todos los casos se llegó a un volumen final de 200μL en cada
posillo; cada dosis se aplicó por triplicado en tres experimentos diferentes, se incubó por 48
horas y se añadió 20μL de reactivo de MTT Gibco (Kit cell titer 96º, Aqueous one solution
reagent), se incubó por 2 horas y se realizó la lectura en el espectrofotómetro (Sunrise) a
una absorbancia de 490nM; los datos obtenidos fueron analizados por medio del programa
Prisma. Los extractos más activos en la inhibición de crecimiento en las líneas celulares se
los fracciono en cromatografía en columna, y la evaluación de la actividad inhibitoria celular
de metabolitos secundarios se realizó en los que se obtuvo en mayor cantidad y sin
problemas de solubilidad.
3.3. Cromatografía en columna.
De acuerdo a los datos obtenidos de la actividad inhibitoria celular de los extractos, a los
más activos se los fraccionó por cromatografía en columna; para las corridas de
cromatografía en columna abierta se utilizó silica gel g 60 F254, se fraccionó el extracto
hexánico de P. cumbalensis, el extracto de acetato de etilo de P. cumbalensis, el extracto
metanólico de P. cumbalensis y el extracto hexánico de P. manicata; la relación extracto -
silica se indica en la tabla 4:
21
Tabla 4. Proporción y peso de cada uno de los extractos de las especies P. cumbalensis y P.
manicata y silica gel utilizados en cromatografía en columna abierta.
Especie vegetal Disolvente utilizado
en el extracto
Proporción extracto :
sílica gel
Peso del extracto
(g)
P. cumbalensis
tallos y hojas Hexano 1:15 18.3
P. cumbalensis
Tallos y hojas Acetato de etilo 1:17 19
P. cumbalensis
tallos y hojas Metanol 1:18 34.5
P. manicata
tallos y hojas Hexano 1:13 13
Fuente: Autor
La elución de las columnas se hizo utilizando mezclas de hexano, acetato de etilo y
metanol, recolectando fracciones (eluatos) de 100 mL, se evaporó el disolvente por medio
de un rotaevaporador, y se realizó cromatografía en capa fina a cada una de las fracciones.
Fotografía 1. Fotografía de Cromatografía en columna: a) cromatografía en columna del extracto
hexánico de P. cumbalensis; b) cromatografía en columna del extracto de acetato de etilo de P.
cumbalensis, c) cromatografía en columna del extracto de metanol de P. cumbalensis; d)
cromatografía en columna del extracto hexánico de P. manicata.
a) b)
c) d)
Fuente. Autor
22
3.4. Cromatografía de capa fina.
Los análisis cromatográficos en capa fina (CCF) se realizaron siguiendo técnicas
convencionales empleando placas de aluminio recubiertas con gel de sílice F254, se observó
con luz ultravioleta de onda corta (254nm) y larga (350nm) y se reveló con una solución de
sulfato cérico.
3.5. Re-cristalización.
En base a la similitud del perfil cromatográfico se unió diversas fracciones, se limpiaron
utilizando disolventes adecuados y se purificaron por el método de par de disolventes
(Sakura, 2011) hasta obtener fracciones puras.
3.6. Caracterización de los metabolitos secundarios.
Los puntos de fusión de cada compuesto en estudio se determinaron en un equipo Fisher
Johns y no fueron corregidos. Los espectros de RMN de 1H y 13C se adquirieron a 400 MHz
y 100 MHz respectivamente en un equipo Varian 400 ASC, los desplazamientos químicos
se expresaron en ppm (δ), y las constantes de acoplamiento (J) se informaron en Hz, se
empleó el tetrametilsilicio (TMS) como referencia interna. Los espectros de masas se
obtuvieron en un cromatógrafo de gases (Agilent Technologies 6890N) acoplado a
espectrómetro de masas (Agilent Technologies 5973 inert) con una columna cromatografía
BSNS.
23
CAPITULO IV
24
4. Resultados y discusión.
4.1. Rendimiento del material utilizado. El rendimiento se obtuvo en base a la fórmula 1: en relación al peso del extracto obtenido y
el peso de la materia vegetal seca; en la tabla 5 se indica el peso de los extractos obtenidos
de cada especie en los diferentes disolventes y el rendimiento de cada uno de ellos. Tabla 5.Extractos obtenidos. Rendimiento de especies P. cumbalensis, P. manicata y P. indecora, y
peso de cada uno de los extractos en los diversos solventes utilizados.
Especie vegetal Parte de la
especie
Extracto
Disolvente
utilizado: Hex
peso del
extracto (g) y
rendimiento (%)
Disolvente
utilizado: AcOEt
peso del extracto
(g) y rendimiento
(%)
Disolvente
utilizado: MeOH
peso del
extracto (g) y
rendimiento (%)
P. cumbalensis
Tallos 6.39 g
0.87%
5.16 g
0.70%
5.30 g
0.72%
Hojas 12.19 g
1.78%
13.81 g
2.01%
17.80 g
2.60%
P. manicata
Tallos 10.23 g
1.03%
7.03 g
0.71%
9.36 g
0.95%
Hojas 14.00 g
2.62%
12.13 g
2.27%
10.36 g
1.94%
P. indecora Tallos y
Hojas
6.29 g
1.6%
2.10 g
0.56%
7.24 g
1.90%
Fuente: Autor
4.2. Inhibición de crecimiento de tres líneas celulares de cáncer humano de los extractos.
La inhibición de crecimiento celular de los extractos se estudió es tres líneas celulares: RKO,
MCF7 y D384mediante MTT, los extractos más activos fueron: extracto hexánico de hojas y
tallos de P. cumbalensis y extracto hexánico de hojas de P. manicata (50 – 60%), como se
observa en las gráficas 1-3.
25
Gráfica 1. Porcentaje de inhibición del crecimiento celular en la línea de cáncer de colon RKO, en
extractos de P. cumbalensis, P. manicata y P. indecora. Los datos representan la media más el error
estándar de 3 experimentos con 3 repeticiones
Fuente: Autor
Gráfica 2. Porcentaje de inhibición del crecimiento celular en la línea de cáncer de mama MCF7, en
extractos de P. cumbalensis, P. manicata y P. indecora. Los datos representan la media más el error
estándar de 3 experimentos con 3 repeticiones.
Fuente: Autor
26
Gráfica 3. Porcentaje de inhibición del crecimiento celular en la línea astrocitoma cerebral D384, en
extractos de P. cumbalensis, P. manicata y P. indecora. Los datos representan la media más el error
estándar de 3 experimentos con 3 repeticiones.
Fuente: Autor
Las tres especies de Passiflora presentaron baja actividad inhibitoria de crecimiento celular
frente a las líneas celulares RKO, MCF7 y D384, excepto el extracto hexánico de P.
manicata y el extracto hexánico de P. cumbalensis, cuya actividad fue moderada (60-70%);
algunas especies pertenecientes del genero Passifloraceae como P. incarnata L. no
presentaron actividad citotóxica (Visozo et al., 2010), a diferencia de otras especies
vegetales caracterizadas por alto valores de citotoxicidad (Valdiviezo, 2010), como es el
caso de P. manicata, cuyo extracto presento altos valores de citotoxicidad (60-70%) contra
una línea de cáncer de próstata PC3 (Suffredini et al,. 2006).
La bioactividad observada se explicaría posiblemente por la presencia de terpenoides,
saponinas y fitoesteroles; en base a que su presencia ha sido confirmada en especies del
mismo género como P. edulis, a estos tres grupos de metabolitos secundarios se les otorga
funciones muy variadas como: anti-cáncer, inhibidores de acetil-colenesterasa,
antiinflamatoria, antimicrobiana, hipolipemiantes, etc. (Olmedo, 2009).Los terpenoides
constituyen el más amplio conjunto conocido como metabolitos secundarios de los
vegetales, los que se han evaluado en diversos compuestos procedentes de plantas
27
demostrando su potencial anticancerígeno (Setzer et al., 2003) como el caso del ácido
kaurenoico un diterpeno aislado de la oleoresina de Copaiferalangsdorffii, que demostró
inhibir in vitro el crecimiento de células leucémicas, cáncer de mama y cáncer de colon
(Costa et al,. 2002); las saponinas constituyen un amplio grupo de heterósidos muy
frecuentes en los vegetales con propiedad antimicótica, antibacteriana, antiinflamatoria,
antioxidante, anticancerígena (Liang et al,. 1995) y los fitoesteroles en la actualidad se los
conoce por sus diversas funciones como disminución de colesterol, enfermedades
coronarias y como antiinflamatorio, actualmente hay estudios que los reconocen capaces de
retardar el crecimiento tumoral y cáncer hereditario en un modelo en ratas y conejos. (FABA,
2012).
4.3. Fraccionamiento mediante cromatografía en columna.
En la tabla 6, se indica el número total de fracciones obtenidas en las cuatro columnas
fueron corridas en el presente trabajo.
Tabla 6. Número de fracciones obtenidas en el fraccionamiento por cromatografía en columna de los
extractos de P. cumbalensis y P. manicata.
Especie vegetal
Disolvente utilizado
para la obtención del
extracto
Número de fracciones
obtenidas
P. cumbalensishojas y tallos Hexano 555
P. cumbalensishojas y tallos Acetato de Etilo 697
P. cumbalensishojas y tallos Metanol 672
P. manicata hojas y tallos Hexano 343
Fuente: Autor
4.4. Identificación de metabolitos secundarios.
Del extracto hexánico de P. cumbalensis se aisló e identifico seis compuestos:
4.4.1. Compuesto 1.
28
De la fracción 98 corrida en cromatografía de columna con una polaridad de 95% Hex-
5%AcOEt, se obtuvo 8mg de un compuesto de color blanquecino, con un punto de fusión
de 78-80ºC, soluble en diclorometano.
Cuyos datos espectroscópicos son: 1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 0.76 - 1.03
(m, 3 H) 1.14 - 1.34 (m, 19 H) 3.65 (t, J=6.65 Hz, 2 H). 13C NMR (100 MHz, CHLOROFORM-
d) ppm 14.4 (s, 1 C) 23.0 (s, 1 C) 26.0 (s, 1 C) 29.6 (s, 1 C) 29.7 (s, 1 C) 29.9 (s, 1 C) 29.9
(s, 1 C) 29.9 (s, 1 C) 30.0 (s, 1 C) 32.2 (s, 1 C) 33.1 (s, 1 C) 63.4 (s, 1 C).EM-IE: m/z % 184
M+ (8), 155 (38), 80 (24), 72 (100), 57 (70).Ver espectro Nº 1,2 y 3. La caracterización se
efectuó por medio de la comparación de los datos espectroscópicos previamente informados
en la base de datos Spectral Data base for Organic Compounds (SDBS).
Que se identifico como dodecanal, de formula molecular C12H24O; peso molecular: 184.3 g
mol−1, se ha identificado como componente principal del aceite esencial de Oriandrum
sativum(cilantro) (Orendain, 2012);este compuesto no se ha identificado para ninguna de las
especies estudiadas en este trabajo. Figura 4. Estructura molecular de dodecanal
4.4.2. Compuesto 2. De la fracción 309 corrida en cromatografía de columna con una polaridad de 60% AcOEt.-
40% MeOH, se obtuvo 12 mg de un compuesto de color blanquecino, con un punto de
fusión de 79-81ºC, soluble en diclorometano.
Cuyos datos espectroscópicos son: 1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 0.85 - 0.92
(m, 3 H) 1.13 - 1.43 (m, 32 H) 1.65 (dt, J=14.11, 6.73 Hz, 14 H) 2.43 (td, J=7.41, 1.93 Hz, 2
H) 9.77 (t, J=1.93 Hz, 1 H). 13C NMR (101 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 14.27 (s, 1 C) 22.24
(s, 1 C) 22.85 (s, 1 C) 29.32 (s, 1 C) 29.51 (s, 1 C) 29.58 (s, 1 C) 29.73 (s, 1 C) 29.81 (s, 1
C) 29.85 (s, 15 C) 32.08 (s, 1 C) 44.08 (s, 1 C) 203.14 (s, 1 C).EM-IE: m/z % 380 M+ (8), 362
(30), 96 (75), 82 (100). Ver espectros Nº 4, 5 y 6. La caracterización se efectuó por medio de
la comparación de los datos espectroscópicos previamente informados en la literatura
(Fatland, et al 2005).
Que se identificó como hexacosanal; formula: C26H52O; peso molecular: 380.6 g mol−1,
pertenece al grupo de los aldehído, ha sido aislado de especie crucífera nativa de Europa
29
Arabido psisthaliana (Fatland, et al 2005), este compuesto no se ha identificado para
ninguna de la especies estudiadas en este trabajo. Figura 5. Estructura molecular de hexacosanal
4.4.3. Compuesto 3. De la fracción 133 corrida en cromatografía de columna con una polaridad de 90% Hex-
10%AcOEt, se obtuvo 9 mg de un compuesto de color blanquecino, con un punto de fusión
de 130-132ºC, soluble en diclorometano.
Cuyos datos espectroscópicos son: 1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 0.71 (s, 3
H) 0.82-0.84 (m, 10 H) 0.92 (d, J=6.4 Hz, 3H) 1.18 (s, 7 H) 1.30 (m, 10H) 2.38 (m, 12H)
5.72 ( s, 4 H) . 13C NMR (101 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 11.8 (s, 1 C) 11.9 (s, 1 C) 18.9
(s, 1 C) 19.1 (s, 1 C) 20.6 (s, 1 C) 20.7 (s, 1 C) 21.0 (s, 1 C) 23.9 (s, 1 C) 24.7 (s, 1 C) 28.1
(s, 1 C) 31.2 (s, 1 C) 31.5 (s, 1 C) 31.6 (s, 1 C) 31.7 (s, 1 C) 36.2 (s, 1 C) 37.1 (s, 1 C) 39.3
(s, 1 C) 40.3 (s, 1 C) 42.0 (s, 1 C) 42.3 (s, 1 C) 50.1 (s, 1 C) 50.6 (s, 1 C) 55.8 (s, 1 C) 56.3
(s, 1 C) 70.2 (s, 1 C) 120.1 (s, 1 C) 129.2 (s, 1 C) 137.6 (s, 1 C) 141.6 (m, 1 C).EM-IE: m/z %
412 M+ (10), 394 (100), 255 (60), Ver espectros Nº 7, 8 y 9.La caracterización se efectuó por
medio de la comparación de los datos espectroscópicos previamente informados en la
literatura (Rojas, et al 2000) y (Pérez, et al 2009).
Se identificó como 5, 22 dien – 3 stigmasterol, formula: C29H48O; peso molecular: 412.69 g
mol−1, este compuesto ha sido aislado en diversas especies, como en el extracto de
diclorometano de Piper pseudochurumayu, se obtuvo en las fracciones eluídas con hexano-
acetato de etilo en proporción 90-10, el precipitado tuvo la apariencia de escarcha
blanquecina, que concuerda con nuestros resultados; además ha sido aislado y
caracterizado de Baccharis decusata (Rojas et al 2000),también se ha identificado en el
extracto de diclorometano de las hojas de Synedrellanodiflora (L.) (Perez et al 2009), este
compuesto no se ha identificado para ninguna de la especies estudiadas en este trabajo.
30
Figura 6. Estructura molecular de 5,22 dien – 3 estigmasterol
4.4.4. Compuesto 4.
De la fracción 121 corrida en cromatografía de columna con una polaridad de 90% Hex-
10%AcOEt, se obtuvo 11 mg de un compuesto de color blanquecino, con un punto de fusión
de 79-81ºC, soluble en diclorometano.
Cuyos datos espectroscópicos son:1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 0.64 - 0.74
(m, 4 H) 0.79 - 0.89 (m, 11 H) 0.91 - 0.98 (m, 5 H) 0.99 - 1.21 (m, 15 H) 1.23 (br. s., 1 H)
1.24 - 1.32 (m, 5 H) 1.37 (br. s., 1 H) 1.39 - 1.63 (m, 13 H) 1.65 - 1.70 (m, 1 H) 1.76 - 1.91
(m, 4 H) 1.92 - 2.13 (m, 5 H) 2.18 - 2.37 (m, 4 H) 3.46 - 3.67 (m, 3 H) 5.05 (s, 1 H) 5.14 (d,
J=8.34 Hz, 2 H) 5.30 - 5.42 (m, 2 H). 13C NMR (101 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 11.86 (s,
1 C) 11.98 (s, 1 C) 12.05 (s, 1 C) 12.25 (s, 1 C) 18.77 (s, 1 C) 18.98 (s, 1 C) 19.03 (s, 1 C)
19.39 (s, 1 C) 19.82 (s, 1 C) 21.08 (s, 1 C) 21.21 (s, 1 C) 23.06 (s, 1 C) 24.30 (s, 1 C) 24.36
(s, 1 C) 26.07 (s, 1 C) 28.24 (s, 1 C) 28.92 (s, 1 C) 29.14 (s, 1 C) 29.70 (s, 1 C) 31.67 (s, 1
C) 31.90 (s, 1 C) 33.94 (s, 1 C) 36.14 (s, 1 C) 36.50 (s, 1 C) 37.25 (s, 1 C) 39.68 (s, 1 C)
39.77 (s, 1 C) 40.49 (s, 1 C) 42.21 (s, 1 C) 42.30 (s, 1 C) 42.32 (s, 1 C) 45.83 (s, 1 C) 50.12
(s, 1 C) 50.15 (s, 1 C) 51.23 (s, 1 C) 55.95 (s, 1 C) 56.05 (s, 1 C) 56.76 (s, 1 C) 56.86 (s, 1
C) 62.74 - 64.09 (m, 1 C) 71.80 (s, 1 C) 121.71 (s, 1 C) 129.26 (s, 1 C) 138.31 (s, 1 C)
140.75(s, 1 C) 150.66 - 193.59 (m, 1 C). EM-IE: m/z % 414 M+ (6), 273 (10), 255 (10), 231
(8), 42 (100), Ver espectros Nº 10, 11 y 12. La caracterización se efectuó por medio de la
comparación de los datos espectroscópicos previamente informados en la literatura
(Gabirello, 2010).
Identificando como gamma-sitosterol, formula: C29H50O; peso molecular: 414.7 g mol−1, es
un fitoesterol que se ha aislado de Clematis montevidensis, a la vez se le otorga funciones
diuréticas (Petenatti, et al 2005). Se ha caracterizado en el extracto hexánico de las hojas
31
de Pentacalia vaccinioides (Gabirello, 2010). También fue caracterizado en el extracto de
diclorometano de Rhoeodiscolor, conocida como “maguey morado o barquilla”, en donde se
le atribuyen funciones de antiinflamatorio y bactericida (Domínguez, et al 2002), este
compuesto no se ha identificado para ninguna de las especies estudiadas en este trabajo. Figura 7.Estructura molecular de gamma sitosterol
4.4.5. Compuesto 5. De la fracción 132 corrida en cromatografía de columna con una polaridad de 90% Hex-
10%AcOEt, se obtuvo 13 mg de un compuesto de color blanquecino, con un punto de fusión
de 79-81ºC, soluble en diclorometano.
Cuyos datos espectroscópicos son 1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 0.69-0.73
(m, 3H) 0.76-0.89 (m, 9 H) 0.91-1.05 (m, 5 H) 1.07-1.13 (m, 3H) 1.35-1.42 (m, 4 H) 1.65 –
1.70 (m, 9H) 1.8- 2.0 (m, 10H) 2.38 (m, 1H) 3.2 (m, 1H)3.63 (m, 1H) 4.68 (m, 1H) 5.19 (m,
J=8.34 Hz 1H) 5.26 (m 2H). 13C NMR (101 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 11.8 (s, 1 C) 17.7
(s, 1 C) 19.3 (s, 1 C) 21.6 (s, 1 C) 24.3 (s, 1 C) 26.1 (s, 1 C) 27.4 (s, 1 C) 28.1 (s, 1 C) 28.4
(s, 1 C) 29.8 (s, 1 C) 32.6 (s, 1 C) 34.3 (s, 1 C) 36.3 (s, 1 C) 37.1 (s, 1 C) 37.2 (s, 1 C) 38.6
(s, 1 C) 38.9 (s, 1 C) 39.2 (s, 1 C) 40.1 (s, 1 C) 40.8 (s, 1 C) 50.5 (s, 1 C) 55.1 (s, 1 C) 55.3
(s, 1 C) 79.0 (s, 1 C) 118.9 (s, 1 C) 121.7 (s, 1 C) 139.8 (s, 1 C) 145.2 (s, 1 C) 150.9 –
151.68 (m, 1 C).EM-IE: m/z % 414 M+ (25), 396 (100), 255 (60) Ver espectros Nº 13, 14 y
15.La caracterización se efectuó por medio de la comparación de los datos
espectroscópicos previamente informados en la literatura (Gabirello, 2010).
Identificado como: beta-sitosterol, formula: C29H50O; peso molecular: 414.7 g mol−1;
pertenece al grupo de los fitoesteroles, ha sido caracterizado en Daucus carota L.
(zanahoria), en donde se le atribuyen funciones como acción vasodilatadora, antitumorígena
y antimutagénica (Gutierrez, 2008). También se lo caracterizado en Buddleja globosa,
32
(matico)en donde se le otorga características antiinflamatorias y cicatrizantes (Goity, 2007);
este compuesto no se ha identificado para ninguna de la especies estudiadas en este
trabajo. Figura 8. Estructura molecular de beta sitosterol
4.4.6. Compuesto 6.
De la fracción 124-127 corrida en cromatografía de columna con una polaridad de 90%
Hex-10%AcOEt, se obtuvo 15 mg de un compuestode color blanquecino,con un punto de
fusión de 79-81ºC, soluble en diclorometano.
Cuyos datos espectroscópicos son: 1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 0.63 (s, 3H)
0.83 (d, J=6.7 Hz 3H) 0.84 (d, 9H) 0.92 (d, J=6.8 Hz 4H) 0.95 (s, 10 H) 1.04 (d, J=6.6 Hz
6H) 3.63 (m, 1H) 5.18 (dd 3H) 5.22 (dd, J=8.0 Hz 1H) 5.39 (m, 1H) 5.58 (m, 3H) . 13C NMR
(101 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 12.0 (s, 1 C) 16.3 (s, 1 C) 17.6 (s, 1 C) 19.6 (s, 1 C) 21.1
(s, 2 C) 23.0 (s, 1 C) 28.3 (s, 1 C) 31.9 (s, 1 C) 33.1 (s, 1 C) 37.0 (s, 1 C) 38.4 (s, 1 C) 39.1
(s, 1 C) 40.4 (s, 1 C) 40.7 (s, 1 C) 42.8 (s, 2 C) 46.2 (s, 1 C) 54.5 (s, 1 C) 55.7 (s, 1 C) 70.4
(s, 1 C) 116.3 (s, 1 C) 119.6 (s, 1 C) 132.0 (s, 1 C) 135.6 (s, 1 C) 139.8 (s, 1 C) 141.3-141.9
(m, 1 C).EM-IE: m/z % 396M+ (64), 381 (3), 363 (100), 337 (35), 271 (5); 253 (20), 227 (4),
211 (15), 158 (5), 143 (17), Ver espectros Nº 16, 17 y 18.La caracterización se efectuó por
medio de la comparación de los datos espectroscópicos previamente informados en la
literatura (Chaparro, et al 2010).
Identificado como: ergosta-5,7,22-trien-3-ol, formula: C28H44O; peso molecular: 396.3 g
mol−1; corresponde al grupo de los fitoesteroles, por lo general se lo aislado de hongos y se
le atribuye funciones como precursor de la vitamina D2, se lo ha caracterizado del extracto
de metanol de Gonoderma lucilum y de Claviceps purpurea, en donde algunos estudios en
conejos han demostrado poseer propiedades antiinflamatorias y antipiréticas (Torpono, et al
33
2012), este compuesto no se ha identificado para ninguna de la especies estudiadas en este
trabajo. Figura 9. Estructura molecular de ergosterol
4.5. Actividad inhibitoria de crecimiento celular de los fitoesteroles identificados, en dos líneas de cáncer humano RKO y D384.
El estudió se lo efectuó en dos líneas celulares RKO y D384, de los fitoesteroles porque
había cantidades optimas y por los reportes anti-cancerígenos encontrados en la literatura;
se obtuvo entre 15-20% de inhibición celular en la línea RKO de todos los fitoesteroles; y de
50-60% en la línea D384 de todos los fitoesteroles, excepto beta-sitosterol que obtuvo 15%,
como se puede observar en las gráficas 4 y 5.
.
Fuente: Autor
Gráfica 4. Porcentaje de inhibición del crecimiento celular en la línea celular RKO de los fitoesteroles identificados: 5, 22 dien 3 estigmasterol, gamma sitosterol, beta sitosterol y ergosterol. Los datos representan la media más el error estándar de 3 experimentos con 3 repeticiones.
34
Fuente: Autor
Se han encontrado algunas evidencias de que los fitoesteroles, particularmente el sitosterol,
podrían inducir apoptosis en células de cáncer de próstata, de mama y de colon mediante
un incremento en la actividad de la caspasa-3, enzima proteasa que participa en la cascada
de la apoptosis (Choi, et al 2003) los fitoesteroles también pueden interferir en el crecimiento
y la multiplicación celular aunque se desconoce la forma en que se lleva a cabo, en las
etapas de angiogénesis y metástasis, estos compuestos parecen reducir la capacidad de las
células, además el sitoesterol participa en la activación de enzimas antioxidantes como la
superóxido dismutasa y la glutatión peroxidasa, con esto se reducen los agentes oxidantes y
potenciales carcinogénicos (Woyengo, et al 2009), se conoce que los fitoesteroles inhiben el
crecimiento tumoral y la oxidación de las lipoproteína al incorporarlos en la dieta, afirmando
esta teoría con el estudio realizado en ratones en donde se confirma que los fitoesteroles en
la dieta retardan el crecimiento y el esparcimiento de células de cáncer de mama, fue
probado en la línea MDA-MB-231, xeno injertado en ratones SCID en donde los animales
fueron alimentados con el suplemento AIN-93G que contiene mezcla de fitoesteroles, por 15
días antes de la inoculación del tumor, al final se observó que el tamaño del tumor
Gráfica 5. Porcentaje de inhibición del crecimiento celular en la línea celular D384 de los fitoesteroles identificados: 5, 22 dien 3 estigmasterol, gamma sitosterol, beta sitosterol y ergosterol. Los datos representan la media más el error estándar de 3 experimentos con 3 repeticiones.
35
desarrollado en los ratones alimentados con fitoesteroles era 33% más pequeño y tenían
20% menos metástasis en nódulos linfáticos y pulmones (Honey, 2012).
En los estudios in vitro, gamma sitosterol y ergosterol inhibieron el crecimiento de las células
PC-3 un 70% y 14% respectivamente, los fitoesteroles también inhibieron la invasión de
membranas de Matrigel, disminuyeron la migración de células tumorales, redujeron los
enlaces de células PC3 con lalaminina y la fibronectina, se concluyó que los fitoesteroles
inhiben el crecimiento de las células tumorales PC3 directamente en cultivo in vitro e
indirectamente como suplemento en la dieta, y que el gamma-sitosterol es más efectivo
(Honey, 2012).
β-sitosterol, es considerado como el principal fitoesterol diétetico que ha sido probado en el
crecimiento delas células HT-29, una línea celular de cáncer de colon humano, cuyo estudio
indico que de 8 y 16 mM fueron eficaces en el crecimiento celular en un 50%, esto se dio por
la incorporación de este fitoesterol al grupo de fosfolípidos en la membrana, por lo que se
produjo una disminución del 50% de las membranas esfingomieliticas de las células
cultivadas, por lo que se considera posible quela inhibición del crecimiento observada por β-
sitosterol puede ser mediada a través de la influencia de la vía de transducción de señal que
implican fosfolípidos de la membrana (Awad, et al 1996).5, 22 dien stigmasterol 3 ol, es un
fitoesterol que se lo ha estudiado en ratones como un posible antitumoral contra el
carcinoma EhrilchAscites (Ghosh et al., 2011). No existen estudios de la identificación o
caracterización de fitoesteroles en las especies estudiadas en el presente trabajo.
4.6. Del extracto de acetato de etilo de P. cumbalensis se aisló e identificó un compuesto.
4.6.1. Compuesto 7.
De la fracción 309-311 corrida en cromatografía de columna con una polaridad de 20% Hex-
80% AcOEt, se obtuvo 8 mg de un compuesto de color blanquecino, con un punto de fusión
de 135-1386ºC, soluble en cloroformo.
Cuyos datos espectroscópicos son: IR (ATR) νmax cm-1: 2916.5, 2848.9 (COH) 1725.4,
1472.8 1377.4.1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 0.78 - 0.85 (m, 3H) 1.18 (m, 30
H) 1.34 (m, 2 H) 2.35 (m, J=7.41, 1.93 Hz, 2 H) 9.70 (t, J=1.93 Hz, 1 H). 13C NMR (101 MHz,
CHLOROFORM-d) ppm 14.11 (s, 1 C) 22.09 (s, 1 C) 22.69 (s, 1 C) 29.16 (s, 1 C) 29.36 (s,
1 C) 29.43 (s, 1 C) 29.58 (s, 1 C) 29.66 (s, 1 C) 29.69 (s, 8 C) 31.92 (s, 1 C) 43.92 (s, 1 C)
202.98 (s, 1 C). EM-IE: m/z % 382 M+ (5), 82 (100). Ver espectros Nº 19, 20, 21 y 22.
Que se identificó como nonadecanal; formula: C19H38O; peso molecular: 382.21 g mol−1,
36
Como se puede ver en el espectro N° 19, existen dos bandas de intensidad parecida 2916.5
y 2848.9 entre 2900 y 2700 que indica la vibración de la tensión de C-H, lo que
generalmente sirve para identificar a los aldehídos. La caracterización se efectuó por medio
de la comparación de los datos espectroscópicos previamente informados en la literatura
(Tabrizi, et al 2010). Ha sido identificado como principal componente del aceite esencial de
T. transcaspicusen habitad natural (Tabrizi, et al 2010). Figura 10. Estructura molecular de nonadecanal
4.7. Del extracto de metanol de P. cumbalensis se obtuvo dos compuestos.
4.7.1. Compuesto 8.
De la fracción 217 corrida en cromatografía en columna con una polaridad de 10% Hex-
90%AcOEt, se obtuvo 6 mg de un compuesto de color blanquecino, con un punto de fusión
de 119-123ºC, soluble en DMSO.
El Espectro de CG/EM mostró tiempo de retención de 30.68, ver espectro Nº 23 y se
determinó su peso molecular de 530g mol−1, ver espectro Nº 24, pero por problemas
desolubilidad no seidentificó y al obtener cantidades pequeñas imposibilitó las repeticiones
de RMN.
4.7.2. Compuesto 9.
De la fracción 401 corrida en cromatografía en columna con una polaridad de 60% MeOH-
40%AcOEt, se obtuvo 5 mg de un compuesto de color blanquecino, con un punto de fusión
de 136-139ºC, soluble en DMSO.
El Espectro de CG/EM mostró un tiempo de retención de 7.99, ver espectro Nº 25 y se
determinó su peso molecular de 561g mol−1, ver espectro Nº 26, pero por problemas de
solubilidad no se identificó.
4.8 Del extracto hexánico de P. manicata se obtuvo dos mezclas de compuestos.
37
4.8.1. Mezcla 1 (M1).
De la fracción 37 corrida en cromatografía en columna con una polaridad de 90% Hex -
10%AcOEt, se obtuvieron7 mg de color blanquecino.
El Espectro de CG/EM mostró: ver espectro Nº 27
4.8.1.1. Compuesto 1-M1.
Tiempo de retención de 10.45, peso molecular de 281 g mol−1. Ver espectro Nº 28 a.
4.8.1.2. Compuesto 2-M1.
Tiempo de retención de 11.02, peso molecular de 355 g mol−1. Ver espectro Nº 28 b.
4.8.1.3. Compuesto 3-M1.
Tiempo de retención de 12.14, peso molecular de 278 g mol−1. Ver espectro 28 c.
4.8.1.4. Compuesto 4-M1.
Tiempo de retención de 17.43, peso molecular de 336 g mol−1. Ver espectro Nº 28 d.
4.8.1.5. Compuesto 5-M1.
Tiempo de retención de 22.08, peso molecular de 364 g mol−1. Ver espectro Nº 28 e.
4.8.2. Mezcla 2:
Fue obtenido de la fracción 138 corrida en cromatografía en columna con una polaridad de
30% Hex - 70%AcOEt, se obtuvieron8 mg de color blanquecino.
El Espectro de CG/EM mostró cuatro compuestos: ver espectro Nº 29.
4.8.2.1. Compuesto 1-M2.
Tiempo de retención de 12.13, con un peso molecular de 278g mol−1. Ver espectro Nº 30 a.
4.8.2.2. Compuesto 2-M2.
Tiempo de retención de 17.39 con un peso molecular de 308g mol−1. Ver espectro Nº 30 b.
4.8.2.3. Compuesto 3-M2.
Tiempo de retención de 22.01 con un peso molecular de 364g mol−1. Ver espectro Nº 30 c.
4.8.2.4. Compuesto 4-M2.
38
Tiempo de retención de 28.8, con un peso molecular de 392g mol−1. Ver espectro Nº. 30 d.
Al obtener cantidades pequeñas, no se pudo separar, aislar o caracterizar los compuestos
puros.
39
CONCLUSIONES
Los extractos con mayor actividad inhibitoria de crecimiento celular fueron el extracto
hexánico de hojas P. manicata, y el extracto hexánico tallos y hojas de P. cumbalensis frente
a las tres líneas celulares de cáncer estudiadas RKO, MCF7 y D384 con un porcentaje entre
el 50% y 60%, mientras que los demás extractos presentaron actividad inhibitoria entre
10y30%.
Del extracto hexánico de P. cumbalensis se identificaron seis metabolitos secundarios, de
los cuales cuatro son fitoesteroles (5,22-dien-3 estigmasterol; gamma-sitosterol; beta
sitosterol y ergosterol) y dos aldehídos (dodecanal y hexacosanal); todos aislados e
identificados por primera vez en esta especie; de los cuales los fitoesteroles poseen
importante actividad inhibitoria 50-60% en la línea celular de cáncer D384 y bajo entre el 15-
20% en la línea celular RKO.
Del extracto de acetato de etilo de hojas y tallos de P. cumbalensis se aisló e identificó un
aldehído (nonadecanal), del extracto de metanol de hojas y tallos de P. cumbalensis se
obtuvo dos compuestos pero no se los identifico por problemas de solubilidad y del extracto
hexánico de hojas y tallos P. manicata se obtuvo dos mezclas de compuestos en pequeñas
cantidades lo que imposibilito su caracterización.
40
RECOMENDACIONES
• Continuar con el estudio del género Passiflora, realizando el aislamiento e
identificación de metabolitos, con el fin de detectar cual son los componentes que le
dan las propiedades curativas de la especie.
• Sería recomendable hacer ensayos de inhibición de crecimiento en líneas celulares
normales para evaluar su efecto toxico en estas.
• Probar otras actividades de los extractos y compuestos identificados como:
antibacteriana, anti fúngica, antioxidante.
• Finalmente continuar realizando estudios en especies vegetales con antecedentes
etnobotánicas y endémicas de nuestra región, con el fin de respaldar científicamente
su aplicación tradicional.
41
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46
ANEXOS
Espectro Nº 1. Espectro de RMN 1H de dodecanal (C12H24O)
47
Espectro Nº 2. Espectro de RMN 13C de dodecanal (C12H24O)
48
Espectro Nº 3. Espectro de Masas dodecanal (C12H24O)
PM: 184 g/mol
49
Espectro Nº 4.Espectro de RMN 1H de hexacosanal (C26H52O)
50
A
Espectro Nº 5. Espectro de RMN 13C de hexacosanal (C26H52O)
51
Espectro Nº 6. Espectro de masas de hexacosanal (C26H52O)
PM: 380 g/mol
52
Espectro Nº 7.Espectro de RMN 1H de 5, 22 dien – stigmasterol (C29H48O)
53
Espectro Nº 8. Espectro de RMN 13C de 5, 22 dien - stigmasterol (C29H48O)
54
Espectro Nº 9. Espectro de EM de de 5, 22 dien - stigmasterol (C29H48O)
PM: 412 g/mol
55
Espectro Nº 10. Espectro de RMN 1H de gamma sitosterol (C29H50O)
56
Espectro Nº 11. Espectro de RMN 13C de gamma sitosterol (C29H50O)
57
Espectro Nº 12. Espectro de Masas de gamma sitosterol (C29H50O)
PM: 414 g/mol
58
Espectro Nº 13. Espectro de RMN 1H de beta sitosterol (C29H50O)
59
Espectro Nº 14. Espectro de RMN 13C de beta sitosterol (C29H50O)
60
Espectro Nº 15. Espectro de Masas de beta sitosterol (C29H50O)
PM: 414 g/mol
61
Espectro Nº 16.Espectro de RMN 1H de ergosta 5-7-22 trien -3 ol (C29H50O)
62
Espectro Nº 17. Espectro de RMN 13C de ergosta 5-7-22 trien -3 ol (C29H50O)
63
Espectro Nº 18. Espectro de Masas de ergosta 5-7-22 trien -3 ol (C29H50O)
PM: 396 g/mol
EEspectro Nº 19.
64
Espectro de IR
R de nonadecanal
65
Espectro Nº 20. Espectro de RMN 1Hde nonadecanal
66
Espectro Nº 21. Espectro de RMN 13C de nonadecanal
67
Espectro Nº 22. Espectro de Masas de nonadecanal
PM: 382 g/mol
68
Espectro Nº 23. Espectro de CG/EM de la fracción 217 del extracto de metanol de P. cumbalensis
69
Espectro Nº 24.. Espectro de Masas del compuesto 8 de la fracción 217 del extracto metanólico de P. cumbalensis
70
Espectro Nº 25.. Espectro de CG/EM de la fracción 401 del extracto de metanol de P. cumbalensis
71
Espectro Nº 26.. Espectro de Masas del compuesto 9 de la fracción 401 del extracto de metano de P. cumbalensis
72
Espectro Nº 27.. Espectro de CG/EM de la mezcla 1 de cinco compuestos de la fracción 37 del extracto hexanico de P. manicata
73
d. e.
Espectro Nº 28. Espectro de masas de la mezcla 1la fracción 37 del extracto hexanico de P. manicata: a) C1-M1, b) C2-M1, c) C3-M1,d)C4-M1, e) C5-M1.
a)
d) e)
c)b)
74
Espectro Nº 29: Espectro de GC/EM de la mezcla de cuatro compuestos de la fracción 138 del extracto hexánico de P. manicata
75
Espectro Nº 30. Espectro de masas de la mezcla 2 la fracción 138 del extracto hexánico de P. manicata: a) C1-M2, b) C2-M2, c) C3-M2, d) C4-M2.
a)
d)c)
b)