LEVADURAS DE INTERÉS LEVADURAS DE INTERÉS MÉDICOMÉDICO
PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN
Levaduras de Importancia MédicaLevaduras de Importancia Médica
Levaduras del género Candida Levaduras del género Cryptococcus Levaduras del género Malassezia Levaduras del género Trychosporon Levaduras del género Rhodotorula Levaduras del género Saccharomyces
Identificación de levaduras del Identificación de levaduras del género género CandidaCandida
Levaduras del géneroLevaduras del género CandidaCandida
Agentes de candidiasis superficiales y Agentes de candidiasis superficiales y profundas.profundas.
Más de 150 especies descritas: Más de 150 especies descritas: C.albicans, C.tropicalis, C. famata, C.albicans, C.tropicalis, C. famata, C.parasilopsis C.lipolytica, C.glabrata, C.parasilopsis C.lipolytica, C.glabrata, C.krusei,C.lusitaniae, C.dubliniensis,C.krusei,C.lusitaniae, C.dubliniensis, etc. etc.
¿Qué importancia tiene identificar las ¿Qué importancia tiene identificar las especies?especies?
Aumento de la incidencia de las Aumento de la incidencia de las candidiasis sistémicas.candidiasis sistémicas.
Aumento en la frecuencia en la aparición Aumento en la frecuencia en la aparición de especies de de especies de CandidaCandida “no albicans” “no albicans”
Resistencia a antifúngicosResistencia a antifúngicos
Levaduras del géneroLevaduras del género CandidaCandida
Identificación de Levaduras del Identificación de Levaduras del género género CandidaCandida
Estudio macro y micromorfológico de las Estudio macro y micromorfológico de las colonias.colonias.
TermotoleranciaTermotolerancia Sensibilidad a la cicloheximida (Micobiotic)Sensibilidad a la cicloheximida (Micobiotic) Pruebas biológicasPruebas biológicas Pruebas bioquímicasPruebas bioquímicas Métodos enzimáticosMétodos enzimáticos Identificación del genotipoIdentificación del genotipo
Identificación de levaduras del Identificación de levaduras del género género CandidaCandida
Estudio macroscópico de la colonia: Estudio macroscópico de la colonia: Colonias blanquecinas, opacas, cremosas,Colonias blanquecinas, opacas, cremosas, lisas, rugosas, cerebroides.lisas, rugosas, cerebroides.
Identificación de levaduras del Identificación de levaduras del género género CandidaCandida
• Estudio microscópico de la coloniaEstudio microscópico de la colonia (ex. fresco, Gram): (ex. fresco, Gram): Levaduras ovaladas, 3-5 Levaduras ovaladas, 3-5 µµ, con pseudofilamentos,, con pseudofilamentos, producción de pseudomicelio o micelioproducción de pseudomicelio o micelio verdadero, Gram (+)verdadero, Gram (+)
Identificación de levaduras del Identificación de levaduras del género género CandidaCandida
Candida albicans
Siembra en Agar Harina de Maíz(clamidosporos +)
Siembra en Suero Humano Normal(tubos germinales +)
Auxanograma(Prueba de asimilación de Hidratos de Carbono)
ZimogramaPrueba de fermentación de Hidratos de Carbono
Candida no albicans
Siembra en Agar Harina de Maíz(clamidosporos -)
Siembra en Suero Humano Normal(tubos germinales -)
Aislamiento de una levadura no capsulada y sin pigmento
Identificación de levaduras del Identificación de levaduras del género género Candida: Candida: Pruebas biológicasPruebas biológicas
Tubos germinales:Tubos germinales:
• Se utiliza un repique de 24 hs.Se utiliza un repique de 24 hs.• Suspensión en suero humano, conejo, oveja, caballo.Suspensión en suero humano, conejo, oveja, caballo.• Incubación a 35-37 ºC por 2-4 hs.Incubación a 35-37 ºC por 2-4 hs.• Ventajas:Ventajas: bajo costo, fácil realización, resultado rápido. bajo costo, fácil realización, resultado rápido. • Desventajas:Desventajas: Aprox. 5 % de las cepas de Aprox. 5 % de las cepas de C. albicansC. albicans no no
los producen.los producen.• Requieren para su observación, personal experimentadoRequieren para su observación, personal experimentado
TUBOS GERMINALES
Identificación de levaduras del Identificación de levaduras del género género Candida: Candida: Pruebas biológicasPruebas biológicas
Producción de clamidosporos:Producción de clamidosporos:• Se utilizan medios pobres AHM-Tween 80Se utilizan medios pobres AHM-Tween 80• Estructuras de resistenciaEstructuras de resistencia• Se utilizan repiques de 24 hs.Se utilizan repiques de 24 hs.• Se observan a las 72 hs. hasta los 7 días. Se observan a las 72 hs. hasta los 7 días. • Personal experimentadoPersonal experimentado• 5-7% de las cepas de 5-7% de las cepas de C. albicansC. albicans no los no los
producenproducen• Son de bajo costoSon de bajo costo
CLAMIDOSPOROS
Agar morfología en placaAgar morfología en placaAgar lecheAgar leche
Identificación de Levaduras del género Identificación de Levaduras del género CandidaCandida: Pruebas bioquímicas: Pruebas bioquímicas
Asimilación de hidratos de carbonoAsimilación de hidratos de carbono Auxanograma convencionalAuxanograma convencionalZimograma convencionalZimograma convencional
Sistemas comerciales de identificación Sistemas comerciales de identificación
Métodos enzimáticosMétodos enzimáticos FluorogénicosFluorogénicos Cromogénicos Cromogénicos
AuxanogramaAuxanograma Método de estudio bioquímico para Método de estudio bioquímico para
identificación de levaduras del género identificación de levaduras del género Candida.Candida. Asimilación de carbohidratos en aerobiosis. Asimilación de carbohidratos en aerobiosis. Repiques de 24 hs de la cepa a estudiar.Repiques de 24 hs de la cepa a estudiar. Lectura luego de 24 hs a 48 hs previo pasaje Lectura luego de 24 hs a 48 hs previo pasaje
por estufa a 37 C.por estufa a 37 C. Halo de crecimiento alrededor del disco, Halo de crecimiento alrededor del disco,
evidencia asimilación del carbohidrato. evidencia asimilación del carbohidrato.
Auxanograma convencionalAuxanograma convencional
Zimograma convencionalZimograma convencional Método de estudio bioquímico para identificación de Método de estudio bioquímico para identificación de
levaduras del género levaduras del género CandidaCandida. . Asimilación de carbohidratos en anaerobiosis.Asimilación de carbohidratos en anaerobiosis. Medio líquido alcalino con indicador de Ph.Medio líquido alcalino con indicador de Ph. Repiques de 24 hs.Repiques de 24 hs. Lectura a las 24 a 48 hs, previo pasaje por estufa a Lectura a las 24 a 48 hs, previo pasaje por estufa a 37 C.37 C.
Identificación de levaduras del Identificación de levaduras del género género Candida: Candida: APIAPI
METODOS BIOQUIMICOS
Interpretación:
Identificación de levaduras del Identificación de levaduras del género género CandidaCandida
Métodos enzimáticosMétodos enzimáticosSe detectan 2 enzimas: L-prolina Se detectan 2 enzimas: L-prolina aminopeptidasa y aminopeptidasa y ββgalactosaminidasa mediante galactosaminidasa mediante métodos fluorogénicos y cromogénicos.métodos fluorogénicos y cromogénicos.
* Tienen buena sensibilidad y especificidad* Tienen buena sensibilidad y especificidad * Lectura entre 5 minutos – 48 hs. de incubación* Lectura entre 5 minutos – 48 hs. de incubación * Adecuados para la identificación de * Adecuados para la identificación de C.albicansC.albicans
Métodos EnzimáticosMétodos Enzimáticos Ventajas:Ventajas: - - No requieren personal especializado No requieren personal especializado
para su lectura.para su lectura. - - Permiten la identificación rápida de Permiten la identificación rápida de
C.albicans.C.albicans. DesventajasDesventajas - - Requieren de gran presición Requieren de gran presición
(flurogénicos)(flurogénicos)
Medios CromógenosMedios Cromógenos
Medios CromógenosMedios Cromógenos
CHROMagar CandidaCHROMagar Candida Candida ID/ID2Candida ID/ID2 Agar BiggyAgar Biggy CHROMalbicansCHROMalbicans Albicans IDAlbicans ID
CHROMagar CandidaCHROMagar Candida
Medio ampliamente difundido en nuestro Medio ampliamente difundido en nuestro mediomedio
Identificación de levaduras del género Identificación de levaduras del género CandidaCandida
Diagnóstico de especie mediante el Diagnóstico de especie mediante el desarrollo de colonias pigmentadas de desarrollo de colonias pigmentadas de diferentes coloresdiferentes colores
CHROMagar CandidaCHROMagar Candida
Evaluación del medio cromógeno CHROMagar Evaluación del medio cromógeno CHROMagar CandidaCandidaTMTM para la indentificación de levaduras de para la indentificación de levaduras de
interés médicointerés médico
Objetivo (I)Objetivo (I) Determinar la sensibilidad y especificidad diagnóstica del Determinar la sensibilidad y especificidad diagnóstica del
CHROMagar Candida, con respecto a la metodología CHROMagar Candida, con respecto a la metodología convencional para la identificación de levaduras del convencional para la identificación de levaduras del género género CandidaCandida
Objetivo (II)Objetivo (II) Evaluar el comportamiento del método CHROMagar Evaluar el comportamiento del método CHROMagar
Candida cuando se incluyen levaduras de otros géneros Candida cuando se incluyen levaduras de otros géneros como como Cryptococcus, TrichosporonCryptococcus, Trichosporon y y RhodotorulaRhodotorula en en dicho mediodicho medio
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El medio es confiable sobre todo para la identificación de El medio es confiable sobre todo para la identificación de C. albicansC. albicans..
Recomendamos utilizar dicho medio para identificar especies de Recomendamos utilizar dicho medio para identificar especies de CandidaCandida luego de tener certeza de que la cepa pertenece a éste luego de tener certeza de que la cepa pertenece a éste género (como lo especifica el fabricante). Por tanto no es posible género (como lo especifica el fabricante). Por tanto no es posible prescindir del estudio morfológico.prescindir del estudio morfológico.
Es necesario utilizar otra metodología para la identificación precisa de Es necesario utilizar otra metodología para la identificación precisa de las especies de las especies de CandidaCandida “no albicans” identificadas por este medio. “no albicans” identificadas por este medio.
No es conveniente utilizar el medio para el aislamiento primario a No es conveniente utilizar el medio para el aislamiento primario a partir de especímenes biológicos, porque induce a resultados falsos partir de especímenes biológicos, porque induce a resultados falsos positivos, fundamentalmente cuando identifica a las especies como positivos, fundamentalmente cuando identifica a las especies como “no albicans”.“no albicans”.
Es de destacar que el medio facilita el reconocimiento de distintas Es de destacar que el medio facilita el reconocimiento de distintas especies que pueden coexistir en la misma muestra. especies que pueden coexistir en la misma muestra.
Candida ID/Candida ID2Candida ID/Candida ID2
Medio cromógenoMedio cromógeno: Aislamiento selectivo de : Aislamiento selectivo de levaduras e identificación de levaduras e identificación de C. albicansC. albicans
Colonias de Colonias de C. albicansC. albicans: azul hidrólisis : azul hidrólisis específica de la hexosaminidasa (sustrato específica de la hexosaminidasa (sustrato cromogénico)cromogénico)..
Colonias rosadas: hidrólisis de otro sustrato Colonias rosadas: hidrólisis de otro sustrato que sirve para diferenciar “otras levaduras”que sirve para diferenciar “otras levaduras”
Lectura: 24-48 hs.Lectura: 24-48 hs. Apropiado para separar cultivos mixtosApropiado para separar cultivos mixtos ID2 = (-) bacterias ID2 = (-) bacterias
Candida IDCandida ID
Albicans IDAlbicans ID
C.albicans
Agar BiggyAgar Biggy
Identificación de levaduras del Identificación de levaduras del género género CandidaCandida
Aglutinación de partículas de látexAglutinación de partículas de látex• Las partículas están recubiertas de AcLas partículas están recubiertas de Ac monoclonales que se unenmonoclonales que se unen específicamente con Ag de específicamente con Ag de C. albicansC. albicans y y C. C.
kruseikrusei• Son métodos rápidos Son métodos rápidos • Sensibles y específicos Sensibles y específicos • No requieren personal entrenadoNo requieren personal entrenado• MUY COSTOSOSMUY COSTOSOS
Identificación de levaduras del Identificación de levaduras del gen. gen. CandidaCandida
Técnicas de biología molecularTécnicas de biología molecular
- Se basan en PCRSe basan en PCR- Más rápidos para la identificación de Más rápidos para la identificación de Candida spp.Candida spp. que los métodos fenotípicos. que los métodos fenotípicos.- Permite identificar aquellas especies que no han podido Permite identificar aquellas especies que no han podido
ser determinadas por métodos fenotípicosser determinadas por métodos fenotípicos- Muy costososMuy costosos- No son aplicables a laboratorios clínicosNo son aplicables a laboratorios clínicos- Laboratorios de referencia - Laboratorios de referencia - Requiere personal especializado- Requiere personal especializado
Gracias