1728 Medicine. 2013;11(28):1728-36 Linfocitos natural killer J. Monserrat Sanz, C. García Torrijos, D. Díaz Martín y A. Prieto Martín Departamento de Medicina. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares. Madrid. España. Resumen Las células natural killer (NK) son las células encargadas de la defensa frente a infecciones víricas y la eliminación de células tumorales. Se caracterizan por una potente capacidad citolítica y un sistema extremadamente eficiente para inducir apoptosis en las células diana. Además, están en- cargadas de diferenciar entre células autólogas y heterólogas o xenogénicas, siendo en parte las principales responsables del rechazo en los trasplantes. Este proceso lo realizan eficientemente gracias a un conjunto de receptores que se han clasificado en dos grandes grupos, los receptores activadores y los receptores inhibidores. Los receptores inhibidores se conocen desde hace tiem- po, siendo responsables del reconocimiento de lo “propio” examinando las moléculas de histo- compatibilidad de clase I. De los receptores activadores conocemos cada vez más y, sin embargo, poco sabemos de sus ligandos, foco actual de interés para los científicos. Alteraciones en el nú- mero o función de las células NK son responsables de numerosas patologías en los ámbitos de las infecciones, los tumores, la autoinmunidad y las inmunodeficiencias. También es muy relevante la cooperación que existe entre las células NK y las otras células del sistema inmune innato como las células dendríticas o del sistema inmune adaptativo como los linfocitos T. En esta actualización se repasan los últimos conocimientos en la biología de las células NK, subtipos, receptores que ex- presan, mecanismos citotóxicos y su papel en la defensa antivírica y antitumoral. Abstract Natural killer lymphocytes Natural killer (NK) cells are responsible for the defence against viral infections and the elimination of tumour cells. They are characterised by their potent cytolytic ability and their highly efficient system for inducing apoptosis in target cells. In addition, they are responsible for differentiating between autologous and heterologous or xenogeneic cells, the latter of which are partly responsible for transplant rejection. NK cells perform this process efficiently thanks to a collection of receptors which receptors have been classified into two major groups: activating receptors and inhibitory receptors. Inhibitory receptors have been identified for some time and are responsible for recognising that which belongs to the body by examining class I histocompatibility molecules. We are steadily learning more about the activating receptors; however, we still know little about their ligands, which are the current focus of interest to scientists. Changes in the number or function of NK cells are responsible for numerous diseases in the context of infections, tumours, autoimmunities and immunodeficiencies. Of significant importance is the cooperation between NK cells and other innate immune system cells, such as dendritic cells, or adaptive immune system cells, such as T lymphocytes. In this monograph, we review the latest discoveries in the biology of NK cells, subtypes, the receptors they express, the cytotoxic mechanisms and their role in antiviral and antitumour defence. Palabras Clave: - Natural killer - Receptores activadores - Receptores inhibidores - Granzimas - Perforinas - Apoptosis Keywords: - Natural killer - Activating receptors - Inhibitory receptors - Perforins - Apoptosis ACTUALIZACIÓN
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1728 Medicine. 2013;11(28):1728-36
Linfocitos natural killerJ. Monserrat Sanz, C. García Torrijos, D. Díaz Martín y A. Prieto MartínDepartamento de Medicina. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares. Madrid. España.
ResumenLas células natural killer (NK) son las células encargadas de la defensa frente a infecciones víricas y la eliminación de células tumorales. Se caracterizan por una potente capacidad citolítica y un sistema extremadamente eficiente para inducir apoptosis en las células diana. Además, están en-cargadas de diferenciar entre células autólogas y heterólogas o xenogénicas, siendo en parte las principales responsables del rechazo en los trasplantes. Este proceso lo realizan eficientemente gracias a un conjunto de receptores que se han clasificado en dos grandes grupos, los receptores activadores y los receptores inhibidores. Los receptores inhibidores se conocen desde hace tiem-po, siendo responsables del reconocimiento de lo “propio” examinando las moléculas de histo-compatibilidad de clase I. De los receptores activadores conocemos cada vez más y, sin embargo, poco sabemos de sus ligandos, foco actual de interés para los científicos. Alteraciones en el nú-mero o función de las células NK son responsables de numerosas patologías en los ámbitos de las infecciones, los tumores, la autoinmunidad y las inmunodeficiencias. También es muy relevante la cooperación que existe entre las células NK y las otras células del sistema inmune innato como las células dendríticas o del sistema inmune adaptativo como los linfocitos T. En esta actualización se repasan los últimos conocimientos en la biología de las células NK, subtipos, receptores que ex-presan, mecanismos citotóxicos y su papel en la defensa antivírica y antitumoral.
AbstractNatural killer lymphocytes
Natural killer (NK) cells are responsible for the defence against viral infections and the elimination of tumour cells. They are characterised by their potent cytolytic ability and their highly efficient system for inducing apoptosis in target cells. In addition, they are responsible for differentiating between autologous and heterologous or xenogeneic cells, the latter of which are partly responsible for transplant rejection. NK cells perform this process efficiently thanks to a collection of receptors which receptors have been classified into two major groups: activating receptors and inhibitory receptors. Inhibitory receptors have been identified for some time and are responsible for recognising that which belongs to the body by examining class I histocompatibility molecules. We are steadily learning more about the activating receptors; however, we still know little about their ligands, which are the current focus of interest to scientists. Changes in the number or function of NK cells are responsible for numerous diseases in the context of infections, tumours, autoimmunities and immunodeficiencies. Of significant importance is the cooperation between NK cells and other innate immune system cells, such as dendritic cells, or adaptive immune system cells, such as T lymphocytes. In this monograph, we review the latest discoveries in the biology of NK cells, subtypes, the receptors they express, the cytotoxic mechanisms and their role in antiviral and antitumour defence.
Palabras Clave:
- Natural killer
- Receptores activadores
- Receptores inhibidores
- Granzimas
- Perforinas
- Apoptosis
Keywords:
- Natural killer
- Activating receptors
- Inhibitory receptors
- Perforins
- Apoptosis
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LINFOCITOS NATURAL KILLER
Introducción
Las células natural killer (NK) fueron descritas por primera vez en la década de los setenta y representan uno de los com-ponentes celulares especializados más relevantes de nuestro sistema inmune innato, caracterizándose por presentar capa-cidades citotóxicas e inmunorreguladoras. Están implicadas en la primera línea de defensa frente a infecciones víricas y células neoplásicas. Décadas atrás, el origen y papel de esta estirpe celular fue ampliamente discutido; sin embargo, en la actualidad está perfectamente establecido que se trata de una clase de linfocito, ya que proceden de la diferenciación a par-tir de precursores presentes en la línea linfoide, que a su vez procede de las células madres CD34+ capaces de diferenciar la mayoría de las células que componen nuestro sistema in-mune1.
Morfológicamente, estas células han sido definidas como linfocitos granulares grandes, debido a su mayor tamaño res-pecto de los linfocitos T, con los cuales comparten receptores de superficie y funciones2. En su citoplasma se describió la presencia de gránulos azurófilos, denominándose alterna-tivamente linfocitos granulares grandes que contenían grá-nulos azurófilos. De manera similar a los linfocitos T, son capaces de secretar citoquinas proinflamatorias y antiinfla-matorias, y presentan mecanismos efectores comunes que incluyen la liberación de moléculas citotóxicas como las granzimas y las perforinas, o la expresión del receptor de su-perficie CD95 (FAS), capaz de inducir la apoptosis celular en células diana. Sin embargo, las células NK presentan impor-tantes diferencias respecto de los linfocitos T; en primer lu-gar, no expresan TCR (el receptor clonal característico de los linfocitos T) ni realizan, por tanto, la recombinación somáti-ca (sintetizan CD3, pero no lo expresan en superficie). Tam-poco necesitan la maduración en el timo, imprescindible para el desarrollo de los linfocitos T.
Funcionalmente, este tipo celular fue definido como natural killer (asesinas natas) por ser capaces de eliminar células tumorales de forma espontánea3 sin inmunización previa, es decir, células cuyo papel efector no estaba restrin-gido por la presentación antigénica en el contexto de las moléculas de histocompatibilidad clásicas de clase I o II. Estudios en modelos animales murinos demostraron que la depleción de estas células, o la alteración en su función, provocaba la inadecuada defensa frente a células infectadas por virus y células malignas. En los últimos años se han publicado cientos de estudios sobre el importante papel de estas células no solo antiinfeccioso y antitumoral, sino tam-bién en los campos de la autoinmunidad, las inmunodefi-ciencias y los trasplantes.
Desarrollo y diferenciación de las células natural killer
Las células NK proceden de precursores presentes en la mé-dula ósea, timo e hígado y comunes a los linfocitos T. Estu-dios previos demuestran que precursores CD34+ proceden-tes del cordón umbilical, médula ósea o timo en apropiadas
condiciones y en presencia de IL-15 pueden ser diferencia-das al linaje celular NK1. Sin embargo, la pregunta clave du-rante años ha sido cómo estas células, capaces de matar es-pontáneamente otros tipos celulares, en el momento de su maduración, momento en el que adquieren sus capacidades citolíticas, no atacaban células adyacentes inofensivas. La so-lución fue hallada; durante su desarrollo, este tipo celular debe adquirir rápidamente competencias para reconocer los alelos de las moléculas de histocompatibilidad autólogas se-leccionándolas adecuadamente mediante sus receptores inhi-bidores. Contradictoriamente, estudios previos in vitro no demuestran esta hipótesis, ya que en las células NK inmadu-ras adquieren su capacidad citolítica antes de ser capaces de reconocer las moléculas de histocompatibilidad autólogas y, sin embargo, no mata a las células estromales de la médula ósea necesarias para su desarrollo. No obstante, se ha repor-tado la importancia de receptores como el 2B4(CD244) du-rante las etapas inmaduras de las células NK, capaces de ejer-cer rutas reguladoras antes de adquirir competencias de reconocimiento de moléculas de histocompatibilidad de cla-se I controlando así una posible agresión a las células estro-males4.
Heterogeneidad: tipos de células natural killer
Las células NK representan entre un 5 y un 15% de todos los linfocitos circulantes. Definir subpoblaciones de células NK en función de la expresión de sus receptores es muy complicado y, por lo tanto, las deberíamos definir como cé-lulas heterogéneas. Sin embargo, durante años se han iden-tificado clases de células NK dependiendo de las funciones que eran capaces de realizar. De esta manera, se han clasifi-cado las células NK en dos grandes grupos atendiendo a la intensidad de expresión de los antígenos de superficie CD56 y CD16, junto con el estudio de su capacidad efec-tora citotóxica. En consecuencia, tendríamos dos grupos de células NK, las que expresan el antígeno de superfi- cie CD56 en alto número de copias en su membrana (CD56+bright) junto con un número bajo de copias o ninguna expresadas en su superficie del receptor de inmunoglobuli-na FCγRIII (CD16+dim/–), es decir CD56+brightCD16+dim/–; el otro grupo se caracterizarían por ser CD56+dimCD16+brigth. Ambos grupos tendrían características funcionales diferen-tes, las células NK CD56+dimCD16+brigth representarían un 90% de las NK circulantes en sangre, y se les denomina NK citotóxicas debido a su alta capacidad lítica y su baja capacidad de secretar citoquinas. Sin embargo, las NK CD56+brightCD16+dim/– representarían el 10% restante, y se caracterizarían por su baja capacidad citotóxica y su alta ca-pacidad inmunorreguladora, siendo responsables de la libe-ración de altas cantidades de citoquinas proinflamatorias y antiinflamatorias (fig. 1)5.
El estudio de la capacidad efectora citotóxica de las célu-las NK se ha determinado en función de:
1. Su capacidad espontánea in vitro de lisar células que no expresan moléculas de histocompatibilidad de clase I o deno-minada citotoxicidad espontánea o natural.
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2. Su capacidad inducida in vitro mediante la estimula-ción con citoquinas de lisar células que expresan moléculas de histocompatibilidad de clase I, también llamada actividad LAK o citotoxicidad inducida.
3. Su capacidad de lisar mediante el reconocimiento de células previamente marcadas mediante inmunoglobulinas IgG, los cuales se unirán a los receptores CD16 mediante el proceso denominado citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC).
Las células NK citotóxicas presentarían una alta capacidad citotóxica natural, inducida y dependiente de anticuerpo, en contra, las células NK reguladoras presentarían una muy baja capacidad espontánea natural y dependiente de anticuerpo, pero una alta capacidad citotóxica inducida. Respecto a su diferenciación y maduración, se ha demostrado que ambos grupos de células NK se caracterizan por presentar rutas di-ferentes (fig. 1)6.
Receptores y ligandos
Las funciones de las células NK van a ser determinadas por una compleja interacción entre los ligandos y un conjunto de receptores activadores e inhibidores que darán lugar a la correspondiente inhibición o activación de estas células, in-duciendo una adecuada respuesta protectora en nuestro organismo. A diferencia de los linfocitos T, las células NK no reordenan sus genes en la línea somática, lo que indica-ría la expresión de un conjunto de receptores poco nume-roso para un desconocido número de ligandos y, por tanto, una función limitada. Sin embargo, las células NK han de-mostrado presentar diferentes mecanismos que les permi-
ten responder eficientemente ante una gran variedad de situaciones infecciosas o neoplásicas. Estos mecanismos están basados en la expresión genética de una amplia diversidad de receptores, entre los que se encuentra, por ejemplo, la extensa familia de los KIR (killer cell immunoglobulin-like receptors), un subconjunto amplio y diverso de receptores implicados en el reconocimiento de moléculas de histocompatibilidad de clase I. La combinación de todos estos recep-tores, junto con la expresión ex-clusiva de algunos de ellos por ciertas subpoblaciones de células NK y asociada a la variedad gené-tica intrínseca a los humanos da lugar a un eficiente pero hetero-géneo compartimento NK.
Tradicionalmente, los recepto-res de las células NK se han clasi- ficado en dos grandes grupos en función de si eran activadores o inhibidores. Cada año se descu-bren nuevos receptores pero mu-
chos de sus ligandos permanecen aún desconocidos. Sin embargo, los receptores bien caracterizados presentan ca-racterísticas comunes que nos ha permitido agruparlos en familias (tabla 1).
Receptores inhibidores
Los receptores inhibidores presentan una cola citoplasmática larga con una o más secuencias ITIM (immunoreceptor tyrosi-ne-based inhibitory motif), las cuales presentan una tirosina que se fosforila mediante una SrC/Tyr Kinasa, y transduci-rían información vía reclutamiento de las proteínas SHP1 o SHP2. Este dominio largo se utiliza en la nomenclatura como una característica común para describir estos recepto-res denominándose DL (domain large), como por ejemplo KIR2DL (fig. 2). La activación de estos receptores provoca-ría la inhibición de las células NK7. Se diferencian dos fami-lias de receptores inhibidores.
La familia de los KIR representa un amplio conjunto de receptores inhibidores; sin embargo, dentro de esta familia también se incluyen receptores activadores que describire-mos a continuación, ambos regulan la función de las células NK. Esta familia de receptores es muy diversa, y parecen haber evolucionado rápidamente mediante la duplicación de genes y su recombinación genética8. A esta familia corres-ponderían los incluidos en la tabla 1, se codifican todos a partir del brazo corto del cromosoma 19. Estos receptores se caracterizarían por presentar dominios largos con secuencias ITIM, y tres dominios de inmunoglobulina extracelulares, aunque se han encontrado excepciones, como el receptor KIR2DL que, aunque tiene un dominio largo, presenta se-
Fig. 1. Clasificación de las células natural killer (NK) en función de sus capacidades efectoras y reguladoras. NK: natural killer.
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cuencias ITAM (imunoreceptor tyrosine-based activation motif) y, por tanto, es un receptor activador. La segunda familia co-rresponde a los receptores de lectinas de tipo C. Esta familia originalmente se caracterizó por presentar receptores activa-dores hasta que se descubrió el receptor inhibidor CD-94NKG2A/B8.
Todos estos receptores tienen en común la capacidad de reconocer moléculas de histocompatibilidad clásicas y no clásicas de clase I y, aunque no se han encontrado receptores para moléculas de clase II, no se descarta que este hecho no sea posible9. El reconocimiento de estas moléculas de clase I provoca que las células NK no ejerzan su función efectora citotóxica. Algunos de los ligandos más conocidos están re-sumidos en la tabla 1.
Receptores activadores
Los receptores activadores se caracterizarían por presentar asociadas proteínas adaptadoras (DAF12) con secuencias ITAM en sus dominios intracelulares. Estas secuencias son necesarias para que las células NK se activen y ejecuten su programa efector citotóxico. En comparación con los recep-tores inhibidores, los dominios citoplasmáticos son cortos, y por esto en la nomenclatura se les denomina DS (domain short) y transducen la activación vía molécula adaptadora DAP12 a través de los dominios ITAM (fig. 2). También sue-len presentar dos dominios de inmunoglobulina extracelula-res. Dentro de los receptores activadores podríamos diferen-ciar 5 familias: los receptores activadores KIR, receptores de lectinas de tipo c, receptores con citotoxicidad natural (NCR), los DNAM-1 y los TLR. Todos ellos están represen-tados en la tabla 1 con sus respectivos ligandos, muchos de ellos todavía desconocidos.
Uno de los receptores mejor conocidos es el de lectinas NKG2D que se expresa constitutivamente en todas las cé-lulas NK, y es capaz de reconocer una amplia variedad de ligandos que se asemejan en no más de un 20% de su com-posición a aminoácidos10; sin embargo, también se ha com-probado la expresión de este receptor en linfocitos T cito-tóxicos y Tγδ9. Estos ligandos son inducidos ante diferentes entornos ambientales adversos o situaciones de estrés, siendo un solo receptor capaz de reconocer muchos ligandos dife-rentes. Por otro lado, el ambiente puede provocar la libera-ción de citoquinas que producen el aumento en la expresión de estos receptores activadores, como por ejemplo ocurre con el NKp44. Este receptor pertenece a la familia de los NCR, considerados los prototipos y los más importantes en la lisis de diversos tumores (tabla 1). Algunos receptores de
TABLA 1Clasificación de los receptores activadores e inhibidores
Tipos Receptores de activación Ligandos del receptor de activación Receptores de inhibición Ligandos del receptor
Fig. 2. Estructura de receptores activadores e inhibidores representativos.
CD94/NKG2A HLA-E
HLA-E
HLA-G
HLA-C(Grupo 2)
HLA-C
MIC-A/B
ULBP-1/2/3
ITIM ITIM
ITIM ITIM
ITIM
DAP12
DAP12
DAP10
ITIM
CD94/NKG2A
ITL2
KIR2DL1
KIR2DS
NKG2D
Inhibición Inhibición
Receptores Ligandos
Activación Activación
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esta familia son exclusivamente expresados por las células NK y, por tanto, son marcadores excepcionales para identifi-carlas; además, su número expresado en superficie es propor-cional a su actividad citotóxica frente a sus células diana y al tamaño de la masa tumoral, por ejemplo el NKp46 y el NKp3011.
El CD16 es otro receptor bien definido capaz de unir inmunoglobulinas del isotipo IgG en baja afinidad y dirigir a las células NK de manera específica hacia la célula diana y, de esta manera, transducir señales de activación sobre la propia célula NK, a este proceso se le denomina ADCC. Las señales transducidas por el CD16 vía dominios ITAM provocan una potente actividad citotóxica y la secreción de citoquinas9,12. En los últimos años, se ha demostrado que algunos de estos receptores no son capaces por sí mismos de establecer seña-les determinantes para que las células NK actúen, sino que necesitan de otros correceptores para que disminuyan el um-bral de activación y las células NK puedan lisar las células diana. También se les ha definido como receptores capaces de mejorar la capacidad citotóxica de las NK, estos recepto-res pertenecen a otras familias como son, por ejemplo, el NKp80 (de la familia receptores de lectinas), el DNAM-1, el 2B4 o el CD59.
El NKp80 actúa movilizando calcio, y su ligando es un receptor expresado por monocitos, macrófagos, granulocitos denominado lectina tipo C inducida por activación (AICL). Este receptor puede modular el grado de activación y producción de citoquinas, así como el mantenimiento de la respuesta in-mune13. El DNAM-1 y el 2B4 son receptores miembros de la superfamila de las inmunoglobulinas. El DNAM-1 está presente en las células NK, linfocitos T y monocitos. Se han descubierto algunos de sus ligandos, como el receptor del virus de la polio (CD155) o el receptor que media la entrada del virus del herpes (CD112). Se ha demostrado que su inte-racción con células tumorales aumenta la citotoxicidad y la producción de citoquinas de las células NK14. El 2B4 está presente en todas las células NK, linfocitos T CD8, basófilos y monocitos, su ligando es el CD48, receptor presente en todas las células nucleadas. Su mecanismo es activador y coestimulador, implicándose en la activación y manteni-miento de la respuesta citotóxica de las células NK; sin em-bargo, también se ha descrito un papel inhibidor15. El CD59 está expresado en una amplia variedad de células de nuestro organismo, incluidos todos los leucocitos y eritrocitos, entre otros tipos celulares. Por un lado, es un receptor muy impor-tante implicado en la inhibición del complejo de ataque a membrana, por otro, representa un importante papel en el aumento de la citotoxicidad y lisis de células malignas por parte las células NK16.
Por último, las células NK expresan receptores de tipo toll (TLR). Se han encontrado niveles de expresión bajos de los receptores TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 y TLR9. Por tanto, las células NK son capaces de responder a una amplia variedad de patrones de moléculas asociados a patógenos (PAMP)17. La mayoría de estos receptores actúan vía MyD88, una proteína adaptadora común a la activación de los TLR, y transduciendo mediante NF-Kβ18. Los TLR actuarían mejorando la eficiencia efectora de las células NK sobre sus dianas (tabla 1, fig. 2).
Regulación de los receptores activadores e inhibidores: reconocimiento de lo ofensivo, pérdida de lo propio
Cuando se descubrieron las células NK, fueron consideradas como células inespecíficas en su interacción con sus células diana. Sin embargo, fue en 1986 cuando Karre y sus colegas propusieron la teoría de la pérdida de lo propio. Según esta teoría, las células NK reconocerían específicamente las mo-léculas de histocompatibilidad de clase I, y como consecuen-cia de este reconocimiento se produciría la inhibición de su actividad lítica19,20. Solo cuando las células no presentaran estas moléculas o no fueran genéticamente idénticas, las cé-lulas NK ejercerían su acción efectora citotóxica. No obstan-te, las células NK presentarían mecanismos para asegurarse de su acción efectora secretando interferón gamma (IFNγ) sobre la célula diana. Esta citoquina ordenaría a la célula dia-na a presentar en su ausencia, o aumentar la expresión en su superficie de sus correspondientes moléculas de histocompa-tibilidad de clase I. Los receptores inhibidores serán, enton-ces, los encargados de reconocer las moléculas de histocom-patibilidad autólogas, y a través de su transducción de señal activar las secuencias ITIM que frenarán totalmente la ac-ción efectora de las células NK. Por otro lado, cuando apa-rezcan los estímulos apropiados para activar a las células NK mediante su amplia familia de receptores activadores asocia-dos a sus dominios ITAM, se transducirán dos tipos de rutas simultáneas: una inhibitoria capaz de bloquear la transduc-ción de señal a través de las secuencias ITIM que frenaba a las células NK, y otra ruta encaminada a activar a las propias NK (fig. 3).
Mecanismos efectores de las células natural killer: respuestas citotóxicas
Las células NK comparten los mismos mecanismos de cito-toxicidad que presentan los linfocitos T CD8. Por un lado, son capaces de liberar mediante exocitosis los gránulos cito-tóxicos contenidos en su citoplasma y, por otro, son compe-tentes para transducir señales proapoptóticas mediante la interacción entre los receptores Fas y FasL (CD95-CD95L).
Citotoxicidad mediada por gránulos: granzimas y perforinas
Los gránulos presentes en las células NK se asemejan a los lisosomas de los neutrófilos o los monocitos, pero además contienen dos clases de proteínas citolíticas de membrana, las proteínas formadoras de poros denominadas perforinas y las granulisinas, y una familia de serinproteasas llamadas granzi-mas, por lo que podríamos describirlos como lisosomas espe-cializados con capacidad de ser secretados. Además, dentro de los gránulos podemos encontrar la serglicina, la calreticulina y enzimas lisosomales como las catepsinas.
Las perforinas son proteínas dependientes de Ca++ que permanecen inactivas gracias a la calreticulina, y son activa-
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das vía cistein-proteasas. La calreticulina une Ca++ y, ante la señal apropiada, por ejemplo vía inositoltrifosfato, libera el Ca++, que es utilizado por las perforinas para polimerizarse en la membrana de la célula diana21. Las perforinas actúan de manera similar al complejo de ataque a la membrana del complemento (MAC) produciendo un poro en la membrana, por el cual se introducen las granzimas. Las granzimas son enzimas que se sintetizan inicialmente como una proenzima inactiva que es escindida y preparada para actuar por la ca-tepsina C. Sin embargo, son enzimas dependientes del pH y permanecen inactivas en el pH ácido presente en los gránu-los. Ambas proteínas se encuentran asociadas dentro de los gránulos de forma no covalente mediante cargas al esqueleto de un proteoglicano de gran tamaño denominado serglicina.
El proceso de secreción granular se inicia con la activa-ción específica de los receptores activadores, asociado de ma-nera simultánea a la inhibición de los receptores inhibidores. Esta activación provoca la migración de los gránulos hacia la membrana mediante la reordenación por parte del centro de organización de microtúbulos (MTOC) y la polarización del aparato de Golgi hacia la célula diana, con la que posterior-mente formará una sinapsis inmunológica uniendo sus mem-branas. A continuación la célula NK procederá a la libera-ción de las granzimas y perforinas al espacio extracelular de la sinapsis inmunológica, donde se polimerizaran en la mem-brana de la célula diana y permitirá que las granzimas entren en la misma. Se ha puesto en duda que los poros producidos por las perforinas sean lo suficientemente grandes para que las granzimas puedan entrar en las células a través de ellos. Sin embargo, el papel de las perforinas es muy importante dentro de los gránulos, interviniendo en la liberación de las proteínas del esqueleto molecular de serglicina y en la acti-
vación de las granzimas21,22. Una manera interesante de estu-diar la activación de las células NK consiste en analizar la expresión del antígeno de superficie CD107a, el cual se en-cuentra dirigido hacia el interior de los gránulos y, al reali-zarse el proceso de exocitosis, este antígeno quedará expues-to en la cara extracelular de la membrana de la célula NK.
Las granzimas representan una amplia familia de protea-sas muy específicas, de las cuales se han encontrado de mo-mento, en los seres humanos, 5 clases: la A, B, H, K y M23. Las más estudiadas han sido las granzimas A y B, en concreto la B, ya que es la responsable de inducir la apoptosis de las cé-lulas diana mediante la activación de la ruta de las caspasas. En los últimos años, se han descubierto más tipos de granzi-mas que, lejos de ser redundantes, son capaces de inducir la muerte de las células diana mediante diferentes rutas, incluso independientes de las rutas de las caspasas. Además, se ha en-contrado variabilidad en los tipos de granzimas encontradas en las células NK, asegurando que la muerte celular si no se produce por una vía lo haga por otra. Por ejemplo, la granzi-ma B es capaz de escindir residuos de aspartato al igual que algunas caspasas, de esta manera es capaz de inducir apoptosis vía caspasa 3. Podría ocurrir que esta ruta estuviera bloquea-da, lo que impediría la activación de la apoptosis, entonces la granzima B es capaz de hidrolizar el inhibidor de la ADNasa activada por caspasas (ICAD) y, por tanto, disregular a las ADNasas activadas por caspasas (CAD) e inducir apoptosis. Por otro lado, la granzima B también actúa escindiendo BID. BID destruye la integridad de la membrana externa mitocon-drial liberando citocromo C, endonucleasas y serinproteasas como la HtrA2/OMI, inhibidora de la proteína inhibidora de la apoptosis (IAP), provocando apoptosis de manera indepen-diente a la ruta de las caspasas.
Fig. 3. Mecanismo de activación de las células natural killer (NK) en ausencia de MHC-I.
Receptorinhibidor
ITI
M
ITAM
ITI
M
ITAM
ITI
M
ITAM
NK NK
Céluladiana
Céluladiana
Céluladiana
NK
HLA-1
HLA-1
IFNγ IFNγ IFNγ
Receptorinhibidor
Receptoractivador
Receptoractivador
Receptoractivador
Ligandodel receptor
activador
Ligandodel receptor
activador
Ligando del receptor activadorAUSENTE
NO LISIS
Ligando del receptor activadorPRESENTE
LISIS
HLA-1AUSENTE O HETERÓLOGO
LISIS
Receptorinhibidor
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ENFERMEDADES DEL SISTEMA INMUNE (I)
El mecanismo de acción de la granzima A es más lento que el de la granzima B, asemejándose a los tiempos de in-ducción de apoptosis mediante ligandos de superficie (por ejemplo, FASL), aunque igual de efectivo, ya que es capaz de producir finalmente la fragmentación del ADN en fragmen-tos oligo-nucleosomales. Sin embargo, estos fragmentos son diferentes a los producidos por las granzimas B, son más pe-queños y con cortes en hebras sencillas respecto a los más grandes y con cortes en hebras dobles, lo que indica rutas efectoras diferentes. Respecto al mecanismo, se conoce que también actúan dañando la mitocondria, liberando especies oxidantes y otras ADNasas, son independientes de las rutas de las caspasas y no son inactivadas por la sobrexpresión de BCL-2 (proteína anti-apoptótica), hecho que sí ocurre en las granzimas B21. El papel de este retraso de las granzimas A respecto de la B no está muy claro, ya que, in vitro y en pre-sencia de perforinas, desaparece. Parece que las perforinas podrían tener un papel limitante en la internalización de las granzimas al espacio intracelular; sin embargo, cuando las células NK se activan se observa un aumento de la concen-tración de granzima A que presenta la capacidad de actuar como una citoquina, estimulando a células cercanas como monocitos a liberar citoquinas proinflamatorias24.
A parte de las perforinas, las células NK y los linfocitos T CD8 también secreta granulisina, que se asemeja a la fami-lia de las proteínas saposinas que catabolizan glucoesfingolí-pidos. Estas actuarían sinérgicamente con las perforinas ayu-dando a iniciar la lisis de bacterias, hongos o células tumorales mediante la desestabilización por cargas (residuos positivos) de sus membranas provocando la degradación lipí-dica, construyendo túneles en la bicapa apolar. Las granulisi-nas también están implicadas en vías proapoptóticas inde-pendientes de caspasas, no se conoce muy bien su mecanismo, pero son inactivadas por la sobrexpresión de BCL-2, y son capaces de dañar la mitocondria liberando endonucleasas, citocromo c y serinproteasas. Globalmente, las granzimas, perforinas y granulisinas constituirían un sistema de interfe-rencia metabólica muy robusto para “asesinar” cualquier tipo celular con membrana lipídica.
Apoptosis mediada por Fas-FasL
Por si no fuera suficiente, las células NK presentan recepto-res en su superficie no secretados pertenecientes a la familia de los factores de necrosis tumoral (TNF) como son el FasL(CD95L), o receptores como TRAIL-R que transducen señales para activar la apoptosis vía sus ligandos Fas(CD95) o TRAIL (ligando inductor de la apoptosis) respectivamente. El más representativo es el FasL, se sintetiza constitutiva-mente y se localiza en la cara interna de los endosomas, solo cuando las células NK se activan FasL es expresado en super-ficie y podrá señalizar vía Fas. Fas es expresado en las células diana constitutivamente, es un monómero que al activarse se trimeriza, recluta una serie de proteínas adaptadoras y activa la vía extrínseca de la apoptosis mediante la caspasa 8, produ-ciendo la muerte celular programada en las células malignas. Estas proteínas adaptadoras forman el complejo de señaliza-ción inductor de muerte (DISC) gracias al adaptador FADD
que se une al dominio de muerte del CD95 y la pro-caspasa 8, que es escindida e inicia la vía extrínseca de la apoptosis. Este mecanismo representa una vía alternativa para matar a las células diana, aunque en importancia es secundario a la secreción granular.
Función inmunorreguladora: citoquinas y quimioquinas
Las células NK son capaces de secretar una amplia variedad y en grandes cantidades de citoquinas capaces de intervenir so-bre las células del sistema inmune adaptativo como los linfo-citos T, e incluso sobre las células del sistema inmune innato como las células dendríticas. Las células NK apenas necesitan unos minutos para secretar grandes cantidades de citoqui- nas proinflamatorias como el IFNγ o el TNFα. Las cito- quinas IL-2, IL-12, IL-15 e IL-18 junto con los interferones (α y β), liberadas por células centinela, como los macrófagos o las células dendríticas, activan a las células NK. La IL-2 y la IL-15 particularmente también son imprescindibles para su desarrollo. Como consecuencia de su activación, las célu- las NK producen, además del IFNγ y el TNFα GM-CSF y grandes cantidades de las siguientes quimioquinas: RANTES, MIP1α, MIP1β, P10 y las linfotactinas25. Las cé-lulas NK también presentan una regulación autocrina por parte de estas citoquinas, mejorando sus funciones efectoras citotóxicas y reguladoras.
Al igual que otras células del sistema inmune, las células NK son especialmente sensibles a las citoquinas antiinflama-torias IL-10 y TGFβ, y adquieren la capacidad de liberar IL-10. Estas citoquinas están encargadas de terminar con la respuesta efectora NK, e incluso impedir que se inicie.
Función de las células natural killer en la fisiopatología humana
Defensa frente a virus
Las células NK, junto con los linfocitos T CD8, representan nuestra principal línea de defensa ante las infecciones provo-cadas por virus. Si bien las células NK son muy eficientes en la defensa antiviral, los virus han coevolucionado con noso-tros aprendiendo a eludirlas. Uno de los primeros objetivos de los virus ha sido eludir los receptores activadores, también han sido capaces de sintetizar proteínas capaces de mimetizar la activación de los receptores inhibidores evadiendo su po-tencial ataque efector, entre otros ejemplos26. Las células NK nos defienden de múltiples variedades de virus; sin embargo, es especialmente relevante la protección que ejercen frente a los herpesvirus. Especialmente significativo es el caso del jo-ven que en 1989 presentaba una ausencia total de células NK y falleció a causa de sucesivas infecciones por Herpesvirus27. Actualmente, pacientes sin células NK o con su función da-ñada sufren infecciones persistentes de Herpesvirus, a pesar de presentar un comportamiento normal de los linfocitos T y B, y necesitan antivirales para sobrevivir.
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LINFOCITOS NATURAL KILLER
En condiciones normales, una célula infectada por un virus provoca la liberación de IFNα e IFNβ, como conse-cuencia, las células NK se activarán y proliferán. Esta oleada de células NK debería ser capaz de eliminar todas las células infectadas por el virus o, por lo menos, ser capaz de ralentizar la infección para dar tiempo a que se desarrolle una respues-ta adaptativa. Además, el destino de los virus está unido a la supervivencia de sus células diana y de sus huéspedes, de otra manera, su supervivencia estaría comprometida. Con todo esto, los herpesvirus han sido capaces de desarrollar variadas estrategias de evasión, impidiendo que su célula huésped sea eliminada, y perpetuando su supervivencia. Se ha demostra-do que estos virus son capaces de provocar la síntesis de CD58 y CD54 en la superficie de la célula diana, impidiendo la función citotóxica de las células NK26.
Se ha comprobado que los herpesvirus son capaces de interferir a diferentes niveles en la expresión de las moléculas de histocompatibilidad de clase I. Por un lado, alterando la síntesis de las cadenas que componen el MHC-I, por otro, inhibiendo el ensamblaje de péptidos antigénicos en las MHC-I y realizado por la enzima TAP. De esta manera, la célula diana no es capaz de presentar péptidos antigénicos del virus, o incluso mimetiza cadenas del MHC-I para que las NK no detecten la ausencia de moléculas de clase I pro-pias de la célula huésped. Si bien estos mecanismos de eva-sión han sido descritos en herpesvirus y citomegalovirus, otros tipos de virus han elaborado otras estrategias similares. El virus del sida es capaz de interferir de forma selectiva en la expresión de los alelos de las moléculas de clase I, dejando expresar uno o dos alelos de los 6 posibles para no activar a las células NK. También ha desarrollado ligandos específicos para activar el receptor inhibidor CD94/NKG2A, el cual im-pide que la célula NK se active. Otros virus también son ca-paces de provocar la liberación de moléculas que bloquean los receptores activadores que les iban a reconocer a ellos mismos. Por ejemplo, algunos citomegalovirus son capaces de bloquear el receptor NKG2D, y algunos virus como el la gripe utilizan hemaglutinina o hemaglutinina-neuraminidasa para bloquear el NKp4628.
Defensa frente a células tumorales
Uno de los papeles más importantes de las células NK con-siste en el rápido reconocimiento de células malignas para generar una rápida respuesta. En diferentes modelos muri-nos, la depleción de las células NK provoca la incapacidad por parte de los ratones de eliminar o reducir la progresión de las neoplasias inducidas29. Son varios los receptores impli-cados en la defensa antitumoral; sin embargo, NKG2D es uno de los más estudiados, debido a que sus ligandos (la fa-milia MIC [A y B] y la familia ULBP) están altamente expre-sados en muchos tipos de células tumorales y estresadas30. Estudios in vitro demuestran que existen más receptores im-plicados en la defensa antitumoral y conocidos desde hace más de 10 años, como los de la familia NCR (NKp30, NKp44, NKp46) pero muchos de sus ligandos presentes en las células neoplásicas permanecen desconocidos, junto con su mecanismo de acción. Recientemente se ha conocido el
papel del ligando B7-H6, el cual solo se expresa cuando las células se malignizan y activan la citotoxicidad NK mediante el receptor NKp30. El receptor Fc de las IgG (CD16) tam-bién ha demostrado ser un importantísimo mecanismo de defensa antineoplásica, señalando a las células NK la presen-cia de antígenos tumorales mediante el reconocimiento es-pecífico de estas inmunoglobulinas.
Existen muchos estudios que demuestran el papel anti-neoplásico de las células NK; sin embargo, los mecanismos por los cuales son capaces de reconocer a las células tumorales cuando empiezan a malignizarse no son todavía bien conoci-dos. Los estudios de transferencia adoptiva de células NK en modelos murinos y en seres humanos nos han dado a enten-der un poco mejor el comportamiento de este tipo celular. En estos modelos de inmunoterapia se extraen las células NK, se expanden y activan con IL-2 e IFNα y posteriormente las células NK autólogas son enfrentadas al tumor provocando la reducción del mismo, e incluso su eliminación completa. Los estudios los inició Rosenberg en los años 80 en pacientes con melanoma y cáncer renal metastásico, donde un 20% de los pacientes respondieron a este tipo de inmunoterapia31. Desde entonces, se han intentado diferentes estrategias experimenta-les en terapia adoptiva para mejorar la respuesta efectora de las células NK, algunas de ellas son32:
1. Bloqueando los receptores inhibidores con anticuer-pos monoclonales o silenciando el gen que los codifica se obtuvo una mejora del rechazo a células que pierden las mo-léculas de histocompatibilidad propias.
2. En trasplantes y terapia adoptiva se han seleccionado donantes con células NK cuyos KIR reconozcan con la ma-yor coincidencia posible las diferentes variantes alélicas de las moléculas de histocompatibilidad de clase I.
3. Mediante irradiación se induce la expresión de ligan-dos en las células diana para ser reconocidos por los recepto-res activadores.
4. Utilizando diferentes clases de citoquinas (por ejem-plo, IL-2) o anticuerpos biespecíficos (crosslinking) hemos sido capaces de inducir la activación, mejorar la citotoxicidad y aumentar la proliferación de las células NK ante sus células neoplásicas.
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Bibliografía
• Importante •• Muy importante
✔ Metaanálisis ✔ Artículo de revisión
✔ Ensayo clínico controlado ✔ Guía de práctica clínica
✔ Epidemiología
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