1
LIPASAS
Drs. Alcántara y SinisterraBiotransformations Group
Faculty of Pharmacy
Universidad Complutense
www.biotransformaciones.com
Liasas, transferasase isomerasas
Enzimas aisladasCélulas aisladas
K. Faber,Biotransformations in Organic Chemistry, 5th ed, 2004
Lipasas (acilglicerolhidrolasas E.C.3.1.1.3): actúan como catalizadores en reacciones lipolíticas (catabolismo de grasas y aceites) a través de la hidrólisis de los enlaces éster de acilgliceroles.
LIPASAS
Son activas únicamente adsorbidas sobre una interfase oleo-acuosa, “activación interfacial.”
1. Centro activo: tríada catalítica (Ser-His-Asp ó Glu)
Características comunes de las lipasas con otras serin-hidrolasas:
2. Hueco oxianiónico: estabiliza el intermedio tetraédrico formado durante la catálisis enzimática a través de la formación de puentes de hidrógeno.
2
LIPASAS E.C. 3.1.1.1
Lipasas no específicas.- hidrolizan todas las posiciones del triglicérido: Staphilococcus aureus,
Candida rugosa
Lipasa 1,3-específicas .- conducen a 2- acil – monoglicéridos : Rhizopus arrhizus
Lipasa 2-específicas.- conducen a 1,3-diacilgliceridos : Geotrichum candidum
Catalizan la hidrólisis de esteres insolubles en agua, mediante una activación interfacial
Modelo de Verger de activación
Interfacial de las lipasas
TIPO DE LIPASA
K. Faber,Biotransformations in Organic Chemistry, 5th ed, 2004
Reconocimiento de alcoholes quirales
HO OH
OH
sn-glicerol
12
3
R1
O
O O
O
R3
O
R2
O
sn-Triglicérido
12
3
Regla de Kazlauskas(J. Org. Chem., 1991, 56, 2656)
Alcoholes secundarios
m
L
HO H
3
ENANTIÓMERO RECONOCIDO
K. Faber,Biotransformations in Organic Chemistry, 5th ed, 2004
Residuos de aminoácidos en 11 lipasas mostrando la tríada catalítica, en el Hueco Oxianiónico (en cursiva) y el sitio de unión propuesto (cursiva).
Lipasa
Secuencia de consenso cercana de la Ser
nucleofila Gly-X-Ser-X-Gly
His catalítica Asp/Glu
Catalítico Hueco
Oxianiónico
CVL, PCL -Gly85-His86-Ser87-Gln88-
Gly89- -His285-Leu286- -Asp263- -Gly16-Leu17-
RML -Gly142-His143-Ser144-
Leu145-Gly146- -His257-Leu258- -Asp203- -Gly81-Ser82-
HLL-Gly144-His145-Ser146-
L 147 Gl 148-His258-Leu259- -Asp201- -Gly82-Ser83-HLL Leu147-Gly148- His258 Leu259 Asp201 Gly82 Ser83
PcamL -Gly143-His144-Ser145-
Leu146-Gly147- -His259-Ile260- -Asp199- -Gly83-Ser84-
ROL -Gly143-His144-Ser145-
Leu146-Gly147- -His257-Leu258- -Asp204- -Gly82-Thr83-
PPL -Gly150-His151-Ser152-
Leu153-Gly154- -His263-Leu264- -Asp176- -Gly76-Phe77-
CAL-B Thr103-Trp104-Ser105-
Gln106-Gly107- -His224-Ala225- -Asp187- -Gly39-Thr40-
CRL (lip1) -Gly207-Glu208-Ser209-
Ala210-Gly211- -His449-Ser450-c -Glu341- -Gly123-Gly124-
GCL (lip II) -Gly215-Glu216-Ser217-
Ala218-Gly219- -His463-Gly464- -Glu354- -Gly131-Ala132-
Asp
His
SerO
N NHH
O
O(Glu)
NH
HN
HN O
HN
HN
NH
O
OHN
O
O
O
Asp
His
SerO
C
R1
N N
O(Glu)
NH
HN
HN O
HN
HN
NH
O
OHN
O
O
O
O H
H
R2O O-
C O
R1
R2O INTERMEDIOTETRAÉDRICO #1
C OHO H2O
MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS LIPASAS
OO
Asp
His
SerO
C OR1
N NH
O
O(Glu)
NH
HN
HN O
HN
O
HN
NH
O
OHN
O
O
O
Asp
His
SerO
C
R1
N N
O(Glu)
NH
HN
HN O
HN
O
HN
NH
O
OHN
O
O
O
O H
H
HO O-
ENZIMA ACILADA
C O
R1
R2OC
R1 R2OH
OH
HINTERMEDIOTETRAÉDRICO #2
4
3. Tapadera:Elemento estructural diferenciador de las lipasas.Formada por una porción helicoidal anfipática.Se coloca sobre el centro activo de la enzima cuando está inactiva. Existen dos conformaciones:
Conformación cerrada o inactiva (medio acuoso)
Conformación abierta (en interfase o medio orgánico)Estructura 3D de la RML
Excepciones:Lipasas de Pseudomonas glumae, Pseudomonasaeruginosa y Candida antarctica B, fosfolipasaspancreáticas A2, y la cutinasa de Fusarium solanicarecen de tapadera.Lipasas pancreáticas de nutria y de cobaya:tapadera sin activación interfacial.Lipasa de Staphylococcus hycius: activacióninterfacial sólo con algunos sustratos.
Representación 3D de la lipasa de Candida rugosa (CRL)
Triada Catalítica:
Ser209, His449, Glu341
MH
O
L
.............His His.............O
M
H
L
His .............
LM
H
O His .............
LH
O
M
b. Permutación H/O c. Permutación M/L d. Permutación M/Ha. Esquema general
Modelo de reconocimiento de alcoholes primarios
Alcoholes primarios m
L
HHO
m
L
H OH
5
Reconocimiento de ácidos quirales
1. en forma de cueva (lipasas de Rhizomucor y Rhizopus).
Clasificación de las lipasas según la geometría del centro activo (Pleiss, Chem. Phys. Lipids, 1998, 93, 67):
A B C
RML: 18 Å de longitud, 4,5 Å deanchura en la base, y 6 Å en la superficiede la proteína. La parte donde se localizala tapadera tiene una altura de 12 Å, y al
otro lado tiene una altura de 8 Å
2. en forma de embudo (lipasas de Candida antarctica,Pseudomonas y páncreas de mamífero y cutinasa).
3. en forma de túnel (la lipasa de Candida rugosa).
Representación del centro activo de las lipasas de Rhizomucor miehei y Candidarugosa. (A) Orientación lateral donde los residuos se encuentran perpendiculares a lafigura y se indican por una línea continua; (B) Forma del centro activo desde una visiónfrontal; (C) Forma del centro activo visto desde arriba.
CRL: 22 Å de largo con un diámetro
de aproximadamente 4 Å.
Ser 144 (catalítica)Zona de reconocimiento del ácido de la RML
Zona de reconocimiento del ácido de la CRL Ser 209 (catalítica)
6
Phe296
Botta, Biochim. Biophys. Acta, 1997, 1337,
Phe296
Botta, Biochim. Biophys. Acta, 1997, 1337, 302. Manetti, Biochim. Biophys. Acta, 2000, 1543, 146.
Superposición de los centros de reconocimiento de los ácidos arilpropiónicos de las lipasas de RML y CRL
Phe296
Modelo cinético de resolución de una mezcla racémica
Relación de velocidades. Medida de la enantioseletividad
= E
7
Reacciones catalizadas por lipasas
TRANSESTERIFICACIÓN (ALCOHOLISIS)
ESTERIFICACIÓN
O O
R1
O
OHHOR2+
lipasa
R1
O
OR2
R1
O
OR2
lipasa, H2O
R1
O
OHHOR2+
HIDRÓLISIS DE ESTERES
SÍNTESIS DE AMIDAS
SÍNTESIS DE TIOESTERES
R1
O
OR2HSR3+
lipasa
R1
O
SR3HOR2+
R1
O
OR2H2NR3+
lipasa
R1
O
NHR3HOR2+
INTERESTERIFICACIÓN
ACIDOLISIS
( )
R1
O
OR2+ R3 OR4
Olipasa
+
O
OR4R1 R3
O
OR2
R1
O
OR2+ R3 OH
Olipasa
+
O
OR2R3 R1
O
OH
R1
O
OR2HOR3+
lipasa
R1
O
OR3HOR2+ SÍNTESIS DE PEROXIESTERES
R1
O
OR2HOOR3+
lipasa
R1
O
OOR3HOR2+
R1 OR2 1 3
Resolución cinética de compuestos quirales a través de una estrategía hidrolítica:
Resolución Cinética de racematos con lipasas
Hidrólisis de ésteres racémicos con el estereocentro en la zona del alcohol (sustratos tipo I).
R1
C
H
R2 O R3
Olipasa, H2O R1
C
H
R2 OH
R2
C
H
R3 O R3
O
+
Hidrólisis de ésteres racémicos con el estereocentro en el grupo ácido (sustratos tipo II).
R1
O
R3 lipasa, H2O R1 OHR2
CR CO
R3
Resolución cinética de compuestos quirales a través de transferencia de acilo.
C
H
R2 CO
OC
H
R2 COH
OC
H
R1 CO
+
R2
C
H
R1 OH
lipasaG R3
O
R2
C
H
R1 O R3
O R2
C
H
R1 OHdisolv.orgánico
R2
C
H
R1 COH
O
lipasa R3
disolv.orgánico
HO R2
C
H
R1 COH
O
R1
C
H
R1 CO
R3
O+
+
APLICACIONES
R1 R2
OH
lipasa deRh. miehei
Lipozyme IM20
disolvente orgánico+
R3
O
O
R4 R1 R2
OH
R1 R2
O+
R3
O
+HO
R4
O
4
(R,S)
R1= Ph-, Bn-, 1-naftil, 2-naftil.
R2= Me-, Et-, Pr-.
R3= Me-, Et-, Pr-, Ph-,
R4 H M
(S) (R)
R4R4= H-, Me-
I. E. De FuentesTesis Doctoral, UCM, 2002
Ph Me
OH
lipasa deRh. miehei
Lipozyme IM20
iPr2O+Me
O
O
H Ph Me
OH
Ph Me
O+
Me
O
(R,S) (S) (R)REACCIÓN TEST
A. R. Alcántara y colsChem. Phys. Lipids, 1998, 93, 169
8
FACTORES QUE DEBEN CONTROLARSE
R1
R2
OH
O
AW
1. VARIABLES CONTÍNUAS
DISOLVENTE(logP)
TEMPERATURA
RELACIÓNMOLAR
R3 NuAGITACIÓN
2. VARIABLES DISCRETAS
ESTRUCTURA DEL ALCOHOL, DEL DONADOR DEACILO, PUREZA DE LA PREPARACIÓN ENZIMÁTICA,NATURALEZA DEL SOPORTE
LIPASA DE LIPASA DE Candida rugosaCandida rugosa
MEZCLA DE ISOFORMAS. 7 GENESLotti y cols. Protein Eng., 7, 531-537, 1994.
Brocca y cols. Current. Genet., 28, 454-457, 1995.
CARACTERIZADAS: Lip1- Lip5 Lotti y Alberghina. Eng. of/with lipases. Ed. K. Academic. 1996.
Lipasa P.M. (Da) pI Puntos de glicosilación Secuencia N-terminal
Lip1 57223 4,5 291, 314, 351 APTA T LANGDTITGLNAI I NE
Lip2 57744 4,9 351 APTA T LANGDTITGLNAI V NE
Lip3 57291 5,1 291, 314, 351 APTA K LANGDTITGLNAI I NE
Lip4 57051 5,7 351 APTA T LANGDTITGLNAI I NE
Lip5 56957 5,5 314, 351 APTA T LANGDTITGLNAI I NE
ESTRUCTURA DE LA Lip1ESTRUCTURA DE LA Lip1
CERRADA ABIERTA
TAPADERA
9
INHIBICIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE INHIBICIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE LIPASAS POR EFECTO DEL GLICEROLLIPASAS POR EFECTO DEL GLICEROL
Candida rugosa:
del Río y cols. Biotechnology Letters, 12, 835-838. 1990
Candida rugosa: fermentación con aceite
de oliva
LIPASAS COMERCIALES LIPASAS COMERCIALES vsvs LIPASAS LIPASAS UNIV. AUTÓNOMA BARCELONAUNIV. AUTÓNOMA BARCELONA
IsoformasLipasa Procedencia
Inductor/ Fuentede Carbono Lip1 Lip2 Lip3
Sigma Comercial ¿? 73 ± 5 8 ± 1 19 ± 2
Roche Comercial ¿? 66 ± 5 13 ± 2 21 ± 2
UAB-II Fed-Batch Q baja Ácido Oleico --- 56 ± 5 44 ± 5
UAB-III Fed-batch Q baja Ácido Oleico --- 56 ± 5 44 ± 5
UAB-IV Fed-batch Q alta Ácido Oleico 33 ± 3 40 ± 4 27 ± 3
Dominguez de Maria et aCurrent Organic Chemistry : 10(10), :1053- :1066 ( 2006)
10
ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS SDSSDS--PAGEPAGE
kDa
88--
60--
1.- Comercial Sigma
2.- Comercial Roche
3.- Ácido Oleico (0,5 %)
4.- Aceite de oliva (0,2 %)
43--
1 2 3 4 5 6 7
4. Aceite de oliva (0,2 %)
5.- Aceite de girasol (0,2 %)
6.- 1-Dodecanol (0,2 %)
7.- Glicerol (0,2 %)
Intervalo: 57-62 kDa
Dominguez de Maria et aCurrent Organic Chemistry : 10(10), :1053- :1066 ( 2006)
ANÁLISIS DENSITOMÉTRICOANÁLISIS DENSITOMÉTRICO
0.80
1.00
0.80
1.00
Lipasa de Sigma Lipasa de Roche
Lip1 Lip1
Lip3
Peso Molecular (kDa)
0.00
0.20
0.40
0.60
Pro
porc
ión
(%)
60.1 58.4 53.3 48.6 45.9
Peso Molecular (kDa)
0.00
0.20
0.40
0.60
Pro
porc
ión
(%
)
60.1 58.4 53.3 48.6 45.9
Lip3 Lip3
Lip2Lip2
Dominguez de Maria et aCurrent Organic Chemistry : 10(10), :1053- :1066 ( 2006)
11
ArO
HN
OH
APLICACIÓN PRÁCTICALos beta-bloqueantes constituyen el grupo más importante dentro de los fármacos adrenérgicos.
utilizados en el tratamiento de: hipertensiónarritmiasangina de pechociertos tipos de ansiedad.
Una familia de estos compuestos, muy vendidos, presentan estructura de ariloxiamino-propanol,v.g.:Sumial, atenolol etc.
con un centro estereogénico, de forma que la actividad biológica en los tratamientos mencionadosreside fundamentalmente en el enantiómero S presentando el isómero R efectos secundariosindeseables en algunas ocasiones.
Dentro de este grupo de fármacos, el propranolol (1-isopropilamino-3(1-naftoxi)-2-propanol) se considera el compuesto de referencia. Se ha comprobado que la actividad beta-bloqueante de su isómero S es 100 veces superior a la del isómero R. Es más, el isómero R presentaun efecto secundario como contraceptivo masculino.
ArO
HN
OH
Ar nombre
propranolol
atenolol
Ar-OH
O
ClN
,1)
2) HCl (1h, 0-5ºC)Ar
O Cl
OH
2.- Resolución cinética de los racematos empleando
1.- Síntesis de los intermedios racémicos de estructura dehalohidrina.
METODOLOGÍA:
OBJETIVO:
Optimizar un proceso quimioenzimático de obtenciónde sintones quirales para obtener estos compuestosenantioméricamente puros.
NH
pindolol
O
oxprenolol
una lipasa
I. Borreguero.Tesis Doctoral, UCM, 1999.
ArO Cl
OHO R1
OR2
lipasadisolvente orgánico
ArO (R) Cl
OH
+
Ar = 1-naftilo,1a2-naftilo,1bo-tolilo, 1cp-tolilo, 1d
1
R-1
R1 = Me, Et, Pr, -CH2Cl, -(CH2)10CH3
R2 = H, Me
ArO
(S)Cl
O
O
R1
S-2
1.- Síntesis de los intermedios racémicos de estructura de halohidrina 1
Ar-OHO
Cl+Ar
O Cl
OH
ArO
O+
N
a
b
HCl (0 5ºC)HCl (0-5ºC)
Ar = 1-naftilo, t = 46 h, conversión > 99%, rendimiento > 90%Ar = 2-naftilo, t = 26 h, conversión > 99%, rendimiento > 90%Ar = o-tolilo, t = 72 h, conversión > 99%, rendimiento > 90%Ar = p-tolilo, t = 120 h, conversión > 99%, rendimiento > 90%
12
2.- Resolución cinética de los racematos de 1 empleando una lipasa
O Cl
OHO
O
lipasadisolv. orgánico
O(R)
Cl
OH+
1
O(S)
Cl
O
O
R1
S-2R-1
60
Conversion (%)
CONDICIONES ESTANDAR: SUSTRATO 1a,
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900Tiempo (h)
0
10
20
30
40
50
Lipozyme IM20
HLL
PPL
CAT. mg t (h) X (%)
Pto.13
ee1(%) Pto.1 ee3
(%) Eb EFc
HLL 106 547 30 S-(+) >99 R-(-) 32 >100 0.73
PPL 106 817 8 S-(+) 65 R-(-) 3 5 0.36
IM20 15 340 53 S-(+) >99 R-(-) 78 >100 0.71
AGENTE ACILANTE = ACETATO DE VINILO (R1 = Me, R2 = H), RELACIÓN MOLAR 1/3, DISOLVENTE = iso-OCTANO, T = 30ºC
O Cl
OHO
O
Lipozyme IM20isooctano
O(R)
Cl
OH+
1a
O(S)
Cl
O
O
S-2aR-1aT = 37ºC, t = 4 h
conversión = 55%, ee1 > 99%, E = 27
2.3.- Condiciones optimizadas
O(R)
Cl
OH
R-1aNH2
O(S)
HN
OH
PROPRANOLOL
Synthesis of nuleoside prodrugs
NH
N
N
O
NH2N
O
OHOH
HHHH
HO
CH3
NH
N
N
O
NH2N
O
OHOH
HHHH
O
CH3
O
H3C
Vinyl acetateCandida antarct ica lipase
99% yield
Anti-leukaemic produg- Glxaxo-SmithKline
Raso & Voss Appl.Ctatal. A: Chemical 221,145-158(2001)
13
Reacciones catalizadas por lipasas
TRANSESTERIFICACIÓN (ALCOHOLISIS)
ESTERIFICACIÓN
O O
R1
O
OHHOR2+
lipasa
R1
O
OR2
R1
O
OR2
lipasa, H2O
R1
O
OHHOR2+
HIDRÓLISIS DE ESTERES
SÍNTESIS DE AMIDAS
SÍNTESIS DE TIOESTERES
R1
O
OR2HSR3+
lipasa
R1
O
SR3HOR2+
R1
O
OR2H2NR3+
lipasa
R1
O
NHR3HOR2+
INTERESTERIFICACIÓN
ACIDOLISIS
( )
R1
O
OR2+ R3 OR4
Olipasa
+
O
OR4R1 R3
O
OR2
R1
O
OR2+ R3 OH
Olipasa
+
O
OR2R3 R1
O
OH
R1
O
OR2HOR3+
lipasa
R1
O
OR3HOR2+ SÍNTESIS DE PEROXIESTERES
R1
O
OR2HOOR3+
lipasa
R1
O
OOR3HOR2+
R1 OR2 1 3
Ejemplos de procesos estereoselectivos
K. Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, 5th ed, 2004
Proceso regioselectivo
14
15
Reconocimiento de alcoholes quirales
HO OH
OH
sn-glicerol
12
3
R1
O
O O
O
R3
O
R2
O
sn-Triglicérido
12
3
Regla de Kazlauskas(J. Org. Chem., 1991, 56, 2656)
Alcoholes secundarios
m
L
HO H
N
OH
N
O
FF
O
R'
RR
N N
O
O
R'OH
R R
F F
+
CALB-BR'COOR"
Organic solvent
CAL-B
10eq H2OOrg. solvent
(3R,4S) (3S,4R)
F
Chemoenzymatic synthesis of (-)Paroxetine (Serotonine reuptake inhibitor)
R= Cbz, Boc, AllocR’= Me R”= vinyl i-propenyl Et -N=C(CH3)2
E>100
N
O
H
O
O
(-) Paroxetine
R Me R vinyl,i propenyl, Et, N C(CH3)2
R’= Ph R”= vinyl
Gotor-Fernandez et al. J.Mol.Catal.B: Enzymatic 2006,40,111-120
N
N
N
O
OHN
Cl
N
N
N
O
ON
Cl
OO
R
ROH/CAL-B
spontaneous in situracemization
O
Cl OR
Chemoenzymatic synthesis of S (+) Zopliclone (hypnotic drug with similar pharmacological profile that benzodiazepines)
S- isomer is more active and less toxic than R- counterpart
N
N
N
O
ON
Cl
O
OR
N
N
N
O
ON
Cl
O
N
NCH3
S-(+)ZoplicloneN-methylpiperazine
30% yield, E>100
Gotor-Fernandez et al. J.Mol.Catal.B: Enzymatic 2006,40,111-120
16
N
NH2
N
NH2
+N
NH
N
NHcBZ
+
OCH3
1.- CAL-B, EtOAc
2- Cbz-Cl
(1R,2R) trans
(1S,2S) transTrans
Chemoenzymatic synthesis of the analgesic U-50,488
N-acylation catalyzed by lipases
N
NH
OCH2 Cl
Cl
U-50,488
Gonzalez-Sabin et al. Chem.Eur.J. 2004,10,5788-5794
17
Lipase-catalyzed aminolysis & ammonolysis
The process is equivalent to the esters hydrolysis/synthesis due to the nucleophilic characteristics of the nitrogen
Gotor-Fernandez Current Org. Chem. 10,1125-1143(2006)
Regioselective process
Lipase-catalyzed aminolysis & ammonolysis
Chemoselective process
Ammonolysis is performed in ammoniasaturated t BuOH
Regioselective processGotor-Fernandez .- Current Org. Chem. 10,1125-1143(2006)
18
Lipase-catalyzed aminolysis & ammonolysis: Resolution of chiral amines
Application to the synthesis of both enantiomers of Amphetamines
The synthesis is performed with ethyl acetate as acyl donor and as solvent
Gonzalez-Sabin et al. Tetrahedron Asymmetry 13,1315-1320 (2002)
Lipase-catalyzed aminolysis & ammonolysis: Resolution of chiral amines
Resolution of cis- & trans-2-phenylcyclopentaneamines(lactanamides).- hypoglycemis activity
Trans- antidepresant Gonzalez-sabin et al. Terahedron:Asymmetry 15,481-488(2004)
Kinetic resolution using 1-butyl-2,3-dimethylimidazolium trifluormethane sulphonateAnd CALB B.-Irinescu & Kato Tetrahedron Let.. 45,523-525(2004)
Gotor-Fernandez & Gotor Current Org. Chem. 10,1125-1143(2006)
Lipase-catalyzed aminolysis & ammonolysis: Resolution of diamines
Azamacrocycles
The synthesis involves two two biocatalytic steps.In both cases the enzyme shows a clear R-enantiopreferenceTherefore the R,R- stereomer is achieved with 98% e.e. and 30% total yield.
Gotor-Fernandez Current Org. Chem. 10,1125-1143(2006)
19
Lipase-catalyzed aminolysis & ammonolysis: Resolution of diamines
Sequential kinetic resolution mechanism of trans- cyclohexane-1,2-diamine
Gotor-Fernandez & Gotor Current Org. Chem. 10,1125-1143(2006)
Lipase-catalyzed aminolysis & ammonolysis: Resolution of diamines
Synthesis of key synthon for the preparation of 1S,2S- U-50,488. Analgesic
E= 170
Lipase-catalyzed aminolysis & ammonolysis: Resolution of aminoalcohols
Gotor-Fernandez & Gotor Current Org. Chem. 10,1125-1143(2006)
Due to the intrinsic activity of lipasesOH is better substrate than NH2
Therefore the reaction can only take placeafter chemical N-protection of amino group
20
RESOLUCIÓN DE ÉSTERES RACÉMICOS
RESOLUCIÓN DE AMINAS RACÉMICAS
(R,S)
lipasa
R o S
O
NHO
O
H2N
H
(R,S)
O
O
NH2
lipasa
NH2
H
CH3
H
R
N
O
CH3
H
REACCIÓN DEL BUTILCARBONATO DE VINILO CON LA p-CLORO-1-
FENILETILAMINA
Lipasa (%) Conv. a % ee b
CRL 28 90
NOV 435 34 99R
NH2
O O
O
R OCH ClNOV-435 34 99
SP523 0 n. d.
SP525 17 99
PS 0 n. d.
a Calculado por HPLC. b Determinado por 1H-RMN
LIPASA72h 25ºCHEXANO
R = OCH3, Cl
N
HR
O
21
22
KR OPTIMISATIONKR OPTIMISATIONCHANGING FROM VYNIL ACETATE TO VINYL BUTYRATE:Better work up (better separation) but the oposite enantiopreference was observed
TEMPERATURE EFFECTS:
Acyl donor T Conv. (%)
time (h)
eep(%) E
Vinyl acetate r. t. 50 30 >99 > 200
O
OHLipase
R O
O
+O
O
O
OH
+
O
R
THF
After 4 hours at50ºC there issome enzymedeactivation
64
Hoyos, P.; Hernandez, M.; Sinisterra, J. V.; Alcantara, A. R., Dynamic kinetic resolution of benzoins by lipase-metal combo catalysis. Journal of Organic Chemistry 2006, 71, (20), 7632-7637.
Vinyl butyrate r.t. 45 24 >99 > 200
Vinyl butyrate 37ºC 49 24 >99 > 200
Vinyl acetate 50ºC 49 4 >99 > 200
Vinyl butyrate 50ºC 50 4 >99 > 200
Best experimentalconditions.
LipaseLipase DynamicDynamic KineticKinetic ResolutionResolution??
Ar
OH
ArO
Ar
O
ArKINETIC RESOLUTION
Max. Theoretical yield = 50%DYNAMIC
??
65
Ar
(S)
O
Ar
O
Ar
(R)
OH
Ar
O
R
OO
100%
??
SHVO’S CATALYSTSHVO’S CATALYST
LipaseLipase DynamicDynamic KineticKinetic ResolutionResolution
Ru Ru
OCH
OCOC CO
Ph Ph
O
H
OPh
Ph
Ph
Ph
Ph Ph
It is widely described for DKR of alcohols
Pelliser Tetrahedron 2008,64,1563-1601
Persson et al. J.A.C.S. 1999, 121, 1645-1650
ActivationActivation
66
byby temperaturetemperature
Shvo et el. J.Am.Chem.Soc 1986,108,7400
23
O
OH
+
KR OO
O
OH
O
O
O
60
70
80
90
100
)
60
70
80
90
(mM
)
step 2
step 1
step 3
SequentialSequential DynamicDynamic KineticKinetic ResolutionResolution1. Vinyl butyrate evaporation2. Add: thrifluoroethyl butyrate
Shvo’s catalystLipase
New enzyme addition
C i 92%DKR
O
O
O
OCF3
O
0 6 12 18 24 30 36 42
t (h)
0
10
20
30
40
50
60(
0
10
20
30
40
50
Co
nce
ntr
atio
n (
68
Hoyos, et al. Journal of Organic Chemistry 2006, 71, (20), 7632-7637.
Conversion 92%eep > 99%t = 48h
24
De castro et al. Tetrahedron: Asymmetry 1997,8, pp 857-8
HIDRÓLISIS DE DIHIDROPIRIDINAS PROQUIRALES EMPLEANDO LA LIPASA B DE C.
antarctica
8 X = H, Z = H9 X = H, Z = NO220 X = CH2OCH3, Z = H21 X = CH2OCH3, Z = NO
C. antarctica
N
O O
O OO
HO
X
Z
N
Z
O O
O O
OO
OO
XR
Z = H, NO2
Producto T (ºC) t (h) %PP a % PF b [] ee% c Configuración d
20 4 26 15 21 -26,25 54 R
20 23 3,75 10 45 -17,1 80 R
8 23 5,5 60 30 -24,21 86 R
8 23 11,5 46 16 -12,35 60 R
21 23 3,75 34 25 -5,37 50 R
9 23 10,5 6 19 -5,53 90 R
a Producto de partida aislado. b Monoéster aislado por cromatografía. c exceso enantioméricodel monoéster aislado. d Configuración del monoéster mayoritario