Manipulación y determinación de estructuras de proteínas.
Curso de Bioquímica 2002
Dr. Enrique Rudiño-Piñera
7606 Factores de estructura1359 Archivos con restricciones de RMN8965
¿COMO DETECTAR LA POSICIÓN DE CADA ÁTOMO?
Necesitamos medir una señal que detecte la posición de cada átomo individual (que interaccione con cada átomo)
debemos procesar la señal de la proteína completa y conseguir individualizar a partir de ella la posición de cada átomo
debemos tener una señal de suficiente intensidad para poder descifrarla y encontrar los detalles suficientes para lograr determinar la estructura
MÉTODOS DE DETERMINACIÓNCristalografía Resonancia magnética nuclear
Necesidad de obtener cristales
para eso se necesita una preparación extremadamente pura y conformacionalmente homogénea
posibilidad de resolución atómica
Estructura en solución
menor cantidad de macromolécula
se interpretan los datos a partir de las posibles conformaciones (menos datos = mayor incertidumbre en los resultados)
Difracción de
Rayos X
Mapa inicialA
just
es a
utom
átic
os
Aju
stes
man
uale
s
Modelo final
d
ONDAS ATRAVEZANDO UNA VENTANA
/d<<1
DIFRACCIÓN DE ONDAS
d
/d>>1
LA FUENTE
RöntgenStrahlen
1895-Wilhem Röntgen tiene 50 años y es profesor de física, director del Instituto de Física y Rector de la Universidad de
Würtzburg.
*Experimenta en Rayos Catódicos, obtiene una donación de untubo de rayos catódicos de Lenard.*Su proyecto era: Encontrar radiaciones de alta frecuencia generadas junto a los rayos catódicos y predichas por von Helmholtz
Platinocianurode Bario
+1metro
Cómo se generan los rayos X:
ánodos rotatorios y sincrotrones
Espejos de rayos X
Ánodo rotatorio
Sincrotrón
EL OBJETO
AceiteSemipermeable
Proteína 2LPrecipitante 2L
H2O
Un cristal se define por sus características físicas:a: Piezoelectricidadb: Cohesiónc: Difracción, etc.
Reloj de Cuarzo Lápiz Diamante
El orden a pequeña distancia induce orden a larga distancia
¿Que pasa si cortas un cristal (en direcciones de cribado) ycada nuevo corte lo vez en el microscopio?
1X 5X 20X nX
Celda Unitaria
3 magnitudes3 ángulos
ABC
Red 3D
Nomenclatura simétrica
1AOL Triptasa
GrupoEspacial
P41
1AOL Triptasa
GrupoEspacial
P41
4/4
3/4
2/4
1/4
0
¡MOMENTO LO ESTOY CARGANDO!
a) one object d) two columns of objects, each as a)b) two objects, each as a) e) a two-dimensional lattice of objects, each as a)
c) four objects, each as a) f) as e), with larger separation between objects
Los cristales, después de
crecidos, deben colocarse en el has de rayos X
sin que se deterioren durante la medición
Los detalles del mapa de densidad,
que permiten ubicar cada átomo en su posición, son
el resultado de medidas de alta
resolución
RESOLUCION
Resolución: Varia
Todos los mapas se calcularon con contornos a 1.
Aquí los datos son todos a 1.65 Å de resolución, pero los valores de
cambian de la siguiente manera:0.7 - 1.0 - 1.3 -1.6 y 2.1
0.7 1.0 1.3
1.6 2.1
¿Qu₫ se sabe de los Rayos X de 1895 a 1912?
1. Se pueden polarizar.2. Existen los rayos X característicos.3.Según varios investigadores su esta entre 0.5 y 1.9A.4.Hay división entre: ¿onda o partícula?
Caf₫, Esquí, Físicos, Estudiantes de doctorado y Ocio
Difracción de rayos X
Universidad de MunichLab. de Röntgen Inst. de Física Teorica Inst. de Mineralogia
Est. Dr. Paul Knipping
Director SommerfeldInv. Max von Laue
Asociado W. FriedrichEst. Dr. Paul Ewald
Inv. P. von Groth
1. Laue discute con Ewald sobre la tesis de este último, Laueesta escribiendo un capitulo sobre ondas electromagn₫ticas para
la enciclopedia que edita Sommerfeld.2. Laue y Sommerfeld esquiando en los Alpes la vibración t₫rmicade los átomos produciría una red muy desordenada para difractar
los rayos X3. Laue, Sommerfeld, Knipping, Friedrich y von Groth en el caf₫
Lutz de Munich.
Placa Cristal Sulf. de Cobre
1er experimento Fte. Rayos X
Sulf. de Cobre2do experimento Fte. Rayos X
Cristal
Conclusiones:1. Los Rayos X tienen 1000 veces menor que la luz visible.
2. Los cristales son redes tridimensionales regulares.3. Laue explica el fenómeno derivando la difracción de 1D a 3D.
LaueRecibe el Nobel de Física de 1914,
lo recibe en 1920.
2
¿Pueden los rayos X ser reflejados por los planos atómicos del cristal?
d
d
= 2d sen
Sigue la analogía de la luz blanca sobre un espejo.
Pero podía medir , pero no conocía ni ni d!
1. Difractó cristales de NaCl, KCl, KBr y KI2. Uso el modelo de Pope y Barlow3. Midió la densidad del cristal de NaCl
= m/v ; v=m4. Ahora conocía el V de la celda Unitaria
si
en una celda cubica (d/)3 = V/3 entonces: d = V 1/3
y
Concluyo que = 1.10 A y que la distancia Na….Cl es 2.8A
= 2d sen
= 2V 1/3 sen
¿Pero con que detector midió la difracción?
….paralelamente su padre invento el espectrómetrode ionización!!!!, y probo que la energía de los rayos X era
igual a la de los electrones usados en el tubo de rayos catódicos.
Juntos:1. analizaron los espectros de los rayos X generados por:Pt, Os, Ir, Pd, Rh, Cu, Ni, etc.2. Resolvieron la estructura de la fluorita (CaF2), la blenda(ZnS), la pirita (FeS2) y el Diamante (Cn).3. Prueban que los trabajos teóricos de Barlow y Fedorov sonreales.4. Reciben el premio Nobel de física en 1915.
“La materia está constituida de partículas indivisibles denominadas átomos que pertenecen a un número finito de clases
distintas. En la realidad, solo existen los átomos y el vacío, lo demás es convención
1912-19501916- Debye y Scherrer descubren el m₫todo de polvos.1928-Kathleen Lonsdale resuelva la estructura del hexametilbenceno,Kekule descansa en paz.1934- Linus Pauling escribe “El enlace Químico.
…..y las macromoleculas? 1920-1 as evidencias de que las proteínascristalizan.
1949-Karle y Hauptman inventan los metodos directos (Nobel 1985).1950Žs-Perutz y Kendrew: Hemoglobina -Watson, Wilkins y Crick: ADN
Macromol₫cula Pura
Cristalizarla
Difractar
Determinar distancia entre planos
Calcular la celda
Encontrar el grupo espacial(Fedorow, Barlow y Schonflies)
Encontrar la fase(Metodos directos, MIR, MR, MAD) Construir un modelo
Ajustar el modelo
Pensar, pensar y pensar
Resultado cristalográfico
Cómo traducirlo en
términos biológicos