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PRACTICA No. 1

TEORIA DE LA GENERACION ESPONTANEA

OBJETIVO:

El alumno ser capaz de comprender la teora de la generacin espontnea, as

como el proceso por el cul los microorganismos se originan de materiales inertes.

INTRODUCCIN. Pueden los microorganismos originarse a partir de materiales inertes o lo

hacen a partir de microorganismos preexistentes?. En esta prctica tendr usted la

oportunidad de explorar por si mismo el problema.

MARCO TEORICO.

El origen de la vida

El origen de la vida ha tenido en todas las civilizaciones una explicacin cuyo

denominador comn era la intervencin divina. La ciencia, sin embargo, ante esta

gran pregunta necesitaba buscar causas, reglas o mecanismos que dieran a ese

hecho una justificacin constatable.

La generacin espontnea de la vida fue una teora autorizada y desautorizada

consecutivamente en varias ocasiones entre 1668 y 1862, ao ste ltimo en que

se disip la incgnita. En 1668 el mdico italiano Francesco Redi demostr que las

larvas de mosca de las carnes en descomposicin se producan a causa de

puestas previas, y no espontneamente por la propia carne. La generacin

espontnea quedaba en parte desautorizada (no exenta de polmica) a pesar del

arraigo que esa teora tena en la historia de la biologa. 1

La polmica sobre la generacin espontnea se aviv an ms cuando en 1677

Antoni Van Leeuwenhoek, un fabricante de microscopios y pionero en

descubrimientos sobre los protozoos, desautoriz de nuevo la antigua teora

cuando experiment sobre microorganismos slo visibles al microscopio, ante la

aparente constatacin de que estos seres aparecan espontneamente en los

alimentos en descomposicin. Demostr que las pulgas y gorgojos no surgan

espontneamente a partir de granos de trigo y avena, sino que se desarrollaban a

partir de diminutos huevos.1,2,3

Tuvieron que transcurrir cien aos para que en 1768 el fisilogo italiano Lazzaro

Spallanzani (fundador de la biologa experimental) demostrase la inexistencia de

generacin espontnea. Hirviendo un caldo que contena microorganismos en un

recipiente de vidrio, y cerrndolo despus hermticamente para evitar la entrada

de aire, el lquido se mantuvo claro y estril. Los inmovilistas de esa poca no

dieron validez al experimento, a pesar de su rotundidad, y expusieron como

argumento que se haba alterado el aire del interior del recipiente por efecto del

calor, eliminando los principios creadores de la vida.

El problema segua sin resolverse definitivamente en la segunda mitad del siglo

XIX, hasta que el bilogo francs Louis Pasteur se propuso emprender una serie

de experimentos para solventar la cuestin de la procedencia de esos

microorganismos que, en apariencia, se generaban espontneamente. En 1862

Pasteur lleg a la conclusin de que los grmenes penetraban en las sustancias

procedentes de su entorno. Ese descubrimiento dio lugar a un debate feroz con el

bilogo francs Flix Pouchet, y ms tarde con el respetado bacterilogo ingls

Henry Bastion; ste ltimo mantena que la generacin espontnea poda darse en

condiciones apropiadas. Una comisin de la Academia de Ciencias acept

oficialmente en 1864 los resultados de Pasteur, a pesar de ello los debates

duraron hasta bien entrada la dcada de 1870.

En la actualidad, la base de referencia de la teora evolutiva del origen de la vida

se debe al bioqumico sovitico Alexandr Ivnovich Oparin, aunque el britnico

John Burdon Sanderson Haldane sostuvo una idea similar. Oparin postul en 1924

que las molculas orgnicas haban podido evolucionar reunindose para formar

sistemas que fueron hacindose cada vez ms complejos, quedando sometidos a

las leyes de la evolucin. Segn esta teora, los ocanos contenan en sus

orgenes gran cantidad de compuestos orgnicos disueltos. En un proceso que

requiri mucho tiempo, esas molculas se fueron agrupando en otras mayores y

stas a su vez en complejos temporales. 2

Alguno de esos complejos se convirti en un protobionte tras adquirir una serie de

propiedades, por las cuales poda aislarse e introducir en su interior ciertas

molculas que le rodeaban y liberar otras. Las funciones metablicas, la

reproduccin y el crecimiento habran aparecido despus de que el protobionte

adquiriera la capacidad de absorber e incorporar las molculas a su estructura,

para finalmente conseguir separar porciones de s mismo con iguales

caractersticas.

La teora de Oparin fue experimentada con validez por Stanley Miller en 1953,

como parte de su tesis doctoral dirigida por H. Urey; consiguiendo obtener

compuestos orgnicos complejos despus de reproducir las condiciones primitivas

del planeta en un aparato diseado al efecto.

Miller cre un dispositivo, en el cual la mezcla de gases que imitan la atmsfera

primitiva, es sometida a la accin de descargas elctricas, dentro de un circuito

cerrado en el que herva agua y se condensaba repetidas veces. Se producan as

molculas orgnicas sencillas, y a partir de ellas otras ms complejas, como

aminocidos, cidos orgnicos y nucletidos.

Se abri as camino a la obtencin de numerosas molculas orgnicas. En

condiciones de laboratorio se han conseguido sintetizar azcares, glicerina,

aminocidos, polipptidos, cidos grasos, o porfirinas que es la base de la clorofila

y hemoglobina, etc.

Una condicin indispensable para la evolucin de la vida a partir de materia

orgnica no viva, era la existencia de una atmsfera terrestre carente de oxgeno

libre. En opinin de Haldane, que sostena esa idea, durante el proceso

biogentico los compuestos orgnicos no podran ser estables en una atmsfera

oxidante (con O2); seran los organismos fotosintticos los que posteriormente

produciran el O2 atmosfrico actual.1,2,5,3

En resumen, la vida surgi en unas condiciones ambientales muy distintas a las

actuales, las de la Tierra primitiva, a partir de molculas orgnicas que no

competan con ningn otro organismo vivo. Mediante la intervencin de la

seleccin natural se habran ido diversificando hasta los actuales organismos. 2,5

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO

8 matraces de 250 ml.

600 ml de caldo nutritivo

Tubo de vidrio recto de 8 a 10 cm. De largo

Tubo de vidrio en forma de S, de 18 a 20 cm de largo

Parafina o cera para sellar

Algodn

Tapn de goma para un matraz

Papel aluminio

Cuerda o hilo

METODOLOGA

Vierta 75 ml de caldo en cada uno de los matraces:

Matraz 1: Tpelo con algodn. No lo caliente.

Matraz 2: Tpelo con algodn. Calintelo suavemente en un bao de agua

hirviendo Durante 10 minutos.

Matraz 3: Calintelo suavemente en bao de agua hirviendo durante 10 minutos y

djelo Destapado.

Matraz 4: calintelo suavemente en bao de agua hirviendo durante 10 minutos.

Despus de Calentado tpelo con un tapn. Selle el tapn al vidrio con cera o

parafina.

Matraz 5: Colquelo en la olla de presin o en el autoclave durante 15 minutos a

una Presin de 15 libras. Deje el matraz destapado.

Matraz 6: Tpelo con algodn. Cubra el tapn de algodn y el cuello del matraz

con una o Dos capas de papel aluminio. Amrrelo fuertemente. Colquelo en la

olla de Presin o en el autoclave como hizo con el matraz 5.

Matraz 7: Tpelo con algodn a travs del cual se ha insertado un tubo de vidrio

recto. Colquelo en la olla de presin o en el autoclave como hizo con el anterior.

Matraz 8: Tpelo con algodn a travs del cual se ha insertado el tubo de vidrio en

forma de S . Colquelo en la olla de presin o en el autoclave igual que los

anteriores.

Coloque los matraces en una mesa de trabajo (evite la luz directa del sol).

Observe los cambios en los matraces, al principio diariamente y despus cada

semana. Anote sus observaciones. Cuando aparezcan cambios en los matraces,

haga una preparacin hmeda de una gota de caldo y obsrvela al microscopio

con el objetivo de mayor aumento. Si tiene dificultades para observar prepare un

frotis coloreado con azul de metileno y use el objetivo de inmersin. Pida

instrucciones a su profesor.

Prepare un cuadro que muestre los datos de observacin y lo que ha sucedido en

cada matraz.

RESULTADOS

Realizar un cuadro que muestre los datos de observacin y lo que ha sucedido en

cada matraz.

CUESTIONARIO

1.- Con base en las observaciones realizadas en los matraces Cules son sus

conclusiones sobre el origen y fuente de los microorganismos.

2.- Que aplicaciones prcticas sugiere este experimento?

REFERENCIAS

1.- Carlos M. Barzizza 1949.Microbiologa.

2.- Bowen W. S. 1963. Microbiologa General y aplicada.. Editorial salvat.

3.- Burdon K.L. 1971. Microbiologa editorial Impresora Publi-mex.

4.- Seeley H.W. 1973. Microbios en accin. Manual de laboratorio para

microbiologa. Edit. Blume S.A.

5.- Palieroni N.J. 1970. Principios generales de microbiologa. Edit. Sec. Gral. De los estado Americanos.

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PRCTICA No. 2

DIFERENCIACION DE CLULAS PROCARIOTES Y EUCARIOTES

OBJETIVO

Observar e identificar microscpicamente las diferencias que existen dentro de los

cuerpos celulares procariote y eucariote.

INTRODUCCIN

En la naturaleza existen dos tipos de clulas, una de ellas ha recibido el nombre de

procaritica (del griego antes del ncleo), la otra evolucion de la clula procaritica y en

la actualidad, se encuentra en protistas, vegetales, hongos y animales, esta recibe el

nombre de eucaritica (ncleo verdadero)

La diferencia marcada entre estas dos clulas consiste en que la clula eucaritica posee

material gentico dentro de una estructura limitada por una membrana nuclear y

normalmente otros organelos, mientras que el material gentico de las procaritas no est

dentro de una membrana.

MARCO TEORICO

La mayora de los sistemas biolgicos estn formados por unidades llamadas clulas.

Cada clula es una entidad viva completa; la biounidad ms pequea capaz de

mantener una existencia independiente. Este concepto (una de las doctrinas bsicas

unificadoras de la biologa) fue elaborado por Schleiden y Schwan en 1839, ms de 150

aos despus del primer reconocimiento evidente de la naturaleza celular de las plantas

superiores por Robert Hooke. La nica excepcin a este conceptos son los virus, que no

tienen capacidad de vida independiente, debido en gran parte a su lapso de vida, pues

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deben asociarse y vivir dentro de las clulas a fin de reproducirse, as que no son, en el

sentido ms amplio, verdaderos organismos vivos.1

Las clulas de los organismos ms simples son capaces de realizar todas las actividades

especficas. Necesitan, por lo tanto, de la capacidad para comunicarse unas con otras, de

manera que las actividades de grupos de clulas especializadas puedan coordinarse y los

productos de un proceso metablico de un grupo de ellas puedan transferirse a otro grupo

para promover el metabolismo. Cada una de las clulas de un organismo multicelular

porta inicialmente, y quiz por toda su vida, la totalidad de la informacin inmediatamente,

por lo tanto, la clula debe tener algn sistema de seleccin y ciertas instrucciones

externas que la habiliten para seleccionar la informacin apropiada.2

Es evidente que el organismo influye sobre el patrn de desarrollo de las clulas

individuales o, en otras palabras, el comportamiento de una de ellas es influenciado por

las otras. Para comprender el comportamiento de un organismo, deben conocerse

ntimamente los detalles del comportamiento y capacidades de las clulas que no

constituyen. Inversamente, el estudio de las actividades y reacciones de una sola clula o

de sus partes es una pretensin estril, a menos que se la estudie en la perspectiva de

todo el organismo del que es una parte y el cual controla y dirige su comportamiento y

desarrollo.3

Las clulas y los organismos formados por ellas, pueden dividirse en dos tipos; las

procariticas (pro, antes y karyotic, que posee ncleo; por lo tanto, clulas que carecen de

ncleo organizado o membrana nuclear) y las eucariticas (eu, bueno; por lo tanto,

clulas que poseen un ncleo bien definido separado del citoplasma por una membrana).

Las bacterias y las algas verde azules son procariticas, son pequeas, cercanas a 1

micra de dimetro y muestran comparativamente escasa organizacin estructural. Las

clulas eucarticas son por lo regular mucho ms grandes (10-100 micras o mayores) y

poseen una compleja estructura interna, inclusive numerosos organelos de funcin

especfica. Aunque las clulas pueden llegar a ser ms y ms complejas con el transcurso

del tiempo, es probable que sean tan simples y sencillas como la complejidad de su

comportamiento lo requiera. Los sistemas biolgicos tienden a menudo a seguir el

principio de la navaja de Occam: la manera ms simple y directa de hacer algo es la

ms idnea. Las formas costosas (en trminos de energa y materia) y complicadas de

hacer las cosas, no tienen la probabilidad de sobrevivir a la evolucin como las ms

simples, para el mismo fin. Este razonamiento (realmente no merece ser calificado de

principio) ha sido til en el estudio y compensin de los complejos sistemas de control

intracelular e intercelular de organismos pluricelulares.1,3

La clula es la unidad morfolgica ms pequea todava capaz de vida independiente,

que aparece como organismo autnomo en los seres monocelulares. En los metazoos

forma grandes agregados y es un organismo elemental o un componente en el marco de

la estructura superior.2

La expresin La expresin clula se encuentra por primera en Robert Hooke quien en

1667 describi cells, little boxes en tapones de botellas. Originariamente, pues, el trmino

significa estructuras que encierran un hueco. Con el transcurso del tiempo el concepto

cambia hasta adquirir importancia el contenido.3

La doctrina celular surgida en la segunda mitad del siglo pasado fue extraordinariamente

fructfera. Virchow formul en 1855 el axioma ovnis cellula e cellula; el concepto de

generacin primaria hubo, pues, de ser definitivamente abandonado. Alrededor de 1875,

Strasburger, Btschli y Flemming descubrieron la divisin nuclear: se haba dado el primer

paso hacia la comprensin de la divisin celular hereditariamente idntica.1

La morfologa, la fisiologa y la patologa dirigieron su atencin hacia la clula.

Adems del ncleo, la clula contiene otras varias formaciones ms pequeas: los

organelos celulares. Estas partculas slo ayuden participar en la formacin de

estructuras biolgicas mayores dentro de una clula o por mediacin de una clula, en la

que son englobada en un organismo dotado de las propiedades de la vida. La clula es

capaz de multiplicacin ( capaz, pues, de desarrollo a travs de mutaciones), es irritable (

muestra recepcin de estmulos y respuesta a los mismos), tiene que mantener su

estructura de acuerdo con el segundo principio de la termodinmica (entropa) con el

auxilio de un metabolismo. En la clula y en la totalidad del organismo, los procesos

fisicoqumicos estn ordenados de tal manera que sirven para la conservacin de estas

propiedades. A travs del metabolismo la clula se halla en relacin con un intercambio

mayor de materiales. Representa un sistema abierto un equilibrio fluido. La clula

contiene el principio del acoplamiento de reaccin que se autorregula.2,3

La clula a secas no existe. Aparece siempre en una determinada figura, diferenciacin,

determinacin. Ninguna clula muestra simultneamente todas las diferenciaciones

posibles. No obstante, casi todas las clulas tienen en comn algunas formaciones: los

organelos celulares. 1

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPO

Microscopio de contraste de fase o campo claro.

Puente de tincin.

Pipeta Pasteur.

Asa bacteriolgica.

Mechero Bunsen.

Porta objetos.

Cubreobjetos.

Cristal violeta.

Lugol.

Alcohol-acetona.

Safranina.

Muestra de cebolla blanca, morada y Cambray

Cepa bacteriana pura.

Agua corriente y destilada

Lanceta estril

Agua encharcada

Torundas con alcohol

Azul de metileno

Bistur con navaja

Pinza de diseccin sin dientes

Aguja de diseccin

Orina

Aceite de inmersin

METODOLOGA

1. Colocar en el porta objetos una capa delgada de los diferentes tipos de cebolla

2. Encima de ellas ponerles cubre objetos.

3. Observar al microscopio con los objetivos 10, 40x y 100x, describir lo observado y

dibujar. Posteriormente, agregar una gota de azul de metileno a las muestras y

observar a 100x.

4. En otro porta objetos, realizar un frotis con una gota de sangre obtenida de la puncin

del dedo pulgar (de la mano contraria a la que utiliza para escribir), con la lanceta

estril. Observar a 10x, 40x y 100x. Y luego agregar azul de metileno a la muestra y

nuevamente observar a 100x.

5. En otro porta objetos realizar un frotis con el inculo bacteriano puro y una gota de

agua estril.

6. Fijar la muestra con la flama del mechero, evitando quemar la misma

7. Enseguida se procede a realizar la tincin de Gram, la cual nos servir para la

diferenciacin celular microscpica de la cepa pura:

Tcnica de tincin de Gram (modificada por Hucker)

1. Coloque el frotis en el puente de coloracin.

2. Cubra el frotis con cristal violeta y djelo actuar durante 1 min. Escurra el colorante y

lave con un chorro suave de agua corriente.

3. Cubra el frotis con lugol y deje actuar durante 1 min. Escurra y lave con agua.

4. Decolore con alcohol-acetona de 5 a 30 seg. Y lave con agua corriente.

5. Cubra el frotis con safranina y deje actuar durante 1 min. Escurra y lave con agua

corriente.

6. Deje secar al aire.

7. Repita el proceso anterior con cada uno de los frotis.

8. Observe las preparaciones en el microscopio con el objetivo de inmersin.

9. Realice esquemas a colores de cada una de las preparaciones observadas al

microscopio.

8. En otro porta objetos realizar un frotis sanguneo y observar al microscopio

9. En otro porta objetos colocar una gota de orina y observar al microscopio

10. En otro porta objetos colocar una gota de agua encharcada y observar al microscopio.

RESULTADOS Y CONCLUSIONES

Se observarn diferencias considerables con respecto a las clulas trabajadas.

CUESTIONARIO:

1. Esquematice la estructura de la clula procariote y mencione las funciones de la

misma.

2. Esquematice la estructura de la clula eucariote y mencione las funciones de la

misma.

3. Mencione las diferencias entre ambas clulas.

REFERENCIAS

1. AUDESIRK, T. Y GERALD, A. Biologa, la vida en la tierra.4 ed. Mxico. Prentice

Hall. 1996

2. VILLE, C.A. et al., Biologa. 2 ed. Mxico. Interamericana McGraw-Hill. 1992

3. BROCK, T. D. y SMITH, O. W. Microbiologa. Mxico. Prentice-Hall

Hispanoamericana.1987

UTS PRCTICA No. 3

FISOLOGA DE PROTOZOARIOS DE VIDA LIBRE

OBJETIVO:

El alumno ser capaz de conocer la fisiologa que llevan a cabo las distintas

formas de protozoarios.

INTRODUCCIN

La mayora de los protozoarios, tanto de vida libre como parsita, se parecen

claramente a los animales en sus hbitos alimenticios, ingieren partculas slidas,

las ingieren y luego las expulsan al exterior. Cuando las amibas o los Paramecium

se desarrollan junto con bacterias en el cultivo de laboratorio, estos se alimentan

de las mismas bacterias. Sin embargo, los organismos parsitos de la clase

Sporozoa se nutren por adsorcin directa de materiales alimenticios solubles a

travs de sus paredes celulares.

A pesar de sus necesidades fisiolgicas especializadas, muchos protozoarios

incluyendo variedades patgenas, pueden crecer en tubos de ensayo en el

laboratorio, en medios enriquecidos con sangre y otras sustancias proticas

complejas, semejantes a las mezclas utilizadas para el cultivo de bacterias

patgenas.

MARCO TERICO El reino protoctista abarca una gran cantidad de organismos eucariticos, cuya

diversidad los hace difciles de caracterizar. Los protistlogos calculan que hay

cerca de 200 000 especies de protistas entre extintas y existentes. Estos

organismos comparten su principal caracterstica con los animales, plantas y

hongos: la estructura celular eucaritica.las clulas eucariticas poseen ncleos

verdaderos y otros organelos delimitados por membrana, como mitocondrias y

plstidos. Su ncleo se divide por meiosis y mitosis, aunque estos procesos

presentan variaciones. Sin embargo, dicha caracterstica hace que la separacin

entre los protistas y el reino monera sea bastante clara. Dentro de este reino, el

tamao de los organismos vara de protozoarios unicelulares a quelpos, algas

cafs gigantes, que pueden alcanzar una longitud hasta de 60 m. Casi todos los

protistas son organismos unicelulares microscpicos. Sin embargo, algunos

poseen una organizacin colonial; otros son cenocticos (multinuclaeados, pero no

multicelulares). Y otros multicelulares. Casi todos los protistas multicelulares

poseen una forma corporal simple, sin tejidos especializados.

La palabra protista se deriva del griego que significa el primero. Los protistas

unicelulares realizan todas las funciones en una clula. Por ej. La regulacin de

agua con frecuencia es controlada por organelos especficos, llamados vacuolas

contrctiles.

Muchos protistas son de vida libre, en tanto que otros forman sociedades

simbiticas con otros organismos. Tales asociaciones van desde el mutualismo,

donde ambos miembros se benefician, hasta el parasitismo, siendo algunos

protistas importantes patgenos de plantas y animales.

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO

Microscopio

Portaobjetos y cubreobjetos

Goteros

Tubo capilar pipeta Pasteur

Tubo de ensayo

Balanza granataria

Agua destilada

Parrilla

Cultivo de Paramecium

Levadura de pan

cido actico

Lugol

Rojo congo

Solucin de metilcelulosa o gelatina

Probeta de 50 ml

METODOLOGA

1. En un tubo de ensayo colocar un gramo de levadura de pan y disolverla en

50 ml de agua destilada.

2. Hervir durante 5 min. esta mezcla.

3. Aadir 0.1 gr de rojo congo, seguir calentando a fuego lento sin hervir

durante 8 min. (no quemar la levadura). Por ltimo deje enfriar la mezcla.

4. En un portaobjetos, adicionar una gota de gelatina o metilcelulosa y una

gota de cultivo que contenga gran cantidad de Paramecium.

5. Adicionar en uno de los extremos de la gota de cultivo, otra de la

suspensin de levadura.

6. Coloque con cuidado un cubreobjetos, observe al microscopio reduciendo y

abriendo el diafragma hasta observar las vacuolas contrctiles.

7. En un portaobjetos, adicionar una gota del cultivo de Paramecium y con

ayuda de un capilar o pipeta Pasteur, colocar cido actico diluido.

8. Observar inmediatamente al microscopio a seco fuerte y anote lo que

sucedi.

9. Repetir el paso anterior, sustituyendo el cido actico por lugol.

RESULTADOS

Se esperan diferentes reacciones al colocarle al cultivo de Paramecium tanto el

lugol como el cido actico.

CUESTIONARIO

1. Qu color tienen las clulas de levadura?

2. mencione, por cul organelo entran las clulas de levadura al

Paramecium? (ingestin)

3. realice un esquema en el que indiquela posicin de las vacuolas contrtiles

en el Paramecium.

4. Explique la funcin de las vacuolas contrctiles.

REFERENCIAS

1. BROCK, T. D. y SMITH, O. W. Microbiologa. Mxico. Prentice may.

Hispanoamericana. 1997

2. CARPENTER, P. L. Microbiologa. Mxico. Interamericana. 1985.

3. VILLE, C. A. ET AL., Biologa 2. Mxico Interamericana. Mc GrAW-Hill.

1992

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PRCTICA No. 4

EFECTO DE LA PRESIN OSMTICA EN LA GERMINACIN

OBJETIVO

El alumno ser capaz de observar el efecto que tienen diferentes presiones osmticas

sobre la germinacin de la semilla, en diversas soluciones.

INTRODUCCIN

El paso de las molculas al interior de las clulas est regida por la permeabilidad de las

membranas, siguiendo las leyes de difusin en algunos compuestos, cuando las

molculas no penetran por difusin lo hacen por smosis.

La presin osmtica es la fuerza que se requiere para equilibrar la tendencia del agua a

moverse desde una solucin con una concentracin ms alta de molculas libres de agua;

hacia una ms baja.

MARCO TEORICO

La presin osmtica es la propiedad coligativa ms importante por sus aplicaciones

biolgicas, como son medios lquidos del organismo (sangre, lquidos intersticiales e

intracelulares) que en conjunto constituyen lo que se ha llamado medio interno. El medio

interno se considera dividido en compartimentos que contienen disoluciones diferentes,

separadas por membranas de propiedades caractersticas, cuyo estudio fisiolgico

requiere un conocimientos fisicoqumico preciso de la presin osmtica as como de

difusin y smosis.

La difusin es un proceso por el cual las molculas de un gas, un lquido o un slido,

tienden a alcanzar una distribucin homognea a todo el espacio que les es accesible.

Por difusin, las molculas del soluto tienden a esta homogeneidad en el seno del

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disolvente, lo que se alcanza al cago de un cierto tiempo. Al poner en contacto dos

disoluciones acuosas por ejemplo de NaCl y KNO3, los solutos difunden en toda su masa,

esencialmente de la misma manera que difunden dos gases encerrados en recipientes

que comunican libremente.

La difusin a travs de la membrana es el tipo de difusin de mayor importancia biolgica,

porque la presencia de membranas de las ms variadas caractersticas condiciona el

paso de disolvente y disoluciones en todas las estructuras celulares. Por eso se estudian

los fenmenos de difusin y permeabilidad en la fisiologa, desde la gnesis de

potenciales elctricos en la clula nerviosa hasta los ms elementales mecanismos de

secrecin glandular2.

Las membranas biolgicas o artificiales, se han definido aproximadamente como

estructuras laminares caracterizadas por poros de determinadas dimensiones. El

comportamiento de la membrana frente a determinadas circunstancias depende

fundamentalmente de la relacin entre el dimetro de los poros y el dimetro de las

partculas. La presencia de una membrana separando dos medios diferentes, determina

ciertas restricciones en el proceso de difusin de las sustancias3.

Las membranas se clasifican esquemticamente en cuatro grupos fundamentales-

impermeables, dialticas y permeables- segn sus propiedades referentes a la filtracin y

smosis. En Fisiologa, al hablar de disolvente, prcticamente en todos los casos, se

refiere al agua, pero los solutos pueden ser muy variables: coloidales, como protenas y

polisacridos; verdaderos, de tipo salino o molecular como NaCl, KHCO3, glucosa, urea,

etc.3

Membranas impermeables. Son aquellas que no las pueden atravesar ni el disolvente, ni

los solutos; por ejemplo, aunque no en un sentido muy riguroso, los tegumentos.

Membranas semipermeables. Las pueden atravesar libremente el agua, pero no permiten

el paso de solutos verdaderos o cristaloides de ninguna clase. Son ejemplos conocidos

las membranas de pergamino o de ferrocianuro cprico.

Membranas dialticas. Son permeables al agua y a solutos verdaderos pero no las

atraviesan los solutos coloidales por ejemplo las membranas de colodin, celofn o el

endotelio capilar.1

Membranas permeables. Permiten el paso de agua y disoluciones verdaderas y coloidales

y slo son impermeables a las dispersiones groseras. Son ejemplos tpicos los filtros de

arcilla y el papel de filtro hmedo.1

Las membranas biolgicas en general, aunque pueden incluirse en algunos de estos

grupos para sistematizar conceptos, en realidad no encajan estrictamente en ninguno de

ellos porque son de propiedades intermedias. Adems, las membranas celulares junto a

sus propiedades de permeabilidad comparables a las de membranas artificiales,

presentan otro fenmeno que es la variabilidad selectiva. Es decir, el paso de sustancias

est condicionado en parte, por los fenmenos metablicos de la membrana o el

protoplasma que modifican el tipo de difusin que sera previsible atendiendo slo a sus

propiedades fisicoqumicas.1,2

Osmosis. Es la difusin de lquidos a travs de membranas. Supongamos dos

disoluciones de concentracin desigual, por ejemplo NaCl 1M y 2M respectivamente,

separadas por una membrana semipermeable que como se ha dicho, permite el paso de

agua pero no de sal. El agua tiende a atravesar la membrana, pasando de la disolucin

ms diluda a la ms concentrada, es de decir, en el sentido de igualar las

concentraciones. Y si los volmenes de las dos disoluciones indicadas fueran iguales, el

equilibrio se alcanzara cuando a los lados de la membrana se llegase a la misma

concentracin (1.5 M ) de sal.1,3

La tendencia a igualarse las concentraciones que est en correspondencia con la presin

osmtica, se explica segn el segundo principio de la Termodinmica, por la existencia de

una diferencia en la presin de vapor. Esto es lo que en rigor podemos considerar como

esencial para el concepto de presin osmtica que no es en s misma una presin

mecnica ejercida por las partculas del soluto sobre las paredes de la vasija, como

supona la teora del bombardeo y no est de ms puntualizarlo as, desde el principio

para precisar conceptos pues que vara valorar la presin osmtica se hace referencia con

frecuencia a sus efectos mecnicos.1

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPO

Soluciones de sacarosa (no electrolito) 0.0 M; 0.1 M; 0.2M; 0.3M; 0.4M; 0.5M;

0.6M.

Cloruro de sodio (electrolito) 0.0 M; 0.1 M; 0.2M; 0.3M; 0.4M; 0.5M; 0.6M.

Agua destilada

Algodn

Cajas de Petri

Semillas de trigo, frijol o acelga

Caja de cartn

METODOLOGA

Colocar en las cajas de Petri una capa delga de algodn y humedecer con agua y

las soluciones abundantemente (0.0 M; 0.1 M; 0.2M; 0.3M; 0.4M; 0.5M; 0.6M.)

Poner dos repeticiones para cada concentracin (0.0 M; 0.1 M; 0.2M; 0.3M; 0.4M;

0.5M; 0.6M.)

Colocar enseguida de 5 a 10 semillas por caja.

Las semillas debern estar dentro de un ambiente tibio y obscuro

Observar cada 24 horas y anotar el nmero de semillas germinadas

Observar por 5 das

Graficar los datos de concentracin contra el porcentaje de geminacin.

RESULTADOS

Las reacciones de las semillas ante las diversas concentraciones de sacarosa o cloruro

de sodio se reflejarn en la morfofisiologa de la semilla-pltula.

REFERENCIAS

1. AUDESIRK, T. Y GERALD, A. Biologa, la vida en la tierra. 4 ed. Mxico.

Prentice-Hall. 1996

2. VILLE, C.A. et al., Biologa. 2 ed. Mxico. Interamericana McGraw-Hill. 1992

UTS PRACTICA No. 5

CUANTIFICACIN DE CROMOSOMAS EN APICES DE HABA

OBJETIVO:

El alumno ser capaz de cuantificar el nmero de cromosomas en pices de

cebolla durante el proceso de mitosis.

INTRODUCCIN. Es la divisin celular que consiste en que a partir de una clula se obtienen 2

clulas hijas, genticamente idnticas a la madre. Se produce en cualquier clula

eucarionte, ya sea diploide o haploide y como mantiene invariable el nmero de

cromosomas, las clulas hijas resultarn diploides, si la madre era diploide o

haploide. La divisin del citoplasma se llama citocinesis, y la divisin del ncleo,

cariocinesis. Algunas clulas no realizan mitosis y permanecen en un estado

interfsico, pero otras la realizan frecuentemente (clulas embrionarias, clulas de

zonas de crecimiento, clulas de tejidos sujetos a desgaste.).

MARCO TEORICO

MITOSIS

Es la divisin celular que consiste en que a partir de una clula se obtienen 2

clulas hijas, genticamente idnticas a la madre. Se produce en cualquier clula

eucarionte, ya sea diploide o haploide y como mantiene invariable el nmero de

cromosomas, las clulas hijas resultarn diploides, si la madre era diploide o

haploide. La divisin del citoplasma se llama citocinesis, y la divisin del ncleo,

cariocinesis. Algunas clulas no realizan mitosis y permanecen en un estado

interfsico, pero otras la realizan frecuentemente (clulas embrionarias, clulas de

zonas de crecimiento, clulas de tejidos sujetos a desgaste.).

Funcin: crecimiento y desarrollo del organismo multicelular, y la regeneracin de

tejidos expuestos a destruccin de clulas. En unicelulares, cumple la funcin de

reproduccin asexual.

Cada mitosis est precedida por una interfase, donde se produce la duplicacin

del material gentico. Acta como un mecanismo que asegura que cada clula hija

reciba la misma informacin gentica.

Etapas: Profase, Prometafase, Metafase, Anafase y Telofase.

1. PROFASE: La cromatina se condensa para formar los cromosomas y los 2

centrolos migran a polos opuestos organizando un sistema de microtbulos

(aparato mittico) para permitir la migracin de los cromosomas. El aparato

mittico est constituido por:

Centrolos: Estn rodeadas por el centrosoma. A medida que cada centrolo

migra, tiene un hijo y cuando llega al polo se ven 2.

steres: Conjunto de microtbulos cortos que se extienden desde cada

centrolo.

Huso acromtico: Tiene forma de ovoide y formado por muchos

microtbulos sin ramificaciones.

Cada cromosoma est constituido por 2 cromtidas unidas por el centrmero. La

envoltura nuclear se desorganiza y sus fragmentos no se distinguen del retculo

endoplasmtico. Desaparece el nucleolo.

1. PROMETAFASE: Los cromosomas condensados migran hacia la placa

ecuatorial del huso acromtico.

2. METAFASE: Los cromosomas se alinean en el plano ecuatorial, y cada uno

estn unido por su centrmero a una fibra del huso acromtico.

3. ANAFASE: Las 2 cromtides de cada cromosoma se separan por fisin del

centrmero y se dirigen hacia polos opuestos. El movimiento de los

cromosomas hijos hacia los polos se debe a un acortamiento de las fibras

cromosmicas y se alargan las fibras interzonales.

4. TELOFASE: El huso mittico y los steres se desorganizan. Alrededor de

cada grupo cromosmico se organiza una envoltura nuclear a partir del

retculo endoplasmtico y de la envoltura original. Los cromosomas se

dispersan y retoman el aspecto de cromatina que tenan antes de iniciarse

la divisin. Los nucleolos reaparecen a partir de sus organizadores. 1,2,3

Citocinesis:

1. La divisin del citoplasma se produce junto con la telofase. Se produce un

surco en la membrana plasmtica, producidos por un anillo de

microfilamentos unidos a ella. Las 2 clulas hijas se separan,

distribuyndose el hialoplasma y los organelos de un modo equitativo.

2. Cuando no ocurre citocinesis luego de la cariocinesis, los dos ncleos

quedan en el mismo citoplasma y resulta una clula binucleada.

Divisin en clulas vegetales:

No hay centrolos ni steres pero se organiza el huso acromtico.

Citocinesis: el citoplasma se divide mediante un tabique, que se forma por

la agrupacin de microtbulos y vesculas. Las vesculas crecen, se

ordenan y se funden entre s originando la placa celular. Finalmente se

arman las paredes celulares a partir de celulosa, hemicelulosa y pectina.

1,2,3

Meiosis

Es un proceso de reduccin cromtica por el que los cromosomas se reducen a la

mitad. En la meiosis I (etapa reduccionaria) se reduce el nmero diploide de

cromosomas a la mitad (haploide) pero an los cromosomas son dobles. En la

meiosis II (etapa ecuacional) se mantiene el nmero cromosmico haploide

conseguido en la etapa anterior. Los cromosomas son simples.1,2,3

Meiosis I: Est precedida por una interfase durante la cual se duplica el

material gentico.

1. PROFASE I: La envoltura nuclear y el nucleolo se desorganizan, los

centrolos migran a polos opuestos, duplicndose y se ordena el huso

acromtico. Se divide en 5 etapas: Leptonema, Cigonema, Paquinema,

Diplonema y Diacinesis.

2. PROMETAFASE I: Los cromosomas migran al plano ecuatorial de la clula.

3. METAFASE I: Los cromosomas se alinean en el plano ecuatorial. Los 2

cromosomas del bivalente se unen por medio del centrmero a la misma

fibra del uso acromtico.

4. ANAFASE I: Los 2 cromosomas homlogos unidos a la misma fibra del

huso se repelen y migran a polos opuestos. Cada cromosoma est formado

por 2 cromatides.

5. TELOFASE I: Cuando los cromosomas llegaron a los polos, se

desorganizan el huso acromtico y los steres, se reorganizan la envoltura

nuclear y los nucleolos y se constituyen los ncleos hijos.

Citocinesis: Se produce simultneamente con la telofase, y da como resultado 2

clula hijas con un nmero haploide de cromosomas.

Intercinesis: Es un perodo que tiene lugar entre la meiosis I y II y no se realiza

duplicacin del ADN.

Meiosis II: Los procesos de esta divisin son semejantes a los de una

mitosis en una clula haploide.

1. PROFASE II: Se condensan los cromosomas, se desintegran los nucleolos,

los centrolos migran a los polos y se duplican, formacin del huso

acromtico y se desorganiza la envoltura nuclear.

2. PROMETAFASE II: Los cromosomas condensados migran a la placa

ecuatorial de la clula.

3. METAFASE II: Los cromosomas se alinean en la placa ecuatorial, y cada

cromosoma se une a una fibra del huso acromtico.

4. ANAFASE II: Se fusiona el centrmero y se separan las 2 cromtidas de

cada cromosoma. Cada una migra a un polo diferente.

5. TELOFASE II: Los grupos cromosmicos llegan a los polos, el huso

acromtico se desorganiza, se reorganizan la envoltura nuclear y el

nucleolo, se dispersan los cromosomas y se transforman en cromatina.

Citocinesis: Separacin de los citoplasmas de las clulas hijas.

El proceso meitico parte de una clula diploide que da como resultado 2

haploides, y a partir de stas dos (meiosis II) se obtienen 4 haploides.

Meiosis, variabilidad gentica y evolucin

La reproduccin sexual introduce una importante proporcin de variaciones

genticas. Cuanto mayor sea la diversidad de gametas formadas en cada

progenitor, mayor ser la probabilidad de originar combinaciones diferentes por

fecundacin, y mayor ser la diversidad de los descendientes. Una clula diploide,

con 2 pares de cromosomas homlogos, originar por meiosis 4 gametas

haploides (uno de la madre y otro del padre). En la Metafase I se va a determinar

en qu sentido migrarn en la Anafase I. Hay dos opciones:

1. Puede ocurrir que los 2 cromosomas paternos migren juntos a un polo y los

dos maternos al opuesto.

2. Puede ocurrir que migren al mismo polo el cromosoma materno del par

homlogo y el paterno del par homlogo. Los otros cromosomas, migran al

polo opuesto. 1,2,3

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO pices de raz

Tubos de ensaye

Gradilla

Mechero

Vaso de precipitado de 250 ml.

Bistur

Agua destilada

8- hidroxiquinolina

Cloroformo

Alcohol etlico al 95%

cido actico glacial

cido clorhdrico

Sol. Acetato-orcena

METODOLOGA PRETRATAMIENTO

Se colocan los cortes de raz, perfectamente lavados con agua destilada en una

solucin de 8-hidrixiquinolina 0.02 M por 3 a 5 horas a 18oC.

FIJACION

Se lavan los cortes con agua destilada y se transfieren a una soluxcin modificada

de Carnoy 86 partes de cloroformo, 3 partes de alcohol etlico al 95% y 1 de cido

actico glacial) mnimo 12 horas en refrigeracin.

HIDRLISIS

Se transfieren los cortes a una solucin de cido clorhdrico 1 N a 50oC durante

15 minutos.

TINCION

En un tubo de ensaye se colocan los cortes de raz y se sumergen en solucin de

acetato-orcena. Se calientan, sin que hiervan por 3 minutos. En un portaobjetos

se colocan los cortes de raz. Con un bistur se cortan los pices (2-3 nm) que se

reconocern por ser la parte mas teida. Se les aade una gota de acetato-

orcena y se aplastan con la tcnica del squash.

RESULTADOS

Realizar esquemas de lo observado.

Comparar los resultados en un cuadro con lo observado por los diferentes

equipos.

CUESTIONARIO

1.- Qu es un cromosoma?

2.- Cul es la fase dentro de la mitosis en la que se observan mejor los

cromosomas?

3.- Cual es la funcin del cido clorhdrico sobre los pices de raz?

4.- Porqu los pices de raz de cebolla se considera como un buen espcimen

para la observacin de cromosomas

REFERENCIAS 1.- GARDNER E. (1985) Principios de Gentica. Limusa. Mxico 2.- BARAHONA A. y DANIEL PIERO (1994). Gentica: Continuidad de la vida. SEP-CONACYT-FCE. Mxico (la ciencia desde Mxico). 3.- SMITH-KEARY (1979). Gentica. Estructura y Funcin.Publicaciones cultural.Mxico

UTs

PRCTICA No. 6

FIGURAS MEITICAS EN GNADAS DE CHAPULN

OBJETIVO:

1. Elaborar preparaciones temporales de gnadas de dos especies de

insectos: chinche o

frailecillo (Stenomacra marginella) y grillo (Achaeta domestica).

2. Identificar en dichas preparaciones las diferentes fases de la meiosis y de la

gametognesis.

INTRODUCCIN

En las clulas eucariontes somticas existen dos juegos de cromosomas 1,

heredados por cada uno de los progenitores. A esta condicin se le denomina

estado diploide o 2N. Las clulas somticas mantienen su condicin diploide

durante la replicacin celular o mitosis. Durante la formacin de gametos el

nmero de cromosomas de la especie se reduce a la mitad (N) por medio de la

meiosis. El nmero de cromosomas de la especie se reestablece cuando se

forma el cigoto durante la fertilizacin. La meiosis, por consiguiente, ocurre en el

tejido germinal de especies con reproduccin sexual.

La meiosis es un tipo de divisin celular que involucra una sola replicacin

del material gentico (Fase S del ciclo celular) y dos divisiones nucleares

sucesivas conocidas como Meiosis 1 y Meiosis 11 (Figura 1. A). La meiosis 1 o

primera divisin meitica, que es ms compleja que la segunda, es una divisin

reduccional en la que se pasa de una clula diploide (con 2N cromosomas con

dos cromtidas hermanas [4cr) a dos clulas haploides (con N cromosomas de

dos cromtidas hermanas cada uno [2c]). La segunda divisin o meiosis 11 es

similar a una divisin mittica en la que a partir de las dos clulas haploides N [2c]

generadas en la primera divisin se producen cuatro clulas haploides con N [1 c]

cromosomas de una sola cromtida. Para su mayor entendimiento, el proceso es

dividido en fases que describen los eventos ocurridos durante sta.

MEIOSIS I

PROFASEI

Durante toda esta fase la membrana nuclear permanece inalterada. Consta de

cinco etapas: leptoteno, zigoteno, paquiteno, diploteno y diacinesis.

Leptoteno 3. Los cromosomas comienzan a condensarse

manteniendo unidos los telmeros4 a la envoltura nuclear. A lo

largo de los cromosomas van apareciendo pequeos

engrosamientos conocidos como crommeros. En este momento slo es posible

distinguir una de

1 Dos juegos de autosomas y el par de cromosomas sexuales o slo uno de ellos.

2 4c: significa que cada cromtida (ADN) se replic en la fase S anterior a la meiosis. Cada gen est representado cuatro

veces, uno en cada cromtida y puede ser el mismo alelo o diferente.

3 Las imgenes de las fases de la meiosis presentadas son de testculo de langosta (Locusta migratoria) y fueron tomadas

de htto://www.vcbio.science.ru.nl/en de la Universidad de Radboud, Nederlands.

4 Telmeros: extremos de los cromosomas de eucariontes.

las dos cromtidas hermanas de

cada cromosoma ya que stas

estn muy unidas entre

s.

A mayor aumento, en los

cromosomas

se puede apreciar un eje proteico 5

de no histonas que posteriormente

tendr gran importancia en el

apareamiento entre cromosomas

homlogos.

Zigoteno. Los cromosomas homlogos (CH) se acercan hasta

quedar apareados en toda su longitud, crommero a crommero

de las cromtidas no hermanas (slo las adyacentes). La

disposicin de stos a lo largo de las cromtidas parece estar

determinado genticamente. Incluso se utiliza la disposicin de

estos engrosamientos para poder distinguir cada cromosoma

durante la profase l.

El reconocimiento de los CH se facilita gracias a que sus telmeros se encuentran

anclados en regiones muy prximas de la membrana nuclear. El eje proteico

central juega un papel

importante en el apareamiento

de los CH al formar los

elementos laterales del

complejo sinaptotmico 6. En

este apareamiento tambin est implicada la secuencia de genes de cada

cromosoma, que evita el apareamiento entre cromosomas no homlogos. Durante

esta fase concluye la replicacin del ADN (2% restante) que recibe el nombre de

zig-ADN.

Paquiteno. Los CH estn perfectamente apareados formando

estructuras denominadas bivalentes, en esta fase se produce el

intercambio de material gentico entre los CH o recombinacin

gentica. sta est mediada por una estructura proteica de 90

nm de dimetro llamada ndulo de recombinacin. En l se

encuentran las enzimas que median en el proceso de

recombinacin. Durante esta fase se produce una pequea

sntesis de ADN, que probablemente est relacionada con

fenmenos de reparacin de ADN ligados al proceso de

recombinacin (HRR7).

Diploteno. Como los cromosomas estn ms condensados se pueden distinguir

las dos cromtidas de cada cromosoma, por lo que a los bivalentes descritos en

el paquiteno se

5 La imagen del eje proteico y la del complejo sinaptotmico fueron tomadas de

htto: / /users. servicios. retecal.es/touente/meiosis/imaoes/

6 estructura proteica con forma de escalera formada por dos elementos laterales y uno central que se van cerrando a modo

de cremallera y que garantiza el apareamiento entre homlogos, ver imagen

7 HRR: Homologous recombination repair

observan ahora como ttradas. Adems en este momento se pueden observar los

lugares del cromosoma donde se ha producido la recombinacin como

estructuras en forma de X denominadas quiasmas. En este punto la meiosis

puede sufrir una pausa, como ocurre en el caso de la formacin de los vulos

humanos. La lnea germinal de los vulos humanos sufre esta pausa hacia el

sptimo mes del desarrollo embrionario continuando la meiosis hasta alcanzar la

madurez sexual. A este estado de latencia se le conoce como dictiotena.

~

Diacinesis. Apenas distinguible del diploteno. En esta fase

podemos observar los cromosomas algo ms condensados y ms

claramente los quiasmas. Al final de sta y por tanto de la profase I

se presenta la fragmentacin en vesculas de la envoltura nuclear.

Durante toda la profase I continu la sntesis de ARN en el ncleo. Al final de la

diacinesis cesa la sntesis de ARN y ya no se ve el nucleolo.

METAFASEI

Comienza con la fragmentacin de la membrana nuclear. En

clulas animales se forma el huso acromtico a partir de los

centrolos ubicados en los centrosomas y que se colocan en los

polos de la clula. Los CH se unen a los microtbulos (MTs)

cinetocricos del huso por medio del centrmero movindose al centro de la

clula. En esta fase los quiasmas son todava visibles.

ANAFASEI

Los CH se separan y se mueven hacia los polos opuestos guiados

por los MTs del huso. Como consecuencia desaparecen los

quiasmas. Cabe hacer notar que los cromosomas de origen

paterno y materno tienen la misma probabilidad de migrar hacia los

polos, y que estos cromosomas han recombinado. De aqu que la meiosis

contribuye de manera importante a generar diversidad, materia prima de la

evolucin.

TELOFASEI

Esta fase de la meiosis vara segn la especie. En algunas se

forman dos nuevas membranas nucleares y se separan las dos

nuevas clulas haploides N [2c] con dos cromtidas cada una de

ellas y unidas por su centrmero. En algunas otras no se forma envoltura nuclear

y se pasa directamente a la segunda divisin meitica.

PROFASE 11

En esta fase desaparece la membrana nuclear, sr es que se

reintegr nuevamente, y comienza el ensamble del nuevo huso

acromtico. Recordar que en este momento cada clula contiene un nmero

haploide de cromosomas, cada uno de ellos con dos cromtidas.

METAFASE 11

Los cromosomas se colocan en el centro de la clula

unidos al huso por su centrmero y con cada una de sus

cromtidas de cara a los polos la clula, formando la placa ecuatorial.

ANAFASE 11

Los centrmeros se separan por despolimerizacin de las

protenas que los unen y las cromtidas hermanas son

arrastradas por los MTs hacia polos opuestos por las fibras del

huso.

TELOFASE 11

En esta fase se desensambla el huso acromtico y los

cromosomas se descondensan. Se vuelve a formar la envoltura

nuclear alrededor de los cromosomas situados en los polos. Al

final se obtienen cuatro clulas haploides N [c] con cromosomas de una sola

cromtida cada uno de ellos 8.

ESPERMIOGNESIS

En los individuos del sexo masculino, los espermatocitos secundarios o gametos

N [1 c] presentan una "especializacin" que consiste en la modificacin de sus

estructuras para producir los espermatozoides. En las preparaciones de las

gnadas masculinas de los insectos que se proporcionarn en esta prctica. se

podrn observar las espermtidas (Figura 1.8) y los espermatozoides9 (Figura

1.C).

Fig. 1.A. Figuras meiticas; B, espermtidas; C,

espermatozoides en testculo de saltamontes

(Locusta migratoria).

8 Para ver una animacin de la meiosis ir a la pgina:

htto://www.iohnkvrk.com/meiosis.html Consulta: httg: /

/users.servicios. retecal.es/touente/meiosis/

9 Imagen tomada del Dr. Wil/iam H. Heidcamp, Biology Department, Gustavus Adolphus College, Sto Peter, MN 56082 --

cellab()gac.edu. en la pagina

htto: / /homeoaaes. aac. edu/~cellab/chots/chotll/fiaurell-6. html

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO

Pinzas de relojero

Agujas de diseccin

Portaobjetos y cubreobjetos

Placa de unicel

Alfileres

Navaja de rasurar (Gillete)

Frascos goteros

Toallas de papel

Microscopio ptico

Microscopio estereoscpico

cido lacto-actico: cido lctico 85%: cido actico 60%:

agua desionizada 1:1 :1. ,( Colorante lacto-aceto-orcena:

orcena (sinttica) 1 % en volmenes iguales de

cido lctico 85%: cido actico 60%. Caliente la mezcla a

ebullicin y hierva varios minutos. Enfre y filtre. Si

posteriormente forma precipitados hay que filtrarla.

cido actico 45% recin preparado.

MA TERIAL BIOLGICO

Adultos de chinche (Stenomacra marginella) fijados en

alcohol 70%. Este hemptero habita en el follaje de

diversos rboles y arbustos. Madura sexualmente previo a

la poca de lluvias y es comn encontrarlo en las

estaciones Primavera- Verano. Lo ms adecuado es

colectarlos durante la cpula, lo que permite diferenciar a

los machos que son ms pequeos. Sus cromosomas son

grandes y fcilmente visibles. En los gametos de las

hembras se pueden observar 12 bivalentes y en los de los

machos 11, por lo que presentan un sistema de

determinacin del sexo XX/XO. (Insecta: Heteroptera:

Largidae.

Machos adultos de grillo domstico (Acheta domestica

(Linnaeus) (Insecta: Orthoptera: Gryllidae) fijados en

alcohol 70%.

METODOLOGA

1. Colectar adultos de ambas especies. Dormirlos con ter y colocarlos en

alcohol de 70 (En este caso se les proporcionarn los insectos ya fijados

en alcohol de 70).

2. Iluminar el microscopio de manera que la luz llegue en un ngulo y el fondo

se vea oscuro.

3. Colocar el insecto en un cuadrito de unicel con la regin abdominal

hacia arriba, y sujetarlo con alfileres de cabeza de la siguiente

manera: Uno en el primer artejo de cada extremidad superior y un

tercero en el lmite inferior de la cabeza. Aadir una gota de cido

actico 45% sobre el insecto.

4. Con la navaja de rasurar cortar longitudinalmente el abdomen cuidado

de cortar slo la cutcula.

5. Con pinzas de relojero eliminar o abrir ambos lados de la cutcula para

exponer el interior del insecto.

6. Con las pinzas apresar transversalmente la parte superior del tubo

digestivo y jalarlo hacia fuera, para sacar todo el sistema digestivo y

los otros rganos.

7. Al quitar los rganos mediante el paso anterior, se podrn ver a ambos

lados del insecto unas estructuras semejantes a racimos y pegadas al

dorso. stas son las gnadas.

8. Aadir gotas de cido actico 45%. Nunca dejar Que se seQuen las

anadas.

9. Colocar en un portaobjetos, una pequea parte del tejido de las

gnadas. Esto es importante porque si se coloca mucho tejido, al

hacer el "squash" ms adelante, no se podrn ver los cromosomas

Debido a que las clulas se vern en varias capas, y no se podr "

ejercer presin suficiente sobre ellas.

10. Remover con cuidado el cido actico aplicando una porcin de una

toalla de papel absorbente sobre la zona del portaobjetos en donde

se haya extendido el actico, sin tocar la muestra.

11. Aadir suavemente una gota de 1 N HCL por 30 segundos y

eliminarla absorbiendo con mucho cuidado con una pipeta Pasteur o

el extremo de una toalla de papel.

12. Rpidamente enjuagar suavemente con cido lacto-actico para

impedir que precipite el colorante.

13. Aadir una gota del colorante y esperar 15 mins.

14. Enjuagar suavemente con gotas de cido lacto-actico.

15. Colocar un cubreobjetos sobre el tejido.

16. Golpear intermitente y suavemente sobre el cubreobjetos con la punta de

un lpiz o una pluma, cuidando que ste no se deslice. Ensayar varias

veces hasta adquirir la habilidad de presionar sin deslizar el cubreobjetos

o romperlo. AL hacerlo puede observarse que el tejido se disgrega

fcilmente.

17. Observar las clulas en el microscopio ptico. Ajustar la iluminacin de

Kohler y buscar las zonas rosas (citoplasma) con regiones nucleares

(magenta).

18. Para hacer preparaciones permanentes se congelan colocndolas sobre

hielo seco. Una vez congeladas se desprende el cubreobjetos con la

ayuda de una navaja de rasurar o navaja muy delgada. Se colocan los

portaobjetos en una jarra de Coplin con etanol helado y ah se dejan

hasta que el alcohol disminuya su temperatura a la del ambiente (T A). Se

sacan del etanol y se secan al aire. Se conservan de esa manera por

periodos largos aTA.

RESULTADOS

Dibuje detalladamente las observaciones encontradas y corrobore con su profesor.

BIBLIOGRAFA

Modificacin del procedimiento elaborado por Jeanette Holden, Queen's

University, Kingston, Ontario. ~:Dr.Thomas Miller's Lab Web Page. Pag~

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2003-05 Miller Web Design.

UTs

PRCTICA No. 7

IDENTIFICACIN DE CROMOSOMAS POLlTNICOS EN LAS CLULAS DE LAS GLNDULAS SALlVALES EN LARVAS DE

Drosophila melanogaster y Drosophila pseudoobscura. OBJETIVO:

Observar el bandeo natural e identificar las estructuras ms

relevantes de los cromosomas politnicos de las glndulas salivales

de Drosophila.

Ubicar la utilidad de los cromosomas politnicos en la localizacin de

genes y en la identificacin de cambios estructurales en los

cromosomas.

INTRODUCCIN. Drosophila melanogaster tiene cuatro pares de cromosomas, un par sexual y tres

pares autosmicos. Los cromosomas sexuales, al igual que en otras especies

superiores son: el cromosoma X (tambin denominado cromosoma 1), que

presenta forma de barra y tiene el centrmero en un extremo y el cromosoma Y

que tiene forma de bastn. La hembra presenta dos cromosomas X y el macho un

cromosoma X y un Y (XX Y XY, respectivamente). De los cromosomas

autosmicos, los pares 2 y 3 son los ms grandes del genoma, cada uno de ellos

est dividido por el centrmero en un brazo derecho y un brazo izquierdo. Los

cromosomas del par 4 son sumamente pequeos y aparecen como puntos

diminutos en las clulas somticas en metafase (Fig. 1).

MARCO TEORICO

En 1881 E. G. Balbiani encontr estructuras peculiares en los ncleos de ciertas

clulas secretoras de los dpteros. Sin embargo stas no fueron reconocidas

como cromosomas sino hasta 1933, cuando T. Painter, E. Heitz y H. Bauer los

redescubrieron y analizaron la constancia que presentan en el arreglo y densidad

relativa las diferentes bandas o discos de que se componen; entonces

establecieron que dichas estructuras eran realmente cromosomas y los

denominaron cromosomas politnicos. Se ha descrito la presencia de este tipo

de cromosomas en tejidos secreto res como tbulos de Malpiphi, recto, intestino y

glndulas salivales de los dpteros.

La politenia es una forma especial de poliploida. Los cromosomas politnicos se

originan durante el ciclo celular atpico al inicio de la fase larvaria. El inicio de la

politenia queda sealado por el estrecho acercamiento de los cromosomas

homlogos en una forma que recuerda a la asociacin de los cromosomas en la

profase meitica. Una vez alcanzado este arreglo las clulas entran al proceso de

endomitosis, en el cual el ciclo celular queda constituido nicamente por una fase

G y una fase S, no ocurre mitosis, de manera que en cada ciclo, el material

gentico se replica pero no se lleva a cabo la segregacin de los cromosomas

replicados. De esta manera, cada cromosoma consta de 1024 juegos

cromosmicos que permanecen integrados en una sola estructura, lo que hace

evidente la presencia de bandas de diferente espesor y afinidad cromtica en

patrones caractersticos a cada cromosoma y, en consecuencia, propias de cada

especie de Drosophila (Fig. 2).

Durante el desarrollo de la mosca, aparecen abultamientos o "puffs" en diferentes

regiones de los cromosomas, as como zonas ampliamente distendidas

denominadas "Anillos de Balbiani" (Fig. 3). Por estudios a nivel molecular se ha

establecido que las reas abultadas de los cromosomas politnicos son reas en

las que se acumula RNA, probablemente como parte de una sntesis intensa de

protenas. La variabilidad del patrn de abultamiento refleja la actividad de genes

tejido-especfico dependientes del desarrollo del organismo.

En las clulas de las glndulas salivales de la mosca, cinco brazos largos parten

de un centro comn llamado cromocentro, el cual es una estructura radial y

representa una coalescencia de las reas heterocromticas alrededor de los

centrmeros de los cuatro pares cromosmicos. El cromosoma se forma por la

atraccin mutua y asociacin estrecha de los centrmeros.

En el caso de los cromosomas politnicos se encuentra que de cada cromosoma

en forma de V (pares 2 y 3) salen dos brazos, izquierdo y derecho (2L, 2R y 3L,

3R, respectivamente); del cromosoma X slo se extiende uno, ya que su

centrmero es terminal. El cromosoma y est formado principalmente por

heterocromatina y se queda en su mayor parte formando el cromocentro. En

ocasiones es posible ver al cromosoma 4 saliendo del cromocentro en una

extensin muy corta.

El estudio de los patrones de bandas e interbandas en los cromosomas

politnicos ha resultado en la elaboracin de mapas citolgicos los cuales

aportaron evidencias de la localizacin lineal de los genes y las relaciones de

ligamiento entre los mismos, por otro lado, el anlisis de las alteraciones en los

patrones de bandeado ha permitido la asociacin de ciertos genes con bandas e

interbandas especficas. Al compararse los mapas citolgicos obtenidos de estos

estudios con los mapas genticos, constituidos a partir del anlisis de datos de

entrecruzamiento utilizando marcadores fenotpicos en cruzas experimentales, se

ha observado que existe consistencia en la informacin aportada por ambos tipos

de mapas.

Los cromosomas politnicos tambin son importantes en el anlisis de

aberraciones cromosmicas como deficiencias, duplicaciones, inversiones y

translocaciones, y ha sido de enorme utilidad en estudios de mutagnesis

experimental.

Adems, los cromosomas politnicos son una herramienta extraordinaria en el

estudio de los polimorfismos genticos de diferentes especies del gnero

Drosophila, entre las que se puede mencionar a D. pseudoobscura, D. willistoni,

D. azteca, D. nebulosa y D. persimi/is, aportando informacin de gran importancia

para establecer relaciones filogenticas y proponer patrones evolutivos.

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO

Larvas de Drosophila melanogaster y de D. pseudoobscura de tercer estadio

Solucin fisiolgica de NaCI al 0.7%

Acetorcena al 2%

2 agujas de diseccin o 2 pinzas de relojero

Toallas de papel

Cubreobjetos

Portaobjetos

Lpiz con goma nueva

Platina de vidrio

Barniz de uas

Etiquetas

Microscopio de diseccin

Microscopio ptico

METODOLOGA

1. Con la ayuda de una aguja de diseccin extraiga una larva de tercer estadio de

un cultivo maduro, seleccione aquellas de mayor tamao y coloque la larva

sobre una platina o portaobjetos en una gota de solucin salina.

2. Con la ayuda de dos agujas disecte la larva. Coloque una aguja en el rea de

las mandbulas y la otra en la parte central del cuerpo. Con un movimiento

rpido separe la regin ceflica del resto del cuerpo para obtener las glndulas

que quedarn adheridas a la zona de la mandbula. Las glndulas salivales

son transparentes y tienen por lo general, una franja de tejido graso adherido

lateralmente en cada una de ellas; con mucho cuidado procure retirar la grasa

tanto como le sea posible (Fig. 5 a y b).

3. Coloque una gota de acetorcena en un portaobjetos

limpio

4. y transfiera las glndulas con sumo cuidado para no perderlas, deje teir de 30

a 45 minutos sin dejar secar.

5. Coloque un cubreobjetos con una pequea gota de colorante (si es necesario),

cubra la preparacin con una toalla de papel o papel higinico y haga presin

con el dedo pulgar siguiendo un movimiento circular o golpee con la goma de

un lpiz siguiendo crculos hasta dispersar el tejido (squash), teniendo cuidado

de no romper el cubreobjetos.

6. Revise si se obtuvieron figuras (a 40 X) Y selle con barniz de uas. Esta

preparacin es semipermanente. Etiquete la preparacin.

7. Analice la laminilla a 40 o 100X para identificar con ayuda del mapa citolgico

el patrn de bandeo natural y los distintos brazos de cada cromosoma;

determine, si le es posible, la presencia de alteraciones (duplicaciones,

inversiones, deficiencias o translocaciones ).

RESULTADOS:

Dibuje las estructuras que observ en cada una de las preparaciones y coloque el

nombre de aquellas que pudo identificar.

CUESTIONARIO

1. Defina bandeo y mencione su importancia en la gentica

2. Defina cromosoma politnico y explque el por qu de su nombre.

3. Explique por qu en esta prctica se utilizaron las glndulas salivales de las

larvas de mosca y no de cualquier otro organismo.

BIBLIOGRAFA

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12. Weaver R.F., Hedrick P.W. (1997) Genetics 3a. ed. WMC. Brown

Publishers, London. 638pp.

UTs

PRCTICA No. 8

MAQUETA VIVIENTE Informacin pendiente UTs

PRCTICA No. 9

ESTUDIO DE CASOS BIOTICOS Informacin pendiente