Resumen.—Se presenta la preparación de un radiocoloide que permite la marcación de leucocitos utilizando su capacidad de fagocitosis. Dado que esta función es exclusiva de los glóbulos blancos, no ejerciéndola otras células sanguíneas, se probó la utilización de un coloide de fluoruro estannoso marcado con 99m Tc (F 2 Sn- 99m Tc) a fin de marcar dichas células en muestras de sangre entera. Mediante técnicas de separación celular en gradientes de densidad y adquisición de imágenes en cámara gamma de la distribución de radioactividad en tubos con Percol 90 %, se observó que la marcación lograda es selectiva y de alta eficiencia para leucocitos (en todos los casos fue mayor del 70 %), óptima reproducibilidad, bajo costo y baja toxicidad celular. PALABRAS CLAVE: Marcación de leucocitos. Fagocitosis. Coloide. Imágenes de infección. LABELING OF LEUKOCYTES USING STANNOUS 99M TC-COLLOID IN WHOLE BLOOD SAMPLES Summary.—This paper presents the preparation of a radiocolloid that still makes it possible to label leukocytes using its fagocitosis capacity. Given that this function is exclusively of the white blood cells, not being exercised by other blood cells, the use of a stannous fluoride radiocolloid labeled with 99m Tc (F2Sn- 99m Tc) was tested in order to label leukocytes in whole blood samples. Using cellular separation techniques in density gradients and acquisition of images in gamma camera of radioactivity distribution in Percol, it was observed that the white cells labeling achieved was selective and with high efficiency for leukocytes (in all cases, it was superior to 70 %), optimal reproducibility, low cost and low cellular toxicity. KEY WORDS: Leucocyte labelling. Phagocytosis. Colloid. Infection imaging. INTRODUCCIÓN Los primeros métodos de marcación de leucocitos se basaron en la captación de un radiofármaco mediante la capacidad propia de este tipo de células de fagocitar partículas 1,2 . Para este fin se prepararon compuestos coloidales o partículas para marcar con 99m Tc. Estos fueron dejados de lado cuando surgen en el mercado radiofármacos lipofílicos capaces de ingresar en el leucocito atravesando la membrana celular (Ej. 99m Tc-Exametazina –HMPAO e 111 In– oxima) 3,9-12 . Evidentemente, dado que todas las membranas celulares son lipofílicas, esta última metodología requiere la separación de leucocitos previa a la marcación, siendo una ventaja para los métodos que utilizan la capacidad fagocítica, la posibilidad de realizarlos en una muestra de sangre entera, tal como lo demostraron Hanna R et al 4,5,14 (fig. 1). En experimentos de separación celular en gradiente de densidad, Hanna et al demostraron que un 80 % de la actividad se une a leucocitos, mientras que Mock y English discuten el método asegurando que un importante porcentaje se une a eritrocitos 6 . En el presente trabajo se muestra por centelleografía de columnas de Percol 90 % (gradiente de densidad) que la actividad se concentra en proporciones mayores al 70 % en la capa leucocitaria coincidentemente con lo que demuestran otros autores usando métodos autorradiográficos 7 . El coloide de F 2 Sn- 99m Tc es de fácil preparación, es económico y reduce la manipulación de muestras de sangre, dado que no requiere la separación de leucocitos. Frente a estas considerables ventajas, este radiofármaco, deberá probarse en estudios “in vitro” de quimiotaxis e “in vivo” en convalidación clínica y comparación con otros productos 8,13 . originales Marcación de leucocitos utilizando coloide estannoso- 99m Tc a partir de muestras de sangre entera G. RABILLER, L. QUESTA, R. GALLI, F. VISCUSI, E. EL T AMER Centro de Medicina Nuclear del Hospital de Clínicas José de San Martín. Universidad de Buenos Aires. Comisión Nacional de Energía Atómica. Buenos Aires. Argentina. Recibido: 22-10-02. Aceptado: 30-06-03. Correspondencia: Bioq. G. RABILLER DE LIS Centro de Medicina Nuclear del Hospital de Clínicas José de San Martín. Universidad de Buenos Aires Comisión Nacional de Energía Atómica Avda. Córdoba 2351 Ciudad de Buenos Aires 1120 Argentina E-mail: [email protected]38 22 Rev Esp Med Nucl, 2004;23(1):22-6
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Resumen.—Se presenta la preparación de un radiocoloideque permite la marcación de leucocitos utilizando sucapacidad de fagocitosis. Dado que esta función es exclusivade los glóbulos blancos, no ejerciéndola otras célulassanguíneas, se probó la utilización de un coloide de fluoruroestannoso marcado con 99mTc (F2Sn-99mTc) a fin de marcardichas células en muestras de sangre entera. Mediantetécnicas de separación celular en gradientes de densidad yadquisición de imágenes en cámara gamma de la distribuciónde radioactividad en tubos con Percol 90%, se observó que lamarcación lograda es selectiva y de alta eficiencia paraleucocitos (en todos los casos fue mayor del 70 %), óptimareproducibilidad, bajo costo y baja toxicidad celular.
PALABRAS CLAVE: Marcación de leucocitos.Fagocitosis. Coloide. Imágenes de infección.
LABELING OF LEUKOCYTES USING STANNOUS99MTC-COLLOID IN WHOLE BLOOD SAMPLES
Summary.—This paper presents the preparation of aradiocolloid that still makes it possible to label leukocytes usingits fagocitosis capacity. Given that this function is exclusively ofthe white blood cells, not being exercised by other blood cells,the use of a stannous fluoride radiocolloid labeled with 99mTc(F2Sn-99mTc) was tested in order to label leukocytes in wholeblood samples. Using cellular separation techniques in densitygradients and acquisition of images in gamma camera ofradioactivity distribution in Percol, it was observed that thewhite cells labeling achieved was selective and with highefficiency for leukocytes (in all cases, it was superior to 70 %),optimal reproducibility, low cost and low cellular toxicity.
Los primeros métodos de marcación de leucocitosse basaron en la captación de un radiofármacomediante la capacidad propia de este tipo de célulasde fagocitar partículas1,2. Para este fin se prepararoncompuestos coloidales o partículas para marcar con99mTc. Estos fueron dejados de lado cuando surgen enel mercado radiofármacos lipofílicos capaces deingresar en el leucocito atravesando la membranacelular (Ej. 99mTc-Exametazina –HMPAO e 111In–oxima)3,9-12.
Evidentemente, dado que todas las membranascelulares son lipofílicas, esta última metodologíarequiere la separación de leucocitos previa a lamarcación, siendo una ventaja para los métodos queutilizan la capacidad fagocítica, la posibilidad derealizarlos en una muestra de sangre entera, tal comolo demostraron Hanna R et al4,5,14 (fig. 1).
En experimentos de separación celular engradiente de densidad, Hanna et al demostraron queun 80 % de la actividad se une a leucocitos, mientrasque Mock y English discuten el método asegurandoque un importante porcentaje se une a eritrocitos6.En el presente trabajo se muestra por centelleografíade columnas de Percol 90 % (gradiente de densidad)que la actividad se concentra en proporcionesmayores al 70 % en la capa leucocitariacoincidentemente con lo que demuestran otrosautores usando métodos autorradiográficos7.
El coloide de F2Sn-99mTc es de fácil preparación, eseconómico y reduce la manipulación de muestras desangre, dado que no requiere la separación deleucocitos.
Frente a estas considerables ventajas, esteradiofármaco, deberá probarse en estudios “in vitro”de quimiotaxis e “in vivo” en convalidación clínica ycomparación con otros productos8,13.
originales
Marcación de leucocitos utilizando coloide estannoso-99mTc a partir de muestras de sangre enteraG. RABILLER, L. QUESTA, R. GALLI, F. VISCUSI, E. EL TAMER
Centro de Medicina Nuclear del Hospital de Clínicas José de San Martín. Universidad de Buenos Aires. Comisión Nacional de Energía Atómica. Buenos Aires. Argentina.
Recibido: 22-10-02.Aceptado: 30-06-03.
Correspondencia:
Bioq. G. RABILLER DE LIS
Centro de Medicina Nuclear del Hospital de Clínicas José de San Martín. Universidad de Buenos AiresComisión Nacional de Energía AtómicaAvda. Córdoba 2351 Ciudad de Buenos Aires1120 ArgentinaE-mail: [email protected]
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MATERIALES Y MÉTODOS
Preparación de coloide estannoso
Se preparó un coloide estannoso a partir de unasolución acuosa de FNa y otra de F2Sn marcándolaposteriormente con 99mTc mediante rotación por unahora. Para este fin se procedió de la siguiente manera:
Se disolvieron 5 mg de FNa en 5 ml de soluciónfisiológica nitrogenada. Este vial se identificó con laletra A.
En otro frasco se pesaron 64 mg de F2Sn que sedisolvieron en 10 ml de solución fisiológica tambiénnitrogenada. Se identifico como vial B.
En un frasco identificado como vial C, secolocaron 4 ml de la solución A y se adicionó 1 ml dela solución B.
A 2,5 ml de elución de 99mTcO4– con una actividad
aproximada de 50 mCi (1850 MBq) se agregó lasolución preparada en el vial C, filtrándolo a través deuna membrana tipo millipore de poro 0,22 um.
El coloide se marcó incubando esta solucióndurante una hora a temperatura ambiente con rotación
continua. Los controles de calidad se realizaron porcromatografía utilizando como fase fija ITLC, y conmetil-etil-cetona o solución fisiológica como fasemóvil. Concluido el proceso de marcación ycontrol de calidad se adicionó 1,5 ml del radiocoloide(99mTc-SnF2) a 20 ml de sangre entera fresca,heparinizada (100 UI/ml) y se mezcló con agitaciónsuave a 37 °C en baño de agua durante 1 hora (fig. 2).
Validación de la marcación de leucocitos
A fin de validar la marcación de leucocitos en unamuestra de sangre entera se siguieron los pasos que sedescriben a continuación:
1. Marcación de leucocitos separados de muestrasde sangre extraída con ACD, sedimentando glóbulosrojos mediante el agregado de HESPAN 6 %(fig. 1B).
2. Marcación de muestras de sangre enteraextraídas con Heparina 100 Ul/ml mediante elagregado directo del radiocoloide (fig. 1A). Todas lasmuestras se incubaron con radiocoloide durante unahora a 37 °C con agitación constante.
3. Centrifugación en Percol 90 % (partículas desílica de 15-30 nm de diámetro revestidas de PVP
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FIG. 1.—A) Marcación de leucocitos en una muestra de sangre entera.B) Marcación de leucocitos separados con Hespan 6 %. Separación
en columnas de Percol 90%.
FIG. 2.—A) Marcación de leucocitos en muestras de sangre entera,separación en Percol y centelleograma. B) Separación con Hespan6 % post-marcación de leucocitos, localización de la capaleucocitaria en columna de Percol y centelleografía en cámaragamma.
–polivinil pinolidona– no dializable)19 ycentelleografía en cámara gamma a fin de observar ladistribución de radioactividad en las capas celulares.El Percol al 90 % se preparó agregando 1 ml de ClNa1,5 molar a 9 ml de Percol al 100 %. De esta soluciónse tomaron 6 ml y se colocaron en tubos de centrífugade aproximadamente 10 ml. Esta operación se realizósiempre por duplicado. Sobre la superficie de uno deellos se agregó 1 ml de sangre entera marcada concoloide y en el otro, 1 ml de leucocitos separados postmarcación de sangre entera con HESPAN al 6 %. Secentrífugo a 150 g (1150 rpm) por 30 minutos. El
Percol es capaz, por si mismo, de generarespontáneamente gradientes, mediante centrifugacióna moderada velocidad. El rango de densidadesformado está dentro de 1,0 y 1,3 g/ml y sonisoosmóticos19. Las células se ubican en la fracciónsuperior mientras que en la fracción inferior lo haceel coloide libre. Ambas columnas fueroncentelleografiadas en cámara gamma (figs. 2A y B)obteniéndose imágenes de la distribución de actividady de los correspondientes perfiles a partir de los cualesse realizó la integración de las distintas áreas.
4. En todas las marcaciones se determinó elporcentaje de células viables mediante el uso de latécnica de coloración de azul tripán y posteriorobservación en microscopio. Para la realización delconteo se uso una cámara de Newbauer procediendodel mismo modo que para un recuento leucocitario. Secontó el número de células coloreadas (azules) quepor alteración de la permeabilidad de la membrana,permitieron el ingreso del colorante al citoplasma, locual indica una alteración de su viabilidad. Se usócomo criterio estadístico el conteo de no menos de200 células y se determinó sobre ellas el porcentaje dealteraciones.
5. Posteriormente se analizó al microscopio lacomposición celular de las capas, localizadas porcentelleografía en cámara gamma respetando ladistribución de radioactividad, habiendo en la capasuperior más del 80 % de leucocitos. La distribuciónde la radioactividad guarda la misma proporción.
RESULTADOS
Eficiencia de marcación del radiofármaco
El control cromatográfico en ITLC mostró que lapreparación del coloide permitía la obtención de unradiofármaco con 90 % + /– 0,4 % de eficiencia demarcación (n = 10) (figs. 3A y B).
Eficiencia de marcación de leucocitos
Las muestras de sangre entera heparinizadas(100 U.I./ml) se marcaron con radiocoloide.
a) La eficiencia de marcación de leucocitos fuedeterminada en Percol según el método ya descripto.El porcentaje de actividad en la fracción leucocitariafue del 74 % + /– 4 % (siendo n = 5). Mediante un
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Cromatografía ITLC en MEK
Cromatografía ITLC en Sol. Fis.
Radiocoloide
99mTc
Radiocoloide
Productos intermedios
FIG. 3.—A y B) Control de calidad cromatográfico del radiocoloide.
A
B
microscopio óptico se corroboró que el 80 % de lascélulas que componían esta capa eran leucocitos.
b) Se separaron leucocitos a partir de alícuotas desangre entera marcada, según procedimientosconvencionales. Luego las fracciones leucocitarias sesembraron en columnas de Percol al 90%.
Se comparó la ubicación de la capa leucocitariaidentificada mediante la observación en elmicroscopio y centelleografía en cámara gamma, conla capa de mayor concentración de actividad de lamuestra de sangre entera marcada. Se observó queambas capas resultaron coincidentes (fig. 1 y figs. 2Ay 2B).
Control de calidad directo
Otra fracción de estas muestras de sangre enteramarcada se centrifugó a 200 g, según lo indicado en elmétodo de Hanna et al4,5, y se determinó la actividad enplasma y en la fracción celular. Considerando que enesta última, los leucocitos, exclusivamente tienencapacidad de fagocitosis, se determinócuantitativamente la eficiencia de marcación siendo de75% + /– 4% (para n = 5).
Viabilidad celular
El porcentaje de células viables fue del 95 % + /–2 %, es decir, no más del 7 % alteró su viabilidaddurante la marcación (fig. 4).
DISCUSIÓN
Si bien existen antecedentes en la bibliografíaacerca de la marcación de leucocitos, aprovechandosu capacidad fagocítica mediante un radiocoloide enmuestras de sangre entera, esta técnica ha sidodiscutida por algunos autores quienes argumentanuniones inespecíficas a eritrocitos.
Por este motivo se han utilizado otrosradiofármacos, tales como el HMPAO-99mTc yOxima-In11115. El costo de estos productos esgeneralmente elevado; además la ventaja de noseparar leucocitos previos a la marcación, evitandomanipuleos riesgosos para el paciente y el operador,motivaron la realización del presente trabajo.
Los resultados evidencian la posibilidad de marcarleucocitos en las condiciones descriptas, aclarando la
controversia planteada por algunos autores. Laactividad no asociada a células puede eliminarsecentrifugando la muestra de sangre marcada durante5 minutos a 150 g (1.500 rpm), separando el plasma yagregando el mismo volumen de solución fisiológicapreviamente a la reinyección.
Un radiofármaco similar se encuentra disponiblecomercialmente, no obstante, el utilizado en estaexperiencia fue preparado en nuestro laboratorio. Sibien contamos con campana de flujo laminar y elequipamiento necesario para obtener un productoestéril, el mismo se preparó sólo con la finalidad deensayarlo “in vitro”.
En una etapa futura, se propondrá para sufraccionamiento y liofilización, en áreasrecomendadas a tal efecto16,17.
A fin de completar los estudios radiofarmacéuticosde este producto próximamente se realizarán ensayosde estabilidad del radiocoloide y se completarán laspruebas de viabilidad celular analizando la quimiotáxisde los leucocitos marcados18. La estabilidad de lascélulas marcadas ya fue estudiada por Hanna et al en19844.
CONCLUSIÓN
La preparación de este radiocoloide permite lamarcación de leucocitos utilizando su capacidad defagocitosis aún en presencia de otras célulassanguíneas. Mediante esta técnica la marcación deleucocitos es selectiva, de alta reproducibilidad, bajocosto, baja toxicidad celular y fundamentalmente altaeficiencia de marcación celular (superior al 70%).
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FIG. 4.—Foto de campo microscópico, donde se observa una célulacoloreada que indica alteración de su viabilidad.
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