13
Julio de 2016 Estancia en el CBM Severo Ochoa Livia Lisi Vega
Julio de 2016
Estancia en el CBM Severo Ochoa
Livia Lisi Vega
1
Presentación
Esta memoria busca recopilar las distintas actividades realizadas durante mi estancia en el Centro de Biología Molecular Severo Ochoa durante la semana del 4 al 8 de Julio de 2016. Esta estancia ha sido posible gracias a la disponibilidad del CBMSO y a la iniciativa de la Olimpiada Española de Biología, la cual nos obsequió con una estancia en un centro del CSIC por haber llegado a la fase nacional celebrada en Vigo en abril de este año.
La estancia
Lunes 4 de Julio de 2016
El primer día de la estancia, fuimos recibidos por Begoña Aguado y Almudena Hernando antes del comienzo de la jornada. Ambas nos explicaron la dinámica del centro, y nos hicieron un esbozo de las distintas actividades que realizaríamos durante nuestra estancia allí.
Animalario
Terminada la bienvenida, nos dirigimos al animalario donde nos esperaban ya con batas y calzas desechables para iniciar nuestro recorrido por las instalaciones. Una vez que estuvimos apropiadamente vestidos, nos llevaron por las diversas partes del animalario, enseñándonos las distintas cabinas según el nivel de bioseguridad y explicándonos los procedimientos según el nivel del que se tratase.
Posteriormente, nos llevaron a ver por dentro las salas donde se encontraban los ratones y las ratas que se usan para las distintas líneas de investigación mientras nos explicaban los cuidados y precauciones que había que tener con ellos.
Para terminar la visita al animalario pasamos a ver las especies acuáticas que también se usan en el centro de investigación. La especie mayoritaria era el pez cebra, del cual nos explicaron sus cuidados y su ciclo de vida, así como los usos y utilidades que esta especie tiene en la investigación.
Fermentación
Tras la visita al animalario, fuimos al servicio de fermentación. Allí nos esperaban Alberto Rastrojo, Alberto Domingo y Maribel Carrascal, quienes nos explicaron en qué consistiría la práctica y poniéndonos rápidamente manos a la obra.
2
La práctica consistió en la realización de algunas técnicas básicas de microbiología:
1. Hicimos nuestra firma microbiológica digital con el fin de observar la cantidad de bacterias que teníamos en las manos y cómo ello podría afectar a nuestras muestras si no realizábamos unas buenas prácticas y una correcta utilización de los instrumentos de laboratorio. Para ello, simplemente presionamos con la palma de la mano una placa estéril con medio de cultivo, la cual dejaríamos incubar a 37ºC hasta el día siguiente.
2. Realizamos la inoculación de cepas de E. Coli en medio líquido con el objetivo de medir la turbidez, la curva de crecimiento, el tiempo de generación, la tasa de división y la tasa de producción de una proteína recombinante, la Green Fluorescent Protein (GFP), que emite bioluminiscencia en la zona verde del espectro visible y que producirían aquellas E.Coli que contuviesen el plásmido portador del gen. Todos los distintos procesos de inoculación, espectrofotometría, etc, nos sirvieron para familiarizarnos con el trabajo en condiciones estériles, las cabinas de bioseguridad y el manejo de los distintos utensilios de laboratorio.
3. Aprendimos distintos procesos para el aislamiento y recuento de microorganismos, como la realización de diluciones y su posterior siembra, y también practicamos varias técnicas de siembra en medio sólido, como la siembra por agotamiento de asa en superficie y la siembra con estrías cruzadas.
4. Finalmente, hicimos pruebas de sensibilidad de una cepa bacteriana a diferentes antibióticos mediante distintos ensayos; uno en medio sólido, que consistía en un antibiograma por difusión, y uno en medio líquido, consistente en hallar la concentración mínima inhibitoria.
Siembra por estrías escocesas Siembra por agotamiento
3
Martes 5 de Julio de 2016
Cultivos celulares
La primera actividad programada era la visita al servicio de cultivos celulares, donde nos recibió Mercedes Dávila. Lo primero que hizo fue explicarnos el protocolo de trabajo en las condiciones de ese laboratorio y cómo variaban las instalaciones, etc., según el nivel de bioseguridad en el que se estuviese trabajando.
Luego pasó a explicarnos y demostrarnos cómo se pasaban células en una cabina de flujo laminar y nos explicó cómo la planificación era crucial a la hora de experimentar con cultivos celulares, debido a los distintos tiempos de incubación y a la tasa de división de las distintas células. Nosotros trabajamos en concreto con las células BHK y las células HEK. Las primeras eran células de riñón de hámster bebé y las segundas eran células humanas.
Antibiogramas Concentración mínima inhibitoria
Mercedes realizando el pase de las células BHK
4
Una vez realizado el pase de células, procedimos a mirarlas por el microscopio y a realizar un recuento de las células mediante el método de la cámara de Neubauer, para determinar de manera aproximada la densidad celular de nuestro cultivo. Gracias a este cálculo, pudimos determinar la cantidad de células que habría en las muestras que utilizaríamos al final de la semana en microscopía óptica y confocal.
Por último, Mercedes nos explicó algunos servicios concretos de ese departamento, como el análisis de micoplasmas en muestras celulares mediante el empleo de unas células HEK especiales denominadas células HEK blue.
Fermentación
A las 11:00 volvimos a fermentación para recoger los resultados de la práctica anterior. Fue muy curioso observar nuestra firma microbiológica y la nitidez con la que los antibiogramas y las diluciones mostraban la resistencia de las bacterias a determinados antibióticos. Para terminar, observamos las placas que habíamos sembrado el día anterior con rayos U.V. donde observamos la bioluminiscencia que producía la GFP en aquellas muestras donde se había inducido su producción.
Microscopía electrónica
Aquí nos recibió Germán Andrés, el encargado de este servicio. Primero nos explicó las bases teóricas de las distintas microscopías, y nos comparó la microscopía óptica y la electrónica, destacando las ventajas e inconvenientes de cada una. También nos explicó las técnicas de señalización que se pueden utilizar para detectar distintos elementos en la muestra que está siendo observada al microscopio; como la inmunofluorescencia directa o indirecta.
Bioluminiscencia de la GFP bajo rayos U.V.
5
Rejillas donde se deposita la muestra para poder verla en el microscopio electrónico
Microcortes de la muestra citológica
Tras mostrarnos las diferentes partes del microscopio electrónico que posee el centro y enseñarnos los soportes para las muestras, nos presentó a Milagros Guerra, que se encargaría de hacernos una demostración de la preparación de una muestra. Se trataba del virus de la peste porcina africana (PPA) y nos mostró como se prepararía para verla en el microscopio electrónico y desglosó los distintos pasos a seguir para realizar una tinción negativa de los virus.
Luego, Milagros y Germán nos hablaron de los diferentes microtomos que había en el laboratorio y de los distintos procedimientos para la preparación de muestras, etc., según el microtomo a utilizar. Después de la explicación, Milagros se dispuso a realizar una demostración del funcionamiento del ultramicrotomo, el cual pudimos observar en plena acción mediante la lupa, lo que nos dejó a todos fascinados.
Visión con lupa del ultramicrotomo
6
Vainas de mielina
Microtúbulos
Por fin llegó el momento de poner en marcha el microscopio electrónico y de observar las muestras realizadas. En esta parte, Germán nos enseñó no solo el virus de la PPA, sino también fotos realizadas a las muestras de otros investigadores. Tuvimos, por tanto, la oportunidad de observar distintas estructura biológicas tal y como aparecen al microscopio electrónico, como la infección de un macrófago por el virus de la PPA, los axones de las neuronas y las vainas de mielina, un corte transversal de un cilio donde se podían observar la organización de los microtúbulos, etc.
Miércoles 6 de Julio de 2016
Cultivos
A nuestra llegada al centro, nos reunimos de nuevo con Mercedes para observar las células que habíamos pasado el día anterior. Para ello, utilizamos el microscopio óptico y observamos las placas de Petri que habíamos sembrado con distinta densidad celular. Mercedes nos señaló las diferencias en la tipología y la fisiología celular entre las células de hámster (cél. BHK) y las humanas (cél. HEK) y también nos hizo notar la diferente disposición y forma que tomaban las células según la densidad celular del cultivo entre otras características.
Proteómica
El siguiente servicio que nos tocó visitar fue el de proteómica. Allí, Anabel Marina nos habló de las nociones de proteómica y nos describió el funcionamiento del espectrómetro de masas y
Cortes transversales de neuronas Cortes transversales de cilios
7
en qué consistía el mapeo peptídico. Seguidamente, nos explicó cómo se realizaría un mapeo peptídico en el caso concreto de la GFP, la proteína con la que habíamos trabajado en fermentación.
Después de la explicación en el servicio nos enseñaron cómo se prepararía la muestra para su utilización en el espectrómetro de masas. Desgraciadamente, una vez preparada la muestra, resultó que una bombilla del espectrómetro de masas no se iluminaba, impidiendo disparar la muestra con el láser para su análisis, por lo que no pudimos ver el proceso completo. Por suerte, las encargadas del servicio de proteómica ya habían realizado anteriormente el proceso con la muestra de GFP, y pudimos observar el resultado final.
Por último, nos mostraron cómo habría que terminar de confirmar que la proteína de la muestra era GFP mediante la comparación de los datos de su mapeo peptídico con los de una base de datos online (Matrix Science-‐ NCBINR).
Genómica y NGS
En genómica fuimos recibidos por Fernando Carrasco, el cual nos explicó en primer lugar las utilidades de los distintos equipos que había en el laboratorio entre los que se encontraban un extractor de ADN, varias máquinas de PCR, una de ellas a tiempo real, el espectrofotómetro.
Al finalizar la explicación, nos guio a otro laboratorio para realizar una extracción de ADN genómico y plasmídico de las E. Coli que habíamos sembrado en fermentación el lunes. Tras un largo proceso conseguimos obtener el ADN plasmídico de las bacterias en 2 Eppendorf; uno de ellos era de las bacterias que carecían de plásmido, como control, y el otro contenía el ADN de una de las cepas de E. Coli que habíamos sembrado y que tenían el plásmido.
Máquina para la extracción automática de ADN
8
Estos Eppendorf los subimos de nuevo al laboratorio de genómica y terminamos nuestra visita analizándolos con el espectrofotómetro y comprobando que los datos de este eran coherentes con lo que suponíamos que pasaría con cada muestra según sus características.
Visita al laboratorio del Dr. Alcamí
Tras haber sido invitados por el centro a comer, nos dirigimos al laboratorio del Dr. Alcamí. Allí nos recibieron de nuevo Alberto Rastrojo y Alberto Domingo y nos contaron las distintas prácticas que haríamos. Por un lado realizamos una digestión del plásmido de las E. Coli que codificaba para la proteína GFP mediante enzimas de restricción.
Hicimos 3 tipos de digestiones con la intención de comprobar los distintos resultados que esto producía:
1. Una digestión con la enzima XbaI procedente de la bacteria Xanthomonas badrii. 2. Una digestión con la enzima HindIII procedente de la bacteria Haemophilus influenzae. 3. Una digestión doble con ambas enzimas, la XbaI y la HindIII.
Mientras se incubaban las muestras calculamos las distintas longitudes de los fragmentos resultantes según el tipo de enzima que hubiese realizado la digestión para luego poder comparar con los resultados de la electroforesis en gel de las muestras, la cual separaría los fragmentos de ADN plasmídico en función de su longitud.
Una vez terminada la digestión procedimos a cargar los geles de agarosa con las muestras y un marcador, el genoma del virus φ-‐29 digerido por la enzima HindIII. Cuando terminó la electroforesis, pudimos observar la placa de agarosa en los rayos U.V. y comparar los fragmentos en los que se había separado el plásmido con los fragmentos del genoma del virus, de los cuales conocíamos el número de pares de bases para concluir la longitud de los distintos fragmentos de plásmido.
Sin embargo, los resultados no nos coincidieron con los que habíamos deducido, y tras analizarlo más detenidamente concluimos que se había producido una digestión parcial del plásmido por parte de la enzima XbaI, dando por terminada la jornada con este fascinante resultado.
Muestra de control y muestra con ADN plasmídico
9
Jueves 7 de Julio de 2016
Transgénesis de Drosophila
Antes de llegar al laboratorio donde se realizan las transgénesis, Almudena Hernando nos enseñó las instalaciones de las que dependía el departamento de biología del desarrollo. Desde las cabinas con distintas temperaturas donde se mantenía a miles de Drosophilas hasta la cocina donde se producía la papilla que estas necesitan para poder crecer en los tubos donde las guardan.
Cuando llegamos al laboratorio, Eva Caminero y Mar Casado nos dieron una calurosa bienvenida y rápidamente nos comenzaron a explicar diversos conceptos de la biología del desarrollo, así como los distintos organismos modelo que se utilizan y subrayaron la idoneidad de la Drosophila pues esta es fácilmente modificable genéticamente gracias a que solo posee 4 cromosomas. También nos mostraron el ciclo de vida de la Drosophila ayudándose de varios tubos que habían cogido de la incubadora y donde había moscas en los distintos estadíos.
Luego pasamos a la parte práctica; donde con ayuda de Eva y Mar recolectamos embriones de Drosophila de uno de los tubos con moscas. Una vez separados, ambas nos mostraron cómo alinear los embriones en la posición correcta para la posterior microinyección con ayuda de una lupa. Esta tarea nos resultó realmente difícil y tras alinear unos cuantos procedimos a colocarlos en un portaobjetos para, con ayuda del microscopio, poder microinyectarlos con el ADN de interés.
Tubo con Drosophilas en distintos estadíos del ciclo vital Embriones de Drosophila
10
Bioinformática
En este servicio nos esperaban Ramón Peiró y David Abia, cada uno encargado de tareas distintas. David fue el primero en recibirnos con una breve introducción sobre las utilidades y los usos de la bioinformática. Una vez terminada la introducción, se centró en mostrarnos cómo era el proceso para hallar la estructura cristalina de una proteína y cómo compararla con otras similares a partir de una base de datos de secuencias. Para ello, utilizamos bases de datos como BLAST y programas como Jalview a partir de la información de la GFP codificada por las E.Coli que habíamos venido obteniendo en los distintos laboratorios durante toda la estancia.
Al terminar de ver los distintos diseños 3D de la proteína GFP y la animación de una bicapa lipídica que nos dejó maravillados, bajamos en compañía de David y Ramón al sótano, donde nos enseñaron la sala donde se encontraban todos los discos duros y sistemas que formaban la red informática del centro.
Después de la visita, pasamos a la parte de genómica. Allí nos explicaron las nociones básicas de secuenciación masiva y del análisis computacional NGS. Ramón hizo especial hincapié en el método del RNAseq y nos enseñó los formatos FASTA y FASTQ para trabajar con secuencias de ADN sacadas de la base de datos del European Nucleotide Archive (ENA).
Seguidamente, nos mostró cómo se realizaría un análisis de calidad y nos explicó el significado de cada uno de los parámetros que medía el programa que lo realizaba (FastQC). Finalmente, procedimos al alineamiento del genoma con los datos de las secuencias de ADN y a organizarlos en un Heatmap donde se indicaban los niveles de expresión génica en función de colores.
Viernes 8 de Julio de 2016
Microscopía Óptica y Confocal
En este servicio nos atendieron Carmen Sánchez y María teresa Villalba. Allí iniciamos nuestra visita realizando una serie de preparaciones y tinciones a las células BHK que habíamos cultivado con Mercedes el martes. Realizamos una tinción del citoesqueleto de las células con Actin Green y una tinción de los núcleos con Dapi y, a otras células diferentes (esta vez vivas y no fijadas), las teñimos con MitoTracker Green para poder observar las mitocondrias. Durante el proceso, María nos fue explicando las distintas técnicas de tinciones y el porqué de los distintos pasos como la permeabilización o la aplicación de una solución de bloqueo a las células antes de incubarlas con el tinte.
Mientras dejábamos actuar el tinte en las células, fuimos con Carmen a ver el microscopio óptico. Tras observar sus distintos componentes, Carmen nos explicó el objetivo de la microscopía confocal y diversos fenómenos de fluorescencia como la inmunofluorecencia, y habló de cómo observaríamos después las células que estábamos incubando. Pasado un rato, María trajo las células para que las pudiésemos ver al microscopio, y nos pusimos manos a la
11
obra. Gracias a las tinciones según la radiación que Carmen le suministraba a la muestra podíamos apreciar los núcleos y el citoesqueleto de las células.
Luego cambiamos de muestra y observamos las mitocondrias de las células de la otra muestra mientras Carmen establecía una serie de parámetros para que el ordenador hiciese miles de fotos durante un intervalo de tiempo. Gracias a esto, una vez que todos habíamos observado la muestra a través del microscopio, pudimos ver el vídeo que resultó de las miles de fotos tomadas por el ordenador y apreciar el sutil pero vital movimiento de las mitocondrias dentro de las células vivas.
Citometría de flujo
Nuestra última parada fue el laboratorio de citometría con Berta Raposo. Berta explicó las aplicaciones de este servicio y nos informó sobre los departamentos que más utilizaban el servicio y de cómo contribuía a las distintas líneas de investigación. También nos habló de cómo funcionaba un citómetro y nos enseñó a interpretar de manera básica los resultados de este y qué significaban en función de las condiciones de la muestra.
Nos condujo después a un citómetro que a su vez seleccionaba las células en base a la señal fluorescente que estas emitían y nos advirtió de la necesidad de introducir una serie de parámetros de corrección según los reactivos usados en las células, mostrándonos para terminar cómo habría que introducirlos en el ordenador y los parámetros a tener en cuenta.
Una vez terminada la sesión en citometría había llegado la hora de despedirse del centro. Antes de poner rumbo a nuestros hogares, Begoña y Almudena nos dieron una motivadora charla acerca de la investigación y nos despidieron calurosamente.
Valoración personal
Disfruté mucho a lo largo de toda la semana y el viernes me marché muy agradecida tanto a la Olimpiada de Biología como al Centro de Biología Molecular Severo Ochoa por darme la oportunidad de vivir esta experiencia.
Ejemplos de microscopía de fluorescencia
12
Fue una semana intensa y ajetreada, pero que se pasó volando gracias a lo entretenidas que eran las actividades que realizamos. Las que más me gustaron fueron aquellas en las que nos dejaban hacer los distintos procesos y experimentos a nosotros mismos en lugar de observarlos simplemente. Fueron estas actividades prácticas las que nos permitieron familiarizarnos con los distintos instrumentos y el protocolo del laboratorio así como llegar a comprender la paciencia y delicadeza necesarias para este fascinante trabajo. Nos llevamos, además, una muy buena primera impresión del ambiente que hay en un laboratorio de investigación y de su dinámica, cosa que me encantó, pues es a lo que planeo dedicarme en un futuro.
Livia Lisi Vega
