MÉTODOS DE SIEMBRA

Agotamiento Masivo

Secreciones, coprocultivo, Para líquidos.repique de tetrationato y BHI.

Rejilla Antibiograma

Para urocultivo con asa 1, 2 y 3 masivos con calibrada (10 l ). escobillón. Debe ser un rayado homogéneo.

*Nota: Todos los cultivos se incuban por 48 horas excepto las orinas que se incuban a 24 horas (cuando es de punción suprapúbica se incuba por 48 horas)

TIPO DE MUESTRA MEDIO DE CULTIVO TÉCNICA DE SIEMBRA RECOMENDACIONES

Orina0-11-5 Bacterias en el 5-10 gram>10

1. Agar Mc Conkey.2. Agar sangre.

Primero en McK y luego en agar sangre.

1. Agotamiento2. Rejilla.

Con asa calibrada (10λ)

El frasco de orina no se descarta si hay que dejar para el PO. Sólo se le hace gram cuando lo piden y se deja una gota sin extenderla en la lámina.

Frotis vaginal 1. A. McK.2. A.S.3. BHI.

Inóculos con el hisopo el cual se toma con pinza estéril.

Agotamiento con asa de argolla.

Gram: En ovillo.Fresco con solución salina y entre lámina y laminilla.

Secreción de ojo 1. A. McK.2. A.S.3. A. Choc.4. BHI.

Inóculo con el escobillón.

Agotamiento con asa de argolla. El escobillón para el inóculo se toma con pinza estéril.

Gram: En ovillo.A.S.: Estría de S. aureus.

Secreción bronquial 1. A. McK.2. A.S.3. A. Choc.

Esputo: A.S., A. McK, y A. Choc.

Agotamiento: Con palillo del BK.

BK: Extendido en lámina.Gram: En ovillo.KOH 10%: Una gota entre lámina y laminilla.

Secreción de oído 1. A. McK.2. A. S. 3. BHI.

Inóculos con escobillón el cual se toma con pinza estéril.

Agotamiento con asa de argolla.

KOH 10%.Gram: Si lo piden.

Coprocultivo 1. A. McK.2. HEA.

1 y 2 por agotamiento.5 cm de caldo + 5 gotas de

No se le hace gram.

3. Caldo de tetrationato. lugol (yodo).LCR 1. Agar chocolate.

2. Agar sangre: Estría del S. aureus.

3. BHI.4. Agar Mc Conkey: No

siempre.

Masiva: Inóculo del sedimento, se toma con chupa estéril.

Gram: Del sedimento, una gota pequeña.Tinta china: Del sedimento, una gota pequeña.KOH 10%: Del sedimento y se monta como un fresco.BK: Una gota del sedimento.

Hemocultivos 1. A. McK.2. A. S.

Agotamiento: Inóculo con la punta de la jeringa, siembra con asa de argolla.

Gram: Una gota.

Líquido pleuralCentrifugar por 10 minutos a 2500 rpm y trabajar con el sedimento. Se guarda el sobrenadante.

1. A. Choc.2. A.S.3. BHI.

Inóculos del sedimento con chupa. También para líquido ascítico (A.S., A. McK) y sinovial( A.S., A. Choc.)

1. Masivo.2. Masivo.3. Una gota.

Si crece en forma de nube en el BHI se debe sospechar de Mycobacterium.

Gram: Una gota.KOH 10%: Entre lámina y laminilla como un fresco (sin KOH) para ver mejor la celularidad, a excepción del líquido peritoneal quirúrgico.

Lavado broncoalveolarCuando está muy líquido se debe centrifugar y tomar del sedimento con chupa estéril.

1. A. Choc.2. A.S.3. BHI.

Masivo. BK y KOH 10%: Una gota.

Líquido peritoneal y quirúrgico

A.S., A. McK, BHI. Agotamiento. Gram.

Líquido amniótico A.S., A. Choc., BHI. Gram.

Semen A.S., A. McK, A. Choc., BHI. Gram.Catéteres y secreciones A.S., A. McK, BHI. Catéter: MAKI.

Secreciones: Agotamiento.Gram.KOH 10% si lo piden.

BATERÍAS BIOQUÍMICAS

TSI (Agar triple azúcar hierro)

- Indicador: Rojo de fenol. Para la detección del sulfuro de hidrógeno se utiliza el tiosulfato de sodio como indicador.- Siembra: En picadura y luego por agotamiento con asa recta. Agar en pico de flauta.- En presencia de ácidos producto de la fermentación de azúcares el medio vira de rojo a amarillo, pues el pH está a menos de 6,8.- Reacciones:

a) Pico alcalino / fondo alcalino: No fermentación de azúcares.b) Pico alcalino / fondo ácido: Fermentación de glucosa únicamente.c) Pico alcalino / fondo ácido: Fermentación de glucosa con

producción de gas H2S.d) Pico ácido / fondo ácido: Fermentación de glucosa y de lactosa

(y/o sacarosa).

INDOL

-Revelador: p-dimetilaminobenzaldehído (reactivo de Erlich o de Kovach).-Técnica: Inocular por picadura e incubar a 35º C durante 18-24 horas. Al finalizar este período añadir 5 gotas de reactivo por la pared interior del tubo. Si se emplea reactivo de Erlich este paso debe ser precedido por la adición de 1ml de cloroformo. Esto no es necesario con el reactivo de Kovach.-El desarrollo de un color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva.

ROJO DE METILO

-Indicador: Rojo de metilo.-Técnica: Inocular el caldo con un cultivo puro del organismo en estudio. Incubar a 35º C durante 48-72 horas. Finalizado este período, añadir directamente al caldo 5 gotas del reactivo rojo de metilo.-El desarrollo de un color rojo estable en la superficie del medio indica que la producción de ácido es suficiente como para bajar el pH a 4,4 y es una prueba positiva. Dado que otros microorganismos pueden producir cantidades menores de ácido a partir del sustrato, es posible el desarrollo de un color naranja intermedio entre el amarillo y el rojo. Esto no indica una prueba positiva.

VOGES-PROSKAUER

-Reveladores: a) -naftol al 5% como intensificador de color (-naftol = 5 g;

alcohol etílico absoluto = 100 ml).b) Hidróxido de potasio al 40% como agente oxidante (KOH = 40 g;

agua destilada = 100 ml).-Técnica: Inocular un tubo de caldo RM / VP con un cultivo puro del microorganismo en estudio. Incubar durante 24 horas a 35º C. Al finalizar este período, transferir 1 ml de caldo a un tubo de ensayo limpio. Añadir 0,6 ml de -naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40% (6 gotas de -naftol y 2 gotas de KOH al 40%). Es esencial adicionar los reactivos en este orden. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejarlo reposar durante 10 - 15 minutos.-Una prueba positiva está indicada por el desarrollo de un color rojo a los 15 minutos de añadir los reactivos, revelando la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína. La prueba no debe leerse luego de más de una hora pues los cultivos como este negativos pueden producir un color cobrizo, con la posibilidad de una interpretación falsa positiva.

CITRATO

-Indicador: Azul de bromotimol, amarillo a pH menor que 6 y azul a pH mayor de 7,6.-Técnica: Inocular (inóculo escaso) en una sola estría con asa recta en el pico del agar inclinado (agar en pico de flauta). Si el inóculo es demasiado abundante los compuestos orgánicos preformados dentro de las paredes celulares de las bacterias que van muriendo pueden liberar suficiente carbono y nitrógeno como para producir un resultado falso positivo. Al trabajar con series es importante estriar primero el medio con citrato a fin de evitar el arrastre de proteínas e hidratos de carbono de los otros medio.-El agar es originalmente de color verde; el desarrollo de un color azul intenso en 24-48 horas indica una prueba positiva y revela que el microorganismo ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con la formación de productos alcalinos. La prueba es también positiva en ausencia de color azul si existe un desarrollo visible de colonias a lo largo de la estría de inoculación. Esto es posible debido a que para que el organismo sea visible, debe encontrarse en la fase logarítmica, lo cual es factible solo si el carbono y el nitrógeno han sido asimilados. Esta interpretación se puede confirmar incubando el tubo durante 24 horas más, en que usualmente aparece un color azul.

UREA

-Indicador: Fenolftaleína (incolora a pH <8,1; rosa-rojo a pH >8,1).-Técnica: Estriar la superficie del agar en pico de flauta con el microorganismo en estudio. Incubar a 35º C durante 18-24 horas.-Los microorganismos que hidrolizan urea rápidamente pueden producir reacciones positivas en 1 o 2 horas, las especies menos activas pueden requerir 3 o más días.-Reacciones:

a) Degradadores rápidos de urea: Color rojo en todo el medio. Ureasa fuerte (color fucsia).

b) Degradadores lentos de urea: Color rojo inicial solo en el pico y gradualmente abarca todo el tubo.

c) No hay hidrólisis de urea: Color amarillo original.

FENILALANINA DESAMINASA (PPA)

-Revelador: Cloruro férrico al 10%. No tiene indicador de pH.-Técnica: Inocular una estría en la superficie del agar en “pico de flauta” con una colonia de cultivo puro. Luego de incubar a 35º C durante 18-24 horas, añadir 4-5 gotas de reactivo cloruro férrico al 10% directamente sobre la superficie del agar. Al añadir el reactivo, rotar el tubo para desprender las colonias de la superficie.-La inmediata aparición de un color verde intenso (quelación del hierro) indica la presencia de ácido fenilpirúvico (quela el hierro del cloruro férrico) y es una prueba positiva.

LIA (Agar Lisina Hierro)

-Indicador: Púrpura de bromocresol.-Técnica: Sembrar en doble picadura y estriar la superficie del agar en “pico de flauta”, incubar a 35º C durante 18-24 horas.-Trabaja sobre la glucosa, a las 10 horas de incubación se ve amarillo en el fondo (fermentación de la glucosa), baja el pH (inicialmente estabilizado a 6,0) por la producción de ácido pirúvico y en ese momento se dispara la enzima lisina descarboxilasa (activa a pH <5,5) y empieza a trabajar sobre la lisina, a las 24 horas se vuelve alcalino por la producción de aminas y el medio toma un color púrpura indicando una prueba positiva. Por el tiosulfato y el citrato amónico férrico se puede producir gas.

MALONATO

-Indicador: Azul de bromotimol. Caldo estabilizado a pH de 6,7.-Técnica: Inocular el caldo con una colonia de cultivo puro del microorganismo en estudio.-Un microorganismo es incapaz de crecer en el caldo a menos que pueda utilizar el malonato como única fuente de carbono.-Reacciones:

a) Positivo: Color azul intenso en todo el caldo. Alcalino (pH 7,6).b) Negativo: No hay cambio de color (verde) o se vuelve amarillo (pH 6)

pues únicamente hay fermentación de glucosa.

MOTILIDAD

-Se emplean tubos con agar semisólido. Los medios contienen concentraciones de agar de 0.4% o menos para permitir la libre diseminación de los microorganismos.-Técnica: Se siembra por picadura pero solo medio centímetro de profundidad.-La prueba se interpreta realizando un examen macroscópico del medio para observar una zona de desarrollo difuso que parte de la línea de inoculación.-En la mayoría de las especies móviles , la movilidad puede observarse a 35ºC; pero Yersinia enterocolítica y Listeria monocytogenes son móviles únicamente a 22º C.

ONPG (O-NITROFENIL-B-D-GALACTOPIRANOSIDO)

-Técnica: Emulsificar un asa cargado de desarrollo bacteriano en 0,5 ml de solución fisiológica hasta producir una suspensión abundante. Añadir a dicha suspensión una gota de tolueno y mezclar unos segundos para liberar la enzima B-galactosidasa de las células bacterianas. Añadir a la suspensión igual cantidad de solución de buffer de ONPG y colocar la mezcla en baño de agua a 37º C.-Interpretación: La velocidad de hidrólisis del ONPG a ortonitrofenol puede ser elevada en algunos microorganismos, produciéndose una acción que se visualiza por la aparición de un color amarillo en 5 a 10 minutos. La mayoría de las pruebas son positivas en una hora; sin embargo, las reacciones no se deben interpretar como negativas antes de las 24 horas de incubación. El color amarillo suele ser bien definido e indica que el organismo ha producido ortonitrofenol a partir del sustrato ONPG por acción de la B-galactosidasa.

Microorganismo

TSI H2S/GAS LIA CITRATO UREA PPA INDOL MOTILIDAD RM VP MALONATO

E. coli A/A - / + K/K - - - + + (-) + - -E. coli inactiva K/A - / + K/K - - - + + (-) + - -E.coli indonógena

A/A - / + K/K - - - - + (-) + - -

Shigella boydii K/A - /+ K/A - - - - (+) - + - -Shigella dysenteriae

K/A - / - K/A - - - Var. - + - -

Shigella flexneri K/A - / - K/A - - - Var. - + - -Shigella sonei K/A - / - K/A - - - - - + - -Salmonella tiphy K/A + / - K/K - - - - + + - -Salmonella paratiphy A

K/A - (++) / + K/A - - - - + + - -

Salmonella choleraesuis

K/A Var. / + K/K - (+) - - - + + - -

Citrobacter freundii

K/A ++ / + K/K(A) + + (-) - - + + - - (+)

Citrobacter diversus

K/A - / + K/K(A) + + / - - + + + - +

Klebsiella oxytoca

A/A - / + K/K + + - + - - + +

Klebsiella pneumoniae

A/A - / + K/K + + - - - - + +

Klebsiella rhinoscleromatis

K/A - / - K/A - - - - - + - +

Serratia liquefaciens

K(A)/A - / + (-) K/K + - - - + - + -

Serratia K/A - / Var. K/K + - (+) - - + - + -

marcescensSerratia rubidae A/A - / - (+) K/K(A) + - - - + (-) - + +Enterobacter aerogenes

A/A - / + K/K + - - - + - + + (-)

Enterobacter agglomerans

K(A)/A - / - (+) K/A Var. - (+) - (+) - (+) + (-) - + (-) + (-)

Proteus mirabilis K/A ++ / + KR/A (+) - + + - + + -(+) -Proteus vulgaris K/A ++ / + (-) R/A - (+) + + + + + - -Providencia stuartii

K/A - / - R/A + - + + + (-) + - -

Providencia rettgeri

K/A - / - R/A + + + + + + - -

Morganella morganii

K(A)/A - / + R/A - + + + + + - -

Yersinia enterocolítica

K/A - / - K/A - + (-) - Var. - + - -

Pseudomona aeruginosa

K/K - / - K/K + Var. /+débil

- - + + / - - +

Acinetobacter K/K - / - K/K + Var. - - - + - +Se mira principalmenteTSI, RM y VP.Citrobacter freundii Vs. Salmonella: Hacer polivalente A = Salmonella aglutina.Salmonella y Shigella tienen significado patógeno en coprocultivo.

E. coli : VP (-) Klebsiella Pseudomona = Motilidad (+)A/A Enterobacter VP (+) K/A Acinetobacter = Motilidad (-). Colonias rosadas. Serratia

Citrato (-) = E. coli (-) = Klebsiella. (+) Motilidad (+) = Enterobacter = DNasa (-)

ó Serratia = DNasa (+)

ANTÍGENOS BACTERIANOS EN LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO

LCR

Separar en dos tubos estériles(se deja un poco para el citoquímico)

Tubo 1 Tubo 2

Baño María 100º C Centrifugar por 10 minutos por 3 minutos a 2500 rpm

Reactivos 1-5 del Sedimento Sobrenadante Directigen

Cultivo, gram, KOH, Reactivo 6 Reincubar tinta china del Directigen* en tubo estéril y guardar

Antígenos bacterianos Directigen Meningitis Combo Test

50 µl de LCR + 1 gota del reactivo correspondiente

Agitador 8-10 minutos

Leer por aglutinación

*Con el reactivo 6 no se inactiva el LCR porque es para E. coli que es termolábil, de lo contrario no se verá la reacción.

HEMOCULTIVOS

-Limpiar tapa del frasco:1. Alcohol.2. Alcohol yodado.3. Algodón seco.

-Agita el frasco y tomar con jeringa estéril, quitar la punta de la jeringa y dejar caer una gota como inóculo en el medio de cultivo.

TETRATIONATO

Repicar en AS, McK y XLD por agotamiento. No se debe emulsionar el caldo. El caldo de tetrationato favorece el desarrollo de Salmonella y Shigella, inhibiendo el crecimiento de coliformes hasta 18-24 horas. Antes de usarlo agregar 5 gotas de yodo.

GRAM

1. Flamear para fijar la preparación.2. Violeta de genciana 1 minuto.3. Lavar con agua.4. Lugol 1 minuto.5. Lavar con agua.6. Alcohol acetona 10 segundos.7. Lavar con agua.8. Safranina 30 segundos.9. Lavar con agua.

ZN

1. Flamear lámina para fijar. Se flamea por los bordes externos de la lámina, nunca hacia el centro de la misma.

2. Fuschina y flamear hasta obtener los 3 vapores.3. Lavar con agua.4. Alcohol ácido hasta que no quede nada rojo.5. Lavar con agua.6. Azul de metileno 5 minutos.7. Lavar con agua.

INFORME DE LÁMINAS

-Gram de esputo: Se observa primero en 10X si hay más de 25 PMN y células epiteliales. Se observa si hay biota mixta o única; y si hay predominio de un tipo de microorganismo especial. Se observa si hay presencia de blastoconidias y pseudomicelios. También se informa la cantidad de reacción leucocitaria. Se debe realizar el examen microscópico en 10X para determinar el grado de contaminación, cuantificando células epiteliales y leucocitos: *Clasificación según Barlett. >25 células

epiteliales y <25 PMN no sirve. Microbiota predominante o microbiota mixta: Abundante, escaso o moderado.

*Grupos 1,2 y 3 no se pueden cultivar.

Cuando se observan pocas células escamosas y predominio de bacterias se debe reportar. Si hay ausencia de leucocitos indica que es una muestra mal recolectada, o se trata de un paciente sin respuesta inmunológica. Si se sospecha infección pulmonar por anaerobios, el gram y el cultivo no tienen ningún valor.

-Secreciones de piel: Reacción leucocitaria en número (0-1 x c, 1-5 x c, 6-10 x c, + 10 x c) y microorganismos en abundante, moderado o escaso.

-Hemocultivo: Se informa el tipo de microorganismo que se encuentre pero no se cuantifica.

-Gram de orina: Las bacterias se informan en número = 0-1 x c,1-5 x c, 6-10 x c, + 10 x c.

-BK: Observar toda la lámina e informar así:(-) = No hay BAAR en 100 c. (+) = < 1 BAAR x c en 100 c. En el BK las blastoconidias se ven azules.(++) = 1-10 BAAR x c en 50 c. > 25 PMN y < 25 células epiteliales.(+++) = >10 BAAR x c en 20 c.

-Fresco de frotis vaginal: Se informan las células guía como (+) o (-). En el fresco se observa si hay presencia de Trichomonas, pseudomicelios y blastoconidias. Se informa la respuesta leucocitaria si está aumentada y si es así se buscan pseudomicelios y blastoconidias. Cuando se duda de células guía, se confirman en el gram.

-Gram de frotis vaginal: Las bacterias se informan como abundantes, moderadas o escasas. Las células guía como (+) o (-), las blastoconidias como abundantes, moderadas o escasas y la reacción leucocitaria en número = (0-1 x c, 1-5 x c, 6-10 x c, + 10 x c). El sistema para el diagnóstico de vaginosis bacteriana está dividido en 3 partes:

A. Cuantificación de:

1. Bacilos gram positivos (Lactobacillus spp.).2. Cocobacilos gram variables (G. vaginalis + Bacteroides).3. Bacilos curvos gram negativos (Mobilluncus).

Las bacterias se cuantifican de 1+ a 4+ de acuerdo con el número que se encuentren por campo microscópico.

GRUPO LEUCOCITOS CÉL. EPITELIALES

6 >25 <255 >25 <104 >25 10-253 <25 >252 10-25 >251 <10 >25

0+ = No hay bacterias.1+ = 1 bacteria x c.2+ = 1-4 bacterias x c.3+ = 5-30 bacterias x c.4+ = > 30 bacterias x c.

B. Una vez establecida la cantidad, se asigna un puntaje de acuerdo con la siguiente tabla:

Lactobacillus G. vaginalis y Bacteroides spp.

Mobilluncus

4+ = 0 puntos 4+ = 4 puntos 4+ = 2 puntos3+ = 1 punto 3+ = 3 puntos 3+ = 2 puntos2+ = 2 puntos 2+ = 2 puntos 2+ = 1 punto1+ = 3 puntos 1+ = 1 punto 1+ = 1 punto0+ = 4 puntos 0+ = 0 puntos 0+ = 0 puntos

C. La puntuación final se obtiene sumando los puntos de los 3 grupos.

De 7 o más puntos = Vaginosis bacteriana.De 4 a 6 puntos = Vaginosis intermedia.De 0 a 3 puntos = Normal.

ANTIBIOGRAMA

En agar MH, con una concentración de microorganismos de 0,5 según escala de McFarland (que se vean las letras a través del tubo con caldo CASO). Introducir sólo la cabeza del escobillón estéril, eliminar el exceso contra la pared del tubo, sembrar suave y de manera homogénea. En una caja se pueden colocar hasta 7 antibióticos (se recomienda no colocar sensidiscos en el centro). Con Enterococcus y S. pneumoniae el antibiograma se realiza en agar sangre. En la lectura cuando se encuentra doble halo de crecimiento se mide el interno.

Gram negativos

Sensidiscos R I SCTX (Cefotaxime) ≤14 15-22 ≥23AN (Amikacina) ≤14 15-17 ≥18GM (Gentamicina) ≤12 13-14 ≥15FEP (Cefepime) ≤14 15-17 ≥18CAZ (Ceftazidime) ≤14 15-17 ≥18CRO (Ceftriaxone) ≤13 14-20 ≥21CFPs (Cefoperazone) ≤15 16-20 ≥21

Gram positivos

Sensidiscos R I SCC (Clindamicina) ≤14 15-20 ≥21CF (Cephalotin) ≤14 15-17 ≥18P (Penicilina) ≤28 (Stph) - ≥24 (Strp)

≥29 (Stph)VA (Vancomicina) 10-11 ≥12OX (Oxacilina)* ≤10 11-12 ≥13AM (Ampicilina) ≤28 - ≥29

≥24 (Strp)SXT(Trimetoprim Sulfametoxazol) ≤10 11-15 ≥16SAM (Ampicilina Sulbactam) ≤11 12-14 ≥15*Oxacilina no se le pone a Enterococcus.

Pseudomonas y Acinetobacter (G-)

Sensidiscos R I SCAZ (Ceftazidime) ≤14 15-17 ≥18AN (Amikacina) ≤14 15-16 ≥17CIP(Ciprofloxacina) ≤15 16-20 ≥21ATM (Aztreonam) ≤15 16-21 ≥22FEP (Cefepime) ≤14 15-17 ≥18MEM (Meropenem) ≤13 14-15 ≥16TZP (Piperacilina Tazobactam) ≤17 18-20 ≥21SXT (Trimetoprim Sulfametoxazol) ≤10 11-15 ≥16*Se ponen todos excepto AN y FEP para no repetirlos.

Urocultivos

Sensidiscos R I SAM (Ampicilina) ≤13 14-16 ≥17 (gram -)

≥29 (gram +)SXT (Trimetoprim Sulfametoxazol) ≤10 11-15 ≥17NOR (Norfloxacina) ≤12 13-16 ≥17FM (Nitrofurantoína) ≤14 15-16 ≥17CIP(Ciprofloxacina) ≤15 16-20 ≥21ATM (Aztreonam) ≤15 16-21 ≥22

BLEE (Betalactamasas de espectro extendido) Técnica

Sensidiscos R I SCTX/CLA (Cefotaxime/Ac. clavulánico) ≥22CAZ/CLA (Ceftazidime/Ac. clavulánico)AMC (Amoxicilina/Ac. clavulánico)

Haemophilus influenzae

Sensidiscos R I SCEC (Cefaclor) ≤16 17-19 ≥20MEM (Meropenem) - - ≥20CTX-CRO (Cefotaxime-Ceftriaxone) - - ≥26SXT (Trimetoprim Sulfametoxazol) ≤10 11-15 ≥16AM (Ampicilina) ≤18 19-21 ≥22CLR (Claritromicina) ≤10 11-12 ≥13

E. coli ATCC

Sensidiscos HaloCIP (Ciprofloxacina) 30-40FEP (Cefepime) 29-35AN (Amikacina) 19-26CTX (Cefotaxime) 29-35CAZ (Ceftazidime) 29-35

S. aureus ATCC

Sensidiscos HaloE (Eritromicina) 22-30VA (Vancomicina) 17-21CF (Cephalotin) 29-37OX (Oxacilina) 18-24

*Nota: No pueden pasar más de 15 minutos entre la siembra en MH y la ubicación de los sensidiscos.Las cepas control ATCC se siembran en MH (antibiograma) y en McK (E. coli, por agotamiento) ó en AS (S. aureus, por agotamiento)

ESTÁNDAR INTERPRETATIVO DE LA ZONA DE INHIBICIÓN

MÉTODO KIRBY BAUER

SENSIDISCO E. coliATCC 25922

S. aureusATCC 25923

P. aeruginosaATCC 27853

Amikacina (30) 19-26 20-26 18-26Ampicilina (10) 15-23 27-38 -Ampicilina Sulbactam (10/10) 20-24 29-37 -Aztreonam (30) 28-36 - 23-29Cefaclor (30) 23-27 27-31 -Cefalotin (30) - 29-35 -Cefotaxime (30) 29-35 - 18-22Cefoperazona (75) 28-34 24-33 23-29Ceftazidime (30) 29-35 - 22-29Cefepime (30) 29-35 - 24-30Ceftriaxona (30) 29-35 - 17-23Ciprofloxacina (5) 30-40 22-30 25-33Cloranfenicol (30) 24-27 19-26 -Eritromicina (15) - 22-30 -Gentamicina (30) 19-26 - -Imipenem (10) 26-32 - 20-28Meropenem (10) 28-34 - 27-33Porfloxacina (10) 28-35 17-28 22-29Oxacilina (1) - 18-24 -Penicilina (10 UI) - 26-37 -Trimetoprim Sulfametoxazol (1,25/23,75)

24-32 24-32 -

Vancomicina (30) - 17-21 -Clindamicina (2) - 24-30 -Piperacilina Tazobactam (100/10)

- - -

ESCALA DE McFARLAND

10 tubos tapa rosca, solución de Cloruro de Bario al 1%, solución de Ácido Sulfúrico al 1%.

Tubo BaCl2 (ml) H2SO4 (ml) Concentración bacteriana/ml ( x108)

0,5 0,05 9,95 1,51 0,1 9,9 32 0,2 9,8 63 0,3 9,7 94 0,4 9,6 125 0,5 9,5 156 0,6 9,4 187 0,7 9,3 218 0,8 9,2 249 0,9 9,1 27

10 1,0 9,0 30

IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM POSITIVOS

Catalasa

(+) (-)

*Staphylococcus *Streptococcus

Coagulasa S. pyogenes Bacitracina (+) B-hemolíticos Grupo A (+) (-)

S. aureus S. epidermidis TAXO A Novobiocina (+) S. pneumoniae Optoquina (+)DNasa (+) AB S. saprophyticus Novobiocina (-) TAXO P S. viridans Optoquina (-)

TAXO NB Enterococo Bilis-esculina (+) NaCl (+)

IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM NEGATIVOS

Serie / ABFermentadores = Serie / AB No fermentadores DNasa

Oxidasa

Serie / AB Serie / AB

Oxidasa (-) Oxidasa (+) DNasa (-) DNasa (-)

Enterobacterias Pseudomona (TAXO N)

Se le coloca Oxacilina para investigar “in vitro” la susceptibilidad frente a la Penicilina G. Es sensible a la oxacilina si el halo es ≥20mm. SXT ≥19mm; VA ≥17mm; Clindamicina ≥19mm. No se le pone Penicilina.Si da sensible a la Oxacilina se informa como si lo fuese a la Penicilina G.

*Staphylococcus

S. aureus S. saprophyticus S. epidermidis

Coagulasa + - -DNasa + - -Novobiocina R R S

*Streptococcus

Bacitracina CAMP Bilis-Esculina

NaCl 6,5%

Optoquina Hemólisis

Grupo A S - - - R βGrupo B R + - V R βGrupos C, F, G

V - - - R β

Enterococos R - + + R α, β, γGrupo D no enterococos

R - + - R α, γ

Viridans V - V - R α, γNeumococo V - - - S α

HEMOCULTIVOS

En caldo tioglicolato se informa crecimiento teniendo en cuenta:- Turbidez.- Hemólisis.- Presencia de colonias flotantes.- Presencia de pequeños coágulos.- Presencia de gas.

Si sale positivo para cualquiera de las anteriores posibilidades, se repica en AS y A.McK. Si sale negativo se guarda hasta por 5 días.

UROCULTIVO: Si se observan varios tipos de colonias en un urocultivo indica que es una muestra contaminada. Todo el medio lleno = +100.000 ufc. Negativo = - 10.000 ufc.Se cuentan las colonias (del mismo tipo) y se multiplica por 1000.Cuando en un urocultivo se encuentran colonias blancas sin hemólisis y sin crecimiento en McK debe sospecharse de levaduras, Staphylococcus y Corynebacterium; entonces se debe hacer primero un gram y luego las pruebas correspondientes. Cuando se trata de un urocultivo de una PSP (punción suprapúbica) cualquier colonia (del mismo tipo) que se encuentre sin importar la cantidad es significativa.

TÉCNICA DE MAKI (Cuantitativa)

Para punta de catéter. Se siembra en AS, McK y BHI. Se toma el catéter y se coloca sobre el agar, se hace rotar 5 veces de arriba hacia abajo sobre el agar con ayuda de un escobillón estéril. Luego de hacer la siembra en los dos agares se toma el catéter y se introduce en el BHI.

Se informa a las 24 horas. Si se ven >15 ufc sobre el agar, de los diferentes tipos de colonias es útil. Si hay < 15 ufc sobre el agar, no tiene validez aunque tenga un BHI con crecimiento. Y si no hay colonias, se informa como negativo.

CATALASA

Con una aguja de inoculación o con un palillo de madera, transferir parte del centro de una colonia a la superficie de un portaobjetos. Agregar una gota de peróxido de hidrógeno al 3% y observar la formación de burbujas. La aparición rápida y sostenida de burbujas constituye una reacción positiva. La observación de unas pequeñas burbujas después de 20 a 30 segundos no se considera un resultado positivo. Debe tenerse cuidado de no tomar eritrocitos junto con el material de la colonia.

COAGULASA

1. Prueba en portaobjetos (coagulasa unida): 2 gotas de agua o solución fisiológica estériles dentro de dos círculos en un portaobjetos. Emulsificar las colonias en el líquido dentro de cada círculo. Colocar 1 gota de plasma en uno de los círculos y mezclar con palillo. Leer aglutinación: De 10-15 segundos es positiva; y es negativa si no hay aglutinación en el término de 2 minutos.

2. Prueba en tubo (coagulasa libre): Emulsificar la colonia en un tubo con 0,5 ml de plasma. Incubar a 35-37º C por 4 horas y observar la formación del coágulo. Si no se ve el coágulo reincubar a temperatura ambiente y leer luego de 18 horas.

OXIDASA

1. Técnica directa en placa: Agregar 2-3 gotas del reactivo (tetrametil o dimetil p-fenilendiamina) directamente sobre colonias aisladas en agar.

2. Procedimiento indirecto con tiras de papel: Añadir unas gotas del reactivo a una tira de papel filtro o se usan tiras o discos comerciales impregnados con reactivo desecado. La colonia se dispersa con el asa sobre la zona reactiva del papel.

3. HURGV: 1,5 ml de plasma + TAXO N (disco) + colonia. Si cambia a morado en menos de 2 minutos es positiva.

El derivado tetrametilo de la p-fenilendiamina es más estable y sensible, menos tóxico que el derivado dimetilo. Es una prueba positiva cuando toma un color morado en 10 segundos, si está entre 10-60 segundos hay que hacer la prueba nuevamente.

BILIS-ESCULINA

-Se basa en la capacidad de los estreptococos del grupo D y especies de Enterococcus, de hidrolizar la esculina en presencia de bilis (4% de sales biliares o 40% de bilis); esto da como resultado la formación de glucosa esculetina que reacciona con los iones férricos (dados por el citrato férrico del medio inorgánico) para formar un compuesto negro que se difunde.

-Técnica: Inocular en estría el agar inclinado, incubar a 35º C por 24-48 horas. El ennegrecimiento difuso de más de la mitad del pico de flauta indica hidrólisis de la esculina.

-Nota: Algunos estreptococos del grupo viridans (3%) pueden hidrolizar la esculina en presencia de bilis.

PRUEBA DE CAMP

1. Hacer en el centro de la placa de agar sangre una única estría en línea recta con S. aureus producto de B-hemolisina.

2. Teniendo cuidado de no tocar la estría del estafilococo, realizar una estría de los estreptococos betahemolíticos a identificar, en forma perpendicular a la estría del estafilococo. Realizar estas estrías de tal manera que, después de la incubación, el desarrollo de los microorganismos no se junte. La estría de estreptococos debe ser de 3 a 4 cm de longitud. En la misma placa deben sembrarse en forma similar cepas conocidas de estreptococos del grupo A y del grupo B como controles negativo y positivo, respectivamente.

3. Incubar la placa a 35º C en aire atmosférico durante 18-24 horas.

-Resultado: Se observa una zona de mayor hemólisis (hemólisis sinérgica) cuando la B-hemolisina secretada por el estafilococo y el factor CAMP (proteína extracelular) secretado por el estreptococo del grupo B se intersectan.

TOLERANCIA A LA SAL

-Técnica: Inocular 2-3 colonias en el caldo (NaCl 6,5%) e incubar toda la noche a 35º C.-HURGV: 0,5 ml de NaCl 6,5% + colonia. Incubar toda la noche.-Resultado: Es una prueba positiva cuando hay presencia de desarrollo bacteriano.

SENSIBILIDAD A LA BACITRACINA Y SXT

Tomar las colonias aisladas de estreptococos betahemolíticos y estriar el inóculo hasta el centro de la mitad de una placa de agar sangre. Con un hisopo estéril o un asa diseminar el inóculo sobre toda la mitad de la placa. Colocar en forma aséptica un disco de bacitracina Taxo “A” y un disco de SXT sobre el área sembrada. Asegurarse de que los discos estén igualmente separados. Utilizando pinzas flameadas, golpear con suavidad los discos para que se adhieran a la superficie del agar. Incubar la placa a 35º C.Sensible: Cualquier tamaño de halo alrededor de cualquiera de los discos.Resistente: Desarrollo hasta el borde del disco.

Bacitracina SXT IdentificaciónSR

S/R

RRS

Presumiblemente grupo APresumiblemente grupo B

Ni A ni B

SENSIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA

Se utilizan discos de novobiocina de 5 µg. Se prepara una suspensión del microorganismo aislado en agua estéril o caldo, con una turbidez equivalente a 0,5 de Mc Farland (con hisopo se distribuye sobre la mitad de la placa de AS) y se coloca un disco de novobiocina sobre el área sembrada. Incubar durante 18-24 horas a 35º C.Resistente: Halo 6-12 mm, S. saprophyticus.Sensible: Halo mayor de 12 mm, S. epidermidis.

OPTOQUINA

Estriar las colonias en una mitad a un tercio de la placa de AS (área sembrada de 3 cm2). Colocar un disco de optoquina (5 µg/ml) en el tercio superior del área sembrada. Incubar a 35º C por 18-24 horas en jara con vela o en estufa con 5-7% de CO2. Halos mayores de 15 mm (o ≥20 mm según HURGV) son característicos de S.pneumoniae.

CRECIMIENTO EN CALDO GLUCOSA AZIDA (CALDO SF)

El caldo SF es selectivo para estreptococos fecales o enterococos. Crecimiento y fermentación de glucosa. Homogeneizar en el caldo una colonia de 24 horas de crecimiento, se realiza a 45º C por 24.48 horas, se puede incubar a 37º C. Indicador: Púrpura de bromocresol.Positivo: Turbidez (crecimiento) y fermentación (de rosado o púrpura a amarillo).

DNasa

Se basa en la presencia de la enzima termoestable DNasa que es capaz de clivar los enlaces fosfodiéster internos de la molécula de DNA. Se utiliza un medio sólido que contiene verde de metilo el cual se combina co DNA altamente polimerizado. Cuando la combinación no ocurre, por acción de la DNasa, se produce una decoloración del medio.Se toma una colonia y se inocula en ovillo sobre el agar, se hace un control positivo. Incubar a 37º C por 24 horas.

TUBO GERMINAL

Se suspende una pequeña porción de una colonia aislada de la levadura a investigar en un tubo de ensayo con 0,5 ml de suero o plasma de conejo o humano. Se incuba a 35º C hasta 2 horas máximo. Se coloca una gota de la suspensión de levaduras en suero sobre un portaobjetos, se cubre con una laminilla y examina al microscopio. Si es una prueba positiva se trata de Candida albicans.

FLUIDOS VAGINALES: Se origina en el cuello uterino y la mucosa de la vagina. Alteraciones:

- Cervicitis: Exocervicitis (Herpes virus), Endocervicitis (N. gonorrhoeae, C. trachomatis)- Vaginitis: Trichomonas, Cándida.- Vaginosis: Gardnerella, bacterias anaerobias. Flujo grisáceo, maloliente, muy acuoso.

Toma de muestra:1. Usar espéculo estéril ojalá desechable. Se introduce de lado, luego se voltea y se abre y observa.2. Localizar el cuello uterino y observarlo lo mismo que las paredes de la vagina.

SECRECIONES URETRALES: Secreción tomada directamente de la uretra. Primera porción de la orina matinal. Si la secreción está presente y es evidente en la uretra, se limpia la secreción presente con algodón o gasa estéril, y se toma de la secreción siguiente con escobillón, si no está presente la secreción se exprime la uretra suavemente con el dedo de la mano enguantada, esto en el caso de la mujer. Si es un hombre se utiliza asa de argolla o escobillón. Se hace gram y cultivo del material.

Lactobacilos pocosCorines No es una reacción normal.Bacilos gram (-)Rx leucocitaria

Lactobacilos: Rx normal.

Diplococos gram (-)intracelulares tipo Neisseria con proliferación De endocervix, anormal. Hay que hacer cultivo.de PMN

Diplococos gram (-)intra y extracelularescon abundante rx En hombre, rx anormal. leucocitaria

Vaginosis bacteriana: No hay lactobacilos, test de aminas positivo con KOH al 20% (2-3 gotas). Sale olor a pescado, pH 7, fresco y gram, no hay presencia de leucocitos porque es flora normal, no hay inflamación, células guía.

Vaginitis: Rx leucocitaria abundante, flujo purulento, inflamación, pH alterado muy alcalino.

Mycobacterium leprae: No se puede cultivar pero si se puede observar por Ziehl-Neelsen.

- Utilidad de la Bx en lepra: No es Dx.1. Clasificación de los enfermos.2. Control del tratamiento: El tratamiento dura dos años, control cada 3 meses.

3. Epidemiología: Por tipo de lepra.4. Evaluación del programa.

Lepra lepromatosa, lepra tuberculoide, lepra indeterminada o limítrofe.

- Clasificación de la lepra: Histopatológica, biopsia de nervio.

Clasificación EspectroR-J TT BT BB BL LL

Tuberculoide Dimorfa LepromatosaPB=0* MB>0*

*Indice bacteriológico

La clasificación bacteriológica del enfermo de lepra determina el tipo de tratamiento, duración del mismo, período de vigilancia, manejo de convivientes.

-Control del tratamiento:Paucibacilares: Al finalizar el tratamiento.Multibacilares: Cada 3 meses (lepra lepromatosa).Se toman muestras de los mismos sitios utilizados para la clasificación.

Se toma muestra de linfa de oreja, moco nasal o de los lepromitas o lepromas (piel), codo:

Para tomar muestra: Lanceta, láminas, desinfectante, pinzas (hacer isquemia).Procedimiento: Limpieza (gasa con alcohol), isquemia (digital, pinza), lanceta (bisturí), gota en lámina.Procedimiento frotis moco nasal: Bolsa plástica, escobillón.Coloración: Secar a temperatura ambiente, fijar en mechero, colorear técnica ZN.Se observa: Bacilos agrupados en globias (como paquetes de cigarrillos)

-Escala de lectura semicuantitativa: Igual que en M. tuberculosis. Se hace sumatoria.

IB = Sumatoria de cruces en 5 sitios (Globias en cada sitio o de bacilos) 5 Sólo en lepra lepromatosa hay presencia de bacilos.

Lesión o. i.

Oreja izq.

Lesión 2 o.

Oreja der.

Ident

Coloración de azul de metileno de Loeffler

I. PRINCIPIO: El azul de metileno es una coloración simple que es particularmente útil para la identificación de especies de Corynebacterium. Los gránulos metacromáticos de C. diphtheriae toman con facilidad el azul de metileno y aparecen con un color azul intenso . aunque algunos autores han sostenido que la formación de gránulos citoplasmáticos característicos de C. diphtheriae se ve raramente en las especies saprofitas de Corynebacterium, este criterio es poco confiable y no puede ser utlizado para la identificación definitiva de C. diphtheriae sin realizar estudios adicionales.

II. MEDIOS Y REACTIVOSAzul de metileno (contenido de colorante del 80%) = 0,3 g.Alcohol etílico (95%) = 30 ml.Agua destilada = 100 ml.

III. PROEDIMIENTO1. Fijar el frotis con calor. Cubrir su superficie con la solución de azul de metileno durante 1 minuto. Lavar el portaobjetos con agua y secar con papel.2. Antiguamente era necesario agregar un álcali a la solución antes de usar. Sin embargo, los colorantes de azul de metileno preparados en los últimos años no requieren este paso adicional, debido a que las impurezas ácidas encontradas en los antiguos colorantes han sido eliminadas.