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Microbiota disbiótica en niños autistas y
sus madres: persistencia de variantes de
la forma L en la pared deficientes en
hongos y bacterias
• N. Markova
Reportes cientificos volumen 9 , Número de
artículo: 13401 ( 2019 ) Cita este artículo
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Resumen
En base a nuestra hipótesis para la microbiota existente de variantes
deficientes en la pared (formas L) en sangre humana, creamos una
metodología innovadora, que permitió el desarrollo de poblaciones en forma
de L de la sangre de todas las personas investigadas. A diferencia de los
controles sanos, las formas L de la sangre de niños autistas y sus madres se
convirtieron en condiciones apropiadas de cultivo en bacterias y hongos
oportunistas detectables, un proceso demostrado por microscopía electrónica
de luz y transmisión. Se puede distinguir en dos tipos de estados: microbiota
sanguínea "eubiótica" en individuos sanos y "disbiótica" en niños autistas y
sus madres. Sorprendentemente, el hallazgo unificador para los niños autistas
y sus madres fue la presencia en la sangre de variantes sin paredes del ciclo de
vida de los hongos filamentosos. Aumento específico de IgG, IgM e
IgA,Aspergillus fumigatus en casi todos los niños autistas. Como se demostró
en nuestro estudio anterior, las formas L filtrables se pueden transmitir por vía
vertical de madre a hijo antes del nacimiento. Por lo tanto, se puede sugerir
que los niños autistas pueden nacer ya colonizados con hongos, mientras que
una "aspergilosis silenciosa" podría contribuir o incluso ser una causa
principal de trastornos del desarrollo neurológico en la primera infancia.
Introducción
La microbiota del huésped puede tener un gran impacto en el sistema
inmunitario y la salud 1 , 2 . Recientemente informamos sobre la presencia de
variantes bacterianas deficientes en la pared celular (formas L) en la sangre
humana. Sobre la base de hechos conocidos sobre su capacidad única de
biología y persistencia, como se observó en nuestros estudios y los de otros
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autores, creamos un concepto de microbiota en forma de L en sangre, que
conduce a nuevas ideas con relevancia para la salud o enfermedad
humana 3 , 4 , 5 , 6 . Domingue sugiere que las formas L juegan un papel en la
persistencia y la patología humana 7 , 8.. La creencia de que la microbiota en
forma de L puede influir en el sistema inmunitario del huésped y contribuir a
las inflamaciones sistémicas, abre nuevas alternativas para comprender la
fisiopatología humana, así como la patogénesis de enfermedades de origen
desconocido.
El autismo pertenece al grupo de trastornos del neurodesarrollo que se
diagnostican principalmente durante la primera infancia. Los Centros para el
Control y la Prevención de Enfermedades en los Estados Unidos informan un
aumento dramático en la prevalencia del autismo en un 15 por ciento (1 de
cada 59 niños, respectivamente 1 de cada 37 niños y 1 de cada 151 niñas) para
2018 9 . A pesar del intenso trabajo de investigación sobre la patogénesis del
autismo, los factores que causan o influyen en este estado siguen sin estar
claros. Se supone que la aparición del autismo puede depender de la
exposición a alguna influencia endógena o exógena, ya sea infección o algún
agente químico o físico 10 . Entre los factores estudiados y discutidos se
encuentran anormalidades inmunológicas, infecciones sistémicas e
inflamaciones durante el período perinatal o el período de la primera
infancia 11, 12 , 13 , 14 , 15. No está claro si el trastorno del neurodesarrollo en
niños autistas es primario per se o es consecuencia de infecciones persistentes
no reconocidas de origen fúngico o bacteriano. Se puede sospechar que la
persistencia microbiana sistémica es un factor que contribuye al autismo, pero
los microbios causantes son difíciles de probar con los enfoques
convencionales. Es por eso que su presencia y significado a menudo han sido
cuestionados. Las variantes deficientes de la pared celular (formas L), tanto de
origen bacteriano como fúngico, pueden sospecharse como posibles
persistentes que pueden desempeñar un papel en estas infecciones. A este
respecto, la "teoría de la forma L" propone que un organismo que tiene una
variante tanto patógena (amurallada) como no patógena (libre de pared
celular) podría proporcionar un mecanismo para explicar los procesos que
rigen la persistencia microbiana oculta / no reconocida.3 , 4 , 5 .
El objetivo del presente estudio fue aislar las variantes deficientes de la pared
celular (formas L) de la sangre de niños autistas, sus madres y controlar a
personas sanas, observar y analizar sus transformaciones morfológicas y
características, así como identificarlas después de la recuperación de sus
paredes celulares.
Resultados
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Desarrollo de la población de sangre en forma de L en caldo
El desarrollo de la población en forma de L (variantes deficientes en la pared
microbiana) en caldo inoculado con sangre se observó en todas las personas
investigadas: niños con TEA (Tabla 1 ), sus madres (Tabla 2 ) y 6 personas
sanas de control. Debido a la metodología innovadora sobre técnicas
especiales e intervalos de subcultivos, los "elementos no cultivables" de la
sangre se adaptaron con éxito en caldos, donde se desarrollaron como formas
L replicables (variantes deficientes en la pared celular). Los intervalos de
subcultivo se realizaron de acuerdo con las observaciones periódicas de las
preparaciones nativas y el reconocimiento de las fases de transformación
microbiana. Como se ve en la Fig. 1, las poblaciones observadas de cuerpos
esféricos y granulares tenían características típicas para las formas L.
Tabla 1 Aislamiento de cultivos bacterianos y fúngicos de sangre y orina
de niños con trastornos del espectro autista (TEA).
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Tabla 2 Aislamiento de cultivos bacterianos y fúngicos de sangre de
madres de niños con TEA.
Mesa de tamaño completo
Figura 1
Desarrollo representativo de la población en forma de L (variantes deficientes
en la pared celular) en caldo (TSB) inoculado con sangre de niños autistas
(14/199, 8/182, 9/185, 4/162), una madre (12/196 M ) y una persona sana de
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control (C1 / 31). Preparaciones nativas contrastadas con azul de metileno:
cuerpos L esféricos y granulares. Ampliación: 1000x.
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Recuperación de cultivos bacterianos de la sangre a través de la reversión de
variantes deficientes en la pared.
Como se ve en las Tablas 1 y 2 , los cultivos en forma de L de especies
bacterianas oportunistas ( Enterococcus agglomerans, Rhizobium radiobacter,
Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Morganella morganii,
Chryseobacterium indologenes , Brevibacterium casei y Aeromonas sobria )
se aislaron de 8 de los niños. (trastornos del espectro autista), así como de 7 de
sus madres ( Serratia marcescens, Enterococcus faecalis, Pseudomonas
aeruginosa, Providencia rettgeri, Brevibacterium casei y Morganella
morganii) Los cultivos bacterianos no se aislaron de las personas sanas de
control. El proceso de reversión de la forma L en bacterias detectables
requirió fases posteriores de subcultivos y procedimientos de enriquecimiento
en caldos y medios semisólidos. Las bacterias, recuperando sus paredes
celulares, pasaron por una serie de formas intermedias. Como se presenta en la
figura 2A , se observó una población mixta de formas L esféricas y cadenas
típicas de enterococos que aparecían en medios líquidos durante la fase de
reversión. Las formas L de Enterococcus faecalis crecieron inicialmente como
colonias L típicas en forma de "huevos fritos" (Fig. 2B ) pero la reversión a
bacterias normales terminó en la formación de colonias típicas
de Enterococcus faecalis (Fig. 2B) El tránsito similar de las colonias L de
"huevos fritos" a las colonias típicas de Pseudomonas aeruginosa se presentó
en la Fig. 2 (F, H) . En las manchas teñidas de Gram de las colonias se
observaron formas morfológicas correspondientes a la fase de reversión. Las
formas granulares grampositivas (Fig. 2D ) y las formas polimórficas Gram
negativas (Fig. 2E ) fueron características de las colonias de tipo L, mientras
que las varillas Gram negativas correspondieron a las colonias típicas
de Pseudomonas aeruginosa (Fig. 2G) También se observaron fases
analógicas de transformación morfológica de formas L en bacterias normales
en el proceso de aislamiento de otras especies bacterianas. Los cultivos
bacterianos aislados fueron identificados con precisión por MALDI-TOF
MS. La identificación por MALDI-TOF MS es precisa porque se basa en una
base de datos que contiene un amplio espectro de huellas dactilares de
péptidos (PMF) para géneros, especies y subespecies específicas 16 .
Figura 2
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Proceso de conversión en forma de L representativo de Enterococcus
faecalis y Pseudomonas aeruginosa , recuperado de la sangre de niños
autistas: Enterococcus faecalis de un paciente 6/178 ( A - C ) y Pseudomonas
aeruginosa de un paciente 7/180 ( D - H ). ( A ) Preparación nativa en
contraste con azul de metileno de TSB - población mixta de formas L
esféricas y cadenas típicas de enterococos que aparecen; ( B ) Típicos "huevos
fritos" - colonias en forma de L en TSA semisólido; ( C ) Colonias típicas
de Enterococcus faecalis en TSA semisólido; ( D) ( E ) frotis teñidos con
Gram de colonias en forma de L; ( F ) colonias de "huevos fritos" de tipo L en
TSA semisólido; ( G ) frotis teñido con Gram de colonias típicas
de Pseudomonas aeruginosa ; ( H ) Colonias típicas de Pseudomonas
aeruginosa en TSA semisólido. Ampliación: A, D, E, G - 1000x; B, C, F-
200x.
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Recuperación de cultivos fúngicos de la sangre a través de la reversión de
variantes deficientes en la pared.
Similar a las especies bacterianas, un factor crítico en la recuperación de
cultivos de hongos de la sangre fue el uso de un protocolo específico, que
garantiza la adaptación y el desarrollo de formas deficientes en la pared en los
medios apropiados (SDB y SDA) hasta la regeneración de sus estructuras de
pared, o la llamada reversión completa. Después de la reversión, su
aislamiento e identificación se hicieron posibles. Se aislaron cultivos
de parapsilosis por Candida de 6 niños; de Cryptococcus albidus de 2 niños y
de Rhodotorula mucilaginosa de un niño (Tabla 1 ). De la sangre de cuatro
madres se aislaron cultivos de Candida parapsilosis y Rhodotorula
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mucilaginosa (Tabla 2) Los cultivos de levadura aislados fueron identificados
con precisión por MALDI-TOF MS. Los cultivos de levadura no se aislaron
de la sangre de control sana. Se reconocieron células de levadura deficientes
en la pared en preparaciones nativas a partir de caldos. Como se puede ver en
la Fig. 3 (A – C) , el aislamiento de Candida parapsilosis fue precedido por
transformaciones morfológicas de células protoplásticas. El tamaño de las
formas de levadura deficientes en la pared era mayor que el de las
bacterias. Las células de levadura protoplásticas usualmente adoptaron una
forma esférica (Fig. 3A ). Se puede ver en la Fig. 3 (B, C) que la primera
generación de células que surgen de los protoplastos varía en forma y tamaño,
pero la siguiente generación tuvo la morfología típica de las células de
levadura. Reversión completa de la parapsilosis de Candidaocurrió en medios
semisólidos. Se observó la misma tendencia de transformaciones morfológicas
para Cryptococcus albidus y Rhodotorula mucilaginosa . También se
encontraron grandes células protoplásticas esféricas en ambas especies de
hongos. (Fig. 3D – G ).
figura 3
Proceso de conversión representativo de células de levadura deficientes en
pared. Candida parapsilosis ( A - C ), Cryptococcus albidus ( D - F )
y Rhodotorula mucilaginosa ( G ) recuperados de la sangre de niños autistas
(pacientes - 1/156, 3/160, 4/162, 7/180; 11/190) . Preparaciones nativas
contrastadas con azul de metileno de SDB - A. Grandes células protoplásticas
de Candida parapsilosis ; ( B , C ) Células transicionales y típicas de Candida
parapsilosis . Aumento; 1000x.
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A diferencia de las levaduras, el estándar de oro en la detección de hongos
filamentosos sigue siendo la visualización microscópica, así como la
recuperación del cultivo de hongos con características típicas. Ver elementos
fúngicos en preparaciones de medios líquidos mediante microscopía directa
proporciona los primeros signos de presencia de hongos en la sangre de niños
autistas y sus madres. Cabe señalar que los elementos fúngicos, cultivados a
partir de sangre, fueron inicialmente variantes deficientes en la pared. Como
se muestra en la Fig. 4 (A – E) , se reconocieron en medios líquidos células
protoplásicas esféricas, ovoides o irregulares, triangulares, algunas de ellas en
gemación. Se puede ver durante el subcultivo posterior que estas formas
comenzaron un proceso de restauración y conversión de la pared celular en
una fase micelial (Fig. 4F – K) Pueden formar hifas septadas a partir de
varios loci (Fig. 4J ) o micelio aseptate grande amorfo con vacuolas
(Fig. 4K ). Se observaron también grupos individuales o grupos de conidios
(Fig. 5A, B ). Se observó que los conidios germinan, produciendo
inicialmente un tubo y posteriormente hifas (fig. 5E-G ).
Figura 4
Imágenes representativas del proceso de conversión de la variante de hongos
filamentosos deficiente en la pared observada en cultivos SDB de sangre de
niños autistas y sus madres (pacientes - 1/156, 1/155 M, 7/180; 11/190,
11/191 M) . Preparaciones nativas contrastadas con azul de metileno de
SDB. Grandes células protoplásticas esféricas, ovoides o irregulares en forma
de triángulo ( A - E ), Proceso de restauración de la pared y conversión en una
fase micelial. ( F - K ) Ampliación: 1000x.
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Figura 5
Observación de elementos fúngicos del ciclo de vida de hongos filamentosos
en SDB de sangre de niños autistas y sus madres. ( A - J ) Aislamiento del
cultivo típico de moho de Aspergillus fumigatus ( K , L ). ( A , B )
Individuales o grupos de conidios. ( E - G ) Germinación de conidios y
formación de hifas. ( C , D ) Cuerpos fructíferos de tipo
cleistotecio. ( H , I , J) Morfogénesis del desarrollo del cultivo micelial de
protoplastos en SDB. Se formaron protoplastos ovales y alargados, que luego
se transformaron en células amuralladas y se organizaron en estructuras que se
asemejan a las cabezas de aspergillus. ( K , J ) Después del subcultivo
posterior en medios semisólidos, crecimiento de colonias de Aspergillus
fumigatus con conidióforos típicos. Ampliación: ( A - J ) - 1000x. ( K , L ) -
200x.
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Otros hallazgos interesantes fueron los cuerpos fructíferos cerrados de tipo
cleistotecio (Fig. 5C, D ). Estos cuerpos, también conocidos como
cleistocarpos, se desarrollan como estructuras de supervivencia bajo ciertas
condiciones. Contienen asci con disposición dispersa. Las ascosporas se
forman en un ascus mediante un proceso conocido como formación de células
libres. El ascocarpo maduro en Aspergillus es un cuerpo redondo de
aproximadamente 100–200 μm de diámetro con paredes lisas. La
morfogénesis del desarrollo del cultivo micelial de protoplastos en medio
líquido se puede ver en la Fig. 5 (H – J). Se formaron protoplastos ovales y
alargados, más transformados y dispuestos en estructuras que se asemejan a
cabezas de aspergillus. El subcultivo posterior en medios semisólidos dio
lugar al desarrollo / crecimiento de colonias de moho, lo que confirma la
viabilidad de los elementos fúngicos observados en la sangre. El crecimiento
típico de Aspergillus fumigatus en medio semisólido se presentó en la Fig. 5
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(K, L) . Como se ve en la Tabla 1 y la Tabla 2, en todos los niños autistas y
sus madres se encontraron elementos morfológicos del ciclo de vida de
hongos filamentosos durante observaciones microscópicas de preparaciones
de medios líquidos. En el control de personas sanas no se detectaron
elementos fúngicos. El subsecuente subcultivo en medios semisólidos dio
lugar al desarrollo / crecimiento de colonias de moho confirmando la
viabilidad de los elementos fúngicos observados en la sangre. Además, se
encontró un aumento en el título de anticuerpos específicos (IgG, IgM, IgA)
contra Aspergillus fumigatus en casi todos los niños con TEA (Tabla 1 ).
La morfología de ultraestructura de la población microbiana en desarrollo
durante el cultivo de sangre de un niño con TEA (1/156) en medio líquido
adaptado para hongos (SDB), se examinó mediante microscopía electrónica de
transmisión (Fig. 6 ). La transformación de las formas L de sangre (variantes
deficientes en la pared celular) en células con paredes parcialmente
recuperadas fue un hallazgo distintivo de aviso principal. En la figura 6A, se
observan cuerpos L densos en electrones de diferente tamaño, así como
formas granulares muy pequeñas con un diámetro de aproximadamente 100
nm, conocidas como "formas filtrables". Los cuerpos L están ubicados entre
estructuras membranosas espesas, densas en electrones y discontinuas
(fragmentos de pared en regeneración). Se ve que las partículas vesiculares,
componentes estructurales de la membrana plasmática, que probablemente
participan como bloques de construcción en un proceso de recuperación de la
pared, cubren la superficie de una estructura membranosa. En la figura 6C ,
se presenta la ultraestructura de dos células con paredes parcialmente
recuperadas junto con un fragmento de pared regenerada, engrosada y de
doble contorno. De especial interés fue la célula madre observada (MC) que a
menudo está presente en la población en forma de L (Fig. 6B) MC contiene
cuerpos elementales de diferentes tamaños y vesículas vacías. Se observa un
proceso de extrusión de un cuerpo granular en la parte superior de la MC
(Fig. 6B ). Se debe prestar especial atención a la ubicación dentro del cuerpo
multinuclear y de paredes gruesas de MC, que se asemeja a un asco fúngico
con ascosporas (Fig. 6B, E ). Junto con los cuerpos L esféricos típicos se vio
una célula más grande con forma de triángulo, distintiva de los protoplastos de
origen fúngico (Fig. 6D ). Sorprendentemente, TEM permitió que se
reconocieran nanopartículas con un tamaño inferior a 50 nm. Como se ve en la
Fig. 6F, estas partículas estaban abundantemente presentes en la población
celular observada, incluso formando capas densas en algún lugar. El TEM de
la población en forma de L de la sangre de una persona sana (C6 / 157) se
realizó como control. Se observaron cuerpos L esféricos, pero no se
detectaron otros hallazgos morfológicos de origen fúngico (estructuras y
nanopartículas similares al ascus).
Figura 6
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Morfología de ultraestructura del desarrollo de la población microbiana
durante el cultivo de sangre de un niño con TEA (1/156) en SDB. Transición
de variantes deficientes en la pared celular en células con paredes
parcialmente recuperadas. ( A ) cuerpos L densos en electrones de diferente
tamaño, así como formas granulares muy pequeñas con un diámetro de
aproximadamente 100 nm, ubicadas entre estructuras membranosas espesas,
densas en electrones y discontinuas (fragmentos de paredes en
regeneración); ( C ) Ultraestructura de dos células con paredes parcialmente
recuperadas junto con un fragmento de pared regenerada, engrosada y de
doble contorno; ( B ) “Célula madre” (MC) y dentro de ella: cuerpos
elementales y vesículas vacías de diferentes tamaños. En la parte superior del
MC - en proceso de extrusión de un cuerpo granular. ( B ,E ) Cuerpo
multinuclear y de paredes gruesas ubicado dentro del MC, que se asemeja a un
asco fúngico con ascosporas; ( D ) Celda libre de pared, en forma de triángulo,
distintiva de protoplastos de origen fúngico junto con cuerpos L esféricos
típicos. ( F ) Abundancia de nanopartículas con tamaños menores de 50 nm.
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Aislamientos microbianos de orina
De la orina de 6 niños se aislaron cultivos bacterianos de Enterococcus
faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Morganella morganii, Proteus mirabilis,
Acinetobacter spp., Aggregatibacter segnis, así como cultivos de levadura de
Rhodotorula mucilagenosa y Candida parapsilosis (Tabla 1 ).
Discusión
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El conocimiento acumulado de las variantes deficientes en la pared celular
microbiana, o el llamado fenómeno de la forma L, da razones para creer que
una comunidad de formas L podría constituir una microbiota en la sangre
humana 3 , 4 , 5 , 6 . La falta de paredes celulares y las propiedades biológicas
inusuales hacen posible la supervivencia de las formas L bajo ambiente
bacteriostático en sangre 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. Mattman proporciona datos
propios y de otros autores, y cree que en una variedad de situaciones, las
bacterias y hongos existen y crecen como organismos deficientes en la pared,
a veces como un evento natural, a veces inducido por agentes
antimicrobianos 25 . Domingue sugiere que las formas L tienen el potencial de
un crecimiento ilimitado y, dependiendo del estímulo recibido, se desarrollan
a lo largo de diferentes rutas 8 . Entonces, las formas L se caracterizan como
células indiferenciadas y multipotentes. La transición de formas L en células
más diferenciadas ha sido bien demostrada por microscopía electrónica en
nuestros estudios previos 3 , 4 , 5 , 6.. Como se encontró en el estudio actual, una
población de formas L esféricas se desarrolló a partir de sangre de personas
sanas, así como de sangre de niños autistas y sus madres. A diferencia de los
controles sanos, las formas L de sangre de niños autistas y sus madres se
convirtieron en condiciones apropiadas de cultivo en bacterias y hongos
detectables. Por lo tanto, se demostró que las bacterias oportunistas aisladas,
la levadura y los hongos filamentosos son capaces de existir no solo como
variantes deficientes de la pared celular (CWD) en la sangre, sino también de
volver a las células reproductoras normales mediante la síntesis de una nueva
pared celular. La recuperación de cultivos bacterianos y fúngicos de la sangre
generalmente es particularmente difícil, especialmente cuando están en un
estado deficiente de la pared celular y no se puede lograr por métodos de
rutina, como se usa en los laboratorios microbiológicos estándar. Sin
embargo, El uso de una metodología innovadora permitió su efectiva
observación, cultivo, reversión, aislamiento e identificación. De los resultados
se desprende que la característica común e importante para los niños con TEA
fue la persistencia de variantes deficientes en la pared celular de hongos y
bacterias en la sangre. El fenómeno similar se encontró en la sangre de sus
madres. Como se demuestra en las Figs 2 - 6 , evidencias convincentes de
conversión de CWD en bacterias y hongos detectables, se obtuvieron a partir
de observaciones microscópicas de luz y TEM durante las fases de su cultivo.
Según la hipótesis de la microbiota existente de variantes deficientes de la
pared celular en la sangre humana, se puede distinguir en dos tipos de estados:
(i) microbiota sanguínea "eubiótica" o equilibrada en individuos sanos y (ii)
"disbiótico", o microbiota sanguínea desestabilizada en niños autistas y sus
madres. Al analizar la microbiota de niños y madres, debe tenerse en cuenta el
hallazgo más obvio y unificador para ellos: la presencia en la sangre de
variantes sin pared del ciclo de vida de los hongos filamentosos. Como se
demostró en el estudio actual, el cultivo en medios líquidos adaptados para
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hongos y una mayor subcultivación en medios semisólidos condujeron al
desarrollo de colonias de moho similares a las de Aspergillus. Una prueba de
anticuerpos en suero positiva, respetivamente un título elevado de IgG, IgM e
IgA específicas encontradas en casi todos los niños,Aspergillus fumigatus . No
menos sorprendente fue la presencia de variantes sin pared de Candida
parapsilosis , Cryptococcus albidus y Rhodotorula mucilaginosa en la sangre
de los niños investigados con TEA y algunas de sus madres. En apoyo de
nuestros hallazgos, los estudios de otros autores han confirmado que la
levadura y los hongos filamentosos pueden existir como formas deficientes en
la pared celular bajo ciertas condiciones 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 .
Se plantea la cuestión de si la presencia y persistencia de variantes deficientes
en la pared celular (bacterias oportunistas, levaduras y hongos filamentosos)
en la sangre pueden contribuir al autismo. Cuándo, cómo y de qué fuentes
puede surgir este fenómeno en niños con TEA. Varios factores de riesgo como
las infecciones prenatales, perinatales y postnatales o la exposición a toxinas
ambientales después del nacimiento se han discutido para el desarrollo del
autismo 32 . Un estudio de casos de autismo ha encontrado un vínculo con las
infecciones bacterianas maternas en el segundo trimestre de embarazos 33 . Al
analizar la microbiota sanguínea de las madres en el estudio actual, destaca
sobre todo el hecho de que todas las madres son portadoras de variantes
filamentosas libres de paredes fúngicas. De su sangre también se aislaron
cultivos deCandida parapsilosis y Rhodotorula mucilaginosa, así como
cultivos de bacterias oportunistas que a menudo se encuentran como causas de
infecciones urogenitales. Por lo tanto, la microbiota sanguínea de la madre
puede considerarse como un "disbiótico". Lo probable es que las madres,
durante su edad adulta, adquieran y mantengan infecciones bacterianas
crónicas de larga duración, así como la interferencia secundaria de agentes
fúngicos. Desde los focos locales de infecciones crónicas, las bacterias y los
hongos como variantes deficientes en la pared pueden entrar en la circulación
sanguínea, superando las barreras anatómicas. La relación entre los niños
autistas y sus madres debe buscarse durante el embarazo. El embarazo puede
convertirse en un hito clave para la entrada al embrión de las formas L
bacterianas y fúngicas de la madre. Recientemente, informamos que
persistiendo en sangre humana filtrable,3 , 4 , 6 . Parece que la microbiota
sanguínea disbiótica de la madre puede ser adquirida por el embrión desde el
desarrollo ontogenético. Esto explica por qué los hijos de estas madres pueden
exhibir una tolerancia prácticamente innata a las variantes libres de paredes de
bacterias y hongos oportunistas.
Candida spp . son el agente causal más comúnmente diagnosticado de
infecciones pediátricas por levaduras en el torrente sanguíneo, mientras
que Aspergillus spp son las principales causas de infecciones sistémicas por
moho 34 , 35 , 36 . El diagnóstico de infecciones fúngicas siempre es difícil de
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establecer porque en la mayoría de los casos los cultivos son negativos 25 . Las
infecciones fúngicas congénitas a menudo se pasan por alto y no se reconocen
sus efectos sobre la salud del recién nacido 37. Los resultados del presente
estudio dan razones para pensar que tanto en los niños autistas como en sus
madres se puede sospechar un fenómeno de "colonización por hongos" o
"infección silenciosa", donde los "portadores" no experimentan síntomas
necesarios para un diagnóstico clínico. Sin embargo, todavía no se han
establecido criterios estándar para distinguir la colonización de la infección
activa. Es esencial que en el caso de las madres, la invasión y colonización por
hongos ocurra durante la edad adulta y usualmente son eventos secundarios
después de infecciones bacterianas u otras causas. En niños autistas, las
madres pueden adquirir variantes sin hongos de la pared por vía vertical antes
del nacimiento y, por lo tanto, el recién nacido puede nacer ya colonizado con
hongos. Como se mencionó anteriormente, las formas L filtrables pueden
atravesar la barrera placentaria y colonizar al feto.4 , 6 . En apoyo de esta
suposición, se demostraron las formas filtrables de TEM en el caldo de cultivo
de un niño autista.
A diferencia de las madres, en los niños autistas, la "colonización fúngica" o
"infección fúngica silenciosa" es un estado principal primario durante la
primera infancia y puede influir fuertemente en el desarrollo del sistema
inmune y nervioso. Los hongos persistentes permanecen metabólicamente
activos y pueden producir micotoxinas y otros subproductos. Los metabolitos
fúngicos a menudo se encuentran en la orina de niños autistas y sirven como
marcadores de presencia de hongos 38 . Se sabe que para evadir las defensas
del cuerpo, Aspergillus fumigatus libera gliotoxina para suprimir el sistema
inmunitario. La gliotoxina es un inhibidor de la activación de las células T y
de la fagocitosis de macrófagos, así como también induce apoptosis en
monocitos y en células dendríticas derivadas de monocitos 39 , 40.. Obviamente,
la supresión inmune primaria inducida por Aspergillus en niños puede
conducir a una invasión polimicrobiana secundaria de bacterias oportunistas y
otras especies fúngicas como Candida parapsilosis o Cryptococcus albidus ,
como se encontró aquí. Los subproductos del metabolismo del moho tienen
efectos negativos sobre la integridad estructural o funcional del sistema
nervioso en desarrollo 41 . Se sabe que Aspergillus secreta enzimas y proteínas
en grandes cantidades y puede generar nanopartículas
extracelularmente 42. Como lo demostró TEM en el estudio actual, se encontró
una gran cantidad de nanopartículas en un niño con TEA, pero no en una
persona sana de control. Las nanopartículas fúngicas pueden ser un material
sorbente eficaz para metales tóxicos como Al, Sb, Ba, Hg, Pb, Cd y
Tl 43 . Además, las nanopartículas poseen la propiedad de penetrar una gran
cantidad de órganos y, por lo tanto, aumentar los efectos tóxicos de los
metales pesados. A menudo se han encontrado niveles elevados de metales
pesados en niños autistas 44. Debe ser interesante observar que las
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nanopartículas encontradas en el niño autista investigado por TEM (1/156)
coincidieron con altos niveles detectados de Pb, Al, Ba y Sb en su orina (datos
proporcionados por los padres). Según la información proporcionada por
algunos de los padres (2/158; 6/178, 7/180, 11/190), el aumento de los niveles
de metales pesados (Al, Sb, Ba, Pb, Cd, As, Tin, W, Sn) se han encontrado en
la orina de sus hijos. La relación entre la producción de nanopartículas (de
Aspegillus fumigatus) y los altos niveles detectados de metales pesados en
niños autistas es un fenómeno que merece una investigación más profunda y
profunda para descifrar la patogénesis y encontrar la vía correcta para el
tratamiento.
Un espectro de efectos y perturbaciones provocados por A.
fumigatus dependen principalmente de la reacción del sistema inmune del
huésped y pueden variar ampliamente de asintomáticos a críticamente
enfermos. Sin embargo, todo el espectro de estos estados reside bajo el mismo
diagnóstico: aspergilosis, análogamente al espectro de trastornos del
neurodesarrollo en niños autistas.
En conclusión, se recuperaron variantes de bacterias y hongos oportunistas
deficientes en la pared celular de la sangre de niños autistas y sus madres. La
CWD se convirtió en condiciones apropiadas de cultivo en bacterias y hongos
detectables. El hallazgo unificador para los niños autistas y sus madres fue la
presencia en sangre de variantes sin pared del ciclo de vida de Aspergillus
fumigatus , un fenómeno de "colonización" fúngica o "infección
silenciosa". Se puede suponer que los niños autistas pueden nacer con
colonización por hongos adquirida de las madres por vía transplacentaria. La
“aspergilosis silenciosa” puede influir fuertemente en el desarrollo del sistema
inmunitario y nervioso en la primera infancia y puede ser una causa principal
de trastornos del desarrollo neurológico.
Un área prometedora para futuras investigaciones es el desarrollo de criterios
para la evaluación personalizada de la microbiota sanguínea y la detección
temprana de la colonización microbiana en los recién nacidos y sus madres,
así como el enfoque selectivo para el tratamiento y cuidado de estos recién
nacidos con el fin de prevenir el desarrollo del autismo.
Materiales y métodos
Esquema de estudio
Como se enumera en las tablas 1 y 2, se estudiaron quince niños (de 3 a 12
años) con diagnóstico de trastorno del espectro autista, así como sus madres
(de 30 a 47 años). El diagnóstico de los niños se ha realizado de acuerdo con
los criterios internacionales estándar. Como controles se estudiaron 6 personas
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sanas: C1 / 31 (hombre de 18 años), C2 / 51 (hombre de 20 años), C3 / 52
(hombre de 22 años), C5 / 81 (hombre de 16 años), C5 / 134 (mujer, 12 años),
C6 / 157 mujeres 17 años) Se recogieron asépticamente muestras de sangre de
todas las personas investigadas utilizando tubos K2E-EDTA Vacutainer (BD
Vacutainer, Plymouth, Reino Unido). Se obtuvo el consentimiento informado
para el uso de las muestras de sangre con fines de investigación de todos los
participantes y / o sus tutores legales. Todas las muestras de sangre fueron
manipuladas y anonimizadas,
Aislamiento de las formas L de sangre y conversión en cultivos bacterianos y
fúngicos.
Para el aislamiento de cultivos microbianos de tipo L a partir de muestras de
sangre se utilizaron dos protocolos designados como "clásicos" y "filtración"
que se describen en nuestros estudios previos 3 , 4.. En resumen, la lisis
sanguínea se realizó con agua destilada estéril a una relación v / v
estrictamente fija y después de 30 minutos de exposición a temperatura
ambiente. Según el protocolo "clásico" (CL), las alícuotas de las muestras de
sangre lisadas se inocularon en tubos con caldo de soja tríptico (TSB, Becton
Dickinson) y se incubaron a 37 ° C durante 72 horas. De acuerdo con el
protocolo de "filtración" (F), después de la inoculación, se filtró TSB a través
de un filtro bacteriano con un tamaño de poros de 0,2 µm y se incubó también
a 37 ° C durante 72 horas. Luego, se subcultivaron nuevamente alícuotas
estrictamente fijadas de caldos primarios (CL y F) en tres variantes de medio
de caldo (TSB, TSB con gentamicina de 100 µg / ml y caldo Sabouraud
Dextrosa-SDB con cloranfenicol de 50 µg / ml) y paralelo plateado en tres
variantes de medios semisólidos -TSA, TSA con Gentamicina de 100 µg / ml
y Sabouraud Dextrosa Agar-SDA con Cloranfenicol de 50 µg / ml. Los
medios semisólidos se solidificaron con agar al 0,8% (p / v) (Fluca). TSB y
TSA se incubaron a 37 ° C, mientras que SDB y SDA a 25 ° C. Los pases en
caldo y medios semisólidos se realizaron utilizando la técnica descrita en el
estudio anterior.3. En los experimentos de control para el desempeño estéril de
los procedimientos técnicos, los caldos y los medios semisólidos se inocularon
con solución salina estéril y las transferencias posteriores se realizaron por la
misma técnica. Todos los cultivos se observaron periódicamente para la
aparición de crecimiento y transformaciones morfológicas dentro de los 2
meses. Las observaciones microscópicas de luz directa de preparaciones
nativas de cultivos se combinaron con frotis teñidos con Gram y Giemsa. Los
cultivos de levadura y bacterias puros aislados se identificaron mediante la
tecnología de espectrometría de masas por desorción láser asistida por matriz
de tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS) utilizando células intactas. Esta
herramienta para la identificación de microbios (bacterias y hongos) se basa
en la automatización de la tecnología proteómica. La identificación de
microbios por MALDI-TOF MS se realiza comparando el espectro
característico llamado huellas dactilares de péptidos (PMF) de organismos
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desconocidos con los PMF contenidos en la base de datos. Esta tecnología ya
se aplica en todo el mundo para la identificación microbiana, mediante el uso
de bibliotecas comerciales de organismos PMF16 . El equipo MALDI-TOF
MS (Vitek MS - BIOMERIEUX) se utilizó en el estudio actual y todos los
procedimientos se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante por
personal de laboratorio capacitado en un laboratorio nacional de salud
pública. En paralelo al estudio de sangre, la orina de niños con autismo se
investigó microbiológicamente siguiendo técnicas estándar.
Prueba serológica
Aspergillus fumigatus: se determinaron IgA, IgG e IgM específicas mediante
una prueba de hemaglutinación sérica estándar.
Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
Las observaciones del caldo de cultivo en forma de L de la sangre de un niño
con TEA (1/156) se realizó por microscopía electrónica. Se recogió un
depósito de caldo de cultivo por centrifugación a 3000 rpm durante 20
min. Después de eso, el depósito se fijó con glutaraldehído al 4% (v / v) en
tampón de cacodilato 0,1 M con sacarosa al 4,5% p / v, pH 7,2 y se fijó
posteriormente en tetróxido de osmio al 1% (p / v) en el mismo tampón a
temperatura ambiente durante 2 h y deshidratado en concentraciones de etanol
ascendente en serie. Después de la deshidratación en series de etanol y óxido
de propileno, los sedimentos celulares se embebieron en resina epoxi Epon-
Araldita (Serva, Heidelberg, Alemania). Bloques de resina polimerizados a 56
° C durante 48 h. Las secciones de células ultrafinas se hicieron con cuchillos
de cristal en un Microtomo Ultracut Reichert-Jung y se tiñeron con acetato de
uranilo al 5% (p / v) en metanol al 70% (v / v) y citrato de plomo al 0,4% (p /
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Descargar referencias
Agradecimientos
Este estudio está dedicado a niños con TEA y en memoria al pediatra Dr.
Dimitar Marinov, mi padre. El autor desea agradecer a los padres de niños
autistas por los materiales proporcionados y también a Albena Cherneva, por
la excelente asistencia técnica. El estudio fue apoyado por el programa
"Microbiota y autismo" A17 / 745238.
Información del autor
Afiliaciones
1. Instituto de Microbiología, Departamento de Microbiología
Infecciosa, Academia de Ciencias de Bulgaria, Acad. G. Bonchev
str. 26, Sofía, 1113, Bulgaria
o N. Markova
Autor correspondiente
Correspondencia a N. Markova .
Declaraciones de ética
Conflicto de intereses
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El autor declara no tener intereses en competencia.
Información Adicional
Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos
jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.
Derechos y permisos
Acceso abierto Este artículo está licenciado bajo una licencia internacional
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obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver
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