MÉTODO DE DETECCIÓN DE NOROVIRUS Y HEPATITIS A
Jornadas de Referencia sobre Análisis de Alimentos Centro Nacional de Alimentación Majadahonda, 11 junio 2014
Mercedes Álvarez García Servicio de Microbiología Alimentaria CNA (AECOSAN)
Centro
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Alimentación
VIRUS
Parásitos intracelulares obligados
Infección a dosis muy bajas
Resistentes a condiciones ambientales
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• Intestino de humanos y animales Hábitat
• Oral - Fecal Ruta de
transmisión
• Vertidos (ríos, lagos y mares) Presentes en
aguas residuales
VIRUS ENTÉRICOS
Centro
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Alimentación
He
pat
itis
A • ARNss +
• Grupo de riesgo 2
• Incubación: 4 semanas
• Síntomas: Fiebre, náuseas, vómitos, diarrea, ictericia
• Duración: meses
• No estacional
No
rovi
rus
• ARNss +
• Grupo de riesgo 2
• Incubación: 1 - 4 días
• Síntomas: Fiebre, náuseas, vómitos, diarrea
• Duración: 2 días
• Estacional: Invierno
Virus de la Hepatitis A y Norovirus
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MOLUSCOS BIVALVOS
Acumulación de virus en el aparato digestivo
Sedimento marino
Riesgo consumo
Aguas superficiales
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ISO/TS 15216:2013
Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Método horizontal para la detección de virus de la hepatitis A y norovirus en alimentos utilizando RT-PCR en tiempo real.
Parte 1: Método para la determinación cuantitativa
Parte 2: Método para la determinación cualitativa
Método de detección de HAV y NoV en moluscos bivalvos
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Método de detección de HAV y NoV en moluscos bivalvos
1. Extracción del virus
2. Extracción del ARN viral
3. RT-PCR en tiempo real
Centro
Nacional de
Alimentación
Método de detección de HAV y NoV en moluscos bivalvos
1. Extracción del virus
2. Extracción del ARN viral
3. RT-PCR en tiempo real
Centro
Nacional de
Alimentación
1. Extracción del virus
Hepatopáncreas (glándula digestiva): zona preferente de bioacumulación del virus
2 g
hepatopáncreas
2 ml
proteinasa K
Lisis de los tejidos del animal
y
liberación de las partículas virales
1 h, 37ºC
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Método de detección de HAV Y NoV en moluscos bivalvos
1. Extracción del virus
2. Extracción del ARN viral
3. RT-PCR en tiempo real
Centro
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Alimentación
2. Extracción del ARN viral
Lisis
Lavados
Elución
Centro
Nacional de
Alimentación
Método de detección de HAV Y NoV en moluscos bivalvos
1. Extracción del virus
2. Extracción del ARN viral
3. RT-PCR en tiempo real
Centro
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Alimentación
5´ 3´ ARN viral
RT
5´ 3´ 3´ 5´
ADNc
PCR
3´ 5´ 5´ 3´
RT
RT Master Mix ARN viral
PCR
PCR Master Mix ADNc
RT-PCR en dos pasos
RT y PCR
RT Master Mix
ARN viral
PCR Master Mix
RT-PCR en un paso
3. RT-PCR en tiempo real
Centro
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3. RT-PCR en tiempo real. Primers y sondas
Norovirus GI
Norovirus GII
Hepatitis A
5291 CGCTGGATGC GCTTCCATGA CCTCGGATTG TGGACAGGAG ATCGCGATCT TCTGCCCGAA TTCGTAAATG ATGATGGCGT CTAAGGACGC
5011 AATGTTCAGA TGGATGAGAT TCTCAGATCT GAGCACGTGG GAGGGCGATC GCAATCTGGC TCCCAGTTTT GTGAATGAAG ATGGCGTCGA
61 TGATACCTCA CCGCCGTTTG CCTAGGCTAT AGGCTAAATT TTCCCTTTCC CTTTTCCCTT TCCTATTCCC TTTGTTTTGC TTGTAAATAT TAATTCCTGC 171 AGGTTCAGGG TTCTTAAATC TGTTTCTCTA TAAGAACACT CATTTTTCAC GCTTTCTGTC TTCTTTCTTC CAGGGCTCTC CCCTTGCCCT
QNIF4 NV1LCR
COG2R QNIF2
HAV240
HAV68
NVGG1p
HAV150-
QNIFS
Centro
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RNA UltraSense™ One-Step Quantitative RT-
PCRSystem
RT
1 hora 55ºC
PCR
5 min 95ºC 15 seg 95ºC
1 min 60ºC x45 1 min 65ºC
x45
3. RT-PCR en tiempo real. Condiciones
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