The University of Arizona 1
1
Necrosis hepatopancreática aguda (AHPND)
The University of ArizonaAquaculture Pathology Laboratory
Tucson, Arizona
2
2009
2010
2011 2011
2012
Dispersión de la enfermedad AHPND en el Este y Sureste Asiático
Síndrome de la mortandad temprana (EMS o AHPND)
EMS presenta dos fases distintivas: Fase aguda/temprana
Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND). Pérdida aguda de la función de las células de los
túbulos del HP (células “R”, “B”, “F” y “E”). Desprendimiento agudo severo de las células de los
túbulos del HP. Ausencia de infección bacteriana (de cualquier tipo), de
acuerdo a pruebas de hibridación in situ (ISH) con sonda genética universal para la detección de bacterias (basada en 16S RNA).
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Síndrome de la mortandad temprana (EMS o AHPND)
Fase terminal. Destrucción del HP por especiesoportunistas de Vibrio spp.
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EMS (China) – Fotos cortesia de Mr. Luyi5
EMS en China – Fotos cortesia de Mr. Luyi6
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Signos clínicos de EMS/AHPND
Marcada atrofia del hepatopáncreas (HP). Tejido conectivo de la cápsula del HP
presenta frecuentemente coloración pálida, amarillenta o blanquecina. En ocasiones se observan puntos o vetas de
coloración negruzca (melanización). Poca consistencia del HP lo hace difícil de
aplastar entre el pulgar y el índice.
Juveniles de Penaeus vannamei (Vietnam). EMS (lado izquierdo); Normal (lado derecho).
Histopatología: Fase aguda con pérdida de la función
del órgano (HP)
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Origen de las muestras:Sur de China: Agosto/Septiembre 2010
Vietnam: Julio 2011 & 2012 & Deciembre 2011 & 2012
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Case 11-041. Hepatopáncreas normal 10PROXIMAL
DISTAL
Case 11-214. P. monodon. Vietnam; 10x Desprendimiento severo de células e inflamación moderada 11
DISTAL
PROXIMAL
Case 11-214. P. monodon. Vietnam; Nótese el avance de las lesiones en sentido proximal a distal. 20x
PROXIMAL
DISTAL
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13Case 11-214. P. monodon. Vietnam; Nótese el avance de las lesiones en sentido proximal a distal. 20x
PROXIMAL
DISTAL
14PROXIMAL
DISTAL
Histopatología: Fase terminal con destrucción del órgano causada por vibriosis
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Origen de las muestras:Sur de China: Agosto/Septiembre 2010
Vietnam: Julio 2011 & 2012 & Deciembre 2011 & 2012
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Case 11-214. P. monodon . Vietnam; Fase terminal de EMS. Destrucción de la mayoría de los túbulos. Infección bacteriana masiva (probablemente Vibrio spp). 4x.
17Sur de China 2010: 10-361B/2; P. vannamei; Fase terminal de EMS; 20x
AHPNDHEPATOPANCREATITIS SÉPTICA
(SHPN-VIBRIOSIS)
HISTOPATOLOGÍAAHPND vs. SHPND
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VIBRIOSIS NHP
HISTOPATOLOGÍA
AHPND vs. SHPND
VIBRIOSIS NHP
HISTOPATOLOGÍA
AHPND vs. NHP
EMS/ AHPND
Hasta marzo del 2013 se desconocía específicamente que agente, infeccioso o tóxico, era responsable. Ahora se sabe que la etiología es infecciosa.
Definición patológica:Degeneración progresiva, aguda, del HP en dirección
proximal a distal, con pérdida de la función del órgano, necrosis y desprendimiento de las células de los túbulos.
Fase terminal con marcada inflamación inter- e intra-tubular, desarrollo de infección bacteriana secundaria masiva acompañada de necrosis y desprendimiento de las células de los túbulos.
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Estudios de infectividad en UAZ-APL usando cepas bacterianas de Vietnam
Un cultivo mixto de cepas bacterianas del estómago que indujo EMS durante estudios llevados a cabo en Vietnam fue sujeto a investigación en UAZ-APL.
Se utilizó el método de inmersión para determinar la patogenicidad de cada una de las cepas de bacteria en el cultivo mixto.
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Experimento #1: Estudio de inmersión con cultivo bacteriano mixto aislado a partir de camarones con EMS (preparado en Vietnam).
Experimento #2: Prueba de desafío (inmersión) con aislados individuales de bacteria cultivada en TSB+ y cultivo mixto (control positivo).
Experimento #3: Prueba de desafío (inmersión) con aislados individuales de bacteria cultivada a partir de los tratamientos del Experimento #2 que lograron inducir EMS.“Gavage reverso” usando filtrado libre de bacteria a partir de caldo TSB+.
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Estudios de infectividad en UAZ-APL usando cepas bacterianas de Vietnam
Prueba de inmersión con bacteria mantenida en caldo de cultivo
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Camarón SPF sumergido en 2.108
cells/ml por 15 min. Camarones
transferidos a contenedores en donde se agregó2.106 cells/ml durante el experimento.
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Resultados Exp#1: Inmersión con cultivo bacteriano mixto
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0
2
4
6
8
10
12
14
16
Day 0 Day 1 Day 2 Day 3 Day 4
Nu
mb
er o
f su
rviv
ing
shri
mp
Day post challenge
ControlImmersion 1Immersion IIImmersion III
Resultados Exp#1: Inmersión. Cultivo bacteriano mixto
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Signos clínicos Exp#1. A&B: inmersión con cultivo mixto; se muestra un camarón con estómago e intestino vacío, palidez y atrofia severa del HP; C&D: se muestra un camarón normal del control negativo; estómago e intestino llenos, coloración obscura normal del HP.
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Exp #1: Resultados del análisis histopatológico.
A&B: Control negativo.
C,D,E & F: camarón infectado con el cultivo mixto mostrando patología típica de EMS.
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Resultados Exp#2: Inmersión. Cultivos puros individuales.
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0
2
4
6
8
10
12
14
16
Day 0 Day 1 Day 2 Day 3
Nu
mb
er o
f su
rviv
ing
shri
mp
Days post challenge
Control
Mixed culture A
Pure culture A/1
Pure culture A/2
Pure culture A/3
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Exp. #2:Resultados del análisis histopatológico
A&D: Cultivo mixto y cultivo puro A/3. Se muestra patología típica de EMS.
B&C: Cultivo puro A/1 y A/2. Se muestra la apariencia histológica normal.
Exp.#3: Inmersión & gavage reverso con cultivos puros
recobrados del Exp#2
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0
2
4
6
8
10
12
14
16
Day 0 Day 1 Day 2 Day 3
Nu
mb
er o
f su
rviv
ing
shri
mp
Days post challenge
Negative control
Mixed culture A
Pure culture A/3
Pure culture B/1
Reverse gavage
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Exp#3: Resultados del análisis histopatológico
A) Cultivo mixto “A”
B) Cultivo puro “A/3”
C) Cultivo puro “B/1”
D) Gavage reverso con filtrado (0.2 µm) de cultivo “A/3”
Resúmen
El agente se localiza en el estómago del camarón.
La causa de EMS es un agente bacterianotransmitido por la via oral; el agente colonizael tracto digestivo del camarón produciendouna toxina(s) que afecta severamente el hepatopáncreas.
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El agente que induce la patología típica de EMS/AHPND fue identificado como una cepa de Vibrio parahaemolyticus.
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Análisis metagenómico de dos cepas de VP
Cepas analizadas: VP A/2 & VP A/3. VP A/2 NO causa AHPND/EMS. VP A/3 SI causa AHPND/EMS. Se diseñaron primers de PCR a partir de la
secuencia metagenómica y del material extracromosómico encontrado.
Se obtuvieron los siguientes resultados:
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1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
NO‐INFECCIOSO
133513‐028 A/3
13‐306 D/4 13‐028 A/2
1 2 3 4 5 6
12‐297 B
INFECCIOSO
Muestras:1. 1 Kb marker2. Phage (contig 9)3. Contig 324. Contig 525. Contig 736. Contig 89
Perfil de PCR de cada cepa
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Se detectó la presencia de un bacteriófago en VP A/3 (contig 9) no relacionado con la virulencia
100 nm100 nm
36
The University of Arizona 13
Contigs Contigs 52 & 89 fueron los únicos
amplicones que se generaron de manera consistente entre las cepas causantes AHPND.
Se diseñó un método de PCR basado en Contig 89 para la detección del VP causante de AHPND.
37
1 2 3 4 5 6
Detección de cepas de VP causantes de AHPND usando Contig 89
Muestras:1. 1 kb marker2. Vietnam3. China4. Malaysia5. Thailand6. Mexico
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PRESENCIA DE EMS/AHPNDEN MEXICO
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Marzo, 2013
Marzo, 2013
Mayo, 2013
Dispersión de “mortalidades atípicas” en el Pacífico mexicano
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EMS/AHPND en Sonora, México – Foto: Dra. Silvia Gomez 42
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Comparación de signos clínicos de EMS entre Asia y México
EMS/AHPND en VietnamEMS/AHPND cerca de Mazatlán,
México
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Signos clínicos de EMS/AHPND en México
HP normalHP atrofiado44
Análisis histológico de muestras tomadas en México
Mayo 2013
EMS/AHPND, fase aguda.
EMS/AHPND, fase terminal.
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Mexico – AHPND fase aguda (Caso UAZ-APL 13-218; 4x)
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Mexico – AHPND fase aguda (Caso UAZ-APL 13-220;10x)
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Análisis histológico de muestras tomadas en México
Mayo 2013
EMS/AHPND, fase aguda.
EMS/AHPND, fase terminal.
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Mexico – AHPND, fase terminal (Caso UAZ-APL 13-220A-3; 4x)
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Mexico – AHPND, fase terminal (Caso UAZ-APL 13-220A-3; 20x)
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Comparación de características bioquímicas entre cepas de VP del sureste asiático y de México causantes de AHPND
API 20 NE Test Result VP A/3SE Asia
VP from Mexico
NO3=> NO2 + +
NO2 => N2 - -
Indole + +
Glucose fermentation - (usually +) - (usually +)
Arginine dihydrolase - -
Urease - -
Esculin hydrolysis - -
Gelatin liquefaction + +
B-Galactodiase + +
Assimilation of:D-glucose, L-arabinose, D-mannose, D-mannitol, N-acetyl-glucosameine, maltose, L-malate
+ +
D-gluconate, caprate, citrate, phenyl acetate - -
Oxidase + + 51
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Confirmación de la patogenicidad de la cepa de VP mexicana y la capacidad de
inducir AHPND
Se llevó a cabo una serie de experimetos por immersion y per os con cepas de VP mexicana.
Se confirmó la capacidad de inducir EMS/AHPND.
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Cepas de Vibrio parahaemolyticus utilizadas en el estudio
Clave de identificación
Tipo de muestra
13-306D/4 (Mexico) Hepatopancreas
13-511A/1 (Mexico) Sedimento
13-028A/3 (Vietnam) Control positivo
13-028A/2 (Vietnam) Control negativo
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Resultados de los experimentospor inmersión y per os
Insert picture of survival graphs from paper
The University of Arizona 19
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Resultados de los experimentospor inmersión y per os
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Resultados de los experimentospor inmersión y per os
Primer Secuencia Tamaño del fragmento
89F 5’ GTC-GCT-ACT-GTC-TAG-CTG-AA-3’470bp89R 5” ACG-GCA-AGA-CTT-AGT-GTA-CC-3’
Muestra ID# Tipo de muestra
1 13-306D/4 HP
2 13-511A/1 Sedimento
3 13-028A/3 Control positivo
4 13-028A/2 Control negativo
Conclusiones del estudio
La presencia de EMS-AHPND en México fue confirmada por medio de histopatología, bioensayo y PCR.
Se cuenta con un método de PCR que puede detectar la presencia de la cepa de V. parahaemolyticus causante de AHPND en México.
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Manejo de la enfermedad (Managing “The Perfect Killer”)
Tomado de: Seminario del Dr. G. Chamberlain en la ciudad de Ho Chi Minh, Vietnam
Deciembre 10, 2013
El manejo de EMS/AHPND requiere de una estrategia diferente
Los virus necesitan un hospedero para replicarse. Se requiere entonces controlar al hospedero. La partícula viral se destruye una vez libre en el agua.
Las bacterias (tales como la causante de EMS/AHPND) se pueden multiplicar sin problema al estar libres en el agua, fuera del hospedero.
Algunas prácticas de manejo que parecen estar funcionando…
Sembrar animales de mayor talla. Los camarones de mayor talla tienden a mostrar mejor sobrevivencia. Uso de “raceways” o maternidades. Use jaulas flotantes en los estanques para
sembrar las postlarvas, liberándolas despues de 2-3 semanas, cuando han alcanzado una talla mayor.
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Uso de especies alternativas. Penaeus monodon parece ser menos afectado que Penaeus vannamei en los estanques.
Policultivo con tilapia. La presencia de tilapia parece estimular la proliferación de cierto tipo de microalgas y cierta flora microbiana que confiere protección a los camarones en los estanques.
Algunas prácticas de manejo que parecen estar funcionando…
Uso de “bioflocs”. Aun bajo investigación. Falta información sobre el nivel de protección que se pueda alcanzar. El principio que se persigue aplicar: la gran variedad de especies de bacteria compitiendo entre sí, podrían desplazar la causante de EMS/AHPND.
Algunas prácticas de manejo que parecen estar funcionando…
Uso de sistemas intensivos con bioseguridad. Es posible tener un mejor control sobre la exclusión del patógeno. Tanques circulares (50m en
diámetro) de baja precipitación, baja salinidad (4ppt) y altas densidades (~450 PL/m2).
Sistemas de recirculación. Altamente bioseguros, completamente aislados y con exclusión total del patógeno. Uso de camarones SPF de rápido crecimiento.
Algunas prácticas de manejo que parecen estar funcionando…
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Programas de selección genética para el desarrollo de resistencia a EMS/AHPND. Parece que existe algún componente genético en el camarón que confiere cierta tolerancia a EMS. Estudios llevados a cabo por el grupo CP a mostrado 75% de sobrevivencia en 10% de familias expuestas a una prueba de enfrentamiento de 15 días. El desempeño en estanques aun esta siendo evaluado.
Algunas prácticas de manejo que parecen estar funcionando…
OIE (World Organization for Animal Health) Department of Animal Health, MARD, Vietnam for local
arrangements in Vietnam. Uni-President feed company in Vietnam for funding toxicity
& infectivity studies. CP Food, Thailand for funding recent work on EMS. World Bank & Global Aquaculture Alliance for travel. FAO project for the airfare. Minh Phu Seafood for diagnostic services. Grobest for molecular biology work.
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Agradecimientos