Biotecnología y bioinformáticaOpción B
B4: Medicina
Tema 9 de Biología NS
Diploma BI
Idea Fundamental: La biotecnologíapuede emplearse para el diagnostico yel tratamiento de enfermedades.
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NATURALEZA CIENCIAS: Las mejoras
tecnológicas conllevan avances científicos Los nuevos métodos usados para el diagnóstico de enfermedades, son
útiles si son precisos y verdaderamente fáciles de usar.
En el caso de enfermedades infecciosas, un diagnóstico más preciso ymás rápido puede permitir un tratamiento que impida la dispersión delpatógeno.
IMAGEN: www.webconsultas.com
Las infecciones parasitariasimplican frecuentemente la elanálisis al microscopio en buscadel microorganismo responsableo evidencias de su actividad.
En el caso de las infeccionesbacterianas, tradicionalmente sehan realizado cultivos en placa apartir de esputos, orina o de lazona infectada, para la posteriorcaracterización de las colonias.
NATURALEZA CIENCIAS: Las mejoras
tecnológicas conllevan avances científicos En el caso de las enfermedades genéticas, su diagnóstico se ha
basado tradicionalmente en la revisión de observaciones clínicas y en labúsqueda de presencia de unos altos niveles de ciertos metabolitosinusuales en la orina o la sangre.
IMAGEN: http://lgcpublishing.com
La innovación entecnología ha permitidoa los científicosdiagnosticar de formamás rápida, específica yfiable las enfermedades,así como su posteriortratamiento.
Detección de metabolitos en sangre y orina Como se ha comentado, los metabolitos indicativos de una
enfermedad en cuestión, pueden detectarse en sangre y en orina.
Existe un amplio grupo de desórdenes genéticos que afectan almetabolismo, denominadas de forma genérica “Enfermedadesmetabólicas congénitas”, en su mayoría debidas a mutaciones en genesconcretos que provocan la síntesis de una proteína no funcional.
Como resultado, se acumulan en el organismo un grupo de moléculastóxicas o bien no se producen aquellas que son necesarias, apareciendodeterminados síntomas secundarios.
La tabla adjunta muestra dos enfermedades y el metabolitocorrespondiente detectado en sangre u orina en los pacientes afectados.
Enfermedad Metabolito detectado
Fenilcetonuria Aminoácido fenilalanina
Síndrome de rotor Pigmento bilirrubina
Orina con olor a jarabe de arce Aminoácidos valina, leucina e isoleucina
La “prueba del talón”, se realiza a los recién nacidos en las primeras 48 hde vida con objeto de detectar fenilcetonuria, enfermedad metabólicacongénita, con un patrón de herencia recesivo.
Si los niveles de fenilalanina en sangre son elevados, es indicativo de queel bebé carece de la enzima fenilalanina hidroxilasa, lo que se traduceen la incapacidad de obtener el aminoácido tirosina a partir defenilalanina en el hígado, acumulándose este último.
IMAGEN: www2.uah.es
El aminoácido fenilalanina esnecesario para el crecimientonormal de los lactantes y niños decorta edad, así como para laproducción normal de proteínas alo largo de la vida.
Detección de metabolitos en sangre y orina
Ahora bien, si se acumula una cantidad excesiva de fenilalanina en lostejidos cerebrales, los altera y a la larga produce retraso mental. Tambiénes la causante de que la piel y la orina despidan un olor a humedad yasimismo de erupciones cutáneas.
Si la enfermedad es diagnosticadacon la suficiente antelación, unadieta modificada puede prevenir laaparición de consecuencias gravesen el Sistema Nervioso.
Se han eliminado de esta dietatodos lo alimentos de altocontenido proteínico, que tambiénsuelen incluir elevadas cantidadesde fenilalanina, tales como carnes,pescado, aves de corral, leche,huevos, quesos, helado, frutossecos y numerosos productos quecontienen harina normal.
IMAGEN: maternidadlafloresta.com
Detección de metabolitos en sangre y orina
Video1
Los modernos métodos moleculares permiten discriminar mucho mejorentre diferentes patógenos. Así, la infección causada por unpatógeno puede detectarse mediante la presencia de su materialgenético o sus antígenos.
La técnica o test de ELISA (Enzyme-Linked Inmunoabsorbent Assay)permite detectar la presencia de anticuerpos específicos de determinadosantígenos (test VIH) solo presentes cuando el paciente ha desarrolladouna respuesta inmune frente al patógeno.
IMAGEN: abcam.com
Indicadores de infección por patógenos
IMAGEN: bio-rad.com
Si a una muestra de unpaciente se añaden losprimers/cebadores quetienen la misma secuenciade nucleótidos que elmaterial genético de undeterminado patógeno,solo se amplificará el ADNsi el material genético delpatógeno está presente.
Otra forma de detectar lapresencia de un patógenoes mediante la utilizaciónde sondas de ADN en latécnica de microarray.
IMAGEN: msu.com
La técnica de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) permitedetectar el material genético de un patógeno.
Indicadores de infección por patógenos
El Test de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) mide si unantígeno o anticuerpo específico asociado a una enfermedad se encuentraen la sangre (orina, etc.) del paciente. Un resultado positivo indica que elantígeno/anticuerpo está presente e implica que la persona ha contraídodicha enfermedad.
Para la interpretación de los resultados de una prueba diagnosticaELISA, hace falta conocer cómo se realiza.
HABILIDAD: Interpretación resultados test ELISA
1) En primer lugar se recubre la placa con un primer anticuerpoinmovilizado anti-antígeno.
2) Después seaplica la muestradel paciente en laque se encuentrael antígeno, queserá retenido enel pocillo al serreconocido por elprimeranticuerpo.
Animación1
HABILIDAD: Interpretación resultados test ELISA3) A continuación se añade el anticuerpo anti-antígeno en estado libre, elcual lleva acoplado un enzima que produce una señal detectable, altranformar un sustrato en un producto detectable (cambio de color).
4) Se lava la solución, de manera que en una prueba negativa, arrastraríaal 2º anticuerpo añadido al no estar retenido, en la zona reacción, mientrasque en una positiva, el 2º anticuerpo queda retenido en la zona dereacción.
5) Finalmente, seañade el sustrato quecambiará de colorcomo consecuenciade la actividad de laenzima unida al 2ºanticuerpo.
Un prueba es positivacuando en la soluciónaparece color.
Video2 y Web1
El Test de ELISA, puede presenter una variante, como el usado para ladetección del VIH, donde son los antígenos del patógeno, los que estánunidos a la superficie de la placa, porque lo que se quiere detectar es lapresencia de anticuerpos frente al patógeno en el paciente.
El suero humano es aplicado y aclarado para eliminar todo, salvo loanticuerpos anti-VIH, que quedan unidos a la placa.
HABILIDAD: Interpretación resultados test ELISA
Se aplican anticuerpos anti-humanos que llevan unidos unaenzima, y que se unen a losanticuerpos humanos/anti-VIHque quedan en la placa.
La cantidad de enzima en laplaca es proporcional a lacantidad de anticuerpo anti-VIHpresente. Se añade el sustratopara la enzima que produce undeterminado color.
El grado de color indica la cantidad deanticuerpos anti-VIH presente, lo que se traduceen un número que indica un resultadopositivo/negativo para el estado VIH-positivo.
APLICACIÓN: Uso de la PCR para la detección de
cepas de virus de la gripe Muchas veces es necesario una rápida detección del virus de la gripe,
especialmente en los grupos de riesgo, como ancianos y mujeresembarazadas, o con objeto de impedir una seria epidemia.
El uso de la técnica de PCR permite detectar distintas cepas delvirus de la gripe.
La Reacción en Cadena de laPolimerasa (PCR) es una técnicade ingeniería genética desarrolladapor Kary Mullis (Premio Nobel en1993) y consistente en la obtenciónde múltiples copias de unasecuencia de ADN concreta.
Si recogemos una pequeña muestrade ADN, podemos usar la PCR paraamplificarla, ya que utiliza la enzimaADN polimerasa para hacer máscopias del ADN molde.
IMAGEN: www.labgeminis.com
1. Elevando la temperatura a 94ºC,se desnaturaliza el ADN mediantela rotura de los puentes dehidrógeno.
2. Disminuyendo la temperatura a54ºC, se promueve que se unan(hibriden) primers/cebadores alcomienzo y final de la sección deADN que se quiere amplificar.
3. Elevando la temperatura a 72ºC,las cadenas de ADN se mantienendesnaturalizadas de manera que laADN polimerasa añade nucleótidoscomplementarios amplificando lasecuencia del ADN específico.
Animación2
La PCR consta de un ciclo detres fases: calentamiento,
enfriamiento y replicación:
APLICACIÓN: Uso de la PCR para la detección de
cepas de virus de la gripe
Web2
Genomic DNA
Target
sequence
5
3
3
5
5
3
3
5
Primers
Denaturation:Heat brieflyto separate DNAstrands
Annealing:Cool to allowprimers to formhydrogen bondswith ends oftarget sequence
Extension:DNA polymeraseadds nucleotides tothe 3 end of eachprimer
Cycle 1yields
2molecules
New
nucleo-
tides
Cycle 2yields
4molecules
Cycle 3yields 8
molecules;2 molecules
(in white boxes)match target
sequence
Este ciclo es repetido más de 35 vecespara producir suficiente ADN para ser
usado en el laboratorio, ya que el ADN esamplificado de forma exponencial.
La PCR se suele usar para amplificar unapequeña muestra de ADN encontrada en el
escenario de un crimen para ser usadocomo evidencia en perfiles de ADN.
APLICACIÓN: Uso de la PCR para la detección de
cepas de virus de la gripe
La ADN polimerasautilizada debe ser
termoestable, porlo que se usa la
enzima de labacteria Thermus
aqueaticus (taqpolimerasa).
APLICACIÓN: Uso de la PCR para la detección de
cepas de virus de la gripe Dado que el virus de la gripe es un virus de ARN, se debe realizar una
variación de la PCR, denominada PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR).En ellas, la enzima transcriptasa inversa producirá una molécula de ADN,denominada ADNc, a partir de un patrón de ARN.
El primer paso consiste en lapurificación de ARNm de célulasdel paciente, para su posteriorconversión a ADNc.
Se añaden primers específicos delas secuencias genéticas de cadauna de las cepas del virusinfluenza que se quieren buscar.
Si los primers del virus se unen alADNc, amplificarán determinadassecuencias de esa cepa concreta.
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Web3
Uso de marcadores para el diagnóstico de
enfermedades genéticas La predisposición a una enfermedad genética puede detectarse
mediante la presencia de marcadores genéticos, que son alelosparticulares que se asocian a una determinado desorden genético.
Los marcadores genéticos pueden ser polimorfismos debidos a un úniconucleótido, o bien repeticiones en tándem. Estos marcadores puedendetectarse mediante PCR o perfiles de ADN.
Los marcadores pueden formar parte o no de una secuencia codificante,es decir, que pueden contribuir a la enfermedad o no.
Los marcadoresdeben ser alelospolimórficos en lapoblación, es decir,que pueden existirvarios genotipos enun mismo locus.
IMAGEN: lascienciaysusdemonios.com
Uso de marcadores para el diagnóstico de
enfermedades genéticas Así, una persona que tenga un mayor número de estos alelos de los que
pueden esperarse por azar, estará afectado por la enfermedad.
Un ejemplo de ello se encuentra en los genes BRCA 1 y BRCA 2, cuyasmutaciones son indicativas de un incremento en la probabilidad depadecer cáncer de mama u ovarios, al estar implicado este gen en elinicio del cáncer.
Obviamente, estos marcadoresson más efectivos en aquellasenfermedades debidas a unúnico gen, dado que encaracteres poligénicos, sonmenos predictivos.
Chips de ADN Se pueden usar chips (microarrays) de ADN para comprobar la
predisposición genética o para diagnosticar enfermedades.
Un chip es una pequeña superficie que contiene un amplio rango desondas de ADN (específicas de un gen diferente) adheridas a su superficie.
A. En cada pocillo debeintroducirse el ARNm de lacélula/tejido de estudio, dadoque en esta forma seencuentran los genes que seexpresan.
B. Sin embargo, no puedeintroducirse en forma deARNm, sino de ADNcsintetizado previamentemediante por la transcriptasainversa (RT).
Los chips pueden usarse paracomprobar la expresión de ungran número de secuencias deADN (genes) distintas.
IMAGEN: fao.org
Chips de ADNC. A estos ADNc sintetizados se les incorpora un colorante fluorescente.
D. Cuando entra en contacto el ADNc de la célula con la sonda específicapara cada gen en cada pocillo, solo se unirán (hibridarán) mediantecomplementariedad de bases si el gen está presente en el ADNc.
E. El chip es lavado yexpuesto a una luzláser que causará lafluorescencia de lasonda en aquellospocillos donde hahabido hibridaciónentre el ADNc y lasonda de ADN en elchip.
Cuanto más intensasea la luz, mayorserá el nivel deexpresión en esaregión.
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Video3
HABILIDAD: Análisis de un chip de ADN simple Un ejemplo del uso de los chips de ADN se encuentra en las células
cancerosas, dado que su expresión génica es diferente a la de las célulasnormales. El proceso sería el siguiente:
1) A partir de ARNm de células normales,se obtiene el ADNc marcado con uncolorante fluorescente verde.
2) A partir de ARNm de célulascancerosas, se obtiene su ADNc marcadocon un colorante fluorescente rojo.
3) Ahora exponen el chip, que contieneadheridas a su superficie un amplio rangode sondas de ADN específicas paradiferentes genes, a ambos tipos demuestras, permitiendo que ocurra lahibridación.
4) Tras su lavado, para eliminar los ADNcque no han hibridado, el chip es expuestoa luz fluorescente.
IMAGEN: es.wikimedia.org
HABILIDAD: Análisis de un chip de ADN simple
5) La parte del chip dondese observa la luz verdeindica que dicho gen solose expresa en las célulasnormales, mientras quedonde se expresan la luzroja, indica que seexpresan solo lassecuencias de las célulascancerosas. Por último,donde se observa la luzamarilla (combinación deverde y rojo), indica queen ambos tipos de célulasse expresa dicho gen osecuencia.
IMAGEN: argenbio.org
Web5 y Web6
Rastreo de proteínas Las proteínas que circulan por la sangre, pueden ser rastreadas si son
marcadas con una sonda (átomo o moléculas) radiactiva que puede serdetectados mediante un escáner de tomografía por emisión depositrones (PET)
IMAGEN: es.wikimedia.org
Los experimentos de rastreode trazas se usan paraobtener información acerca dela localización e interacción dela proteína deseada.
Estos experimentos de rastreopermiten a los investigadoresconocer los patrones dedistribución y localización de talesproteínas, así como determinarqué proteínas interaccionan conun determinado tejido.
APLICACIÓN: Rastreo de células tumorales
La tasa de captación de transferrina esmayor en las células cancerosas que enlas células del entorno.
Las células tumorales se puedenrastrear mediante la proteínatransferrina ligada a sondasluminiscentes.
IMAGEN: javeriana.edu.co/
La transferrina es una proteína globular que capta el hierro de la dieta, loacumula y transporta, constituyendo la principal proteína fijadora dehierro circulante.
Se están realizandoexperimentos concélulas de linfoma,para determinarcómo tiene lugar laendocitosis mediadapor receptor de latransferrina.
IMAGEN: www.bloodjournal.org
Biopharming
Sin embargo, la producciónde proteínas terapéuticasmás complejas, es másdifícil de producir enbacterias o levaduras, dadoque estos microorganismosno realizan modificacionespost-traduccionales, comola adición de azúcares, quesolo realizan las células demamíferos.
IMAGEN: ied.edu.hk
Existen 3 categorías principales de proteínas usadas en terapia:anticuerpos, proteínas humanas y proteínas antigénicas de virus ybacterias (para hacer vacunas).
La producción de proteínas humanas recombinantes, tales como lainsulina o el factor de crecimiento, ha sido exitosamente producidas enbacterias modificadas genéticamente.
Video4
Biopharming Este problema ha sido resuelto mediante el denominado biopharming
(obtención mediante transgenia, generalmente de sustancias deinterés farmacéutico), donde se emplean plantas y animalesmodificados genéticamente para producir proteínas con finesterapéuticos.
IMAGEN: link.springer.com
Así, se han modificado cabras, ovejas yvacas para producir proteínas humanasrecombinantes en la leche para su usoterapéutico.
Por otro lado, en 2012 se aprobó el uso dela primera proteína humana producida poruna planta, para el tratamiento de lossíntomas de la enfermedad de Gaucher,donde la persona carece de una enzimallamada glucocerebrosidasa, y que haceque se acumulen sustancias dañinas en elhígado, el bazo, los huesos y la médulaósea. Estas sustancias impiden que célulasy órganos funcionen apropiadamente.
APLICACIÓN: Producción de antitrombina por Biopharming La antitrombina es un inhibidor de la coagulación a través de la
neutralización de la enzima trombina.
La deficiencia de antitrombina es una enfermedad genética rara queaparece cuando se sufren trombosis venosa recurrentes. Los pacientesson tratados con anticoagulantes o con un concentrado deantitrombina.
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javer
iana.
edu.c
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APLICACIÓN: Producción de antitrombina por Biopharming
IMAGEN: javeriana.edu.co/
Una de las formas del concentrado, la antitripsina (ATryn) es obtenida dela leche de cabras modificadas genéticamente.
El gen ATryn se une a la region promotora de un gen de proteína lácteade cabra (caseina o lactoalbúmina). Este gen recombinante se inserta enel pronúcleo de un óvulo de oveja recien fertilizado, que es implantado enuna madre.
La oveja que nace,expresará el gen humanoen las glándulas mamarias,secretando la proteína enla leche, de donde podráser aislada para su usofarmacéutico.
Video5
Las enfermedades genéticas son desórdenes heredables causados por undefecto específico en un gen, y que afectan alrededor del 1-2% de lapoblación humana.
Estas enfermedades se deben a una mutaciónen un único gen, siendo recesivo el alelomutante que causa la enfermedad. Porejemplo, la fibrosis quística se debe a un genrecesivo en el cromosoma 7, mientras que lahemofilia se encuentra en el cromosoma X.
Enfermedades genéticas comunesincluyen la fibrosis quística,anemia falciforme, disfrofiamuscular de Duchenne,talasemia, inmunodeficienciasevera combinada,hipercolesterolemia familiar yla hemofilia.
Terapia génica
La terapia génica consiste en la introducciónde genes en células humanas para aliviar unaenfermedad genética. Es un tratamiento muyreciente y que conlleva ciertos riesgos.
El objetivo es reemplazar genes defectuosospor los mismos en su versión correcta, coninformación para producir la proteínafuncional.
Estos genes son transportados en un vector,que es un virus modificado medianteingeniería genética para infectar ciertascélulas humanas en el paciente mientras llevaADN con los genes correctos.
Terapia génica
Tipos de terapia génica Existen dos tipos de terapia génica:
- Terapia de línea germinal: Dicha terapia cambiaría el ADN de lascélulas germinales del paciente (gametos) y por tanto, el defecto genéticono sería transmitido a la descendencia aunque el paciente seguiríapadeciéndola.
- Terapia somática:Dicha terapia cambiaría elADN de una pequeñaporción de célulassomáticas del paciente, elcuál quedaría libre de dichodefecto genético, pero noasí su descendencia.
Técnicas de terapia génica somática En células somáticas se utilizan tres técnicas de terapia génica somática:
- Terapia ex vivo: Se extraencélulas con genes defectuosos y se leintroducen, mediante vectoresadecuados, copias normales dedichos genes antes de reintroducirlos.
- Terapia in vivo: Se inyectan en lasangre vectores que contienen losgenes deseados y que solointeraccionan con las células dianadel cuerpo (poseen receptoresespecíficos en su membrana),transfiriéndoloes su con tenidogenético a dichas células.
- Terapia in situ: Se introducenvectores que contienen los genesdeseados directamente sobre lostejidos donde se necesitan.
Uso de vectores virales en terapia génica Los virus son muy eficientes
penetrando en las células de losorganismos, por lo que en terapiagénica se pueden usar vectoresvirales, al proporcionar un poderosomedio para liberar genes terapeuticosdentro de las células.
Antes de que un virus pueda usarsecomo vector, debe ser modificadomediante ingeniería genética demanera que pueda entrar, pero noreplicarse en el interior de la céluladiana. Esto se consigue eliminando oinactivando los genes viralesimplicados en la replicación.
La delección de estos genes permiteque genes no virales puedan serinsertados en su interior, pasándose aconocer estos virus como vectores.
Uso de vectores virales en terapia génica Los retrovirus o virus de ARN son los vectores
más usados, entrando en las células dianasvia receptores específicos y convirtiendo suARN en ADN que será integrado en el materialgenético de la célula.
Los adenovirus o virus de ADN se usan conmenor frecuencia, dado que no integran elADN viral en el genoma e la célula, por lo quela condición no es transmitida a la siguientegeneración y el tratamieto debe ser repetido.
IMAGEN: f4r.org Video6
Una de las historias más exitosas de la terapia génica somática es eltratamiento de una enfermedad en niños que nacen con unainmunodeficiencia combinada severa (SCID).
Video7
Estos niños afectados tienen una mutaciónen un gen que afecta a su sistema immune(linfocitos no funcionales), al no producir laenzima adenosina desaminasa (ADA), loque conlleva la acumulación del nucleótidodesoxiadenosina, tóxico para los linfocitos Ty B.
Estos niños sólo pueden viviren una “burbuja” libre degérmenes, por lo que seconocen como niños burbuja.
APLICACIÓN: Uso de vectores virales en terapia
génica: Inmunodeficiencia Severa Combinada (SCID)
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En 1998 se extrajeron linfocitos de la médula ósea de 11 niños con laenfermedad, y tras su cultivo in vitro, fueron mezclados con un virus quetransportaba una copia del gen ADA normal.
El virus transferió la copianormal a estos linfocitos yfueron devueltos a la médulaósea de los niños.
El gen reemplazado produjola enzima ADA, y por primeravez estos niños recuperaronsu sistema inmune. Diezmeses más tarde los niñosabandonaron el hospital,perdurando el efecto durante4 años.
Sin embargo, 2 años más tarde, dos de los niños contrajeron leucemia yuno de ellos murió, lo que pudo haber sido causado por el virus. Es obvioque el procedimiento tiene riesgos.
APLICACIÓN: Uso de vectores virales en terapia
génica: Inmunodeficiencia Severa Combinada (SCID)
Terapia génica y TdC En todo el mundo se han producido casos de personas fallecidas como
consecuencia de haber participado en un protocolo de investigación deterapia génica.
¿Como se adopta ladecisión de interveniren procedimientos noexentos de riesgos?
¿Cual es el nivelaceptable de riesgoque debe permitir lainclusión de sereshumanos en unainvestigacióncientífica?
Terapia génica y TdC Un paciente tratado con terapia génica en la Universidad de Pennsylvania
falleció, lo que generó muchos interrogantes y llevó a que gran parte deestas irregularidades se mantengan ocultas.
Por esta razón la terapia génica, anunciadacomo la más firme esperanza de lamedicina en el siglo XXI, sufrió un durísimorevés en los EEUU. Todo se debió a lamuerte de Jesse Gelsinger, quien sesometió a un proceso destinado a corregiruna enfermedad genética. A los pocos díasfalleció por un fallo múltiple de sus órganosvitales, causado por una reacción inmune.
Esta fue la primera muerte directa debida aterapia génica, tras 10 años de trabajo enlos departamentos de investigación de losprincipales hospitales norteamericanos.
Terapia génica y TdC Al parecer, Gelsinger no recibió información sobre los riesgos de las
pruebas, que habían causado la muerte de varios monos y al menoscuatro casos de toxicidad en pacientes anteriores.
Los investigadores de la Universidad de Pennsylvania silenciaron lasposibles contraindicaciones a sus pacientes, y ni siquiera los sometieron aun chequeo médico previo para comprobar su estado de salud.
Según la investigación oficial realizada “losinvestigadores ocultaron información crucial quehubiera evitado el incidente”, lo que hubierasupuesto la inmediata suspensión del ensayo,según las normas acordadas por la agencia desalud.
En la mayoría de estos casos de ocultamiento hay“motivos económicos”. Los científicos callan parano perder financiación de empresas farmacéuticas.
Por ello resulta necesario abordar problemas de laterapia génica con transparencia y gran controlsobre protocolos a ensayar.