Plataforma de Microscòpia
Conceptes de microscòpia Bàsica
Marta Valeri-Sala, MSc, Biòloga
Responsable de la Unitat de Microscòpia
UAT - VHIR
Microscòpia
La microscòpia és l’art de fer visibles detalls fins.
Les condicions prèvies per fer visibles detalls fins són: Ampliació, resolució i contrast.
L’òptica estudia la interacció de la llum amb la matèria i la formació de les imatges a
través de les lents.
Font Llúminica
Creació de la imatge
Detecció
Tractament de la imatge i
anàlisi de les dades
La llum Teories
Teoria corpuscular
La llum està composta per un flux de partícules invisibles o corpuscles (fotons) emeses
pels objectes i captades per l’ull. Es considerava que aquests corpuscles eren emesos
directament d’objectes lluminosos i que es reflexaven en l’ull a partir d’objectes no
lluminosos.
Teoria de les ones electromagnètiques
La llum és una ona electromagnètica.
La imatge es genera degut a la interaccció de les ones electromagnètiques amb el seu
entorn.
La llum Ona electromagnètica
La longitud d’ona és la distància que ha recorregut la llum en realitzar una vibració
completa.
La freqüència és el nombre de vibracions per segon d’una logitud d’ona determinada.
L’amplitud d’ona és el desplaçament màxim d’una partícula respecte del seu punt d’equilibri.
Velocitat llum en l’aire = 300.000 Km/sec
A
La llum Longitud d’ona
La longitud d’ona determina el color de la llum.
L’amplitud d’ona determina la intensitat de la llum.
La llum Refracció
Quan els feixos de llums paral·lels provinents d’una font llumínica canvien de medi canvien
la velocitat i la mantenen dins el medi on es troben.
La refracció es produeix en la superfície on canvia el medi i els feixos es mantenen
paral·lels tant abans com després d’aquesta.
El desviament de la llum depèn de l’angle d’incidència d’aquesta i de la diferència
d’índex de refracció dels dos medis.
L’índex de refracció és el quocient entre la velocitat de la llum en l’aire i la seva
velocitat en altres substàncies.
aire = 1
aigua = 1,33
Vidre de cobreobjetes = 1,51
Oli = 1,51
v 1 v 2
Glicerol = 1,47
La llum Difracció o dispersió
Detecció espectral
Prismes
La difracció es produeix quan les ones procedents d’una font quasi puntual troben un
obstacle o una petita obertura. Llavors deixen de propagar-se en línia recta i volten
l’objecte o s’obren després de passar l’obertura.
La llum Reflexió
Quan la superfície del vidre és un mirall, el feix llumínic no penetra a través d’ell sinó
que es reflexa.
És el mecanisme que coneixem en la generació comuna de les imatges en la vida
quotidiana.
La llum incideix sobre els objectes i es reflexa en ells en un angle que depèn del
propi angle d’incidència del feix llumínic.
i r
i = angle d’incidència
r = angle de reflexió
i = r
La llum Formació d’una imatge
Les ones de llum interaccionen d’una manera que pot ser destructiva ( pèrdua de llum ) o
constructiva ( increment de llum ). El resultat d’aquestes interaccions generalment és
parcialment destructiu i parcialment constructiu.
La formació d’una imatge en un microscopi òptic està directament relacionada amb la
interacció de la llum amb l’objecte:
Desviament dels feixos de llum quan aquests passen a través d’estructures molt
petites (difracció).
Desviament dels feixos de llum quan passen per les diferents lents del propi
microscopi (refracció).
Microscopi Formació de la imatge
La funció de l’objectiu és comparable a la lent d’un
projector.
Projecta la imatge a l’extrem superior del tub del
microscopi (imatge aèria).
Visualitzem la imatge a través de l’ocular que funciona
com una lupa.
La imatge real es forma a l’ull, però aquest la percep com
si es trobés en el pla de la imatge virtual.
Augment real de l’objecte
Augment de l’objectiu x augment de l’ocular = 100 x
10 = 1000
Augment de l’objectiu (ex:100X) = distància entre objecte
i imatge aèria (5000mm) / distància entre l’objecte i
objectiu (50mm).
5000mm
50mm
Microscopi Objectius
Són les peces més precises del microscopi, ja que la seva
funció és augmentar la mostra i resoldre els detalls amb tota
nitidesa i fidelitat.
Augment
És el producte matemàtic entre l’augment de l’objectiu i
el de l’ocular.
El límit de l’augment ve determinat pel poder de
resolució de l’objectiu.
Obertura numèrica
És la variable que defineix el poder de resolució de
l’objectiu.
Aberració
És el defecte òptic inherent al disseny d’una lent que li
impedeix concentrar tots els raigs de llum en un focus
exacte.
Microscopi Objectius
Obertura numèrica
A major obertrura numèrica d’un objectiu, major serà el seu poder de resolució.
Microscopi
aire
Oli
Objectius
Obertura numèrica
Mostres fixades Mostres vives
Objectius d’immersió
Medis de muntatge
Objectius d’aigua
Objectius que es
submergeixen
al medi de cultiu
n = índex de refracció del medi
. Aire n = 1
. Aigua n = 1.33
. Oli n = 1.515
Microscopi
Resolució òptica
Una imatge d’un objecte puntiforme no és un punt sinó que, degut al fenomen de
difracció de la llum, és una petita taca de llum envoltada d’anells llumínics.
Criteri de Rayleigh
La resolució lateral mínima es dóna quan el centre màxim del primer disc d’Airy del
punt 1 cau en el primer mínim del punt 2.
Objectius
RL = 1,22 l /2NA ( NAobjectiu + NA condensador)
Microscopi
Crear la imatge d’un punt com un disc
redueix 1,22 vegades la resolució del
microscopi.
RL = 1,22 l /2NA
Raxial = 2 n lem / NA2
El poder de resolució incrementa amb la llum
monocromàtica i el màxim de resolució es troba en
les longituds d’ona més petites de l’espectre.
Profunditat de camp Propietat que tenen els objetius de presentar
detalls a una mateixa posició de focus en el
gruix d’una mostra.
f = 1/ NA
Objectius
Resolució òptica
Microscopi
Aberracions
Els raigs de llum que passen per la perifèria de la
lent no arriben al mateix punt que aquells que
passen pròxims al centre. La imatge queda més o
menys borrosa i no pot enfocar-se (pèrdua de
contrast).
Esfèriques
Les lents estan formades per un conjunt de prismes més inclinats com més es
trobin a la perifèria.
Cromàtiques
Es detecta en un sistema de lents quan
els raigs de colors que composen la llum
blanca no es condueixen a un focus
simultàniament. Aquest fet provoca
l’aparició de franges cromàtiques no
desitjades en la imatge.
Objectius
Curvatura de camp
Produïda per la pròpia curvatura de la lent.
Microscopi
Correccions
Lent acromàtica
Confeccionades amb cristall de crown i cristall de flint.
Correcció de l’aberració cromàtica de manera que té la
mateixa distància focal per dos colors (roig i blau). Aquesta lent
també està corregida per l’aberració esfèrica per un color.
Lent fluorita (semiapocromàtica)
Combina cristall de quarç i fluorita. Gràcies a la seva baixa
dispersió produeix una qualitat d’imatge propera a la dels
objectius apocromàtics. Té correcció cromàtica per 3 colors (roig,
blau i verd) i correcció esfèrica per dos.
Lent apocromàtica
Corregeixen les aberracions cromàtiques i esfèriques pels tres
colors (roig, blau i verd).
Correcció plana
Corregeix la pròpia curvatura de la lent.
Objectius
Microscopi Objectius
1 2 3
4
5
6 6. Codi de colors pel líquid d’immersió
nergre oli, blanc aigua, taronja glicerina
4. Codi de color per l’Augment
Negre 1.25X, cafè 2,5X, roig 4X i 5X,
taronja 6.3X, groc 10X, verd 20X, 25X
32X, blau clar 40X, 50X, blau fosc 63X,
blanc 100X
1.Categories dels objectius /Color del mèt. contrast
roig POL I DIC,
verd Ph
2. Augment / Obertura Numèrica
3. Longitud del tub / Gruix del cobreobjectes
5. Anell mecànic de correcció
Microscopi Parts del microscopi
Microscopi invertit
Microscopi recte
Microscopi Òptica de Köhler
Il·luminació òptima i homogènia de la preparació a través del condensador i del
diafragma de camp.
Ajust òptim de contrast i resolució a través del condensador i l’obertura de diafragma.
Feix de llum per formar la imatge
(plans de camp conjugats)
Feix de llum d’il·luminació
( plans d’obertura conjugats)
Microscopi Òptica de Köhler
Condensador
Obertura de
camp
Obertura de
diafragma
Centratge
Treure un ocular:
Tancar obertura del
diafragma fins a 3/4
Tipus d’imatge Imatges de camp clar
La font d’ones electromagnètiques genera un raig de llum que penetra en la mostra
que es troba al seu pas. Aquesta interacció provoca l’absorció i refracció de la llum que
es desviarà del seu recorregut inicial de manera diferent segons el material biològic
que travessi. Aquests canvis produiran una imatge amb regions de llum i ombres.
Aquest fenomen es pot incrementar amb l’addició de colorants segons l’afinitat pel
material. Això fa que es produeixi l’absorció de determinades bandes de l’espectre i
s’observin parts de la mostra amb diferents coloracions contrastades.
Es necessita al menys una
diferència d’intensitat d’un
20% per veure les mostres
contrastades.
Objectes de fase
Objectes d’amplitud
Llum transmesa
DICT
n2
n1
El feix llumínic en passar per un
objecte de fase rep un desplaçament
que depèn del seu índex de refracció.
El feix llumínic 1, en passar per un
objecte de fase amb diferent índex
de refracció que el feix llumínic2,
rebrà un desplaçament de fase
diferent.
El desplaçament de fase entre
diferents estructures de la mostra fa
que veiem les imatges amb
profunditat la qual cosa ens permet
diferenciar millor els detalls.
V1 > V2
l1 < l2
f1 = f2
Tipus d’imatge
Llum transmesa
Contrast de Fases
S’aprofita el fenomen de difracció de la llum per incrementar el contrast entre
estructures.
Objectiu Aire
S’incrementa la diferència de fase entre
llum difractada i no difractada d’1/4 a 1/2.
S’incrementa la influència de la llum
difractada en la imatge intermitja
reduint la intensitat de la llum no
difractada.
Tipus d’imatge
Llum transmesa
Obertura del diafragma pràcticament tancada Obertura del diafragma totalment oberta
Contrast de Fases
Posar el filtre de contrast de fases específic per
cada objectiu.
L’obertura del diafragma ha d’estar totalment
oberta.
DICT
Tipus d’imatge
Llum reflexada i emesa
A més de les característiques pròpies de l’objecte que fan que s’absorbeixi
una determinada quantitat de llum d’una franja de l’espectre determinat, la
disposició relativa de la font de llum i la mostra fa que s’obtinguin ombres
que confereixen una sensació de profunditat.
i r És el mecanisme que coneixem en la generació comuna de les imatges en
la vida quotidiana.
La llum incideix sobre els objectes i es reflexa en ells en un angle que depèn
del propi angle d’incidència del feix llumínic.
Lupes estereoscòpiques
Llum emesa El propi objecte és el que emet la llum quan és excitat.
Fluorescència: determinades substàncies són capaces d’absorbir fotons molt
energètics al ser estimulades amb llum d’una determinada longitud d’ona i
alliberar part de l’energia absorbida en forma de fotons de menor energia.
Tipus d’imatge
Upright Microscope
Inverted Microscopes
Olympus BX61
Microscopi
Olympus IX71
Nikon Eclipse TE-2000-S
FSX100
Microscopi Programes
Temps d’exposició
Mida de la imatge (nombre de píxels)
Sensibilitat de la càmera
Olympus IX71 Olympus BX61
Nikon Eclipse TE-2000-S
Microscopi Programes
Correcció de soroll de fons
Microscopi Límits de Resolució
MO
MLC
STORM
STED
SIM
PALM
Lupa