Plataforma para el desarrollo de una Vacuna bivalente pediátrica contra
VIH-1 y M. tuberculosis.
J. Joseph et al.
Hospital Clínic de Barcelona-IDIBAPS/HIVACATUnitat de Recerca VIH/SIDA
Taller UITB 2011Taller UITB 2011Taller UITB 2011Taller UITB 2011Barcelona, 29Barcelona, 29Barcelona, 29Barcelona, 29----11111111----11111111
– Hospital Clínic de Barcelona / HIVACAT.
– MRC Human Immunology Unit, Weatherall Institute of Molecular Medicine, University of Oxford.
ESTUDIO COLABORATIVO ENTRE:
EDCTP:EDCTP:EDCTP:EDCTP: European and Developing European and Developing European and Developing European and Developing countries clinical trial partnership.countries clinical trial partnership.countries clinical trial partnership.countries clinical trial partnership.PedVacc:PedVacc:PedVacc:PedVacc: Development of an infant vaccine Development of an infant vaccine Development of an infant vaccine Development of an infant vaccine against motheragainst motheragainst motheragainst mother----totototo----child transmission of child transmission of child transmission of child transmission of HIVHIVHIVHIV----1 through breast milk.1 through breast milk.1 through breast milk.1 through breast milk.
rBCG:HIV: ¿de qué tipo de vacuna estamos hablando?
José Esparza MD, PhDBill & Melinda Gates Foundation, IAC 2004
Vector vacunal:Mycobacterium bovis
bacillus Calmette-Guérin BCG(I)
Ventajas del uso BCG como vector(I)• Perfil bioseguridad (desarrollado como vacuna
atenuada contra TB en 1920 por Calmette i Guérin ).
• Miles de millones de dosis administradas como vacunas frente a M. tuberculosis
• Producción en masa fácil y barata.• Bacteria Intracelular, reconocida por las Células
Dendríticas, Macrófagos,…
Ventajas del uso BCG como vector (II)
• Adyuvante Inmunopotenciador natural, por la composición de la pared celular.
• Induce inmunidad celular y humoral de larga duración• BCG recombinante se ha utilizado como vector vacunal frente a otras enfermedades.
• Utilizada como vacuna pedipedipedipediáááátricatricatricatrica, que se administra en las primeras semanas de vida.
• Forma parte del programa vacunal en la mayoría de países del mundo.
Vector vacunal: BCG(II)
A:A:A:A: The country currently has universal BCG vaccination program. B:B:B:B: The country used to recommend BCG vaccination for everyone, but currently does not. CCCC: The country never had universal BCG vaccination programs.Zwerling A, Behr MA, Verma A, Brewer TF, Menzies D, et al. (2011) The BCG World Atlas: A Database of Global BCG Vaccination Policies and Practices. PLoS Med 8(3): e1001012. doi:10.1371/journal.pmed.1001012
Map displaying BCG vaccination policy by country.
ADN BCG
Lys-
pJH222HIVA
multi-CTL epitope region
p24 p17
Pk Tag1 2 3
HIVA: Immunogen designed for a CTL response versus
HIV-1 Clade A.
BCG LysA-: BCG substrain Pasteur, Lys auxotrophic.
Plasmid DNA: pJH222HIVA
HIVA
Kan r
LysA
OriE
OriMpJH222HIVApJH222HIVA
Nuestro modelo vacunal: BCG.HIVA222
Inmunógeno: rBCG222HIVA
Modelo animal: BALB/c
Vía de Inoculación: Intraperitoneal
MVA INOC
WEEK 0 WEEK 14 WEEK 17
SACRIF.BCG INOC
VacunaciVacunaciVacunaciVacunacióóóón:n:n:n:primeprimeprimeprime----boost heterboost heterboost heterboost heteróóóólogologologologo
(dos vectores con el mismo inmun(dos vectores con el mismo inmun(dos vectores con el mismo inmun(dos vectores con el mismo inmunóóóógeno)geno)geno)geno)
rBCG isolated from vaccinated mice at 14 weeks p.v.
rBCG:HIVA in vivo stability
At 14 weeks p.v., 100% of the isolated colonies carried the pJH222HIVA plasmid
Pruebas de protección:
1) Naïve 2) BCG.p3) BCG.HIVA4) pTHr.HIVA DNA5) pTHr.HIVA DNA + BCG.p6) pTHr.HIVA + BCG.HIVA
DesafDesafDesafDesafíííío subrogado con virus vaccinia que expresa HIVAo subrogado con virus vaccinia que expresa HIVAo subrogado con virus vaccinia que expresa HIVAo subrogado con virus vaccinia que expresa HIVA
InfecciInfecciInfecciInfeccióóóón conn conn conn con Mycobacterium tuberculosisMycobacterium tuberculosisMycobacterium tuberculosisMycobacterium tuberculosis
Protocolo de vacunación
MVA INOC
WEEK 0 WEEK 14 WEEK 17
SACRIF.BCG INOC
Grupos1: (6 mice) BCG:HIVA + MVA:HIVA2: (6 mice) BCGwt + MVA:HIVA
Grupos1: (6 mice) BCG:HIVA + MVA:HIVA2: (6 mice) BCGwt + MVA:HIVA
Animales: Hembras BALB/C mice
Edad: 7 semanas (adultos)
7 días (recién nacidos)
Dosis:rBCGHIVA y BCGwt:..........106 cfuMVA:HIVA:.......................106 pfu
Vías inoculación:
rBCGHIVA/BCGwtAdultos:-Intradérmica (ID)-Subcutánea (SC)Recién Nacidos:-Subcutánea (SC)
MVA:HIVA-Intramuscular (IM)
Inducción de respuesta específica frente a VIH-1: ensayo ICS y CTL
IFN-γγγγ ICS, CD8+,
estimulación con P18I10
Respuesta citolítica “in vitro” frente a
VIH.Células diana pulsadas
con P18I10 0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
Adult I.D. Adult S.C. New born S.C.
% s
pec
ific
kill
ing
*********
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
Adult I.D. Adult S.C. Newborn S.C.
IFN
γγ γγ+
(%
CD
8 + T
-ce
lls)
*****
*
*
Inducción de respuesta específica frente a Mycobacterium:
ELISpot, esplenocitos, estimulación con PPD
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Adult S.C. Newborn S.C.
IFNγγ γγ s
fu/1
06 sp
len
ocy
tes
*
Vaccinated Newborn mice body weight growth curve
0
5
10
15
20
25
30
0 5 10 15 20 25
Age (weeks)
Bo
dy w
eig
ht
(gr)
rBCG:HIVA + MVA:HIVA
BCGwt + MVA:HIVA
rBCG:HIVA
MVA:HIVA
BCGwt
Naïve
Mean
MVA vacc.
BCG vacc.
Seguridad de la vacuna: evolución del peso corporal de los ratones
recién nacidos
MVA vacc.BCG vacc.
Vaccinated Newborn mice body weight growth curverBCG:HIVA + MVA:HIVA
BCGwt + MVA:HIVA
rBCG:HIVA
MVA:HIVA
BCGwt
Naïve
Desarrollo de un vector de refuerzo MVA recombinante que contiene inmunógenos de Mycobacterium (Ag 85A) para mejorar la respuesta inmune frente a Mycobacterium Tuberculosis en un programa de inducción-refuerzo con BCG.
MVA.HIVA MVA.HIVA MVA.HIVA MVA.HIVA vsvsvsvs MVA.HIVA.85AMVA.HIVA.85AMVA.HIVA.85AMVA.HIVA.85A
Priming Agents:Priming Agents:Priming Agents:Priming Agents:-BCG.HIVA401
BCG1331∆ureC::ΩpfoA-BCG.HIVA222
BCG Pasteur ∆lysA5
Boosting Agents:Boosting Agents:Boosting Agents:Boosting Agents:-Human Adenovirus serotype 5 (HAdV5.HIVA)-Ovine Atadenovirus serotype 7 (OAdV7.HIVA)-Modified Vaccinia Ankara Strain (MVA.HIVA)-Plasmid DNA (pTH.HIVA)-BCG.HIVA222 (BCG Pasteur ∆lysA5)
Desarrollo del vector vacunal BCG.HIVA222 kanminus
Incluído en el proyecto financiado por la EDCTP““““PedVacc: PedVacc: PedVacc: PedVacc: Development of an infant vaccine against motherDevelopment of an infant vaccine against motherDevelopment of an infant vaccine against motherDevelopment of an infant vaccine against mother----totototo----child transmission of HIVchild transmission of HIVchild transmission of HIVchild transmission of HIV----1 through breast milk.1 through breast milk.1 through breast milk.1 through breast milk.””””
La parte del proyecto de nuestro grupo de investigación era:- Desarrollo de la cepa BCG.HIVA222 libre de resistencias a
antibióticos: BCG.HIVA222kanminus.- Caracterización de la cepa BCG.HIVA222kanminus y
demostración de su inmunogenicidad y seguridad.
Eliminación de la resistencia a la kanamicina del plásmido
pJH222HIVA
Kan r
Eliminación del gen de la resistencia a la kanamicina mediante un proceso de “represor titration”, realizado por Cobra Inc
ADN BCGLys-
Transformación de BCG Pasteur Lys-
BCG.HIVABCG.HIVABCG.HIVABCG.HIVA222222222222
BCG.HIVABCG.HIVABCG.HIVABCG.HIVA222222222222kanminuskanminuskanminuskanminus
pJH222HIVAkanminuspJH222HIVAkanminus
HIVA
LysA
ADN BCG Lys-
pJH222HIVAkanminus
OriEOriM
pJH222HIVA pJH222HIVA kanminuskanminus
CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA DE LA CEPA BCG.HIVA222kanminus (I)
Identificación del plásmido pJH222HIVA kanminus por digestión
con enzimeas de restricción.
Demostración por PCR de la presencia de la secuencia codficante para HIVA en la Matriz de Siembra de
BCG.HIVA222kanminus (carril 3), comparado con la banda obtenida de la cepa BCG.HIVA222 con resistencia
a kanamicina (carril 6).
CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA DE LA CEPA BCG.HIVA222kanminus (II)
ADN BCG Lys-
pJh222HIVA kanminus
Confimación de la cepa BCG de Mycobacterium bovis mediante ensayo
GenoType® MTBC (Hain Lifescience GmbH).
Confirmación de la subcepa Pasteur de BCG por Multiplex PCR, descrito por
Bedwell et al. Vaccine. 2001, 19:2146-51.
CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE LA CEPA BCG.HIVA222kanminus (I)
• AUXOTROFIA PARA LISINA DE LA CEPA BCG Pasteur.
• PRESENCIA DEL GEN DE COMPLEMENTACION DE SÍNTESIS DE LISINA EN EL PLASMIDO.
• AUSENCIA DE RESISTENCIA A KANAMICINA.
Demostración por dot-blot de la síntesis del polipéptido codificado por
la secuencia de HIVA en BCG.HIVA222kanminus (Clon10)
DEMOSTRACIÓN DE LA INMUNOGENICIDAD DE
BCG.HIVA222kanminus EN BALB/c
2x106 cfuADULTOS: 7 semanas, vía IDNEWBORN: 7 días, vía SC
106 pfuVía IM
Specific HIVA immune response by ICS staining in BALB/c mice inoculated with
BCG.HIVA222kanminus+MVA.HIVA
00,10,20,30,40,50,6
Adult Newborn Naïve
%C
D8+
T- c
ells
p
rod
uci
ng
IFN
-γ (P
18I1
0 st
imu
latio
n)
Specific BCG immune response by ELISpot in BALB/c
mice inoculated with BCG.HIVA222kanminus+MVA.HIVA
0
50
100
150
200
Adult Newborn Naïve
sfu
/10
6 sp
len
oc
yte
s
(PP
D s
tim
ula
tio
n)
DEMOSTRACIÓN DE LA SEGURIDAD DE BCG.HIVA222kanminus EN BALB/c
Seguimiento de la evolución del peso corporal de los ratones adultos y recién nacidos durante el desarrollo de la prueba.
CONCLUSIONES- Se ha caracterizado genética y fenotípicamente
BCG.HIVA222kanminus.
- Se ha demostrado la inmunogenicidad y seguridad de BCG.HIVA222kanminus en ratones BALB/c adultos y recién nacidos.
- El modelo desarrollado permitiria avanzar en la realización de ensayos clínicos.
- El uso de inmunógenos contra M. tuberculosis en el virus de refuerzo (MVA.HIVA.Ag85A) aumenta la respuesta inmune frente a TB.
- BCG.HIVA222 es un buen vector de inducción con vectores de refuerzo distintos a MVA.HIVA: HAdV5.HIVA, OAdV7.HIVA.
- BCGHIV+MVAHIV se podria utilizar como vacuna bivalente pediatrica contra TB y VIH.