PPAR� atenúa el estrés del retículo endoplasmáticoinducido por palmitato en células cardíacas humanaspor medio de la inducción de la actividad AMPK�
Xavier Palomera, Eva Capdevila-Busquetsa, Gerard Garretaa, Mercy M. Davidsonb
y Manuel Vázquez-Carreraa,∗
a Departamento de Farmacología y Química Terapéutica, IBUB (Institut de Biomedicina de la Universitat de Barcelona) y CIBER deDiabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM), Facultad de Farmacia, Universitat de Barcelona, Barcelona, Espanab Department of Radiation Oncology, Columbia University, New York, Estados Unidos
Recibido el 31 de diciembre de 2013; aceptado el 13 de febrero de 2014
PALABRAS CLAVEProteína cinasaactivada por 5’-AMP;Cardiomiocitos;Cardiomiopatíadiabética;Corazón;Estrés del retículoendoplasmático;Receptor activadopor proliferadoresperoxisómicos detipo �
ResumenIntroducción: El estrés del retículo endoplasmático (RE) se ha relacionado con distintas enfer-medades cardiovasculares, como la arteriosclerosis y la hipertrofia e insuficiencia cardíacas.Este estrés del RE altera la senalización de la insulina, contribuyendo al desarrollo de la resis-tencia a la insulina y la diabetes. Diversos estudios han demostrado que PPAR� inhibe el estrésdel RE, por lo que el objetivo de este trabajo consistió en investigar si la activación de estereceptor nuclear era capaz de prevenir el estrés del RE inducido por ácidos grasos saturados encélulas cardíacas, así como los mecanismos implicados.Métodos: Cardiomiocitos humanos AC16 fueron tratados con palmitato en presencia de diferen-tes activadores e inhibidores de AMPK y PPAR�. Para los estudios in vivo, ratones macho fueronalimentados con una dieta rica en grasa (HFD). Posteriormente, se determinó la presencia dedistintos marcadores de estrés del RE en células cardíacas por medio del análisis de la expresióngénica y la acumulación proteica.Resultados: El palmitato y la dieta HFD indujeron el estrés del RE en células cardíacas, pues
incrementaron diversos marcadores de este, como son la expresión génica de ATF3, BiP/GRP78y CHOP, el splicing de XBP1 y la fosforilación de IRE-1� y eIF2�. El tratamiento con Wy-14,643, un agonista de PPAR�, previno el incremento del estrés del RE inducido por palmitato por medio
Cómo citar este artículo: Palomer X, et al. PPAR� atenúa el estrés del retículo endoplasmático inducido por pal-mitato en células cardíacas humanas por medio de la inducción de la actividad AMPK. Clin Invest Arterioscl. 2014.http://dx.doi.org/10.1016/j.arteri.2014.02.003
de la activación de la AMPK.
� Una comunicación referente a esta línea de trabajo, titulada «La activación de AMPK previene el estrés del retículo endoplasmáticoinducido por palmitato en cardiomiocitos humanos AC16», fue presentada en el XXV Congreso Nacional de la SEA-Reus 2012 y galardonadacon una Mención especial.
∗ Autor para correspondencia.Correo electrónico: [email protected] (M. Vázquez-Carrera).
a diabetes de tipo 2 y la obesidad, especialmente si noe corrigen, se encuentran entre los principales factorese riesgo para el desarrollo de enfermedades cardiovas-ulares. De hecho, la clásica dieta Western, debido au alto contenido en grasa, presenta diferentes efectosobre la fisiología cardiovascular que parecen estar rela-ionados directamente con una amplia variedad de efectosdversos a nivel cardíaco, incluyendo inflamación, hiper-rofia, fibrosis y disfunción contráctil1. Sin embargo, losecanismos a través de los cuales el consumo de die-
as ricas en grasas participa en la progresión de estosrastornos son aún poco conocidos. En los pacientes coniabetes de tipo 2 y obesidad es frecuente observar nive-es elevados de ácidos grasos libres en plasma, los cualeson responsables de múltiples efectos nocivos sobre elorazón, como la activación del retículo endoplasmáticoRE) y procesos inflamatorios crónicos de baja intensi-ad. Por ejemplo, se han detectado niveles elevados dearcadores clave en el estrés del RE tanto en pacien-
es diabéticos2 como en ratones diabéticos y obesos3,4.
Cómo citar este artículo: Palomer X, et al. PPAR� atenúa
mitato en células cardíacas humanas por medio de la induchttp://dx.doi.org/10.1016/j.arteri.2014.02.003
simismo, se ha indicado que los ácidos grasos saturadosrovocan resistencia a la insulina por medio de la inducciónel estrés del RE en células �-pancreáticas5,6, hepatocitos7
lpt
células musculares8,9, tanto de origen humano comourino.El RE es el orgánulo responsable del plegamiento, así
omo de la correcta maduración, de las proteínas sinte-izadas de novo en las células eucariotas. Las proteínaslegadas correctamente viajan desde la luz del RE a otrosrgánulos celulares, la membrana celular e incluso el espa-io extracelular, mientras que las proteínas mal plegadason dirigidas hacia la vía de degradación proteosomal aso-iada al RE (ERAD) para su posterior eliminación10. Cualquiererturbación fisiológica o patológica que interfiera con elormal funcionamiento del RE provocará la acumulación deroteínas plegadas incorrectamente, lo que conducirá a lactivación por parte del RE de lo que se conoce como la res-uesta a proteínas mal plegadas (UPR)11. La activación desta UPR implica 3 proteínas de senalización principales: elactor de transcripción activador (ATF)6, la enzima depen-iente de inositol (IRE)-1� y la cinasa del RE de tipo PKRPERK). En ausencia de estrés, los extremos N-terminalesransmembrana de estas proteínas se encuentran unidas aa proteína intraluminal BiP/GRP78 (proteína de unión anmunoglobulina/proteína 78 regulada por glucosa). Ante
el estrés del retículo endoplasmático inducido por pal-ción de la actividad AMPK. Clin Invest Arterioscl. 2014.
a presencia de un factor de estrés, el gran exceso deroteínas mal plegadas secuestra BiP/GRP78 de las pro-eínas transmembrana del RE, lo que inducirá la UPR. En
PPAR atenúa el estrés del retículo endoplasmático inducido
concreto, ATF6 es transportado desde el RE hasta el com-plejo de Golgi, en el cual una escisión proteolítica liberaun fragmento soluble que se trasloca hacia el núcleo, dondeactuará como un factor de transcripción para chaperonas delRE y genes relacionados con la vía ERAD12. Por otro lado, laactividad endoribonucleasa de IRE-1� escinde un segmentode 26 pares de bases del ARNm de la proteína de unión aX-box 1 (XBP1), generando un mensaje alternativo que setraduce en una forma activa de este factor de transcripción,XBP1s. Finalmente, PERK fosforila e inhibe el factor de ini-ciación eucariota 2� (eIF2�), impidiendo de esta manera latraducción de la mayoría de los ARNm10. No obstante, algu-nos ARNm logran escapar de este control de la traducción,como es el caso de ATF4, un regulador clave de la respuestadel RE al estrés, ya que es capaz de inducir la expresiónde ATF3, BiP/GRP78, proteína homóloga a C/EBP (CHOP)o GADD153 y genes implicados en la autofagia, respuestaantioxidante y apoptosis13.
Inicialmente, la activación de la UPR tiene como obje-tivo principal mitigar los efectos adversos del estrés delRE y, por lo tanto, incrementar la supervivencia celular.Esto se consigue mediante la detención de la traduccióngeneral de ARNm, facilitando la degradación de proteí-nas a través de la vía ERAD y mejorando la producciónde chaperonas moleculares implicadas en el plegamientoproteico. Si el estrés del RE es limitado, la UPR poten-ciará la autofagia para proteger las células14, pero si esteestrés no se mitiga dentro de un cierto período, o el tras-torno es prolongado, entonces la UPR iniciará el procesoapoptótico con el fin de eliminar las células que amena-zan la integridad del organismo15. En el corazón adulto,los cardiomiocitos rara vez proliferan y, como consecuen-cia, su pérdida debido a la apoptosis puede desempenar unpapel fundamental en la patogénesis de las enfermedadescardiovasculares12. En consonancia con esto, se ha descritoque el estrés del RE está implicado en la patogénesis dela cardiomiopatía diabética como consecuencia del incre-mento de la muerte celular que provoca en el miocardio deratas diabéticas16. Igualmente, el miocardio de 2 modelosdistintos de rata con diabetes de tipo 2 también muestraestrés del RE17,18. En concreto, en el miocardio de uno deestos modelos, la rata diabética no obesa SDT, se produce unincremento de marcadores de estrés del RE y de senalizaciónpro y antiapoptótica que coincide con una disminución deproteínas relacionadas con el metabolismo de la glucosa ylos lípidos17. Entre estas proteínas destacan los receptoresactivados por proliferadores peroxisómicos (PPAR) de tipo� (PPAR�) y � (PPAR�), además de genes diana de estos,como son los transportadores de glucosa (GLUT4) y áci-dos grasos (carnitina palmitoiltransferasa-1 [CPT-1])17. LosPPAR son factores de transcripción dependientes de ligandoque pertenecen a la superfamilia de receptores nuclearesy que forman heterodímeros con el receptor de retinoi-des X para unirse al ADN de sus genes diana e iniciar sutranscripción génica. De los 3 subtipos de PPAR presen-tes en mamíferos, PPAR� (NR1C1) y PPAR� (NR1C3) son,respectivamente, dianas terapéuticas de fármacos hipoli-pidemiantes (fibratos) y antidiabéticos (tiazolidinedionas).
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mitato en células cardíacas humanas por medio de la induchttp://dx.doi.org/10.1016/j.arteri.2014.02.003
PPAR� se expresa en tejidos con una elevada capacidad de�-oxidación de ácidos grasos, como el hígado y el corazón,donde lleva a cabo funciones de regulación del catabolismolipídico y de control de la inflamación19-21. Puesto que se ha
eflr
PRESSalmitato en cardiomiocitos 3
ndicado que la inhibición del estrés del RE podría ser unaiana terapéutica útil para la prevención y el tratamientoe la cardiomiopatía diabética, este estudio fue disenado,n primer lugar, para comprender los mecanismos medianteos cuales la exposición a ácidos grasos saturados resultan estrés del RE en células cardíacas y, en segundo lugar,nvestigar si la activación de PPAR� podría prevenir estestrés.
ateriales y métodos
écnicas de cultivo celular
as células cardíacas humanas AC16 fueron crecidas yantenidas tal y como ya se ha descrito previamente22.revemente, las células AC16 no diferenciadas fueron man-enidas con medio de cultivo Dulbecco’s modified Eagle’sedium (DMEM):F12 suplementado con un 12,5% (v:v) de
uero bovino fetal, 1% (p:v) de penicilina-estreptomicina 1% (p:v) de fungizona (Life Technologies, S.A., Espana),n un incubador a 37 ◦C y 5% de CO2, hasta llegar an 70-80% de confluencia. Las células fueron entoncesstimuladas durante 18 h con un medio que contenía pal-itato (0,25 mM), en presencia o ausencia de distintos
gonistas o antagonistas farmacológicos. El medio con pal-itato se preparó por conjugación con albúmina séricaovina (BSA) libre de ácidos grasos23. Después de la incu-ación y los correspondientes tratamientos, se extrajeronl ARN y las proteínas, tal y como se describe a continua-ión.
nimales
atones C57BL/6X129/SV macho fueron mantenidos bajoondiciones estándar de iluminación (ciclos de 12 h deuz/oscuridad) y temperatura (21 ± 1 ◦C), y alimentados conna dieta estándar hasta el comienzo de los estudios,eniendo acceso ad libitum a bebida y alimento duranteodo el procedimiento. A los 5 meses de edad, los ratonesueron divididos en 2 grupos experimentales: uno fue ali-entado con una dieta estándar (con un 4% de grasa) y el
tro con una dieta rica en grasas (high-fat diet [HFD], conn 45% Kcal procedente de grasas, un 91,5% de las cuálescidos grasos saturados) durante 8 semanas. La investiga-ión fue realizada de acuerdo con la Guía para el cuidado yl uso de animales de laboratorio publicada por el US Natio-al Institutes of Health (Publication n.◦ 85-23, revisada en996). Todos los procedimientos fueron aprobados por elomité Ético de la Universitat de Barcelona, conforme a
o establecido en la Ley 5/21 de julio de 1995, aprobadaor la Generalitat de Catalunya. Al final del tratamiento,os ratones fueron anestesiados con isofluorano 5% y, des-ués de monitorizar la eficacia de la anestesia por medioe la determinación de los reflejos en la pata trasera,ueron sacrificados por dislocación cervical. Después de
el estrés del retículo endoplasmático inducido por pal-ción de la actividad AMPK. Clin Invest Arterioscl. 2014.
sto, se extirpó el corazón, que se lavó en tampón fos-ato salino frío y finalmente fue congelado en nitrógenoíquido para ser conservado a ---80 ◦C hasta su análisis poste-ior.
btención del ARN y análisis de la expresión génicaor reacción en cadena de la polimerasauantitativa en tiempo real
l ARN total fue aislado utilizando el reactivo UltraspecBiotecx, Houston, EE. UU.), siguiendo las indicaciones delabricante. Los niveles relativos de ARNm fueron analiza-os mediante la técnica de transcriptasa reversa asociada aa reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) a tiempoeal, tal y como se ha descrito previamente24. Los nive-es de XBP1s se determinaron por electroforesis en gel degarosa8. Las secuencias de los oligonucleótidos utilizadosara la amplificación se describen en la tabla 1.
nálisis de Western-blot
os extractos proteicos totales fueron obtenidos por lisise las células en tampón RIPA (Sigma, St Louis, EE. UU.)on inhibidores de fosfatasas y proteasas. El homogenizadoesultante fue centrifugado a 10.000 g durante 30 min a 4 ◦C,
la concentración proteica contenida en el sobrenadanteue determinada mediante el método de Bradford25, adap-ado a microplacas. Posteriormente, las proteínas fueroneparadas en geles de SDS-PAGE al 10% (p:v) de acrilamida
transferidas a membranas de polivilideno (Millipore, Bed-ord, EE. UU.). Para la determinación de IRE-1� se utilizón gel phos-tag según se ha descrito en la bibliografía26. Lanmunodetección se realizó utilizando anticuerpos especí-cos (Cell Signaling Technology, Danvers, EE. UU.; Sigma)
el kit de quimioluminiscencia Western Lightning® Plus-ECLPerkinElmer, Waltham, EE. UU.). El tamano de las proteínase determinó utilizando un estándar de pesos molecularesLife Technologies).
nálisis estadísticos
os resultados se expresan como la media ± desviaciónstándar de al menos 3 experimentos independientes paraos estudios in vitro, cada uno de ellos consistente en 3lacas de cultivo (n = 9), y 5 ratones para los experimen-os in vivo. Las diferencias significativas fueron establecidasediante los tests estadísticos t de Student o ANOVA, depen-
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iendo del número de grupos comparados, y utilizando elrograma informático GaphPad Prism (GraphPad Softwarenc, San Diego, EE. UU.). En los casos en que se encontra-on diferencias estadísticamente significativas, se aplicó el
ost-test de Tukey-Kramer para comparaciones múltiples.as diferencias fueron consideradas significativas a partir de
< 0,05.
esultados
os ácidos grasos saturados incrementan losarcadores de estrés del retículo endoplasmático
n células cardíacas
n primer lugar, se determinó si el ácido graso saturadoalmitato era capaz de inducir la expresión de distintos mar-adores de estrés del RE en células cardíacas humanas AC16.omo se observa en la figura 1 A, el palmitato indujo el spli-ing, y por lo tanto la activación, de XBP1, en comparaciónon las células expuestas solo a BSA. Asimismo, los análi-is de RT-PCR cuantitativa en tiempo real demostraron queste ácido graso saturado inducía de manera significativaa expresión de ATF3 (aproximadamente 2 veces, p < 0,001s. control), BiP/GRP78 (∼ 2 veces, p < 0,001) y CHOP (∼
veces, p < 0,001) (fig. 1 B). Para corroborar los resultadosbtenidos in vitro con células cardíacas humanas, tambiéne realizaron estudios in vivo con ratones alimentados conietas ricas en ácidos grasos saturados (HFD). De acuerdoon lo observado in vitro, la dieta HFD indujo de manera sig-ificativa la expresión de BiP/GRP78 y CHOP en el corazóne estos ratones (∼ 1,5 veces, p < 0,001 y p < 0,01, respec-ivamente, vs. dieta control) (fig. 2 A). Por el contrario, ladministración de una dieta rica en grasas no incrementól splicing de XBP1 ni, en consonancia con esto, tampocoodificó la fosforilación de IRE-1� (fig. 2 B), pero sí indujo
a fosforilación de eIF2� en Ser51 (fig. 2 C).
a activación de la proteína cinasa activada por’-AMP mediante 5-aminoimidazol-4-carboxamidaibonucleótido previene el estrés del retículondoplasmático inducido por palmitato enardiomiocitos humanos AC16
iversos estudios han demostrado que la inducción de laroteína cinasa activada por 5’-AMP (AMPK), la cual es con-
el estrés del retículo endoplasmático inducido por pal-ción de la actividad AMPK. Clin Invest Arterioscl. 2014.
iderada una diana farmacológica para el tratamiento dea resistencia a la insulina y la diabetes de tipo 227, inhibel estrés del RE8,28, mientras que la reducción de la activi-ad de esta cinasa lo promueve29. En consecuencia, nuestro
PPAR atenúa el estrés del retículo endoplasmático inducido por palmitato en cardiomiocitos 5
ACtrl
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XBP1u XBP1s
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Figura 1 El palmitato induce el estrés del RE en cardiomiocitos AC16. A) Niveles de XBP1u/XBP1s (unspliced/spliced) determinadosmediante RT-PCR y B) cuantificación relativa de los niveles de ARNm de ATF3, CHOP y BiP/GRP78 determinados mediante RT-PCRcuantitativa en tiempo real, de muestras obtenidas de células AC16 tratadas con palmitato (Pal, 0,25 mM, 18 h). Los gráficosrepresentan los niveles de ARNm normalizados con el gen control 18S y están expresados como porcentaje respecto el grupo control
upldi(tfidnicemtderA1pse1eieieuamf3cfc
(Ctrl) ± DE.***p < 0,001 vs. Ctrl.
siguiente objetivo fue investigar el papel de la AMPK en elestrés del RE inducido por palmitato en células cardíacashumanas. Para ello, utilizamos un mimético de AMP queactúa como activador de la AMPK, el 5-aminoimidazol-4-carboxamida ribonucleótido (AICAR), así como un inhibidorde esta, el Compuesto C. Tal y como demuestran nuestrosresultados, AICAR redujo el splicing de XBP1 inducido porpalmitato (fig. 3 A), así como la expresión de BiP/GRP78y CHOP, aunque incrementó la expresión de ATF3 (∼ 3,5veces, p < 0,001 vs. control, fig. 3 B). AICAR también previnoel incremento inducido por palmitato de la proteína CHOP yla activación por fosforilación de IRE-1� (fig. 3 C), cuya acti-vidad endoribonucleasa provoca el splicing de XBP1. Estosresultados concuerdan con la reducción de XBP1s y de latranscripción de CHOP.
Por el contrario, AICAR indujo la fosforilación de eIF2�en Ser51 (∼ 3 veces, p < 0,01 vs. control, fig. 3 C). El signifi-cado fisiológico del incremento de la fosforilación de eIF2�en Ser51 permanece aún por elucidar, pues es ampliamenteconocido que la fosforilación de eIF2� inhibe la traduccióngenérica del ARNm a proteína en el RE, pero podría estarrelacionado con los efectos descritos para AICAR sobre laexpresión de ATF3 ya descritos en la figura 3 B. Este papeldual de AICAR ya había sido descrito previamente en car-diomiocitos de ratón HL-1, donde este activador de AMPKreduce la apoptosis inducida por hipoxia/reoxigenación10.En todos nuestros estudios, la activación de AMPK por AICARse confirmó mediante Western-blot por determinación de lafosforilación de AMPK en Thr172, la cual es esencial para suactividad, así como la fosforilación de una proteína diana deesta, la acetil-CoA carboxilasa 2 (ACC2) en Ser218 (datos nomostrados).
La activación de la proteína cinasa activada por5’-AMP inducida por Wy-14,643 atenúa el estrésdel retículo endoplasmático inducido por palmitato
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pero no por tunicamicina
PPAR� es un factor de transcripción clave para el controldel metabolismo celular. Dado que la AMPK es también
ccb
n regulador importante de la homeóstasis metabólica queuede ser inducida por agonistas de PPAR�, y que la desregu-ación de PPAR� tiene un papel importante en el desarrolloe la hipertrofia y la insuficiencia cardíacas, a continuaciónnvestigamos el papel de un agonista de PPAR�, Wy-14,64310 �M, 24 h), sobre el estrés del RE inducido por palmi-ato en células cardíacas humanas. Como se observa en lagura 4, el tratamiento con Wy-14,643 redujo los nivelese expresión de ATF3 y CHOP inducidos por palmitato, peroo previno el splicing de XBP1, ni tampoco el importantencremento de expresión de BiP/GRP78. La coincubaciónon un inhibidor de AMPK, el Compuesto C, indicaba que losfectos beneficiosos de Wy-14,643 sobre ATF3 y CHOP eranediados por la activación de AMPK. Al mismo tiempo, el
ratamiento con el Compuesto C solo no modificaba ningunoe estos genes (datos no mostrados). Estos cambios en laxpresión génica de marcadores de estrés del RE coincidie-on con los niveles proteicos determinados por Western-blot.sí, la figura 4 C muestra cómo el cotratamiento con Wy-4,643 no revirtió la fosforilación de IRE-1� inducida poralmitato, de la misma manera que tampoco prevenía elplicing de XBP1, demostrando que este agonista de PPAR�ra incapaz de inhibir la actividad endoribonucleasa de IRE-� sobre XBP1. Asimismo, y de acuerdo con los niveles dexpresión génica, el tratamiento con Wy-14,643 atenuó elncremento en los niveles de proteína CHOP provocado porl palmitato. Esta reducción de los niveles de proteína CHOPnducidos por Wy-14,643 fueron completamente prevenidosn presencia del Compuesto C, demostrando la implicación,na vez más, de la AMPK en los efectos beneficiosos de lactivación de PPAR� sobre el estrés del RE inducido por pal-itato. Sorprendentemente, Wy-14,643 también indujo la
osforilación de eIF2� en Ser51 de manera significativa (∼ veces, p < 0,05 vs. control). A diferencia de lo que ocurríaon el activador de AMPK, AICAR, este incremento en laosforilación de eIF2� inducido por activación de PPAR� noorrelacionaba con una mayor expresión de ATF3.
l estrés del retículo endoplasmático inducido por pal-ción de la actividad AMPK. Clin Invest Arterioscl. 2014.
La inhibición del estrés del RE después de la activa-ión de la AMPK con AICAR también se demostró en célulasardíacas inducidas con tunicamicina, una mezcla de anti-ióticos nucleósidos homólogos que actúa como un potente
Figura 2 La dieta rica en grasas (HFD) induce el estrés del RE en corazón de ratón. Cuantificación relativa de los niveles de: A)ARNm de BiP/GRP78 y CHOP, determinados mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real, y B) XBP1u/XBP1s (unspliced/spliced),determinados mediante RT-PCR, de muestras obtenidas de corazón de ratones alimentados con un dieta estándar (control [Ctrl])o rica en ácidos grasos saturados (HFD) durante 8 semanas. Los gráficos representan los niveles de ARNm normalizados con el gencontrol APRT y están expresados como porcentaje respecto el grupo control ± DE. C) Análisis por Western-blot de los niveles deproteína IRE-1� total y fosforilada, y eIF2� total y fosforilada en las mismas muestras descritas en el panel A. Los gráficos representanla cuantificación de los niveles de proteína normalizados y están expresados como porcentaje de las muestras control ± DE. Todaslas autorradiografías son representativas de 2 experimentos independientes.*p < 0,05 vs. Ctrl.*
*
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* p < 0,01 vs. Ctrl.**p < 0,001 vs. Ctrl.
nductor farmacológico del estrés del RE. Como era de espe-ar, la tunicamicina provocó un aumento muy importanten la expresión de distintos marcadores de estrés, comoon el ATF3 (∼ 3 veces, p < 0,001 vs. control), BiP/GRP78∼ 8 veces, p < 0,001) y CHOP (∼ 11 veces, p < 0,001), ade-ás de inducir los niveles proteicos de CHOP (∼ 2 veces,
< 0,001) y la fosforilación de IRE-1� (∼ 3 veces, p < 0,05) eIF2� (∼ 1,5 veces, p < 0,05) (fig. 5). La adición de AICAR
las células tratadas con tunicamicina impidió el aumentoe algunos de estos marcadores, tales como la expresiónénica de BiP/GRP78 y CHOP, pero no de ATF3 (fig. 5 A).os análisis de Western-blot revelaron que AICAR también
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mitato en células cardíacas humanas por medio de la induchttp://dx.doi.org/10.1016/j.arteri.2014.02.003
uprimía el aumento de la proteína CHOP inducido por tuni-amicina, pero no de la fosforilación de eIF2� o IRE-1�fig. 5 B). La activación de AMPK por AICAR se confirmóe nuevo mediante la determinación de la fosforilación de
cr(c
MPK y ACC2 (datos no mostrados). Por el contrario, la adi-ión de Wy-14,643 a las células tratadas con tunicamicinaue incapaz de prevenir ninguno de los cambios inducidosor tunicamicina sobre estos marcadores (fig. 5).
Dado que los agonistas de PPAR�, incluyendo Wy-14,643,ueden inducir la fosforilación de AMPK de manera indepen-iente de la activación de PPAR�, nuestro último objetivoue examinar si esta cinasa estaba realmente implicadan los efectos de Wy-14,643. Para ello, monitorizamosos niveles de fosforilación de AMPK en Thr172 medianteestern-blot con anticuerpos específicos. Sorprendente-ente, tanto el palmitato (∼ 3 veces, p < 0,05 vs. grupo
el estrés del retículo endoplasmático inducido por pal-ción de la actividad AMPK. Clin Invest Arterioscl. 2014.
ontrol), como Wy-14,643 (∼ 2,5 veces, p < 0,05), induje-on la fosforilación de AMPK en células cardíacas humanasfig. 6 A). Dado que la regulación de la actividad de AMPK esompleja, y su estado de fosforilación es controlado tanto
PPAR atenúa el estrés del retículo endoplasmático inducido por palmitato en cardiomiocitos 7
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Figura 3 La activación de AMPK previene el estrés del RE inducido por palmitato en células cardíacas humanas. Células AC16fueron tratadas con palmitato (Pal, 0,25 mM, 18 h) en presencia o ausencia de AICAR (AIC, 2 mM, 24 h). A) Niveles de XBP1u/XBP1s(unspliced/spliced) determinados mediante RT-PCR. B) Cuantificación relativa de los niveles de ARNm de ATF3, CHOP y BiP/GRP78determinados mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real. Los gráficos representan los niveles de ARNm normalizados con el gencontrol 18S y están expresados como porcentaje respecto del grupo control (Ctrl) ± DE. C) Análisis por Western-blot de los nivelesde proteína IRE-1� total y fosforilada, CHOP, y eIF2� total y fosforilada en Ser51. Los gráficos representan la cuantificación de losniveles de proteína normalizados y están expresados como porcentaje de las muestras control ± DE. Todas las autorradiografías sonrepresentativas de 2 experimentos independientes.*p < 0,05 vs. Ctrl.**p < 0,01 vs. Ctrl.***p < 0,001 vs. Ctrl.****
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p < 0,05 vs. Pal.*****p < 0,01 vs. Pal..
por fosfatasas como por cinasas, también se exploró la fos-forilación de la isoforma ACC2 en Ser218. En contraste conlo que se observaba en la fosforilación de la AMPK, los
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niveles de fosfo-ACC2 se redujeron ligera pero significati-vamente en células expuestas a palmitato, mientras que enpresencia de Wy-14,643 se incrementaban de manera signi-ficativa (∼ 2 veces, p < 0,01 vs. control). Por el contrario,
hdpf
y-14,643 no incrementó la actividad de AMPK ni modificóa fosforilación de ACC2 en las células tratadas con tunica-icina, proporcionando quizá una explicación plausible al
l estrés del retículo endoplasmático inducido por pal-ción de la actividad AMPK. Clin Invest Arterioscl. 2014.
echo de que Wy-14,643 fuera incapaz de prevenir el estrésel RE inducido por tunicamicina, y reforzando aún más elapel de la AMPK en los efectos positivos de este agonistarente el palmitato. Finalmente, los resultados obtenidos en
Figura 4 Efecto de la activación de PPAR� con Wy-14,643 sobre el estrés del RE. Células AC16 fueron tratadas con palmitato(Pal, 0,25 mM, 18 h) en presencia o ausencia de Wy-14,643 (Wy, 10�M, 24 h) y del Compuesto C (CC, 30�M, 25 h). A) Niveles deXBP1u/XBP1s (unspliced/spliced) determinados mediante RT-PCR. B) Cuantificación relativa de los niveles de ARNm de ATF3, CHOPy BiP/GRP78 determinados mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real. Los gráficos representan los niveles de ARNm normalizadoscon el gen control 18S y están expresados como porcentaje respecto del grupo control (Ctrl) ± DE. C) Análisis por Western-blot de losniveles de proteína IRE-1� total y fosforilada, CHOP, y eIF2� total y fosforilada en Ser51. Los gráficos representan la cuantificación delos niveles de proteína normalizados y están expresados como porcentaje de las muestras control ± DE. Todas las autorradiografíasson representativas de 2 experimentos independientes.*p < 0,05 vs. Ctrl.**p < 0,01 vs. Ctrl.***p < 0,001 vs. Ctrl.****p < 0,05 vs. Pal.*****p < 0,01 vs. Pal.*
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ardiomiocitos in vitro con el palmitato concuerdan con losatos obtenidos in vivo, donde se detectó una disminución
Cómo citar este artículo: Palomer X, et al. PPAR� atenúa
mitato en células cardíacas humanas por medio de la induchttp://dx.doi.org/10.1016/j.arteri.2014.02.003
anto de la fosforilación de AMPK (reducción del 40% vs.atones control, p < 0,01), como de la ACC2 (50% vs. ratonesontrol, p < 0,05), en el corazón de los ratones alimentadoson una dieta HFD.
Edre
iscusión
el estrés del retículo endoplasmático inducido por pal-ción de la actividad AMPK. Clin Invest Arterioscl. 2014.
n los últimos anos, la activación de la UPR durante el estrésel RE ha captado la atención de numerosos investigado-es como un nuevo mecanismo implicado en la asociaciónntre la inflamación provocada por los ácidos grasos
PPAR atenúa el estrés del retículo endoplasmático inducido por palmitato en cardiomiocitos 9
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Figura 5 AICAR, pero no Wy-14,643, previene el estrés del RE inducido por tunicamicina. Células AC16 fueron tratadas durante 4 hcon tunicamicina (Tun, 5 �g/ml) en presencia o ausencia de AICAR (AIC, 2 mM, 24 h) o Wy-14,643 (Wy, 10�M, 24 h). A) Cuantificaciónrelativa de los niveles de ARNm de ATF3, CHOP y BiP/GRP78 determinados mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real. Los gráficosrepresentan los niveles de ARNm normalizados con el gen control 18S y están expresados como porcentaje respecto del grupo control(Ctrl) ± DE. B) Análisis por Western-blot de los niveles de proteína IRE-1� total y fosforilada, CHOP, y eIF2� total y fosforilada enSer51. Los gráficos representan la cuantificación de los niveles de proteína normalizados y están expresados como porcentaje delas muestras control ± DE. Todas las autorradiografías son representativas de 2 experimentos independientes.*p < 0,05 vs. Ctrl.**p < 0,01 vs. Ctrl.***p < 0,001 vs. Ctrl.
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****p < 0,05 vs. Tun.*****p < 0,01 vs. Tun.
saturados y las enfermedades metabólicas crónicas, comopor ejemplo la obesidad, la resistencia a la insulina yla diabetes de tipo 211,30. Diversos estudios realizados en
8,31 32
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músculo y células � pancreáticas han demostrado queel palmitato induce el splicing de XBP1 e incrementa laexpresión de distintos marcadores de estrés del RE, comoATF3, BiP/GRP78 y CHOP, además de la fosforilación de
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RE-1�8,31. De acuerdo con esto, nuestro estudio muestraue el palmitato induce el splicing de XBP1 y la fosfori-ación de IRE-1�, así como el incremento en la expresión
l estrés del retículo endoplasmático inducido por pal-ción de la actividad AMPK. Clin Invest Arterioscl. 2014.
la acumulación proteica de ATF3, BiP/GRP78 y CHOP, enélulas cardíacas humanas. El incremento en los niveles deiP/GRP78 indica que el estrés del RE inducido por palmitaton células cardíacas se corresponde con la fase adaptativa
Figura 6 La activación de AMPK interviene en los efectos de Wy-14,643 sobre el estrés del RE inducido por palmitato. Análisispor Western-blot de los niveles de proteína AMPK total y fosforilada en Thr172, y ACC2 total y fosforilada en Ser218 en muestrasobtenidas de: A) células AC16 tratadas con palmitato (Pal, 0,25 mM, 18 h) en presencia o ausencia de Wy-14,643 (Wy, 10�M, 24 h); B)células AC16 tratadas durante 4 h con tunicamicina (Tun, 5 �g/ml) en presencia o ausencia de AICAR (AIC, 2 mM, 24 h) o Wy-14,643(Wy, 10�M, 24 h), y C) corazón de ratones alimentados con un dieta estándar (Ctrl) o rica en ácidos grasos saturados (HFD) durante8 semanas. Los gráficos representan la cuantificación de los niveles de proteína normalizados en relación con la actina y estánexpresados como porcentaje de las muestras control (Ctrl) ± DE. Todas las autorradiografías son representativas de 2 experimentosindependientes.*p < 0,05 vs. Ctrl.**p < 0,01 vs. Ctrl.**
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e la UPR, pues esta se caracteriza por un incremento dea expresión de proteínas con función chaperona, como esl caso de BiP/GRP78, que colaboran en la estabilizacióne los intermediarios de plegamiento proteico33. No obs-ante, y al contrario de lo descrito previamente en célulasusculares8,9,34, la vía PERK/eIF2� de la UPR no se activaba
n presencia de palmitato, ya que no se observaron cam-
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mitato en células cardíacas humanas por medio de la induchttp://dx.doi.org/10.1016/j.arteri.2014.02.003
ios en la fosforilación de eIF2� en Ser51. Además, en estestudio demostramos por primera vez en células cardíacasumanas cómo la activación de PPAR� con Wy-14,643 pre-iene el estrés del RE inducido por ácidos grasos saturados,
edeq
ues este agonista evitaba el incremento de ATF3 y CHOP. Deanera análoga a lo que sucede en células � pancreáticas
ratadas con agonistas de PPAR�/�35, los efectos benefi-iosos de Wy-14,643 sobre nuestras células no derivaba deambios en los niveles proteicos de la chaperona BiP/GRP78.simismo, Wy-14,643 fue incapaz de prevenir la fosforilacióne IRE-1� y el splicing de XBP1. No obstante, en relación con
el estrés del retículo endoplasmático inducido por pal-ción de la actividad AMPK. Clin Invest Arterioscl. 2014.
ste último resultado, no se puede descartar que el tiempoe tratamiento utilizado fuera insuficiente para detectarstos posibles cambios, especialmente teniendo en cuentaue XBP1s es una proteína muy inestable la transcripción de
PPAR atenúa el estrés del retículo endoplasmático inducido
la cual depende tanto de ATF6 como del propio IRE-1�36.XBP1s regula muchos de los procesos esenciales de la UPRimplicados en plegamiento proteico, biogénesis de orgánu-los, vía ERAD y autofagia, si bien sus dianas génicas puedenvariar en función del tipo celular y la naturaleza del agenteinductor del estrés10. Aunque la expresión de BiP/GRP78puede ser transcripcionalmente controlada por las 3 ramasde la UPR, nuestros resultados indican que esta chaperonapodría ser regulada por XBP1s en células cardíacas huma-nas, pues sus niveles muestran una elevada correlación ennuestro modelo.
La dieta tipo Western, debido a su elevado contenido engrasas, favorece el desarrollo de la resistencia a la insulinay la diabetes de tipo 2, de la misma manera que induce laactivación del estrés del RE y la inflamación31,37. Nuestrosestudios realizados in vivo demuestran cómo la alimenta-ción de ratones con dietas ricas en ácidos grasos saturadosinduce un incremento de la expresión de BiP/GRP78 y CHOPen el corazón. No obstante, y al contrario de lo que suce-día en células cardíacas humanas, el corazón de los ratonesalimentados con la dieta HFD mostró un incremento en lafosforilación de eIF2�. Algunos de los genes que escapan delcontrol traduccional de eIF2� cuando este es fosforilado sonATF4 y la fosfatasa GADD34. Puesto que GADD34 es capaz dedefosforilar eIF2� al cabo de solo 6 h después de producirseel estímulo, es posible que esta actividad fosfatasa sea laresponsable de la ausencia de cambios en la fosforilaciónde eIF2� observada in vitro en nuestro modelo. Aunque nose pueden descartar diferencias entre especies, es factibleque esto no suceda en corazón de ratón debido a la conti-nua exposición a los ácidos grasos saturados que se producein vivo.
Aunque el corazón no es un órgano principal para elalmacenamiento de lípidos, sí que puede acumular ácidosgrasos, fosfolípidos y triglicéridos en los cardiomiocitos, par-ticularmente cuando la disponibilidad de estos lípidos seencuentra incrementada, tal y como sucede durante la obe-sidad y la diabetes38. Si esta acumulación persiste en eltiempo, el corazón comenzará a acumular intermediarioslipídicos tóxicos, los cuales están ligados al posterior des-arrollo de la resistencia a la insulina y la cardiomiopatíalipotóxica, derivando finalmente hacia la apoptosis de losmiocitos y la disfunción contráctil39. Aunque los mecanis-mos precisos mediante los cuales los ácidos grasos saturadoso las dietas ricas en lípidos provocan la apoptosis de los car-diomiocitos no han sido completamente elucidados, diversasevidencias senalan el estrés del RE como una de las causasprincipales32,35. Así, un estrés del RE prolongado o severo,como por ejemplo el que se produce durante la cardio-miopatía diabética, provoca la muerte por apoptosis de loscardiomiocitos18. Si tenemos en cuenta que los cardiomioci-tos raramente pueden proliferar en el corazón adulto, lapérdida de estos puede llegar a comprometer la funcióncardíaca. En este sentido, las 3 ramas de la UPR puedenpromover la expresión de CHOP, un factor de transcripcióncon una actividad proapoptótica importante, y que lleva acabo un papel clave en la muerte de las células cardíacascausada por un estrés del RE crónico durante la insuficiencia
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cardíaca15 o la hipertrofia cardíaca40. Nuestros estudios handemostrado cómo el tratamiento con Wy-14,643 preveníael incremento de CHOP inducido por palmitato, de manera
dlc
PRESSalmitato en cardiomiocitos 11
imilar a como lo hacía la activación de AMPK medianteICAR. Estos resultados indican que la activación de PPAR�on Wy-14,643 podría desempenar un papel antiapoptóticomportante por medio de la inhibición del estrés del RE
abre una nueva vía de estudio para la cardiomiopatíaiabética. De acuerdo con nuestros resultados, se ha des-rito que el palmitato es capaz de inducir la apoptosis poredio de la activación del estrés del RE41,42, mientras que
a activación de PPAR�/� previene la apoptosis inducida poralmitato en células �-pancreáticas35. Este último estudiondicó además que los efectos antiapoptóticos de la activa-ión de PPAR�/� eran debidos al aumento de la �-oxidacióne los ácidos grasos.
Debido a su papel causativo en enfermedades cardio-asculares asociadas a enfermedades metabólicas como labesidad y la diabetes, el estrés del RE ha sido postuladoomo una potencial diana terapéutica. Con este objetivo,e ha examinado el efecto de distintas chaperonas sintéti-as para prevenir este estrés, debido a su capacidad parastabilizar proteínas y asistir a su correcto plegamientoentro del RE, de manera similar a como lo hacen las cha-eronas endógenas43. Es el caso, por ejemplo, del ácido-fenilbutírico y del ácido tauroursodeoxicólico, que hanostrado efectos beneficiosos sobe la resistencia a la insu-
ina, la obesidad y la diabetes en distintos modelos in vitro8,9
in vivo44. A pesar de ello, estas chaperonas químicas pre-entan 2 grandes inconvenientes: su baja especificidad ya necesidad de dosis elevadas para conseguir ser eficaces.s por ello que la investigación y el desarrollo de nuevosármacos que inhiban el estrés del RE durante las enfer-edades metabólicas han despertado un gran interés. La
ctivación de AMPK produce múltiples efectos protectores,ncluyendo la inhibición de la inflamación, el estrés oxi-ativo y la resistencia a la insulina, que resultan en unenor riesgo de obesidad y diabetes de tipo 245. Puestoue la inhibición de la AMPK promueve el estrés del RE, sea indicado que esta cinasa podría actuar como represorasiológica de este estrés. En este sentido, recientementee han publicado distintos trabajos donde se demuestraue la AMPK protege de la lesión isquémica del miocar-io, la hipertrofia cardíaca y la aterosclerosis por medio dea inhibición del estrés del RE29,46. De manera similar, sea descrito que la activación de la AMPK con AICAR pre-iene el estrés del ER en células musculares esqueléticasratadas con palmitato8. Cuando nosotros examinamos losecanismos potencialmente responsables del incrementoel estrés después de la exposición a palmitato, observa-os cómo este ácido graso saturado reducía la actividadMPK determinada por una disminución de los niveles deosfo-ACC2. ACC2 es una de las proteínas diana de la cinasaMPK cuya fosforilación en Ser218 inhibe su actividad. Enl corazón, ACC2 es responsable de la conversión de acetil-oA a malonil-CoA, un conocido inhibidor de la CPT-1, lanzima mitocondrial que interviene en el transporte de áci-os grasos de cadena larga a través de la membrana parau subsiguiente �-oxidación. Por lo tanto, se puede infe-ir de estos datos que el aumento de la fosforilación deMPK observado después del tratamiento con palmitato se
l estrés del retículo endoplasmático inducido por pal-ción de la actividad AMPK. Clin Invest Arterioscl. 2014.
ebe a que la célula trata de compensar la reducción dea actividad ACC2 y, con ello, de la capacidad de oxida-ión de ácidos grasos. En consonancia con todo esto, el
otratamiento con AICAR previno el aumento de la mayo-ía de los marcadores de estrés en cardiomiocitos humanos.esultados similares fueron obtenidos después de inducir elstrés del RE mediante tunicamicina. Más importante aún,uestros experimentos indican que los efectos preventivosue tiene Wy-14,643 sobre el estrés del RE inducido poralmitato son dependientes de la activación de esta cinasa.sto se demuestra por los datos obtenidos después de laoincubación de nuestras células con el inhibidor de la AMPK,l Compuesto C, y también por el incremento de la fos-orilación de la AMPK y la ACC2 en presencia del agonistae PPAR�. Igualmente, los resultados obtenidos en ratónndican que la dieta HFD reduce la �-oxidación de ácidosrasos en corazón. Estos resultados concuerdan con aque-los obtenidos en hígado y músculo de ratón alimentado conna dieta HFD, donde los ácidos grasos saturados parecenontribuir a la inhibición de la AMPK47. En conjunto, nues-ros resultados están en la misma línea que los descritos enélulas �-pancreáticas e hígado48, donde se reportó que lactivación de la oxidación de los ácidos grasos por parte degonistas de PPAR era capaz de prevenir el estrés del RE. Elecho de que el efecto de Wy-14,643 solo se produjera sobrel estrés del RE inducido por palmitato, pero no por tunica-icina, podría explicarse porque esta induce un estrés más
evero o, más probablemente, por la presencia de mecanis-os adicionales de inducción del estrés del RE por parte de
a tunicamicina.En resumen, los resultados aquí presentados demuestran
ue la activación de PPAR� con Wy-14,643 atenúa el estrésel RE inducido por palmitato en células cardíacas humanasor medio de la activación de AMPK. PPAR� regula muchasunciones fisiológicas valiosas que van desde el aumento delatabolismo de los ácidos grasos y la mejora de la sensi-ilidad a la insulina, hasta la inhibición de la inflamación,ostrando de este modo un papel terapéutico potencialara la prevención y el tratamiento de enfermedades comoa diabetes, las dislipidemias o el síndrome metabólico. Dadoue la inflamación crónica de baja intensidad y el estrésel RE desempenan un papel importante en la hipertrofiaardíaca y la insuficiencia cardíaca, y que los agonistas dePAR� se han demostrado eficaces para mejorar e inclusorevenir las enfermedades cardiovasculares asociadas a labesidad y la diabetes, es tentador especular que esteeceptor nuclear podría ser una diana terapéutica útil pararevenir la hipertrofia cardíaca y la insuficiencia cardíacanducidas por el estrés del RE durante estos trastornos meta-ólicos.
inanciación
ste estudio ha sido financiado por fondos del Ministerio deconomía y Competitividad del Gobierno espanol (SAF2009-6939 y SAF2012-30708). CIBER de Diabetes y Enfermedadesetabólicas Asociadas (CIBERDEM) es una iniciativa del Ins-
ituto de Salud Carlos III (ISCIII), Ministerio de Economía yompetitividad.
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mitato en células cardíacas humanas por medio de la induchttp://dx.doi.org/10.1016/j.arteri.2014.02.003
utoría
P contribuyó en el diseno del estudio, la recogida e inter-retación de los datos, y en la redacción del artículo. ECB,
1
PRESSX. Palomer et al
G y MMD contribuyeron en el diseno, la interpretación deos datos, y la revisión del artículo. MVC contribuyó en eliseno del estudio, así como en la revisión y aprobación delrtículo.
onflicto de intereses
os autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
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