Page 1
I. INTRODUCCIÓN
La guanábana (Annona muricata L.) es un árbol pequeño de 5-6 m
de altura, con hojas grandes y brillantes de color verde oscuro. Produce un
gran fruto comestible que es de 15-20 cm de diámetro, de color amarillo-verde
que tiene la carne blanca en su interior., el fruto se encuentra entre las pulpas y
jugos de preferencia en los consumidores; además, es considerada una planta
medicinal que constituye una alternativa común para el tratamiento del cáncer
gástrico y gastrointestinal en muchos países del mundo.
Por otra parte, en la farmacología ha empezado a cobrar fuerza el
hecho que su tallo, sus hojas y semillas han sido usadas históricamente en
medicina tradicional por los pueblos indígenas dadas sus capacidades
antitumorales, parasiticidas y anti-diarreicas
El fruto posee propiedades funcionales y por ello es necesario
obtener datos científicos sobre las hojas, del cultivo que se viene realizando en
nuestra región, ya que las hojas se comercializan indicando que posee
propiedades medicinales benéficas para la salud, planteando los siguientes
objetivos para el presente trabajo de investigación:
En el desarrollo de la práctica se planteó los siguientes objetivos:
- Conocer el funcionamiento y distribución de áreas del centro de
investigación.
Page 2
2
- Utilizar métodos para realizar la caracterizacion química, fitoquimica y
capacidad antioxidante de las hojas de guanábana.
Page 3
3
II. REVISION DE LITERATURA
2.1. Generalidades de guanábana
La guanábana (annona muricata L.), soursop en inglés, graviola en
portugués, es originaria de América y África tropical, y debido a la llegada de
los españoles a América fue distribuida en los trópicos y hoy en día es posible
encontrarla en el oeste de la India, en Norte y Suramérica, Islas del Pacífico y
en el Sureste de Asia (CORREA, 2012). Es una fruta tropical exótica y en
nuestra amazonia peruana es cultivado en los departamentos de En la selva
peruana, se cultiva en los Departamentos de Loreto, San Martín y Ucayali, su
cultivo es dirigido al consumo de pulpa (SIAMAZONIA, 2001).
2.2. Clasificación taxonómica de guanábana
La guanábana (Annona muricata L.), originaria de América y África
tropical, pertenece:
Género: Guanabaní
sección: Evannona,
división: Spermatophytia,
subdivisión: Angiosperma,
clase: Dicotiledónea,
subclase: Archylamudeae,
Orden: Ranales,
Page 4
4
Familia: Anonaceae,
Género: Annona
Especie: Annona muricata L.
Su óptimo desarrollo se da en altitudes menores a 1.200
msnm, con temperatura media entre 25 y 28°C, humedad relativa entre 60 y
80 %. Crece y produce bien en una amplia gama de condiciones edáficas.
(MÁRQUEZ, 2009).
2.3. Variedad de guanábana y características del cultivo
2.3.1. Variedades de guanábana
Entre las numerosas especies del género Annona, las más
conocidas son: A. reticulata L., A. squamosa L., A. cherimolla Mill y A. muricata
L., siendo está última la denominada guanaba en los países de habla hispana,
y la que presenta las mejores características para su industrialización. (AVILA,
F. 2005).
El árbol o arbusto es de 3 a 10 m de alto, ramificado, cónico,
frondoso, con hojas ovaladas elípticas de 2 a 6 cm de ancho por 6 a 12 cm de
largo, con yemas axilares, (MENDEZ, 2003).
Page 5
5
2.4. Composición química de la hoja de guanábana
ASCÁZUBI (2008), menciona que en las hojas de guanábana existen
Lactonas tales como: Annohexocina, Annomuricina A, B, C y E, Annomutacina,
Annopentocinas A, B y C, Muricoreacina, Gigantetronemina, Murihexocina A y
C, Javoricina; Isoquinolinas: Anonaine, Anoniine, Atherospermine, Coreximine;
Lípidos: Acido gentísico, Acido lignocérico, Acido linoleico, Acido esteárico.
2.5. Antioxidantes y Radicales libres
2.5.1. Antioxidantes
Los compuestos antioxidantes están en la capacidad de inhibir la
oxidación de moléculas y por lo tanto actuar como protectores de moléculas
biológicas contra especies reactivas de oxígeno o radicales libres. (CORREA et
al., 2012).
- Polifenoles
Los efectos de los polifenoles son fundamentalmente
consecuencia de sus propiedades antioxidantes (QUIÑONES et al., 2012)
La concentración en polifenoles de cualquier alimento es muy
variable, porque depende de muchos factores tales como la variedad o el grado
de maduración del vegetal. También su biodisponibilidad es muy variable
(CREUS, 2004).
2.5.2. Radicales libres
Los radicales libres son protagonistas de numerosas enfermedades
que provocan reacciones en cadena, estas reacciones solo son eliminadas por
Page 6
6
la acción de otras moléculas en estos procesos tóxicos en el organismo, los
llamados sistemas antioxidantes defensivos. Se ha demostrado que el
organismo posee un número de mecanismos a través de los cuales produce y
a la vez limita la producción de especies reactivas de oxígeno. Un exceso de
radicales libres suele iniciar el daño de la pared vascular y en este proceso se
encuentra implicado el colesterol LDL; se ha demostrado en la incidencia de
enfermedades cardiovasculares con suplementos individuales de antioxidantes.
(RAMOS et al., 2008).
a) Radical 1,1 difenil-2- picril-hidrazil (DPPH)
Es un radical libre estable y se utiliza como indicador para medir la
capacidad de secuestro de cualquier compuesto que posea actividad
antioxidativa. El principio del método de DPPH consiste en la sustracción de un
átomo de hidrógeno proveniente de un donador (ejemplo compuesto fenólico)
para generar el compuesto difenilpicrilhidrazina y una especie radical. En este
proceso, la reacción desarrolla un cambio de color de violeta a amarillo a
medida que disminuye la absorbancia detectable a 515 nm. (LEBEAU et. al.,
2000).
2.6. Laboratorio de investigación
Un verdadero laboratorio de investigaciones (el de una Universidad, por
ejemplo) tiene por misión producir conocimiento científico básico o aplicado por
el conocimiento mismo, suelen también producir tecnologías. Es también
natural que ello ocurra porque la tarea de investigación no tiene fronteras
rígidas y por lo tanto muchos investigadores no se detienen en la obtención de
Page 7
7
un determinado conocimiento sino que se interesan en su aplicación y realizan
así trabajos que no son específicos de un laboratorio de investigaciones sino
de una fábrica de tecnología (SÁBATO Y KAPLAN, 1972).
Su objetivo es contribuir al desarrollo de las ciencias biológicas,
biotecnológicas y de la salud a través de la resolución de problemas sociales o
económicos. Siempre en la búsqueda de la excelencia en investigación se
busca atraer nuevos grupos de investigación que ayuden a hacer crecer la
actividad de investigación. (FUNDACIÓN PABLO CASSARA, 2012).
2.7. Métodos de Análisis
2.7.1. Cuantificación de Polifenoles totales
Los compuestos fenólicos son antioxidantes naturales, por lo
general se encuentran en frutas y verduras. La preparación de muestras para
los estudios analíticos es necesario determinar la composición polifenólica en
estas matrices. El sistema de extracción más utilizado es extracción líquido-
líquido (LLE), que es un método barato, puesto que implica el uso de
disolventes orgánicos, pero requiere largos tiempos de extracción, dando lugar
a la degradación extracto posible. Asimismo, extracción en fase sólida (SPE) se
puede utilizar en muestras líquidas. Las técnicas modernas, que han ido
reemplazando a las convencionales, incluyen: extracción con fluidos
supercríticos (SFE), la extracción de líquido presurizado (PLE), la extracción
asistida por microondas (MAE) y la extracción asistida por ultrasonido (EAU).
Estas técnicas alternativas reducir considerablemente el uso de disolventes y
acelerar el proceso de extracción (GARCIA et. al. , 2010).
Page 8
8
El método espectrofotométrico desarrollado por Folin y Ciocalteau,
para la determinación de fenoles totales, se fundamenta en su carácter
reductor y es el más empleado. Se utiliza como reactivo una mezcla de ácidos
fosfowolfrámico y fosfomolibdíco en medio básico, que se reducen al oxidar los
compuestos fenólicos, originando óxidos azules de wolframio (W8O23) y
molibdeno (Mo8O23). Los resultados se expresan en mg de ácido gálico por
100 g de pulpa de frutos. (KUSKOSKI et. al., 2005).
2.7.2. Determinación de la capacidad antioxidante mediante el
radical 1,1-difenil-2-pricrilhidrazil (DPPH)
Se evalúa la capacidad que tiene un posible antioxidante para
neutralizar un radical. El compuesto 1,1-difenil-2-pricrilhidrazil (DPPH) es un
radical estable que presenta una intensa coloración violeta y que absorbe
radiación a 517 nm, de forma que su concentración se puede determinar
mediante métodos espectrofotométricos. Se determina la concentración inicial
de DPPH y la concentración resultante una vez que se ha añadido el posible
antioxidante, de forma que una disminución de la absorción de radiación se
traduce en una disminución de la concentración de DPPH debida a la cesión de
electrones de la especie antioxidante (RIVERO Y BETANCORT, 2009).
2.7.3. Cromatografía de capa fina.
La expresión “Thin Layer Chromatography” (T. L. C.), consiste
esencialmente el empleo de capas finas y uniformes de adsorbentes
normalizados sobre soporte rígidos (placas de vidrio, porta-objetos de
Page 9
9
microscopía, poliéster, etc.), en las que se depositan mezclas o sustancias
puras, para que mediante desarrollo con un fase móvil (disolventes) en
una cubeta, puedan separarse e incluso identificar por medida de la
capacidad de adsorción (AREAL Y BESSA, 2011).
2.7.4. Análisis químicos
Los análisis comprendidos dentro de este grupo, también conocido
como análisis proximales Weende, Estos análisis nos indicarán el contenido de
humedad, proteína cruda (nitrógeno total), fibra cruda, lípidos crudos, ceniza y
extracto libre de nitrógeno en la muestra. (FAO, 1993).
Page 10
10
III.PLAN DE TRABAJO
3.1.Reconocimiento del Centro De Investigación para el Desarrollo
Biotecnológico De La Amazonia- CIDBAM
3.1.1.Descripción y ubicación del CIDBAM
3.1.2.Organización
3.2.Áreas del Centro De Investigación para el Desarrollo Biotecnológico
de la Amazonia- CIDBAM
3.2.1.Área de micropropagacion in vitro d vegetales
3.2.2.Area de HPLC
3.2.3.Area de cultivo celular
3.2.4.Area de biología molecular
3.2.5.Area de antioxidantes
3.3.Análisis realizados
3.3.1. Materia prima
3.3.2. Preparación de extractos
3.3.3. Método de análisis
3.3.3.1. Análisis químico proximal
3.3.3.2. Análisis fitoquímico
3.3.3.3. Análisis de polifenoles totales
3.3.3.4. Análisis de la capacidad antioxidante
Page 11
11
3.4.Caracterización química y fitoquímica de las hojas de guanábana
3.5.Capacidad funcional de las hojas de guanábana
3.5.1. Determinación de polifenoles totales
3.5.2. Análisis de la capacidad antioxidante Coeficiente de inhibición del
radical DPPH (IC50) radical 1,1-diphenyl-2-picrilhydrazil (DPPH)
Page 12
12
IV. DESARROLLO DEL PLAN DE TRABAJO
4.1. Reconocimiento del Centro De Investigación para el Desarrollo
Biotecnológico De La Amazonia (CIDBAM)
4.1.1. Descripción y ubicacion del CIDBAM
El CIDBAM esta orientada promover el desarrollo socio-económico,
promueve investigaciones orientado al mejoramiento del conocimiento en áreas
de importancia para la Amazonia Andina. Promueve el entrenamiento y
educación de estudiantes con el fin de transmitir los conocimientos y resultados
científicos de las investigaciones biotecnológicas.
El centro de investigación para el desarrollo Biotecnológico de la
Amazonia (CIDBAM), de la Universidad Nacional Agraria de la Selva (UNAS);
ubicada en Av. Universitaria s/n, distrito de Rupa Rupa, Provincia de Leoncio
Prado, región Huánuco; a una altitud de 667 m.s.n.m. con un clima tropical
húmedo y una temperatura promedio de 24ºC y humedad relativa media de
89%.
4.1.2.Organización
El CIDBAM viene funcionando fundamentalmente con fines
académicos, investigación, producción y extensión tecnológica que depende
directamente del Vice-rectorado Académico. La organización se encuentra
detallada en la Figura 1 Anexo I.
Page 13
13
4.2. Areas del Centro de Investigación para el Desarrollo Biotecnológico
de la Amazonía
El Centro de Investigación para el Desarrollo Biotecnológico de la
Amazonia – CIDBAM, actualmente se cuenta con diferentes ambientes,
equipos, materiales y reactivos, su distribución se describe en la Figura 2
Anexo II.
4.2.1. Área de micropropagación in vitro de vegetales
En esta área se realiza el cultivo in vitro de tejidos vegetales, área
con características y medios para el buen desarrollo de tejidos y células que se
trabajen, empleándose una serie de técnicas y métodos de micropropagación
en diferentes cultivos de nuestra amazonia.
Materiales
- Tubos de ensayo Genx Mate (10ml, 50ml).
- Vasos de precipitación (100ml, 500ml, 100ml).
- Fiolas (1000ml, 500ml, 50ml, 10ml).
- Baguetas de vidrio estériles.
- Placas petri.
- Asa de siembra.
- Pipetas de 1 mL.
- Matraz.
- Mecheros.
- Probetas.
- Termómetros.
Page 14
14
Equipos
- Equipo de PCR marca BIOMETRA modelo T personal TVL-
312A, 220-240 V.
- Equipo de electroforesis marca ESPECTROLINE modelo 25x-2,
220-240 V.
- Equipo de balanza analítica AE 163 (ADAM TOLEDO,
Switzerland).
- Equipo de flujo laminar marca PIDESTAL modeloODH4- 9340A,
220-110 V.
- Autoclave NAPCO model – 9000 D, 32 psi, 130ºC, 230 V, 6,3 A,
1430 w, USA.
4.2.2. Área de HPLC
Área de Cromatografía Líquida de Alta Performancia (HPLC),
dedicándose cuanto a la separación, aislamiento, identificación y cuantificación
compuestos desconocidos que el investigador requiera con estándares
adquiridos por el centro de investigación.
Materiales
- Vasos de precipitación (1000 mL, 500 mL, 100 mL, 50 mL,
10mL).
- Fiolas (1000 mL, 500mL, 100mL, 50 mL 10 mL).
- Probetas.
- Termómetros.
- Tips, FISHERBRAND® (1000 µL, 200 µL, 100 µL).
Page 15
15
- Micropipetas, Gene Mate® (1000 µL, 200 µL, 100 µL).
- Matraces erlenmeyer, PIREX.
Equipos
Los equipos que se encuentran en esta área cuentan con ficha de
uso, ficha de registro para cada uno de los equipos que se utilicen durante las
evaluaciones que se realizan, estos equipos son:
- Homogenizador modelo VORTEX GENIE-2 (Scientificindustrias
SITM).
- Equipo de cromatografía líquida de alta performancia (HPLC)
modelo LC-10AVP (ShimadzuScientific, MD, USA.). Equipado
con: Desgasificador modelo FCV – 10AL VP, Bomba modelo LC-
10ATVP, Columna cromatográfica C18-110R Gemini, Horno de
columna modelo CTO – 10ASVP Detector UV-Vis modelo SPD-
10AVVP, Controlador Modelo SCL – 10AVP, Software de
interfase CLASS-VP, Computadora compatible USB-52X,
Inyector de muestra de capacidad 20 µL.
Reactivos y solventes
Los reactivos encontrados en esta área están debidamente
codificadas y registradas para su fácil ubicación en estantes separados de los
materiales y equipos para evitar contaminación o accidentes, tenemos:
- L (+) ácido ascórbico puro, Sigma Chemical.
- (+)-catequin, Sigma Chemical.
- Etanol (grado HPLC), Sigma Chemical.
- Metanol (grado HPLC), Sigma Chemical.
Page 16
16
- Ácido acético, Sigma Chemical.
- Acetonitrilo (grado HPLC), Sigma Chemical.
4.2.3. Área de cultivo celular
En esta área se realiza la búsqueda de microorganismos
productoras de enzimas, contando con un ambiente estéril con reactivos,
materiales y equipos empleados en cada uno de los métodos empleados.
Materiales
- Erlenmeyers estériles.
- Pipetas bacteriológicas estériles.
- Baguetas de vidrio estériles.
- Placas petri.
- Asa de siembra.
- Pipetas.
- Matraz.
- Mecheros.
- Gradillas.
- Micro pipetas.
Equipos
- Incubadora Labor MUSZERIPARI MUVER LP – 111, 220V, 0,19
Kw, HUNGARA.
- Agitador orbital de bandeja BAMSTEAD internacional Lab-Line,
Modelo MaxQ2000, 220 – 240V, 0.4 A, 45 w, 50/60 Hz, 500 rpm
USA.
Page 17
17
Medios de cultivo
- Agar-agar Merck GERMANY.
- Agar OGY Merck GERMANY.
- Agar glucosa Merck GERMANY.
- Agar Sabouraud Merck GERMANY.
- Extracto de carne seco granulado Merck GERMANY.
- Extracto de levadura BIOGEN.
- Peptona de carne obtenida por digestión pancreática granulado
Merck GERMANY.
- Glicerina Merck GERMANY.
- Goma arábiga SIGMA ALDRICH.
4.2.4. Área biología molecular
Esta área está relacionada con otros campos de la Biología y la
Química, particularmente Ingeniería genética y Bioquímica. La biología
molecular concierne principalmente al entendimiento de las interacciones de
los diferentes sistemas de la célula.
Materiales
- Ermelenyer estériles de 500 ml de capacidad.
- Pipetas bacteriológicas estériles.
- Mecheros.
- Gradillas.
Page 18
18
Equipos
- Equipo de electroforesis marca ESPECTROLINE modelo TVL-
312A, 220-240 V.
- Equipo de PCR marca BIOMETRA modelo T personal TVL-
312A, 220-240 V.
- Equipo de termociclador marca MINICYCLER TM modelo MJ
Research - PTC-150, 220-240 V.
- Destilador modelo D 7036 (Barnstead).
4.2.5. Área de antioxidantes
Esta área se encamina a la evaluación del contenido compuestos
funcionales de productos a estudiar. Evaluando la capacidad antioxidante,
cuantificación de polifenoles entre otros.
Las muestras que cada investigador posee se encuentran
debidamente codificadas para facilitar su identificación e indicar si aun están
en condiciones para su evaluación.
Materiales
Los materiales se encuentran ordenadamente en estantes
separados a los estantes de reactivos, estos después de usadas son lavados
adecuadamente para que en próximos usos no alteren resultados o causen
reacciones no esperadas, tenemos:
- Materiales de vidrio :
Frascos de vidrio con tapa.
Embudos
Page 19
19
Matraces (50, 250 ml) Kimax USA, Schott Duran Germany.
Probetas (100, 250 ml) Brand Germany.
Pipetas con émbolo (10 ml) Pyrex USA
Vasos de precipitación (50, 100, 250,500 ml) Pyrex USA.
- Tubos de plástico con tapa (15 – 20 ml).
- Microtubos (1.5 – 2.0 ml).
- Micropipetas (10 – 100 µL), (100 – 1000 µL).
- Tips (200 - 1000 µL ).
- Cubetas de poliestireno (1cm x 1cm x 4.5cm).
- Bolsas de polietileno.
- Papel metálico.
- Papel de filtro rápido.
- Asa de siembra
- Placas Petri
Equipos
Los equipos que se utilizan en esta área cuentan con indicaciones
de uso, donde se explica gráficamente el modo de uso del equipo, así mismo
cuentan con ficha de registro donde cada investigador registra sus datos fecha
y hora de uso.
- Centrifuga marca Hettich – modelo MIKRO 22R y velocidad
10,000 rpm.
- Rotavapor BUCHI R-200.
- Autoclave NAPCO model – 9000 D, 32 psi, 130ºC, 230 V, 6,3 A,
1430 w, USA.
Page 20
20
- pH metro marca METTLER TOLEDO.
- Espectrofotómetro modelo Genesys 6 (Thermo Electrón
Corporation).
- Homogenizador modelo VORTEX GENIE-2 (Scientific industrias
SITM).
- Baño maría modelo YCW-010E (Associated With Cannic, Inc,
USA).
- Equipo de ultrasonido.
- Desionizador modelo D 7035 (Barnstead).
- Balanza analítica: digital Precission, capacidad máxima 210 g.,
modelo ESJ 210-4.
- Balanza analítica digital, sensibilidad ± 0.0001g. U.S.A. marca
Sartorius.
- Balanza analítica modelo AE 163 (METLER TOLEDO,
Switzerland).
- Horno microondas SANSUNG.
- Sonicador JAC ULTRASONIC 1002.
- Estufa modelo ODH6- 9240A (TOMOS Heatring Drying Oven).
- Congelador FFV-2065FW (Frigidaire, USA).
- Congelador vertical BOSCH.
- Refrigerador Icebeam Door Cooling LG GR-5392QLC.
Reactivos
Los reactivos de encuentran debidamente codificado existiendo un
listado de estos para su fácil ubicación, se cuenta con fichas donde se reporta
Page 21
21
el gasto de cada reactivo por cada investigador, ubicados en estantes muy
separados de los materials:
- Ácido gálico al 98.1% Sigma Aldrich.
- (+) Catequina: pureza 98%. Sigma Chemical.co
- 1,1-Diphenyl-1-picrilhydrayl (DPPH; Sigma Aldrich, USA).
- 2,2-azino-bis (3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid)
diammonium salt (ABTS; Sigma Aldrich, USA).
- 2,2-azobis (2-amidino-propane) (ABAP; Sigma Aldrich, USA)
- Fosfato de potasio dihidrogenado (Scharlau, UE).
- Etanol al 99.99% Merck KGaA.
- Folin-ciocalteu’s phenol reagent, 2N, Sigma Aldrich.
- Carbonato de Sodio (Na2CO3) p.a. ISO. Scharlau.
- Hidróxido de Sodio (NaOH) en lentejas p.a. ISO. Merck.
Germany.
- Agua destilada desionizada (H2Odd).
4.3. Análisis realizados
4.3.1. Materia prima
Las hojas de guanábana fueron recolectadas del fundo
“MILAGROS” en el km 27.8 carretera Tingo María- Aguaytía. , se trasladaron
al Centro de Investigación para el Desarrollo Biotecnológico de la Amazonia
(CIDBAM) para su respectivo acondicionamiento y su posterior análisis
siguiendo cada uno de las operaciones descritas en la Figura 3.
Page 22
COSECHA
SELECCIÓN-CLASIFICACION
TRANSPORTE
RECEPCION
BLANQUEADO
OREADO
SECADO
MOLIDO
Ebullición/60seg
TO Amb. / 12horas
65 OC/ 12 horas
ENVASADO
SELLADO
CODIFICADO
ALMACENADO
HOJAS APICAL, MEDIA Y BASAL
22
Figura 3. Flujograma de operaciones para la preparación de la muestra.
4.3.2. Preparación de extractos
4.3.2.1. Preparación del extracto para el análisis fitoquímico
Para la obtención del extracto se pesó 30 g de muestra seca
y se adicionó 140 mL de alcohol al 96 %, la mezcla fue macerada en envases
de vidrio color ámbar, puestas en el agitador orbital a temperatura ambiente
Page 23
23
durante siete días; posteriormente la mezcla fue filtrada con papel de paso
rápido con la ayuda de una bomba de vacío, el filtrado se colocó en platos
hondos. Finalmente la muestra se llevó a concentrar en una estufa a 40 ºC por
un periodo de tiempo aproximado de 3 a 4 díase.
4.3.2.2. Preparación de extracto para cuantificación de
polifenoles totales y determinación de la capacidad
antioxidante
Los extractos fueron preparados a partir de las muestras
secas; se pesaron 1,5 g de muestra y se enrazó en 15 mL de solución
hidroalcohólica 50:50 (agua: etanol), se transfirió a frascos de vidrio de color
ámbar, se taparon herméticamente cada frasco y se llevó a agitación por 24
horas a temperatura ambiente. Pasado el tiempo se filtró el extracto con papel
filtro de paso rápido. Finalmente la solución filtrada se almacenó en frascos
ámbar a -20 ºC como se muestra en la Figura 4.
Page 24
MUESTRA SECA MOLIDA
EXTRACCION HIDROALCOHOLICA
AGITACION
FILTRADO
ENVASADO
ALMACENADO
Dilución 50:50
24 h / 100 rpm
-20 ºC
1.5 g de muestra
24
Figura 4. Flujograma para preparación de extracto hidroalcohólico para los
análisis de actividad antioxidante y polifenoles totales.
4.3.3. Método de análisis
4.3.3.1. Análisis químico proximal
- Humedad, método 23.003 AOAC (1997).
- Proteína, método 991.29 AOAC (1997).
- Grasa, método 935, 60 AOAC. (1997).
- Fibra, método 930.20 AOAC (1997).
- Cenizas, método 942.50 de calcinación directa AOAC
(1997).
- Carbohidratos, se determinó por diferencia de los demás
componentes del análisis fisicoquímico (HART y FISHER,
1991).
Page 25
25
4.3.3.2. Análisis fitoquímico
Se determinó por el método de estudio de productos
naturales, descrito por LOCK DE UGAZ (1988).
Ensayo de Solubilidad
Para este procedimiento se tomaron pequeñas cantidades de
muestra del extracto obtenido como se menciona en el ítem 4.3.2.1 y se coloca
en diferentes tubos de ensayo, en los cuales se diluyeron con diferentes
solventes, aproximadamente 2 a 3 ml (n-hexano, acetona, diclorometano,
metanol, etanol y agua destilada). Se dejo en reposo por un tiempo de 2 a 4
minutos, el solvente con mejor solubilidad frente al extracto seco se tomó para
la marcha fitoquímica.
Marcha fitoquímica
La detección de constituyentes químicos del extracto etanólico
se realiza siguiendo la marcha fitoquímica general.
Ensayos cromatográficos
En la cromatografía en capa fina, se usa como sistema de
solventes: metanol: Diclorometano (1:4 v/v), presentándose tres manchas a la
luz UV/V 254 nm y 365 nm, luego se realizó la cromatografía en escala
preparativa y fueron reveladas con los reactivos FeCl3 (1%), H2SO4 (50%) y el
reactivo Wagner.
4.3.3.3. Análisis de cuantificación de polifenoles totales
Se realizó mediante el método de espectrofotometría de
absorción molecular desarrollado por Folin y Ciocalteau con modificaciones
descrito por SANDOVAL et al. (2001).
Page 26
26
Curva patrón
Se tomó 1.58ml de H2O destilada en un microtubo
procediendo a incorporar 20µl de acido gálico a concentraciones de 1; 0.5;
0.25; 0.125 y 0.0625 mg/ml seguidamente se añadió 100µl de folin, 300µl de
Na2CO3, finalmente; vortear toda la mezcla para incubar por 2horas en la
oscuridad y ser leída a 700nm.
Determinación de polifenoles en hojas de guanábana
Se tomó 1580 µl de H2O desionizada en un microtubo
procediendo a incorporar 20µl de la muestra seguidamente se incorporó 100µl
de folin y finalmente 300µl de Na2CO3 para neutralizar la reacción; vortear toda
la mezcla para incubar por 2 horas en la oscuridad y se realizo la lectura a
700nm. Los resultados se expresaron en miligramos equivalentes de Acido
gálico (AG) por 100 gramos de muestra.
4.3.3.4. Análisis de la capacidad antioxidante Coeficiente de
inhibición del radical DPPH (IC50) radical 1,1-diphenyl-2-
picrilhydrazil (DPPH)
Método de inhibición del radical DPPH (2,2-diphenyl-
picrilhydrazyl), descrito por Brand- Williams modificado por SANDOVAL et
al.,2001. El extracto utilizado para este análisis correspondió a 100 mg/ml a
partir de este se preparó soluciones de trabajo, se tomó una cubeta de
poliestireno se adicionó 25 μL de la solución y 975 μL de solución DPPH a 100
µM, se realizó la lectura en un espectrofotómetro de UV/VIS a una longitud de
onda de 517 nm con un tiempo de 10 min e intervalos de tiempo de 30
segundos como se observa en la Figura 5. Para determinar el porcentaje de
Page 27
EXTRACTO (100mg/mL)
r3r2r1
27
inhibición se utilizó la siguiente ecuación:
% InhibicionDPPH=[ (AbsControl−AbsMuestra )AbsControl ]×100
Donde: Abs Control: Absorbancia del control
Abs Muestra: Absorbancia de la muestra en 10 min.
Figura 5. Flujograma para la determinación de la capacidad antioxidante.
4.4.Caracterización química y fitoquímica de las hojas de guanábana
4.4.1 Caracterización química de las hojas de guanábana
Se realizó el análisis fisicoquímico de las hojas de guanábana ápice,
medio y basal de la planta, siguiendo los métodos ya descritos en el métodos
de análisis. Los resultados se muestran en el Cuadro 1.
10000 rpm/10min/4°C
517nm/10minLECTURA
DETERMINACIÓN (% de inhibición, IC50)
CENTRIFUGADO
DILUCIÓN
REACCIÓN (DPPH°)
Page 28
28
Cuadro 1. Resultado del análisis químico proximal de las hojas de guanábana.
Partes Hojas
Analisis Fisicoquímico APICAL MEDIO BASAL
BH1 BS2 BH1 BS2 BH1 BS2
Humedad 81.39±0.91 ---- 70.13±1.20 ---- 66.50±0.64 ----
Proteína (%) (N x 6.25) 2.15±0.13 11.54±0.16 3.55±0.23 11.87±0.29 4.59±0.27 13.68±0.60
Grasa (%) 0.90±0.05 16±0.01 1.85±0.04 6.21±0.12 2.59±0.04 7.72±0.05
Fibra (%) 3.90±0.18 20.95±0.06 6.18±0.36 20.67±0.37 7.18±0.19 21.42±0.36
Ceniza (%) 0.98±0.06 5.28±0.07 1.79±0.06 6.02±0.23 2.77±0.12 8.26±0.25
Carbohidratos (%) 3 10.68±0.51 57.38±0.24 16.49±0.56 55.24±0.40 16.38±0.38 48.92±1.15
1 % Base húmeda, 2 % Base seca, 3 Por diferencia
Page 29
29
4.4.2 Caracterización fitoquímica de las hojas de guanábana
- Ensayo de solubilidad
Durante el ensayo de solubilidad se mostro que tan soluble era el
extracto frente a los diferentes solventes buscando un solvente en el cual se
obtenía una mejor dilución para proseguir con la marcha fitoquímica como se
puede apreciar en el Cuadro 2, obteniendo una mayor solubilidad con etanol en
todos los extractos de los estadios de las hojas de guanábana.
Cuadro 2. Resultado de solubilidad en los extractos de las hojas de
guanábana.
Estadios de las hojas de guanábana
Solvente Apical Medio BasalÉter de petróleo + + ++Acetona + + ++Benceno + ++ ++Cloroformo ++ ++ +++Etanol +++ +++ +++Metanol ++ +++ +++
Agua destilada - - -(-) Ausente; (+) Poca solubilidad; (++) Regular solubilidad; (+++) mayor solubilidad
Figura 6. Solubilidad de los diferentes estadios de las hojas de guanábana.
Page 30
30
- Marcha fitoquímica de las hojas de guanábana
En el Cuadro 3 se muestran los resultados del análisis fitoquímico
siguiendo el método mencionado en la parte de marcha fitoquímica.
Cuadro 3. Resultado del análisis fitoquímico de las hojas de guanábana.
Tipo de reacciónHojas de guanábana
CompuestosÁpical Medio Basal
Ninhidrina - - - Aminoácidos
Gelatina + + + Taninos
Tricloruro Férrico (FeCl3) +++ +++ +++Compuestos
Fenólicos
Dragendorff + + + Alcaloides
Mayer + + + Alcaloides
NaOH 5% - Bortranger ++ + + Quinonas
Molish(-naftol-H2SO4 concentrado)
++ ++ ++ Glicósidos
Shinoda (Mg-HCl concentrado)
++ ++ + Flavonoides
(-) Ausente; (+) Poca cantidad; (++) Regular cantidad; (+++) Abundante cantidad
Figura 7. Coloraciones en el análisis fitoquímico de las hojas de guanábana.
Page 31
31
- Análisis cromatográfico de las hojas de guanábana
Figura 9. Diagrama de una cromatografía de
capa fina (muestra -eluyente)
Figura 10. Diagrama de
una cromatografía de
capa fina (revelado de las
placas con luz UV)
4.5.Capacidad funcional de las hojas de guanábana
4.5.1. Determinación de polifenoles totales
Los resultados obtenidos en la determinación de polifenoles totales
expresada en mg equivalente de acido gálico (EAG) se presentan en el
Cuadro 4.
Cuadro 4. Contenido de polifenoles en hojas de guanábana apical, media y
basal
Page 32
32
TRATAMIENTO mg EAG/100 G Apical 7088.78 ± 304.40Media 5922.95 ± 175.62Basal 3906.20 ± 30.70
4.5.2. Análisis de la capacidad antioxidante Coeficiente de inhibición
del radical DPPH (IC50) radical 1,1-diphenyl-2-picrilhydrazil
En cuanto a la capacidad de inhibición del radical DPPH, los resultados se
observan en el Cuadro 5.
Cuadro 5. Efecto de las hojas de guanábana en la actividad antioxidativa.
Tratamientos IC50,µg/mL Máxima Inhibición, %
Apical 46.11±1.71 86.16±2.19Medio 80.71±1.91 92.44±0.69Basal 123.07±3.05 89.53±0.44
Page 33
33
V. DISCUSIÓN
5.1.Referencia del Centro De Investigación para el Desarrollo
Biotecnológico De La Amazonia (CIDBAM)
5.1.1. Descripción y ubicacion
El CIDBAM esta orientada promover el desarrollo socio-económico,
promueve investigaciones orientado al mejoramiento del conocimiento en áreas
de importancia para la Amazonia Andina. Promueve el entrenamiento y
educación de estudiantes con el fin de transmitir los conocimientos y resultados
científicos de las investigaciones biotecnológicas. CASTAÑEDA et al., (2010)
hace referencia sobre los centro de investigación que es un lugar dotado de los
medios necesarios para realizar investigaciones, experimentos trabajos de
carácter científico o técnico. asimismo PUCP (2012), menciona que un centro
de investigación esta dedicado al desarrollo de proyectos e investigaciones en
diferentes campos del conocimiento.
5.1.2.Organización
En la Figura 1. se puede observar que el organigrama del CIDBAM
es de orden jerárquico, MCGRAW-HILL (2008), mencionan que las
organizaciones jerárquicas están centralizadas y se estructuran por niveles, los
Page 34
34
organigramas verticales tienen forma piramidal, representándose los niveles
jerárquicos de arriba abajo. El organigrama de la Figura 1 esta encabezada por
el Vicerector académico seguido por el director del centro; la FUNDACION DE
LA HUPA INVESTIGACION (2010), menciona que el director es el responsable
directo del funcionamiento y organización del laboratorio.
La UACH. (2007) menciona sobre las funciones principales del director:
- Vigilar el adecuado cumplimiento del objeto del Centro.
- Determinar las políticas, objetivos, estrategias y acciones para orientar el
trabajo del Centro.
- Aprobar sus Reglamentos Internos y en general la organización y los
sistemas internos de trabajo, y presupuesto de cada ejercicio anual.
- Aprobar la contratación de créditos para financiar la ejecución y
operación de programas del Centro.
El laboratorio debe analizar y documentar todas las actividades que
realiza diferentes a las de ensayo o calibración para determinar si se producen
conflictos de interés en personal clave de la organización. En el caso de que el
laboratorio pertenezca a una organización superior el análisis debe incluir las
actividades realizadas por dicha organización (ISO/IEC 17025 , 2005).
5.2.Reconocimiento del Centro De Investigación para el Desarrollo
Biotecnológico De La Amazonia- CIDBAM
Como se observa en el anexo II, Figura 2; el centro de investigación se
encuentra dividida en áreas marcadas, cada una brindando seguridad, en
cuanto a los sistemas de ventilación solo el área de HPLC cuenta con aire
Page 35
35
acondicionado, GUARDINO (2000), menciona sobre las ventajas de separar en
áreas un laboratorio:
- Separación de las áreas con riesgo elevado.
- Control de acceso a las áreas de riesgo elevado.
- Diseño de sistemas de ventilación independientes.
- Facilidad de evacuación en casos de emergencia.
- Dificultad de propagación de incendios.
- Control de la contaminación.
Cada una de las áreas reconocidas cuentan con materiales, equipos y
reactivos empleados en cada uno de los análisis, estos se encuentran
ordenadas en estantes, los materiales los hay de material de vidrio, porcelana y
plástico
Los reactivos de cada área se encuentran codificados respectivamente
para su fácil ubicación, UPP (2012) menciona que los reactivos que se utilicen
en el laboratorio deberán almacenarse adecuadamente, identificados y
separados de materiales.
Actualmente el centro no cuenta con un reglamento para el manejo y
desecho de sustancias peligrosas. INSTITUTO DE ECOLOGÍA (2005)
menciona que todos los laboratorios que utilicen sustancias peligrosas
deberán contar con un reglamento para el manejo y desecho de las mismas.
Los equipos que se utilizan en el área de antioxidantes cuentan con
indicaciones de uso, donde se explica gráficamente el modo de uso del equipo,
así mismo cuentan con ficha de registro donde cada investigador registra sus
datos fecha y hora de uso, UPP (2012), menciona que cuando se haga uso de
Page 36
36
cualquier equipo de laboratorio es de carácter obligatorio registrarse en la
bitácora, de no existir, reportarlo con el técnico de laboratorio.
Las muestras usadas en los respectivos análisis se encuentran
debidamente codificadas, la UPP, (2012) menciona que las muestras que se
guarden en los refrigeradores, congeladores, shaker, y equipos de incubación,
deberá estar etiquetada con la siguiente información:
- a) Nombre completo del alumno.
- b) Fecha y período que se mantendrá almacenada.
- c) Tipo de muestra.
- e) investigador responsable.
5.3.Análisis realizados
En el CIDBAM se realizan una serie de análisis con datos similares o
cercanos a los reportados para evitar ciertos desperfectos en cuanto a
diferentes factores como lo menciona la ISO/IEC 17025 (2005), los requisitos
técnicos de calibración se dirigen a aquellos factores que en el caso de un
laboratorio, contribuyen a la exactitud, fiabilidad y validez de los ensayos que
realiza. con factores: Factor humano, Locales y condiciones ambientales,
métodos de ensayo y calibración y validación de métodos, equipos, trazabilidad
de las medidas, muestreos, manipulación de las muestras de ensayos y
calibraciones.
5.4.Caracterización química y fitoquímica de las hojas de guanábana
5.4.1. Caracterización química de las hojas de guanábana
Page 37
37
Los resultados obtenidos durante el análisis químico proximal se
muestran en el Cuadro 1. En donde se observan los siguientes datos: humedad
81.39, 70.13, 66.50%; proteína 11.54, 11.87, 13.68%; grasa 16, 6.21, 7.72%;
fibra 20.95, 20.67, 21.42; ceniza 5.28, 6.02, 8.26, y carbohidratos 57.38, 55.24,
48.92%, respectivamente en cada estadio de las hojas de guanábana. JUSTO
(2007), reporta en las yemas terminales de la guanábana (Annona muricata L.)
obteniendo los siguientes resultados: humedad 76%, proteína 16%, grasa 7%,
cenizas 6%, fibra 20.6%, carbohidratos 49.3 %.
5.4.2. Caracterización fitoquímica de las hojas de guanábana
Los resultados el ensayo de solubilidad presentados en el Cuadro 2
muestran que el etanol fue el solvente con el que se obtuvo mejores resultados.
En el Cuadro 3 se observan los resultados de la marcha fitoquímica de las
hojas de guanábana encontrándose mayor presencia compuestos fenólicos,
glicósidos y flavonoides.
VARGAS et al., (2005) mencionan que en varias especies los
flavonoides varian sustancialmente entre genotipos, cambios estacionales,
edades y daños de la hoja y sitios de ubicación.
5.5.Capacidad funcional de las hojas de guanábana
5.5.1. Determinación de polifenoles totales
Durante la evaluación de polifenoles totales de las hojas de
guanábana como se muestran los resultados en el cuadro 4 se obtuvieron
7088.78 mg AG/100g en las hojas apicales, 5922.95 mg AG/100g en las hojas
Page 38
38
medias o joven y 3906.20 mg AG/100g en las hojas basales o maduras,
MARÍN et al., (2011) reporto resultados donde se mostraron mayor contenido
de polifenoles 9.071,46 mg AG/100g muestra seca, en hojas jóvenes en
comparación con las hojas maduras con 4.663,57 mg AG/100g muestra seca,
Destacando la hoja joven como el mejor estado fenológico de la hoja para la
cuantificación de polifenoles totales en plantas de guayabo.
5.5.2. Análisis de la capacidad antioxidante Coeficiente de inhibición
del radical DPPH (IC50) radical 1,1-diphenyl-2-picrilhydrazil
(DPPH)
Se observó que para el análisis de la capacidad antioxidante
Coeficiente de inhibición del radical DPPH (IC50) los resultados se
representados en el cuadro 5. Observamos un IC50 en las hojas: Apical
46.11 μg/mL, medio 80.71 μg/mL , basal 123.07 μg/mL; BASKAR et al., (2007)
realizaron una investigación en la India a diferentes concentraciones (100-500
μg/mL) del extracto etanólico de hojas de guanábana pulverizadas
proporcionando como resultado 70 μg/mL IC50, valor intermedio en el estudio
de especies de Annonáceas.
Page 39
39
VI. CONCLUSIONES
- Se conoció las diferentes áreas con las que cuenta el CIDBAM; el
funcionamiento del espectrofotometro, centrifuga entre otros equipos.
- Se conoció el metodo para cuantificar polifenoles totales, los métodos para
realizar el analisis quimico proximal, analisis fitoquimico y actividad
antioxidante.
- Se realizó la caracterización química, fitoquímica y capacidad antioxidante
de las hojas de guanábana, obteniéndose las mejores caracteristicas en la
hoja apical; con contenidos de polifenoles totales 7088.78 mg AG/100g y
de 5922.95 mg AG/100g en las hojas medias o joven y 3906.20 mg
AG/100g en las hojas basales o maduras.
- La capacidad antioxidante obtenida en la hoja apical fue 46.11±1.71, en la
hoja media 80.71±1.91 y en la hoja basal 123.07±3.05 IC50, µg/mL
respectivamente
Page 40
40
VII. RECOMENDACIONES
- Realizar la calibración de todos los equipos que se encuentran en las
diferentes áreas.
- Tener reglamento para el manejo y desecho de sustancias peligrosas.
- Realizar un manual de gestión de calidad.
- Evaluar por HPLC compuestos específicos que se encuentran en la hoja de
guanábana.
- Contar con acceso a revistas reconocidas a nivel mundial para la obtención
de investigaciones actualizadas.
- Capacitaciones al asistente de investigación para el empleo de nuevos
equipos y métodos, de esta forma ampliar el numero de investigaciones.
Page 41
41
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
SANDOVAL, M.; OKUHAMA, N.; ANGELES, F. 2001. Técnicas de
investigación para determinar la actividad antioxidante y anti-inflamatorio
de plantas medicinales de la amazonia. 1stinternational workshop. Iquitos
– Perú.
BRAND-WILLIAMS, W., CUVELIER, M., BERSET, C.1995. Use of free radical
method to evaluate antioxidant activity. Lebensm. Wiss Technol. 28: 25-
30 p.
LEBEAU, J; FURMAN, C; BERNIER, J; DURIEZ, P; TESSIER, E;COTELLE, N.
2000. Antioxidant properties of di-tert-butyl hidroxy lated flavonoids. Free
Rad. Biol. And Med. 29: 290 – 291 p.
KUSKOSKI, M., ASUERO, A., TRONCOSO, A., MANCINI- FILHO, J. y FETT,
R. 2005. Aplicación De Diversos Métodos Químicos para Determinar
Actividad Antioxidante en Pulpa de Frutos. Ciencia Y Tecnología De
Alimentos. Campinas, 25(4): p 726-732.
ESCOBAR, W., SANCHEZ, L. Fruticultura colombiana: guanábano. Bogotá:
Produmedios, 2000. 100 p.
CORREA , J., ORTIZ, D., LARRAHONDO, J., SÁNCHEZ, M. Y PACHÓN,
H.2012. Actividad antioxidante en guanábana (Annona muricata L.).
Page 42
42
Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y
Aromáticas 11 (2): 111 – 126
MÁRQUEZ, C. 2009. Caracterización fisiológica, físico-química, reológica,
nutraceútica, estructural y sensorial de la guanábana (Annona muricata
L. cv. ELITA). Tesis, Universidad nacional de colombia sede Medellín -
Facultad de Ciencias Agropecuarias. Colombia. 274pp
AVILA, F. 2005. Efecto del acido giberelico y agua a 4º C en la germinación de
las semillas de guanaba (Annona muricata L.). Tesis, Universidad de san
Carlos de Guatemala, Facultad de Agronomía. Guatemala. 72 pp.
RAMOS, E., CASTAÑEDA, B., IBÁÑEZ, L. 2008. Evaluación de la capacidad
antioxidante de plantas medicinales peruanas nativas e introducidas.
Rev ACAD Perú salud 15(1). Perú.
SISTEMA DE INFORMACIÓN DE LA DIVERSIDAD BIOLÓGICA Y
AMBIENTAL DE LA AMAZONIA PERUANA. 2001. Regiones de cultivo
de guanábana en Perú. [en línea]: SIAMAZONIA
(http://www.siamazonia.org.pe/archivos/publicaciones/amazonia/libros/
51/5100002.htm Doc. 2 Agosto. 2012)
RIVERO, A Y BETANCORT, J. 2009. Evaluación de la actividad antioxidante
de polifenoles de algas marinas.
FUNDACION PABLO CASSARA. 2012. Laboratorios de Investigación
Científica. Buenos Aires - Argentina [en línea]:
(http://www.fundacioncassara.org.ar/?es/investiga/lic/ Doc. 2 Agosto.
2012)
Page 43
43
GARCIA, P, MORALES, A, SEGURA, A, FERNÁNDEZ, A. 2010. Phenolic-
compound-extraction systems for fruit and vegetable samples. Pubmed
3;15(12):8813-26.
FAO. 1993. Analisis químico proximal. [en línea]:
(http://www.fao.org/docrep/field/003/AB489S/AB489S03.htm Doc. 3
Agosto. 2012).
SÁBATO, J. Y KAPLAN, M. 1972. Laboratorios de Investigación o Fábricas de
Tecnología. Editorial Ciencia Nueva. Argentina. Pag 13.
CREUS E. 2004. Compuestos fenólicos. Vol 23.Num 6. Pag 5.
QUIÑONES, M., MIGUEL, M. Y ALEIXANDRE, A. 2012. Los polifenoles,
compuestos de origen natural con efectos saludables sobre el sistema
cardiovascular. 27(1):76-89
AREAL R. Y BESSA J, 2011. La Cromatografía de Capa Fina. Vol 1. Pag 21
CASTAÑEDA, S., SOSA, A., ROVIROZA, J., ZAMORA, J., HERNÁNDEZ, A.,
TREJO, M., ROSIQUE, F., SERRALDE, A., ABAD, D. 2010.
Reglamento General de uso de Laboratorios. México. Vol 1. Pag 6
GUARDINO, G. 2000. INSHT NTP 551. Diseño, ubicación y distribución de
laboratorios importancia en prevención. 31p.
UNIVERSIDAD POLITECNICO DE PACHUCA. 2012. Laboratorio de
Investigación de Biotecnología. [en línea]: ( www.upp.edu.mx. Doc. 25
Agosto. 2012).
GOMES J., DE SOUSA T., THIJAN V., LYRA D., DESTERRO M., CARNEIRO
S., CAVALCANTI E. Y ALBUQUERQUE U. 2010. Antiproliferative
Page 44
44
Activity, Antioxidant Capacity and Tannin Content in Plants of Semi-Arid
Northeastern Brazil. Journal of molecules. Vol. 15: Pag 9
BASKAR, R., RAJESWARI, V., SATHISH, T. 2007. In vitro Antioxidant studies
in leaves of Annona Epecies. Journal of Experimental Biology. Vol 45.
Pag 480-485.
CARRION, V. 2008. Evaluación De La Actividad Antioxidante de la Yema
Terminal de Guanábana (Annona muricata L.) en tres niveles de altitud
de la Provincia de Leoncio Prado. Tesis, Universidad Nacional Agraria
De La Selva, Facultad de Ingeniería En Industrial Alimentarias. Perú.
pp.15-30.
MCGRAW-HILL. 2008. La Organización de la Empresa. [en línea]:
(www.mcgraw-hill.es/bcv/guide/capitulo/8448146859. pdf . Doc. 20
Agosto. 2012).
FUNDACION DE LA HUPA INVESTIGACION. 2010. NORMATIVA SOBRE
USO Y FUNCIONAMIENTO DEL LABORATORIO DE INVESTIGACION.
[en línea]: (www.madrid.org/cs/Satellite?blobcol=urldata.../pdf. Doc. 20
Agosto. 2012).
UACH. 2007. REGLAMENTO DE INVESTIGACIÓN.
www.upagu.edu.pe/documentos/normas/investigacion.pdf
ENTIDAD NACIONAL DE ACREDITACION. 2005. Criterios generales para la
acreditación de laboratorios de ensayo y calibración según norma UNE-
EN ISO/IEC 17025.
Page 45
45
Servicio Nacional de Acreditación del INDECOPI, NTP-ISO/IEC 17025
Requisitos Generales Para La Competencia De Laboratorios De Ensayo
Y Calibración
www.gestion-calidad.com/requisitos-tecnicos-iso-17025.html
PUCP. 2012. Organización de un Centro de Investigación [en línea]:
(http://www.pucp.edu.pe/content/pagina14.php?
pID=6027&pIDSeccionWeb=7&pIDReferencial Doc. 23 Agosto. 2012).
MCGRAW-HILL. 2008. Materiales y Equipos en un Laboratorio. [en línea]:
(www.mcgraw-hill.es/bcv/guide/capitulo/8448199154.pdf Doc. 26
Agosto. 2012).
MARÍN, M., ETTIENE, G., SILVA, N., RAGA, J., PÉREZ, E., GONZÁLEZ, C.,
SANDOVAL, L., MEDINA, D. 2011. Determinación De Fenoles Y
Flavonoides Totales En Hojas De Guayabo (Psidium guajava L.).
INSTITUTO DE ECOLOGÍA. Reglamento De Seguridad En Los Laboratorios.
[en línea]: (normateca.inecol.edu.mx/normateca/documentos/0107.pdf.
Doc. 26 Agosto. 2012).
POMA, E., REQUIS E., GORDILLO G., FUERTES C. 2011. Estudio
Fitoquímico y Actividad Antiinflamatoria de la annona muricata l.
(guanábana) de Cuzco. Ciencia e Investigación 14(2): 29-33
VARGAS, D., SOTO, M., GONZALES, V., ENGLEMAN M., Y MARTINEZ A.
2005. Cinética de Acumulación y distribución de Flavonoides en
Guayaba (Psidium guajava L.).Mexico. Agrociencia 40: 109-115.
Page 47
Centro de Investigación para el Desarrollo de la Amazonia (CIDBAM)
Coord. Facult. de Agronomía Coord. Facult de ZootecniaCoordinador Facult. de Ingeniería en Industrias AlimentariasCoordinador Facult. Recursos Naturales Renovables
Vicerrectorado Académico
Asistente de Investigación
47
A-I. Organigrama del Centro de Investigación para el Desarrollo Biotecnológico de la Amazonia
Figura 1. Organigrama del CIDBAM.
Page 48
48
A-II. Plano de distribución de las áreas de CIDBAM-CIPNA
Figura 2. Plano de distribución CIDBAN-CIPNA
Page 49
49
INDICE GENERAL Página
I. INTRODUCCIÓN..........................................................................................1
II. REVISION DE LITERATURA.......................................................................3
2.1. Generalidades de guanábana..........................................................................3
2.2. Clasificación taxonómica de guanábana.....................................................3
2.3. Variedad de guanábana y características del cultivo.............................4
2.3.1. Variedades de guanábana................................................................................4
2.4. Composición química de la hoja de guanábana......................................5
2.5. Antioxidantes y Radicales libres...................................................................5
2.5.1.Antioxidantes..........................................................................................................5
2.5.2. Radicales libres.....................................................................................................5
2.6. Laboratorio de investigación...........................................................................6
2.7. Métodos de Análisis.............................................................................................7
III. PLAN DE TRABAJO..............................................................................10
3.1. Reconocimiento del Centro De Investigación para el Desarrollo Biotecnológico De La Amazonia- CIDBAM...............................................10
3.1.1. Descripción y ubicación del CIDBAM............................................10
3.1.2. Organización.................................................................................10
3.2. Áreas del Centro De Investigación para el Desarrollo Biotecnológico de la Amazonia- CIDBAM.................................................10
3.2.1. Área de micropropagacion in vitro d vegetales..............................10
3.2.2. Area de HPLC...............................................................................10
3.2.3. Area de cultivo celular...................................................................10
3.2.4. Area de biología molecular............................................................10
3.2.5. Area de antioxidantes....................................................................10
3.3. Análisis realizados.............................................................................................10
3.3.1. Materia prima.................................................................................10
3.3.2. Preparación de extractos...............................................................10
3.3.3. Método de análisis.........................................................................10
3.3.3.1. Análisis químico proximal...........................................................10
Page 50
50
3.3.3.2. Análisis fitoquímico....................................................................10
3.3.3.3. Análisis de polifenoles totales....................................................10
3.3.3.4. Análisis de la capacidad antioxidante.........................................10
3.4. Caracterización química y fitoquímica de las hojas de guanábana...........................................................................................11
3.5. Capacidad funcional de las hojas de guanábana............................11
3.5.1. Determinación de polifenoles totales.............................................11
3.5.2. Análisis de la capacidad antioxidante Coeficiente de inhibición del radical DPPH (IC50) radical 1,1-diphenyl-2-picrilhydrazil (DPPH)...............11
IV. DESARROLLO DEL PLAN DE TRABAJO...........................................12
4.1. Reconocimiento del Centro De Investigación para el Desarrollo Biotecnológico De La Amazonia (CIDBAM).....................................12
4.1.1. Descripción y ubicacion del CIDBAM........................................12
4.1.2. Organización................................................................................12
4.2. Areas del Centro de Investigación para el Desarrollo Biotecnológico de la Amazonía.........................................................13
4.2.1. Área de micropropagación in vitro de vegetales......................13
4.2.2. Área de HPLC...............................................................................14
4.2.3. Área de cultivo celular................................................................16
4.2.4. Área biología molecular..............................................................17
4.2.5. Área de antioxidantes.................................................................18
4.3. Análisis realizados.............................................................................21
4.3.1. Materia prima...............................................................................21
4.3.2. Preparación de extractos............................................................22
4.3.3. Método de análisis.......................................................................24
4.4. Caracterización química y fitoquímica de las hojas de guanábana...........................................................................................27
4.4.1 Caracterización química de las hojas de guanábana...............27
4.4.2 Caracterización fitoquímica de las hojas de guanábana.........29
4.5. Capacidad funcional de las hojas de guanábana............................31
4.5.1. Determinación de polifenoles totales.............................................31
4.5.2. Análisis de la capacidad antioxidante Coeficiente de inhibición del radical DPPH (IC50) radical 1,1-diphenyl-2-picrilhydrazil.............................32
Page 51
51
V. DISCUSIÓN................................................................................................33
5.1. Referencia del Centro De Investigación para el Desarrollo Biotecnológico De La Amazonia (CIDBAM).....................................33
5.1.1. Descripción y ubicacion.............................................................33
5.1.2. Organización................................................................................33
5.2. Reconocimiento del Centro De Investigación para el Desarrollo Biotecnológico De La Amazonia- CIDBAM.......................................34
5.3. Análisis realizados.............................................................................36
5.4. Caracterización química y fitoquímica de las hojas de guanábana...........................................................................................36
5.4.1. Caracterización química de las hojas de guanábana...............36
5.4.2. Caracterización fitoquímica de las hojas de guanábana.........37
5.5. Capacidad funcional de las hojas de guanábana............................37
5.5.1. Determinación de polifenoles totales.............................................37
5.5.2. Análisis de la capacidad antioxidante Coeficiente de inhibición del radical DPPH (IC50) radical 1,1-diphenyl-2-picrilhydrazil (DPPH)...............38
VI. CONCLUSIONES....................................................................................39
VII. RECOMENDACIONES...........................................................................40
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.......................................................41
IX. ANEXO ....................................................................................................46
