PRODUCCIÓN DE ENZIMAS XILANOLITICAS POR BACTERIAS

AISLADAS DE LA LAGUNA BLANCA DEL ALTIPLANO BOLIVIANO

1. INTRODUCCIÓN

Hoy en día la tecnología enzimática ocupa un lugar preponderante dentro de la biotecnología y

específicamente dentro del sector alimentario. Alrededor de un 65 % de enzimas que se

producen industrialmente están de una u otra manera relacionadas con la industria alimentaría,

aunque es conveniente señalar que sólo las proteasas alcalinas empleadas en detergentes

ocupan 25% del total de esta distribución, 10% restante corresponde a aplicaciones en las

áreas farmacéutica y analálitica. (López, Barzana. 2002)

Las xilanasas son enzimas hidrolíticas que participan en el rompimiento de los enlaces

glicosídicos ß-1,4 presentes en los polisacáridos hemi-celulosa, respectivamente. El interés

por las xilanasas empezó alrededor de los años 50 debido a su enorme potencial para convertir

la lignocelulosa en glucosa y azúcares solubles

El progreso de la biotecnología de celulasas y xilanasas ha llamado la atención a nivel

mundial, ya que los métodos tradicionales de producción de enzimas pueden ser demasiado

prolongados hasta la obtención de la enzima purificada. Por esta razón nace la necesidad de

buscar nuevas alternativas que permitan la obtención de enzimas en tiempos cortos y con

propiedades bioquímicas adecuadas para el proceso en el cual va a usarse, una de ellas es la

obtención de cepas productoras de xilanasas.

Se ha informado que las Xilanasas están en bacterias marinas, en algas, hongos, en

invertebrado y plantas (Dekker y Richards 1976). Aunque la mayoría del xilanasas del

extracelular deriva de las bacterias del mesófilas, hongos del psicrófilos así como termófilos y

halófilos en las que se han descrito producción de xilanasas. (Waino, 2002)

Las xilanasas son producidas por una gran variedad de microorganismos entre los que se

encuentran hongos y bacterias. La mayoría de los microorganismos celulolíticos son capaces

de producir tanto celulasas como xilanasas; sin embargo, algunos otros sólo producen

celulasas o xilanasas.

Actualmente existen diversos ecosistemas en nuestro planeta considerados como extremos

para el hombre, como ser las regiones polares, lagos y ríos ácidos o alcalinos, las

profundidades de los océanos y muchos otros, que a pesar de estas condiciones se encuentran

colonizados por microorganismos especialmente adaptados a estos habitats excepcionales.

Desde hace 30 años se han estado estudiando a aquellos microorganismos que viven bajo

condiciones que los humanos podrían llamar extremas, organismos que son conocidos como

extremófilos (Madigan et al., 1999).

La última década se ha visto un aumento en la investigación de enzimas producido por

microorganismos aislados de los hábitats extremos, en particular, aquéllos de extremófilos y

termófilos. Sin embargo, los recientes estudios han mostrado enzimas producido por los

microorganismos halófilos.

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo General:

Seleccionar microorganismos hálofilos/halotolerantes aisladas de Lagunas hipersalinas

de la Región Andina de Bolivia capaces de producir enzimas xilanoliticas.

2.2 Objetivos Específicos:

Seleccionar microorganismo halófilo con mayor actividad xilanolítica, en medio de

cultivo específico (HM).

Determinar los parámetros experimentales (temperatura, revoluciones por minuto

(rpm), % NaCl), y nutricionales para obtener condiciones optimas de la producción

enzimática.

Cuantificar la actividad enzimática de las bacterias seleccionadas por el método DNS

(ácido 3,5 dinitrosalicilico).

Determinar las condiciones optimas del Optimizar el extracto crudo enzimático con

distintos parámetros (T, pH, %sal).

Determinar la estabilidad de la enzima.

Seleccionar levaduras con la capacidad de fermentar D-xilosa.

Producción de xilanasas en un birreactor discontinuo.???

3. JUSTIFICACIÓN

La Universidad Mayor de San Simón cuenta con el Centro de Biotecnología el cual aisló

microorganismos halófilos halotolerantes de lagunas hipersalinas ubicadas en la región la

Región Andina de Bolivia.

Estos microorganismos poseen la capacidad de producir enzimas hidrolíticas extracelulares y

su aplicación en la producción de alimentos e industrias es de gran importancia debido a que

muchos procesos industriales requieren altas o bajas temperaturas o pH ácidos o alcalinos, los

extremófilos se han convertido para las industrias en atractivas fuentes de biocatalizadores

(enzimas) estables a condiciones extremas.

Las xilanasas son enzimas hidrolíticas que participan en el rompimiento de los enlaces

glicosídicos ß-1,4 presentes en los polisacáridos y hemicelulosa. Hoy en día esta enzima es de

gran significado en biotecnología, con aplicaciones en la industria alimentaría, fermentación,

textiles hasta la industria de papel.

Al lado de la celulosa, el hemicelulosa es el segundo polisacárido renovable abundante en la

naturaleza, se produce a una velocidad de 1010 toneladas por año. El xilano siendo el más

importante del hemicelulosa, es normalmente un heteropolimero, compuesto de un espinazo

de los residuos del b-D-xylopyranose 1,4-unidos y ramas de L-arabinofuranose, el ácido de

D-glucuronic, o 4-O-metilo-Dglucuronic. (Waino, 2002)

Por lo tanto el presente proyecto de grado plantea estudiar microorganismos capaces de

producir Xilanansas que forman parte del Banco de bacterias halófilas del Centro de

Biotecnología, con el fin revelar su utilización en aplicaciones biotecnológicas.

4. MARCO TEORICO

4.1 Microorganismos extremófilos

Durante mucho tiempo se pensó que era imposible encontrar algún organismo que viviera en

sitios con condiciones extremas, inhabitables para la gran mayoría de los organismos

conocidos: temperaturas superiores a 80ºC, presiones aplastantes, oscuridad total, altas

concentraciones de sales o minerales, ambientes muy ácidos, o sitios de temperaturas

extremadamente bajas.

No obstante, cuando las técnicas utilizadas para explorar esos nichos tan extremos se

perfeccionaron, se pudo encontrar una diversidad de organismos que habitan en ellos. Se los

conoce como “extremófilos”, amantes de las condiciones extremas, y pueden ser bacterias,

plantas o animales.

Los microorganismos extremófilos proveen a la industria un gran rango de herramientas

biotecnológicas en procesos en los que son requeridos enzimas termoestables por ejemplo.

Otros extremófilos tienen aplicaciones en el tratamiento de minerales y degradación de

desechos tóxicos. (Ventosa, et al., 1998).

Los extremófilos son mayoritariamente microorganismos procariontes pertenecientes a las

Eubacterias y las Archaebacterias (o Arqueas). Si bien estos microorganismos comparten la

característica de ser unicelulares procariotas, estudios moleculares recientes han demostrado

que las Arqueas tienen un funcionamiento a nivel molecular más similar a las células

eucariotas.

Los extremófilos que habitan en altas temperaturas son conocidos como termófilos, los que

habitan a bajas temperaturas, psicrófilos, los que viven en altas concentraciones salinas son

denominados halófilos, los que viven en sitios de pH ácido, acidófilos y los de pH básico,

alcalófilos. (Peréa, 2004)

La supervivencia de los extremófilos es posible debido a que sus células tienen componentes y

propiedades particulares que les permiten mantenerse estables en el entorno en el que viven.

Algunas de estas propiedades se detallan a continuación:

Contienen enzimas estables. Por ejemplo, los termófilos tienen enzimas que no se

desnaturalizan a altas temperaturas y protegen al ADN para evitar su degradación.

Estas enzimas, al igual que las que funcionan a bajas temperaturas o a pH extremos,

son conocidas como extremozimas.

La membrana celular no es una bicapa de lípidos, como en el resto de los seres vivos,

sino una monocapa, con uniones químicas distintas a las de las membranas

convencionales, que le otorga mayor estabilidad.

4.2 Microorganismos halófilos/halotolerantes

Los microorganismos halotolerantes y halófilos pueden ser encontrados en cada uno de los

dominios de la vida: Arqueas, Bacterias y Eucariontes. Arqueas halófilas aeróbicas de la

familia Halobacteraceae, son halófilas extremas por excelencia y se desarrollan en lugares

tales como el Mar Muerto, lagunas hipersalinas y salares. Entre los eucariotas los halófilos

son escasos, el único microorganismo eucariota de importancia presente en medio ambientes

salinos es el alga Dunaliella que es un halotolerante más que un microorganismo halófilo. El

dominio de las bacterias contiene muchos diferentes microorganismos halotolerante y

halófilos. La mayor parte de este tipo de bacterias son moderados halófilos; sin embargo,

existen algunas bacterias que se asemejan a las arqueas halófilas de la familia

Halobacteriaceae en sus requerimientos y tolerancia a la sal. En estos ecosistemas salinos, el

dominio Bacteria está principalmente representado por halófilos moderados del grupo

Proteobacterias (notablemente en γ-subdivisión), algunas Gram positivas, cianobacterias y

algunas mas (Oren,2002).

Los microorganismos halófilos son aquellos que se encuentran en los ambientes hipersalinos,

pero se diferencian de los halotolerantes porque son capaces de reproducirse y realizar sus

funciones metabólicas de una manera más eficaz en presencia de altas concentraciones de

sales que en su ausencia.

Aunque las sales se requieren para todas las formas de vida, los microorganismos halófilos se

distinguen o clasifican por el requerimiento de condiciones hipersalinas para su crecimiento:

los halófilos ligeros muestran crecimiento óptimo dentro de una concentración de NaCl que

oscila entre 0.2 y 0.85 M (2-5%): los halófilos moderados, crecen entre 0.85 y 3.4 M (5-20 %)

de NaCl, y por último, los halófilos extremos, que crecen de 3.4 a 5.1 M (20-30%) de NaCl.

En contraste, los organismos no halófilos sólo pueden crecer por debajo de 0.2 M de NaCl.

(Gonzáles- Hernández, 2002)

Los organismos halotolerantes son aquellos que pueden crecer en presencia y en ausencia de

altas concentraciones de sal. Muchos organismos halófilos y halotolerantes pueden crecer

dentro de un amplio margen de concentración de sal, con requerimiento o tolerancia para

algunas sales, dependiendo del medio y de los factores nutricionales. (Gonzáles- Hernández,

2002)

Los microorganismos halófilos y halotolerantes son encontrados en diversos ambientes como

en los charcos salados originados por evaporación de agua de mar y contienen una

composición de sal similar a la del agua de mar, con iones de sodio y cloruro como los

dominantes y con un pH cercano al neutro o ligeramente alcalino. Algunos ambientes salinos

incluyen lagos salados y aguas salobres (España, Chile, Bolivia, Djibouti y los Grandes Lagos

Salados en Utah), suelos salinos (Mar rojo, Valles Secos Antárticos), alimentos salados

(pescado, carne) y otros (Ventosa et al., 1998; Quillaguaman, et al, 2004).

4.3 Extremozimas

Las enzimas son proteínas que favorecen ciertas reacciones químicas que, en otras

circunstancias, tardarían mucho más en ocurrir, o directamente nunca ocurrirían. Intervienen

en la respiración, la fotosíntesis y un sin número de reacciones de síntesis y degradación. O

sea: son esenciales para que un organismo se mantenga vivo. Las extremozimas cumplen

funciones similares a sus análogas no extremófilas. Pero presentan diferencias estructurales

que les permiten funcionar en condiciones donde las otras se desorganizarían por completo.

El termino “extremozima” ha sido acuñado para referirse a enzimas que funcionan a

temperaturas estremadamente altas (o enzimas que funcionan de forma óptima bajo cualquier

condición ambiental extrema; por ejemplo en el frío, a elevada concentración salina, o a pH

muy ácido o muy alcalino) y a los oprganismos que las producen se les denomina

extremofilos.

Las primeras extremófilas fueron descubiertas hace cosa de 40 años. La gran mayoría, en los

últimos tiempos. Al principio se pensó que se trataba de casos raros. Nadie las buscaba,

porque viven en ambientes que se creían incompatibles con la vida. Hoy están en la mira de

los cazadores de bacterias. Y es evidente que constituyen un linaje profusamente ramificado

del árbol de la vida.

La industria imagina otras aplicaciones para las extremozimas. Por ejemplo, añadirlas a los

detergentes para que contribuyan a la degradación de las grasas. O incorporarlas a la comida

de los animales para que faciliten la digestión. Existen muchas enzimas que pueden realizar

estas funciones, pero solamente las extremozimas pueden hacerlo en el medio alcalino de los

detergentes o en el ácido aparato digestivo de los animales. ( Alzogaray, 1999)

4.4 Xilanasas

Las xilanasas son enzimas hidrolíticas que participan en el rompimiento de los enlaces

glicosídicos ß-1,4 presentes en los polisacáridos. El interés por las xilanasas empezó debido a

su enorme potencial para convertir la lignocelulosa (celulosa, hemicelulosa y lignina) en

glucosa y azúcares solubles. Las xilanasas son producidas por una gran variedad de

microorganismos entre los que se encuentran hongos y bacterias. La mayoría de los

microorganismos celulolíticos son capaces de producir tanto celulasas como xilanasas; sin

embargo, algunos otros sólo producen celulasas o xilanasas. La producción microbiana de

estas enzimas está sujeta a diferentes mecanismos de regulación. (Ponce, 2001)

Las xilanasas realiza la degradación total de la xilano para producir xilosa o arabinosa es

llevada a cabo, por un grupo de enzimas que participan sinergísticamente. Las más conocidas

son las endo-ß-D-xilanasas (E.C. 3.2.1.8), las cuales rompen al azar los enlaces glicosídicos de

la cadena principal de la molécula. La arabinofuranosidasa (E.C. 3.2.1.55) hidroliza las

cadenas laterales de arabinosa, mientras quelas acetil xilan esterasas (E.C. 3.1.1.72) liberan

grupos acetatos. La glucoronidasa (E.C. 3.2.1.139) remueve las cadenas laterales de ácido

glucorónico a partir de unidades de xilosa. Las ß-xilosidasas (E.C. 3.2.1.37) son enzimas

activas sobre oligosacáridos cortos, llevando a cabo la hidrólisis de los enlaces ß-1,4-aril-

xilopiranósido produciendo xilosa. (Ponce, 2001)

4.5 Xilano

El material que forma las paredes celulares de las plantas es una matriz compleja de celulosa,

lignina y hemicelulosa. Las hemicelulosas son una clase de polímeros que se distinguen por

producir al ser hidrolizados una serie de pentosas, ácidos glucurónicos y algunas formas

desoxi de azúcares. Las interrelaciones entre los componentes de la pared celular no son

conocidas con detalle pero existen con seguridad enlaces físicos y covalentes entre ellos.

La hemicelulosa más abundante presente en los alimentos posee en esqueleto de tipo xilano

compuesto por unidades (1 -4) ß-D-Xilopiranosilo, estas ejercen probablemente su mayor

efecto en los productos de panadería, en los que mejoran la capacidad de retención del agua

de la harina. (Fennema, 1996)

Las xilanas son heteropolisacáridos y su degradación total para producir xilosa y/o arabinosa

es llevada a cabo, como en la celulosa, por un grupo de enzimas que participan

sinergísticamente. Las más conocidas son las endo-ß-D-xilanasas, las cuales rompen al azar

los enlaces glicosídicos de la cadena principal de la molécula. (Ponce, 2001)

El xilano es el componente mayoritario de la hemicelulosa, la b-1,4-endoxilanasa y la b-

xilosidasa son las enzimas responsables de la hidrólisis de la cadena principal y representan

los principales componentes del sistema xilanolítico. (Ponce, 2001)

Según la bibliografía (Martínez et al, 2002), las materias primas usadas que tiene más xilano

son: paja de arroz, bagazo de caña de azúcar, virutas de madera.

La corteza de los árboles y la paja contienen hasta 30% de xilano, la madera de coníferas 7 -

12% y la de árboles de hojas caducas 20 - 25%. La cadena consta de 30 - 100 unidades de b-

D-xilopiranosa con enlaces 1,4 -glicosídicos.

4.6 Aplicación industrial de las Xilanasas

La biotecnología de las celulasas y xilanasas empezó al principio de los años 80, primero en la

alimentación animal seguida por aplicaciones en la industria de alimentos.

Posteriormente estas enzimas empezaron a usarse en las industrias de lavandería, textil y de la

pulpa y papel. En las últimas dos décadas su uso se ha incrementado en forma considerable y

actualmente representan cerca del 20% del mercado mundial de las enzimas.

Una de las aplicaciones más importantes de las xilanasas es en la industria de la pulpa y del

papel. El pulpeo Kraft involucra el cocimiento alcalino de la pulpa para remover el 95% de la

lignina presente en la madera. El 5% remanente le confiere a la pulpa el color café pardo

oscuro. Por razones estéticas y para mejorar las propiedades del papel es necesario un paso del

blanqueo, el cual tradicionalmente se hacía por un proceso multietapas, que utiliza cloro o

dióxido de cloro.

Las xilanasas, como las celulasas, también se usan en la industria alimentaria en la

clarificación de jugos y vinos, licuefacción de mucílago de café; extracción de saborizantes y

pigmentos, aceites de plantas y semillas; maceración de materia vegetal; acondicionamiento de

piensos para aves y cerdos y en la industria de la panificación, entre otras. (Ponce, 2001)

En la industria de la panificación las xilanasas, especialmente la endo-1,4-ß-xilanasa, se

adicionan a la masa para mejorar su calidad, obteniéndose productos de panadería con mejor

textura y sabor. El efecto de las xilanasas es incrementar el volumen específico de los panes,

sin provocar un efecto colateral negativo en el manejo de la masa. (Ponce, 2001)

4.7 Materiales

Para la ejecución del presente trabajo de investigación, se utilizarán cepas de bacterias

halófilas y halotolerantes del banco de microorganismos del Centro de Biotecnología (FCyT-

UMSS) y los siguientes equipos y reactivos:

4.7.1 Equipos:

Shaker incubator

Autoclave

Incubadora.

Espectrofotómetro UV-Vis

Centrifuga

Vortex

Balanza analítica

Bioreactor

Baño maria

4.7.2 Reactivos

Acido dinitrosalicilico (DNS)

NaCl p.a

MgSO4.7H2O

CaCl2.2H2O

KCl

NaBr

NaOH p.a

Almidón de Yuca

Extracto de levadura

Agar granulado

Xilano

Xilosa

Tris-HCl

Glicina

Fosfato de potasio

Paja de cebada

5. DESARROLLO EXPERIMENTAL

5.1 Selección del mejor microorganismo que produzca xilanasas

El Banco de Microorganismos del Centro de Biotecnología reporta a tres cepas halofilas

productoras de xilanasas: LB-4, LC-7 y VS-2. Las cuales serán sembradas en medio liquido al

1% paja de cebada, extracto de levadura 1 % (g/l), NaCL 5% (g/l), sales sintéticas como: KCl

0.05% (g/l), NaBr 0.006% (g/l), MgSO4·7H2O 0.025% (g/l), CaCl·2H2O 0.009% (g/l),

Llevar a pH = 7.5 con OHNa 0.1N. (Quillaguamán, et al., 2004).

Se tomara muestras cada 12 horas y se realizan pruebas de azucares reductores y actividad

enzimático.

5.1.1 Cuantificación de la actividad enzimática

La actividad xilanolitica se realizará usando xilano al 1%, mediante la determinación de

carbohidratos liberados mediante usando acido 3,5 dinitrosalicílico (DNS). Se cuantificara la

desaparición del sustrato por espectrofotometría a 540 nm de longitud de onda. Este método

tiene una sensibilidad de 0.2 a 2 mg por ml de muestra. (Miller 1952)

5.1.1.1 Procedimiento

La cuantificación de la actividad xilanolitica se coloca 200µl de la muestra en tubos de ensayo

con tapa rosca, luego se añade la solución del sustrato (400 µl buffer Tris-HCl 50 nM + 1%

xilano); se tapan los tubos y se incuba a 30ºC en un baño maría por 10 minutos.

Inmediatamente se añade 1 ml de DNS y se lleva a ebullición en baño maría por 10 minutos.

Luego se enfría los tubos en agua a temperatura ambiente, se agrega 5.33 ml de agua destilada

y se agita.

Se mide la absorbancia a 540 nm de longitud de onda frente a un blanco que se remplaza la

muestra por la solución buffer y sigue el mismo procedimiento.

5.1.1.2 Curva patrón

La curva de calibración se prepara una solución madre de xilosa 10 mM. Se disuelve 150.13

mg de xilosa en un matraz aforado de 100ml y diluir de siguiente forma:

Dilución Xilosa µmol/ml1:1 (0,15013g/100ml) 10

1:2 (25ml/50ml) 51:3 (16ml/50ml) 3,21:5 (10ml/50ml) 2

En tubos de tapa rosca distribuir 1.5 ml de cada dilución, añadir 3 ml de la solución DNS.

Llevar a baño maría por 5 minutos, enfriar los tubos y añadir 16 ml de agua destilada. Agitar

los tubos y medir la absorbancia a 540 nm de longitud de onda frente a un blanco.

5.2 Caracterización de las bacterias halófilas con actividad xilanolítica:

Se llevara a cabo un estudio Morfológico de cada una de las colonias seleccionadas,

examinando los bordes, forma, color, elevación y textura, utilizando cultivos celulares

jóvenes, de no más de 24 horas de crecimiento, se realizara una tinción de Gram en los

mismos, posteriormente las células seran observadas bajo el microscopio con el objetivo de

aceite de inmersión con una magnificación de x 1000 veces el tamaño original; de esta forma,

se determinara se el microorganismo es Gram positivos o Gam negativos

5.3 Crecimiento bacteriano a diferentes pH y % sal

Se utilizara matraces con 30 ml de medio de cultivo (HM) liquido estéril y se ajustara el pH a

6,7,8,9 y 0,5,10 % sal; se incubara a 30ºC y 200 rpm. El crecimiento será seguido mediante la

medición de la DO (densidad óptica) a 600 nm en un espectrofotómetro, en intervalos de

tiempo de 12 horas desde el momento de su inoculación por 60 horas con el fin de obtener

curva de crecimiento bacteriano.

5.4 Optimización de la producción enzimática mediante un diseño factorial 2n

Una vez obtenidos las curvas de crecimiento microbiano, se implementara un diseño factorial

2n, que describe los experimentos más adecuados para conocer simultáneamente que efecto

tienen n factores sobre una respuesta (actividad xilanolitica) y descubrir si interaccionan entre

ellos.

Donde “n” representara el número de factores seleccionados con el fin de definir la influencia

de las diferentes factores en el proceso de obtención xilanasas hidroliticas extracelulares, este

diseño permitirá estudiar todas las combinaciones de las distintos factores.

Para la obtención de enzimas xilanoliticas los factores seleccionados serán los sguientes:

Velocidad de agitación (rpm)

Temperatura

% sal

Se elegirá la velocidad de agitación por que los nutrientes que dispone el microorganismo se

dispersan en toda la superficie del recipiente que los contiene y hay menor gasto de energía de

la propia bacteria y esto les motiva a crecer más rápido. La concentración de NaCL por lo

siguiente: por que son halotolerantes, aquellas bacterias capaces de crecer en ausencia de sal

tan bien como en presencia y halófilos aquellos que requieren sal para crecer. La temperatura

porque para cada bacteria existe una temperatura óptima en la cual el microorganismo se

desarrolla de forma más rápida y un espectro de temperatura en el cual el desarrollo puede

producirse.

Los factores considerados:

Factor Menor Mayor

Velocidad de agitación (rpm) 100 200

T ºC 30 37

%sal 0 5

Debido a que el diseño factorial presenta 3 factores, el número mínimo de experiencias que

deberán llevarse a cabo es de: 2n = 23

= 8, de la siguiente forma:

#

Experimentos

%NaCl T °C rpm

1 0 30 100

2 0 30 200

3 0 37 100

4 0 37 200

5 5 30 100

6 5 30 200

7 5 37 100

8 5 37 200

El parámetro medible será determinado por la actividad xilanolitica en el trascurso del

crecimiento bacteriano

5.5 Optimización de la actividad enzimática del extracto crudo (enzimático)

Una vez determinadas las condiciones optimas de la producción enzimática, se procederá a

obtener el extracto enzimático, que se llevara a cabo centrifugando el medio inoculado.

El parámetro medidle será la actividad enzimática, pero a diferentes temperaturas

(4,23,30,40,50,60,70)ºC, pH ( 7,8,9,10) y % sal (0,5,10,15). Esta prueba tiene como fin

determinar las condiciones optimas de la actividad enzimática (con que factores hidroliza más

la enzima.)

5.6 Fermentación de la D-xilosa

El Centro de Biotecnología cuanta con un banco de levaduras las cuales será utilizada para

determinar si alguna de estas levaduras pueden fermentar la xilosa en etanol.

El método empleado será en platos donde se utilizara medio solidó compuesto por: extracto de

malta 2%, agar 2% y xilosa 2%. Se sembrara las levaduras por picadura, luego incubarlas a

30ºC por 48 horas.

Las levaduras que puedan fermentar la xilosa presentaran un halo alrededor de la colonia.

6. CRONOGRAMA DE TRABAJO

Actividades Mayo Junio Julio Agosto Septiembre Octubre Noviembre DiciembreRevisión bibliográfica                

Selección del MO                

Pruebas de DNS                Caracterización del MO                

Diseño factorial 2                Optimización del extracto                

Aplicación                Análisis de resultados                Redacción del proyecto