Date post: | 14-Dec-2015 |
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Productos biotecnológicos
• Productos de ADN recombinante
• Ejemplos. – Enzimas recombinantes (Insulina, activador tisular de plasminógeno)
– Anticuerpos monoclonales o recombinantes (Antivenenos)
– Hormonas recombinantes (Hormona de crecimiento)
– Citoquinas recombinantes (Interferon alfa, IL-11)
– Receptores solubles recombinantes (Receptor de TNF)
– Vacunas recombinantes (Anti hepatitis B)
– Factores de coagulación recombinantes (Factor VIII)
Requerimientos para Producir
Proteínas Recombinantes
1) Gen de interés
2) Vector
3) Célula para clonación del gen de interés
4) Célula para expresión de la proteína codificada por el gen de interés
Vector
• DNA pequeño (proveniente de virus,
bacterias, levaduras) que puede ser
introducido y mantenido en una célula
(procariota o eucariota) y en el que se
puede injertar un fragmento de DNA con
el fin de ser clonado.
• Células anfitrionas:
– Eucariotas, procariotas
Tipos de Vectores
• Virus, bacteriófagos
• Cósmidos – Sitios cos ʎ + plásmido
• Cromosomas artificiales de levaduras (YACs)
• Cromosomas artificiales de bacterias – BAC
• Plásmido F
– PAC • Plásmido P1
Clonación
1) Aislamiento y purificación del DNA de interés
2) Escogencia de la célula hospedera y del vector de clonación.
3) Obtención del vector recombinante
4) Trasformación, transfección del vector recombinante en célula hospedera
5) Selección de células que contienen DNA recombinante
6) Detección de los clones que contienen el DNA de interés
4.Transformación/transfección
6. Selección del clon 5. Crecimiento celular, expanción clonal
Algunas figuras tomadas de Lodish, 5th Ed
Clonación
Purificación plásmidos recombinantes
Células Anfitrionas
• Bacterias
– Escherichia coli (E. coli)
• Eucariotas – Levaduras
• Saccharomyces cerevisiae(S. cerevisiae), Pichia pastoris (P. pastoris)
– Células de insectos
– Líneas celulares mamíferas • Células derivadas de ovario de hámster chino
(CHO)
Traducción Introducción de
secuencias que permitan
el reconocimiento del
mRNA por los ribosomas
Optimización de la
traducción
(Utilización preferencial
de codones)
Introducción de señales
que garanticen
estabilidad de la
proteína
Introducción de señales
que garanticen la
secreción de la proteína
http://palaeos.info/bacteria/glossary/glossary1.html
Sistemas de Expresión
• Procariotes
E. coli
• Cuerpos de inclusión
• Eucariotes
–Levaduras
• S. cerevisiae
• P. pastoris
–Células de insectos
Secretan
Glargina
Adaptado de Vajo Z et al. Endocr Rev 2001 22: 706-717
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
24 25 28 26 29 27 30
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly
Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala
Gly
Arg Arg
• By-product profile influenced by folding and cleavage
Insulin biosimilars
S S
SS S
S
E.coli cell
Inclusion body
Fusion protein
Preproinsulin
Insulin
Folding
conditions
influence
by-product
pattern
Cleavage
enzyme:
specificity &
selectivity
Typical
operations for
inclusion body
processes
5. Isolation of cells
6. Cell disruption via
homogeniser
7. Isolation and purification
of fusion protein
8. Folding
9. Enzymatic cleavage
10. Prepurification and
concentration via adsorption
S S
SS S
S
S S
SS S
S
Cortesía sanofi
Insulin biosimilars
• Purity is determined by chromatography steps
Insulin
Chromatography
defines purity
Fibrillation
tendency
11. Ion-exchange
chromatography
12. Reversed-phase
chromatography
13. Crystallisation
and lyophilisation
14. Blending / filling
S S
SS S
S
S S
SS S
S
Cortesía sanofi