Productos Male Factor Infertility Elucigene® Instrucciones de uso
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Productos Elucigene® Male Factor Infertility
Instrucciones de uso
Producto Cantidad Código del catálogo
Elucigene Male Factor Infertility 25 ensayos AZFXYB1
Elucigene MFI-Yplus 10 ensayos AZFPLBX
Para uso diagnóstico in vitro
Fabricado por: Elucigene Diagnostics Citylabs Nelson Street Manchester M13 9NQ
Para ventas, servicio al cliente y asistencia técnica: T: +44 (0) 161 669 8122 F: +44 (0) 161 669 8129 E: [email protected] E: [email protected]
Elucigene Diagnostics es el nombre comercial de Delta Diagnostics (UK) Limited., una empresa registrada en Inglaterra y Gales con el número 8696299.
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Elucigene Male Factor Infertility
La gama de productos Elucigene Male Factor Infertility comprende ensayos multiplexados basados
en ADN para la determinación rápida del estado de aneuploidía cromosómica sexual, así como la
detección y caracterización de las tres clases de microdeleción del cromosoma Y más comunes
asociadas con la infertilidad masculina. Los kits Elucigene Male Factor Infertility están disponibles en
los formatos enumerados a continuación. Para obtener más información sobre los kits de la gama
Male Factor Infertility por favor visite:
http://www.elucigene.com/product-category/reproductive-health/
Uso previsto
Male Factor Infertility
Para el diagnóstico cuantitativo in vitro rutinario de las aneuploidías cromosómicas sexuales más
comunes (p. ej., el síndrome de Klinefelter) y las microdeleciones del cromosoma Y (AZFa, AZFb y
AZFc) comúnmente asociadas con el factor de la infertilidad masculina. El ensayo incluye los
marcadores STR del cromosoma sexual XHPRT y DXYS218 y los marcadores no STR AMEL, TAF9L
y marcadores SRY para la determinación del estado de la aneuploidía cromosómica sexual. El
ensayo también incluye los marcadores específicos sY84, sY86, sY127, sY134, sY254 y sY255 para
la detección de las microdeleciones del cromosoma Y de los loci AZFa, AZFb y AZFc. El método en
que se basa el kit Elucigene Male Factor Infertility es la técnica QF-PCR (reacción en cadena de la
polimerasa cuantitativa fluorescente). Los dispositivos están diseñados para ser usados en ADN
extraído de sangre entera (EDTA), pero no para ser usados con otras matrices de ensayo. La
población destinataria son pacientes varones con infertilidad sospechada que pueden mostrar
características asociadas tales como un recuento bajo de espermatozoides. El dispositivo está
diseñado para ser usado en conjunción con otros procedimientos de diagnóstico con el fin de apoyar
o descartar el diagnóstico clínico propuesto. El dispositivo es sólo para uso profesional en un
entorno de laboratorio de citogenética o biología molecular.
Male Factor Infertility-Yplus (MFI-Yplus)
Kit suplementario que contiene marcadores del cromosoma Y adicionales que será utilizado junto con
Male Factor Infertility para la caracterización in-vitro rutinaria de las tres microdeleciones del
cromosoma Y más comúnmente asociadas con la infertilidad masculina. Este kit está disponible para
el análisis y la caracterización de microdeleciones del cromosoma Y detectadas mediante el kit Male
Factor Infertility. El método que se emplea en el kit Elucigene MFI-Yplus es la técnica QF-PCR
(reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa fluorescente). Los dispositivos están diseñados
para ser utilizados en el ADN extraído de sangre completa (EDTA); no están diseñados para ser
utilizados con otras matrices de ensayo. La población destinataria son pacientes varones con
infertilidad sospechada que han dado positivo para una microdeleción del cromosoma Y. El
dispositivo está diseñado para ser utilizado junto con otros procedimientos de diagnóstico con el fin
de apoyar o descartar el diagnóstico clínico propuesto. El dispositivo es para uso profesional
solamente en un entorno de laboratorio de citogenética o biología molecular.
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Resumen y explicación
Estadísticamente, entre un 10% y 15% de las parejas tienen dificultades para concebir, con factores
asociados a la infertilidad masculina como p. ej. un recuento bajo de espermatozoides, lo cual se
cree que es un problema subyacente en aproximadamente el 50% de los casos. A pesar de que en
la mayoría de las incidencias las causas de la infertilidad masculina se desconocen, los estudios han
demostrado que la aneuploidía cromosómica sexual y las microdeleciones de regiones específicas
del cromosoma Y pueden desempeñar un papel (1).
El síndrome de Klinefelter es la aneuploidía cromosómica sexual más comúnmente asociada con el
factor de la infertilidad masculina. Este síndrome tiene una incidencia de nacimientos con vida entre
1:500 y 1:650 varones y la causa más común es una copia adicional del cromosoma X (cariotipo 47,
XXY); este cambio es el defecto genético más frecuente observado en la infertilidad masculina. Las
microdeleciones del cromosoma Y son la próxima causa genética más común de la infertilidad
masculina (2), con microdeleciones producidas en tres regiones (AZFa, AZFb, AZFc) detectadas en
hasta un 7% de casos de oligospermia (recuento bajo de espermatozoides) y un 13% de
azoospermia no obstructiva (recuento cero de espermatozoides) (1). Estas microdeleciones ocurren
debido a la recombinación homóloga de secuencias repetitivas en estas regiones y los exactos
mecanismos moleculares y eventos de recombinación subyacentes en estos cambios se han puesto
en claro. Estas regiones están ubicadas en el cromosoma Yq11 y aunque la región de microdeleción
AZFa es evidente, hay un considerable grado de coincidencia entre las regiones afectadas por
microdeleción AZFb y AZFc (Figura 1).
Figura 1: Ubicación cromosómica de las regiones de microdeleción AZFa, AZFb y AZFc en el
cromosoma Y (Poongothai et al., 2009).
La identificación de las causas genéticas de la infertilidad masculina puede dar lugar a una gestión
clínica más eficaz de los pacientes. Por ejemplo, los pacientes que presentan una microdeleción que
afecta a la región AZFc (los más comunes) presentan un fenotipo variable (que a menudo depende
de antecedentes genéticos). Sin embargo, estos pacientes por lo general muestran niveles
residuales de espermatogénesis y en estos casos hay un 50% de posibilidad de recuperar los
espermatozoides mediante TESE (extracción de espermatozoides testiculares). Las parejas
afectadas por microdeleciones AZFc pueden concebir con la ayuda de técnicas de fertilidad asistida
tales como ICSI (inyección intracitoplasmática de espermatozoides). Esto contrasta con pacientes
que experimentan microdeleciones completas en las regiones AZFa, AZFb y AZFc de quienes una
recuperación eficaz de esperma funcional es poco probable (2), aunque la probabilidad aumenta si la
deleción no se ha completado (consulte la Figura 2).
AZFc
AZFb AZFa
Brazo Largo Corto
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Principios del procedimiento
El método empleado en la gama de productos Elucigene Male Factor Infertility para llevar a cabo un
ensayo multiplexado que detecte la aneuploidía de los cromosomas X e Y (Male Factor Infertility), así
como las microdeleciones del cromosoma Y (Male Factor Infertility y MFI-Yplus), es la técnica QF-
PCR (reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa fluorescente) (3-7).
(i) Detección de la aneuploidía cromosómica sexual
Mediante la amplificación de la PCR, la aneuploidía cromosómica se detecta cuando imprimaciones
etiquetadas con colorante fluorescente apuntan a regiones altamente polimórficas de la secuencia
del ADN, llamadas secuencias cortas repetidas en tándem (STR), que se encuentran en los
cromosomas de interés. Cada marcador STR objetivo es específico al cromosoma en el que se
encuentra; por lo tanto, el número de copia del marcador STR puede diagnosticar el número de copia
del cromosoma. Se han seleccionado marcadores STR informativos que presentan una alta
heterogeneidad, de modo que el número de copia puede determinarse fácilmente cuando dos alelos
de un cromosoma STR específico son determinados vía la técnica QF-PCR como dos picos en una
proporción de 1:1. La observación de un alelo STR extra como un patrón de tres picos en una
relación de 1:1:1, o un patrón de dos picos en una relación de 2:1 o 1:2 picos, diagnostica la
presencia de una secuencia adicional que a su vez puede representar un cromosoma adicional.
(ii) Detección de la microdeleción cromosómica
En 2004, la Academia Europea de Andrología (EAA) y la Red Europea de Calidad en Genética
Molecular (EMQN) sugirieron una serie de directrices sobre las mejores practicas para probar la
microdeleción del cromosoma Y evaluando 2 marcadores de sitio de secuencia etiquetada (STS)
mediante la PCR para cada región de deleción: AZFa- sY84 y sY86, AZFb- sY127 y sY134 y AZFc-
sY254 y sY255 (8). Estas directrices se enmendaron en 2014 para incluir el análisis de extensión
que proporcionó una caracterización y dimensionamiento adicional de las microdeleciones en la
región AZF detectadas usando un conjunto definido de marcadores separados: AZFa – sY82,
sY1182, sY83 y sY88, AZFb – sY105, sY121, sY143 y sY153, AZFc (subtipo gr/gr) – sY1191 y
sY1291 (2). Una caracterización o dimensionamiento adicional de las microdeleciones en la región
AZF es útil debido a la posibilidad de obtener espermatozoides funcionales de pacientes con
microdeleciones parciales, en comparación con pacientes que presentan una deleción completa de
una o más de estas regiones. Por ejemplo, la microdeleción gr/gr que es una subdeleción AZFc
normalmente asociada con un fenotipo más leve que el observado en deleciones totales. De hecho,
la importancia clínica de esta subdeleción varía de acuerdo con los antecedentes genéticos, al ser
considerada como causante de un fenotipo de subfertilidad en algunas poblaciones y se considera
incluso "fija" en algunos haplotipos del cromosoma Y comunes en la población japonesa con ningún
efecto en el recuento de espermatozoides. Imprimaciones etiquetadas con colorante fluorescente
específicas para el flanqueo secuencial de estos marcadores amplifican la secuencia natural,
mientras que la pérdida del pico de diagnóstico natural revela la microdelección que abarca este
marcador STS.
Productos amplificados de la técnica QF-PCR se analizan cuantitativamente en un analizador
genético de electroforesis capilar para determinar tanto el número de copia de los marcadores STR
analizados como el estado de deleción de los marcadores STS del cromosoma Y.
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Deleción de
sY84, sY86
Deleción de
sY127, sY134
Deleción de
sY254, sY255
Análisis de extensiónBorde proximal:
sY82 (+): sY83/sY1064 (-)Borde d istal:
sY1065/sY118 (-):sY88 (+)
Análisis de extensiónBorde proximal:
sY105 (+): sY121/sY1224 (-)Borde d istal:
sY143/sY1192 (-):sY153(+)
Verifique la presencia de heterocromatina
sY160
Marcadores no concordantes
con una deleción completa
Deleción AZFa de AZFb
completa
Deleción de AZFc completa
B2/b4 o terminal [sY160 (-)]
Fenotipo test icular de semen
variable
Posibilidad de TESE
prácticamente nula
Posibilidad de TESE alrededor del 50%
(deleción de b2/b4)
Informe con orientación para el asesoramiento genético y la
selección de parientes
masculinos
Informe con orientación para
el asesoramiento genético
Informe con orientación para el asesoramiento genético,
Cariotipo (posible 45, X mosaicismo), selección de
parientes masculinos
Figura 2: Organigrama mostrando las consecuencias clínicas de encontrar cada tipo de
microdeleción del cromosoma Y común (Krausz et al., 2014).
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Advertencias y precauciones
1. El ADN de control normal incluido en los kits fue sometido a ensayos independientes con resultados negativos para el virus de la hepatitis B (VHB), el virus de la hepatitis C (VHC) y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) 1 y 2.
2. Se debe tener cuidado al manejar material de origen humano. Todas las muestras deben considerarse potencialmente infecciosas. Ningún método puede ofrecer plena garantía de que están ausentes los VHB, VHC, VIH u otros agentes infecciosos.
3. El manejo de muestras y componentes de ensayo, su utilización, almacenamiento y eliminación deberán estar acordes con los procedimientos definidos por la correspondiente regulación o directriz de seguridad nacional contra peligros biológicos.
4. De acuerdo con las buenas prácticas aplicables, los laboratorios deben procesar sus propias muestras de QC interno de tipo conocido en cada ensayo, de manera que se pueda evaluar la validez del procedimiento.
5. Si el kit está dañado su contenido puede tener desperfectos. No utilice el kit y póngase en contacto con el servicio al cliente.
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Símbolos utilizados en las etiquetas
Los símbolos utilizados en todas las etiquetas y envases se ajustan a la norma armonizada
ISO 15223
Fabricante
Número de ensayos
Consulte las Instrucciones de uso
Almacenar por debajo de la temperatura indicada
Utilizar antes de la fecha indicada
Código del catálogo
Número de lote o remesa
Dispositivo médico para el diagnóstico in vitro
X°C
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Materiales proporcionados
Kit de Elucigene Male Factor Infertility
Cada kit contiene:
Elucigene Male Factor Infertility (TA) (Código de pieza 450208): 1 x 250µl (25 ensayos), mezcla de
reacción que contiene las imprimaciones para amplificar los marcadores de STR (secuencias cortas
repetidas en tándem) específicos para X e Y y los no STR, así como los marcadores de
microdeleción del cromosoma Y. Consulte el apéndice 2 para obtener más detalles de los
marcadores en cada kit. La mezcla de reacción también contiene polimerasa de ADN y
deoxinucleótidos trifosfatos en tampón.
ADN de control (DC) (Código de pieza 404489): ADN de control en 1 vial de 50µl, normal para ambos
marcadores de detección de la aneuploidía cromosómica sexual y para los marcadores de deleción
del cromosoma Y en el ensayo Elucigene Male Factor Infertility.
Kit de Elucigene MFI-Yplus
Cada kit contiene:
Elucigene MFI-Yplus (TA) (Código de pieza 450211) : 1 x 100 µl (10 ensayos) de mezcla de
reacción que contiene las imprimaciones para amplificar los marcadores del cromosoma Y. Consulte
el apéndice 2 para obtener más detalles de los marcadores en cada kit. La mezcla de reacción
también contiene polimerasa de ADN y deoxinucleótidos trifosfatos en tampón.
ADN de control (DC) (Código de pieza 404489): ADN de control en 1 vial de 50µl, normal para los
marcadores de deleción del cromosoma Y en el ensayo Elucigene MFI-Yplus.
Preparación y almacenamiento del kit
Al abrir el kit se recomienda que la mezcla de reacción se distribuya en viales de PCR de 0,2ml en
volúmenes de 10µl y se congelen a -20°C. Asegúrese de que el contenido del vial esté
completamente descongelado y mezclado antes de distribuirlo.
El ADN de control debe congelarse a -20°C.
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Materiales necesarios pero no proporcionados
Generales
Consumibles de laboratorio: guantes, tubos de microfuga con tapón de rosca, viales PCR de 0,2ml o
placas de microtitulación recomendadas por el fabricante del termociclador utilizado y puntas de
pipeta.
Equipo de laboratorio: pipetas de precisión (2 conjuntos: 1 para pre-amplificación y 1 para post-
amplificación, pipetas de desplazamiento positivo preferiblemente), ropas de protección, agitador
vortex, microfuga, centrífuga de placa de microtitulación de 96 pocillos.
Amplificación por PCR
Termociclador para alojar placas de microtitulación de 96 pocillos o viales de 0,2ml con una precisión
de temperatura de +/-1°C entre 33°C y 100°C y uniformidad de temperatura estática de +/-1°C. Male
Factor Infertility y MFI-Yplus se han validado y demostrado que funcionan de acuerdo con las
especificaciones en las plataformas de termociclador recomendadas siguientes:
GeneAmp 9700 de Life Technologies
Veriti Dx de Life Technologies (funcionando en régimen normal)
Veriti Dx de Life Technologies (funcionando en régimen de simulación 9700)
Proflex de Life Technologies (funcionando en régimen normal)
Proflex de Life Technologies (funcionando en régimen de simulación 9700)
Electroforesis capilar
Electroforesis capilar – polímero POP-7 (Nº catálogo ABI 4352759), 10 tampones analizadores
genéticos (Nº catálogo ABI 402824) y formamida Hi-Di (Nº catálogo ABI 4311320), GeneScan 600v2
LIZ estándar de tamaño (Nº catálogo ABI 4408399) y DS-33 (conjunto de colorantes G5) matriz
estándar (Nº catálogo ABI 4345833).
Analizadores genéticos ABI 3130 y 3500 de Applied Biosystems (con software GeneMapper), matriz
capilar de 36 cm (matriz capilar de 50 cm para analizador genético 3500), placas ópticas de 96
pocillos, septos de 96 pocillos y casetes de 96 pocillos.
Análisis de datos
Se requiere uno de los paquetes de software de análisis de datos siguientes: GeneMapper 3.7
(Applied Biosystems Inc.) o superior o GeneMarker 1.65 (SoftGenetics LLC) o superior.
Documentación adicional del producto Elucigene Male Factor Infertility
Estas Instrucciones de uso incluyen una sección básica sobre la interpretación de los resultados
obtenidos. Una guía de productos Elucigene Male Factor Infertility para la interpretación con
ejemplos y un glosario y guía de software de análisis están disponibles en el sitio web de Elucigene:
http://www.elucigene.com/product-category/reproductive-health/
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Recogida y almacenamiento de muestras
Se han evaluado muestras de sangre entera (EDTA) para su compatibilidad con este ensayo
En ocasiones se ha informado que algunos dispositivos de recogida de muestras son perjudiciales
para la integridad de ciertos analitos y que podrían interferir con las tecnologías utilizadas en algunos
métodos (9). Se recomienda a cada usuario asegurarse de que el dispositivo de recogida de
muestras que selecciona sea utilizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante y que sea
compatible con este ensayo.
Las muestras de sangre deben almacenarse a -20 °C antes de la preparación de ADN. Evite
congelar y descongelar repetidamente.
Preparación de DNA con muestras de sangre entera (EDTA)
Se obtienen resultados regulares con ADN extraído utilizando el QIAamp 96 DNA Blood Kit (o el
QIAamp DNA Mini Kit utilizando proteinasa K), observando el protocolo descrito en el Manual de
QIAamp y comenzando con 200litros de sangre entera líquida y diluyéndola en 200litros de agua
de calidad para biología molecular.
Concentración de ADN
Utilizando las condiciones de la PCR recomendadas y la configuración de inyección de muestras
(consulte la nota en la sección Electroforesis capilar) especificadas en los módulos de ejecución de la
columna capilar, se obtienen regularmente resultados aceptables con la cantidad de ADN introducido
de 15 ng. Sin embargo pueden obtenerse resultados interpretables con un rango de ADN entre 5 ng
y 30 ng introducido.
La cuantificación de ADN es muy importante, la concentración de cada muestra de ADN que va a
ensayarse debe medirse para asegurar resultados óptimos. Técnicas tales como fluorescencia
PicoGreen o absorbancia de UV son aceptables. Debido a la variación en las técnicas de
cuantificación de ADN, el usuario debería considerar las directrices siguientes:
Cantidades muy elevadas de AND introducido aumentarán la probabilidad de que sean etiquetados
los picos de fondo por el software de análisis. Pueden observarse los pasos siguientes para reducir
la probabilidad de que sean etiquetados los picos de fondo.
Diluya la muestra de ADN y vuelva a amplificarla.
Reduzca el tiempo de inyección; consulte la sección Electroforesis capilar.
Aumente el umbral de amplitud de pico mínimo; consulte la Guía del software de análisis CF-
EU2v1 de Elucigene.
Si las cantidades de entrada de ADN son bajas se aumentará la probabilidad de que los picos
diagnóstico sean débiles y que no sean etiquetados por el software de análisis. Pueden observarse
los pasos siguientes para aumentar la señal.
Aumente el tiempo de inyección; consulte la sección Electroforesis capilar.
Vuelva a extraer la muestra y dilúyala en un volumen de agua reducido (50litros).
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Protocolo de ensayo
Procedimiento de amplificación
Nota: para minimizar el riesgo de contaminación, deben observarse los pasos 3 - 5 en una zona libre
de ADN. También deben observarse pasos para evitar la contaminación con el producto PCR.
1. Programe el termociclador para un ciclo de paso único con el fin de activar la polimerasa de ADN a 94°C durante 20 minutos vinculado a un programa de ciclado de amplificación de 1 minuto a 94°C (desnaturalización), 2 minutos a 58°C (recocido) y 1 minuto a 72°C (extensión) para 30 ciclos. Esto debería vincularse a un archivo de tiempo de retardo de 20 minutos a 72°C (extensión) en el ciclo final.
2. En cada ejecución de PCR debe incluirse un control (agua) negativo. También puede
considerarse adecuado incluir otros controles, como p. ej. un control masculino normal
positivo (suministrado por el ADN de control) y un control femenino normal (no suministrado
por el ADN).
3. Descongele suficientes viales de mezcla de reacción de producto Male Factor Infertility
previamente alicuotados (Male Factor Infertility o IFM-Yplus) para el número de muestras y
controles que van a ejecutarse (consulte la nota en Materiales suministrados) y centrifugue
los viales a 12.000 g durante 10 segundos.
4. Utilizando distintas puntas de pipeta, agregue 2,5 µl de ADN de ensayo a un vial de muestra que contenga 10 µl de mezcla de reacción y mezcle mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Haga esto para todas las muestras que van a ensayarse.
5. No agregue ADN al vial de PCR para el control negativo; en lugar de eso agregue 2,5 µl de agua destilada estéril.
6. Centrifugue brevemente los viales hasta que todo el líquido esté en la parte inferior de cada vial.
7. Coloque todos los viales con firmeza en el termociclador. Inicie el programa de activación a
94°C seguido del programa de amplificación (consulte el paso1).
8. Al finalizar el programa de amplificación las muestras pueden almacenarse durante la noche a temperatura ambiente, o a 2-8°C durante un máximo de 7 días antes de proceder a su análisis mediante electroforesis capilar.
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Electroforesis capilar
Se recomienda a cada usuario asegurarse de que el equipo seleccionado sea utilizado de acuerdo
con las instrucciones del fabricante y que sea compatible con este ensayo. En este contexto los
parámetros clave son el polímero y la matriz capilar. Pueden obtenerse resultados óptimos
utilizando las condiciones de electroforesis capilar en el analizador genético ABI3130 o ABI3500.
1. Combine 6,8 µl de estándar de tamaño con 250 µl de formamida Hi-Di y mezcle bien (mezcla suficiente para 16 pocillos). Distribuya 15 µl de la mezcla en el número necesario de pocillos de una placa óptica de 96 pocillos*.
2. Agregue 3 µl de producto PCR de muestra de ensayo a la mezcla de estándar de tamaño (del paso 1) ya distribuido en la placa y mezcle utilizando la pipeta. Selle la placa.
3. Desnaturalice el producto de PCR distribuido en la placa óptica en un termociclador
utilizando los parámetros siguientes: 94°C durante 3 minutos vinculado a 4°C durante 30
segundos.
4. Centrifugue la placa a 1.000 g durante 10 segundos para eliminar las burbujas que pueda
haber en los pocillos y proceda a cargarla en el analizador genético.
*Nota: Es esencial que los pocillos no utilizados (es decir, pocillos no cargados con una muestra de
ADN) todavía estén cargados con formamida Hi-Di para garantizar que los capilares no se sequen.
La configuración de inyección de muestras pueden modificarse para adaptarse a la cantidad de
amplicón producido durante la PCR que puede variar debido a la cantidad de ADN genómico
introducido agregado. Para el análisis puede aplicarse menos amplicón a la columna, reduciendo el
tiempo o la tensión de la inyección. En cambio puede aplicarse más amplicón a la columna de
análisis, aumentando el tiempo o la tensión de la inyección. Las muestras amplificadas previamente
se pueden volver a inyectar varias veces para nuevos análisis.
Análisis de datos posterior a la PCR
ANALIZADOR GENÉTICO ABI3130
La gama de productos Male Factor Infertility se ha diseñado para ser compatible con el producto
CFEU2v1 de Elucigene. Como tales, los productos Male Factor Infertility pueden ejecutarse
utilizando módulos y configuración CFEU2v1 existentes. Por otra parte, el usuario puede crear un
módulo de ejecución de Male Factor Infertility (MFI) de la siguiente manera.
Proceda a crear una hoja de muestra utilizando el software de recogida de datos 3130 con la
configuración siguiente:
• Nombre de la muestra: debe ser el mismo nombre o número específico de la muestra.
• Propietario de ejecución: seleccione el propietario predeterminado para el laboratorio.
• Protocolo de ejecución: MFI (contiene el módulo de de ejecución MFI 3130)*.
*Nota: Es necesario crear un módulo donde se indique la configuración del instrumento y luego
asignar esto a un protocolo de ejecución en el cual se haya seleccionado el conjunto de colorantes
G5. Para obtener más información sobre cómo crear módulos de ejecución, por favor consulte el
Manual de usuario del instrumento.
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MÓDULO DE EJECUCIÓN 3130
PARA EL POLÍMERO POP7
Módulo capilar de 36 cm: MFI
Proceda a crear módulo de ejecución MFI en el gestor de módulos del software de recogida de datos
3130. Asegúrese de que selecciona lo siguiente:
• Tipo: Regular
• Plantilla: FragmentAnalysis36_POP7
• Introduzca los parámetros detallados en la tabla siguiente:
# Nombre del parámetro. Valor Rango
1 Temperatura del horno 60 int 18…65 Gra.C
2 Poly_fill_Vol. 6500 6500…38000 pasos
3 Estabilidad actual 5,0 int 0…2000 uAmps 4 PreRun_Voltage 15.0 0…15 kvoltios 5 Pre_Run_Time 180 1…1000 seg.
6 Injection_Voltage 3,0 1…15 kvoltios
7 Injection_Time 12,0 1…600 seg.
8 Voltage_Number_of_Steps 20 1…100 nk
9 Voltage_Step_Interval 15 1…60 seg. 10 Data_Delay_Time 60 1…3600 seg.
11 Injection_Voltage 15,0 0…15 kvoltios 12 Injection_Time 1200 300…14000 seg.
Nota: El "tiempo de ejecución" requerido variará en función de la temperatura ambiente del lugar en
el cual se ha instalado el analizador genético. Para obtener más información sobre cómo crear
módulos de ejecución, por favor consulte el Manual de usuario del analizador genético 3130 de
Applied Biosystems.
Proceda a crear el protocolo MFI en el gestor de protocolo y asegúrese de que selecciona lo
siguiente:
• Tipo: Regular
• Módulo de ejecución: MFI (consulte el módulo de ejecución más arriba)
• Conjunto de colorantes: G5
Para ejecutar las muestras proceda a crear una hoja de muestra utilizando el gestor de placa y
asegúrese de que se ha seleccionado el protocolo correcto para el instrumento (consulte más arriba).
Nota: Para obtener más información sobre la configuración, funcionamiento y localización de
defectos, por favor consulte el Manual de usuario del analizador genético 3130 de Applied
Biosystems.
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ANALIZADOR GENÉTICO ABI3500
Es necesario crear un protocolo de instrumento MFI que luego puede utilizarse para cada ejecución
de producto Male Factor Infertility.
Proceda a crear el protocolo de instrumento MFI a través de la biblioteca de protocolos del
instrumento 3500.
Asegúrese de que selecciona lo siguiente:
• Módulo de ejecución: FragmentAnalysis50_POP7
• Introduzca la configuración detallada en la imagen siguiente:
Para ejecutar las muestras proceda a crear una placa de muestra haciendo clic en "Create Plate from
Template" (Crear placa desde la plantilla) en la "Dashboard" (Consola) y asegúrese de que se ha
asignado el protocolo de instrumento correcto para MFI (consulte más arriba).
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Configuración de hoja de muestras GeneMarker:
El software GeneMarker permite hacer una comparación entre los datos A y B del mismo individuo.
Para facilitar esto es importante que el nombre del archivo de salida de datos sin procesar (fsa) sea
coherente en todas las muestras y mezclas. La hoja de muestra debe contener el nombre de
muestra único para cada muestra sometida a ensayo con el sufijo _A o _B en función de la mezcla
sometida a ensayo. Si la ID de placa ha de incluirse en el nombre del fsa deberá utilizarse un
formato fijo de cada vez, p. ej., MFI DDMMAAAA.
En el 3130 deben configurarse los parámetros del “destino de resultados”, de modo que el nombre de
la muestra sea incluido en el nombre del fsa, p. ej., MFI DDMMAAAA_1234,5_A_A01.
En el 3500 debe configurarse la convención del nombre del archivo, de modo que el nombre de la
muestra sea incluido en el nombre del fsa, p. ej., MFI DDMMAAAA_1234,5_A_A01.
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ANXYAZFES 001 Junio de 2015 Página 16 de 42
Análisis e interpretación de resultados
Interpretación general de resultados
Los productos PCR se observan como un sistema de etiquetado con 5 colorantes utilizando el
conjunto de filtros G5. El conjunto de filtros G5 detecta los fragmentos etiquetados 6-FAM (azul), VIC
(verde), NED (amarillo) y PET (rojo) además del marcador de estándar de tamaño etiquetado con LIZ
(naranja) en un electroforetograma y en el programa GeneMapper o GeneMarker
http://www.elucigene.com/product-category/reproductive-health/
Nota importante: diferentes combinaciones de instrumentos, polímeros y estándares de tamaño
pueden hacer que el tamaño especificado varíe ligeramente. Durante la validación del kit, el usuario
debe comprobar que la configuración del bin predeterminada dé lugar a un etiquetado de pico preciso
y ajustarlo si es necesario. En caso de cualquier dificultad, por favor póngase en contacto con
Asistencia técnica ([email protected]) para obtener asesoramiento.
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ANXYAZFES 001 Junio de 2015 Página 17 de 42
Directrices de análisis general para todos los productos Male Factor Infertility
1. El control negativo no debe mostrar picos agudos en el rango de lectura de 100 a 550 pb.
2. El control positivo debe mostrar los resultados previstos y todos los picos deben cumplir con
los criterios siguientes.
3. Para el análisis de aneuploidía en muestras de ADN debería observarse por lo menos 1 pico
para cada marcador sometido a ensayo. El rango aceptable para picos de marcador
analizados en el analizador genético 3130 para análisis de aneuploidía y microdeleción es
entre 50 y 6000 unidades de fluorescencia relativa (rfus) y para los analizadores genéticos
3500 es entre 175 y 32000 rfus. Alturas de pico fuera de este rango no deben analizarse.
4. Los electroforetogramas de mala calidad debido a un derrame excesivo entre tonos de
colorante (también llamado "pull-up") o "repuntes electroforéticos" (picos agudos presentes
en más de un colorante) no deben interpretarse. Los productos de PCR deben inyectarse y
analizarse de nuevo.
5. El análisis de aneuploidía se realiza mediante la evaluación de relaciones de pico (A1/A2),
donde A1 es el área del pico del fragmento de longitud más corta y A2 es el área del pico del
fragmento de la mayor longitud. La relación resultante diagnostica el número de copia locus.
Para cromosomas disómicos los marcadores heterocigóticos deben mostrar dos picos con
alturas similares. Un análisis completo del estado del número de copias del cromosoma se
realiza mediante la comparación de las relaciones de las áreas de los picos.
6. Los marcadores dialélicos heterocigóticos (i.e., dos alelos) deben estar dentro de una
relación de 0,8 a 1,4 . Sin embargo, en el caso de dos alelos separadas en más de 24 pb de
tamaño, una relación de hasta 1,5 es aceptable. Cualquiera de los valores comprendidos en
esta región se consideran como que tienen una relación de 1:1. Si el saldo de la relación se
encuentra dentro de esta región puede deberse a una serie de factores, tales como:
Trisomía cromosómica completa (cromosoma sexual)
Trisomía cromosómica parcial (incluyendo duplicaciones submicroscópicas)
Mosaicismo
Segundo genotipo contaminante
Tartamudeos que causan desviaciones
Amplificación preferente de un alelo que causa desviaciones
Polimorfismos de sitio primario
Mutaciones somáticas en los microsatélites
La Guía de interpretación de productos Elucigene Male Factor Infertility, disponible en el sitio
web de Elucigene, ofrece algunos ejemplos de los perfiles típicos de varios de estos factores. Los
marcadores homocigóticos no son informativos porque no se puede determinar una relación.
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Análisis de los marcadores del cromosoma sexual AMEL, TAF9, XHPRT, DXYS218 y SRY
(ensayo Male Factor Infertility):
Para interpretar un resultado de estos marcadores como anormal, se requieren por lo menos dos
marcadores informativos compatibles con un genotipo trialélico con todos los demás marcadores no
informativos. No se recomienda interpretar un resultado como anormal en base a la información
recibida de un solo marcador.
1. El marcador AMEL amplifica las secuencias no polimórficas en los cromosomas X (104 bp) y
Y (110 bp) y puede utilizarse para determinar la presencia o ausencia de un cromosoma Y
ademas de representar la cantidad relativa de la secuencia de X a Y. Por favor observe que
en raras ocasiones se ha informado un fallo de amplificación debido a la mutación de la
secuencia AMEL-Y.
2. TAF9L es un marcador parálogo invariable con secuencias en los cromosomas 3 y X. El pico
específico del cromosoma 3 (116 bp, que representa 2 copias del cromosoma 3) puede así
pues utilizarse como pico de referencia para ayudar a determinar el número de cromosomas
X presentes (pico de 121 bp). Analizado en combinación con amelogenina y los otros
marcadores de cromosomas sexuales, es particularmente útil en el diagnóstico de la
aneuploidía cromosómica sexual. En una mujer normal, los marcadores deben estar dentro
de una relación de 0,8 a 1,4 . En un hombre normal, los marcadores deben estar dentro de
una relación de ≥1,8. Más detalles sobre la interpretación del marcador TAF9L pueden
encontrarse en la Guía de interpretación de productos Elucigene Male Factor Infertility.
3. El marcador STR polimórfico DXYS218 está presente en ambos cromosomas X e Y y
representa el número total de cromosomas sexuales. Para los resultados masculinos
informativos no es posible determinar qué alelo representa el cromosoma X o Y.
4. El marcador informativo específico de X, XHPRT, representa el número de cromosomas X.
5. El marcador específico de Y, SRY, aportará un solo pico en varones normales y no
amplificará en hembras normales.
Análisis de marcadores de microdeleción del cromosoma Y (productos Male Factor Infertility y
MFI-Yplus):
1. Todos los marcadores de microdeleción del cromosoma Y se representan mediante un solo
pico. La pérdida de un pico corresponde a una microdeleción de esa región.
2. El marcador ZFX/ZFY representa secuencias en ambos cromosomas X e Y. El amplicón
generado a partir de ambas secuencias no puede distinguirse por su tamaño; este marcador
aportará un solo pico pese al sexo de la muestra. Este marcador no está diseñado para ser
utilizado como diagnóstico y en su lugar sirve como un control de amplificación.
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Guía de análisis del GeneMapper
Importación y análisis de archivos de productos Male Factor Infertility
1. Abra el archivo del programa GeneMapper
2. Haga clic en para agregar archivos de datos a un proyecto nuevo. Vaya a donde están almacenados los archivos de datos sin procesar .fsa, resalte los archivos de datos pertinentes y haga clic en el botón "Add to List>>".
3. La carpeta de ejecución aparecerá ahora en la ventana "Samples to Add". Al hacer doble clic en el icono de la carpeta de ejecución esta ventana mostrará cada archivo .fsa que se va a importar. Seguidamente se agregan muestras haciendo clic
en en la parte inferior de la pantalla. Los archivos de datos aparecerán ahora en la pantalla principal del GeneMapper (Figura 2)
Figura 2: Muestras listas para agregar al proyecto
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ANXYAZFES 001 Junio de 2015 Página 20 de 42
Importación de la configuración para el análisis del producto GeneMapper en el
gestor GeneMapper
Es necesario importar la configuración del Male Factor Infertility para el GeneMapper. Este proceso
se controla a través de la interfaz "GeneMapper Manager". La configuración de GeneMapper para
el producto Male Factor Infertility está disponible en el sitio web de Elucigene:
http://www.elucigene.com/product-category/reproductive-health/
1. Abra "GeneMapper Manager" haciendo clic en el icono .
2. Seleccione la pestaña "Métodos de análisis" y haga clic en el botón importar.
3. Vaya hasta el (los) archivo(s) de configuración de análisis del producto Male Factor Infertility
(Male Factor Infertility o MFI-Yplus [3130 o 3500]) y proceda a importar el requerido.
4. Informe el proceso seleccionando la pestaña adecuada e importando el archivo
correspondiente para lo siguiente:
Configuración de tabla
Configuración de plot
Estándares de tamaño
Nota: La configuración de plot en grupo, las matrices, los conjuntos de SNP y la
configuración de informe no requieren la importación de archivos.
Nota*: Si los ensayos Male Factor Infertility o MFI-Yplus se están realizando en conjunción con el ensayo Elucigene CFEU2 (fibrosis quística), la configuración del estándar de tamaño CFEU2 puede utilizarse en su lugar.
Importación de la configuración del producto Male Factor Infertility en el Gestor de
panel
Es necesario importar el panel del Male Factor Infertility y MFI Y-plus y la configuración del bin para
el GeneMapper. Este proceso se controla a través de la interfaz "Gestor de panel".
El panel del GeneMapper específico para el producto Male Factor Infertility y los archivos de
configuración del cubo están disponibles en el sitio web de Elucigene:
http://www.elucigene.com/product-category/reproductive-health/
1. Abra el programa del Gestor de panel haciendo clic en el icono .
2. Haga clic en "Panel Manager" en la ventana de navegación izquierda. Gestor de panel aparecerá ahora resaltado en color azul.
3. Seleccione "File/Import Panels". Vaya hasta el panel del GeneMapper Male Factor
Infertility_Panels.txt’ (Figura 4) y proceda a importarlo. Alternativamente, para el MFI-Yplus seleccione MFI Y-plus_Panels.txt.
4. El archivo de panel se visualizará ahora en la ventana de navegación izquierda. Haga clic en
el archivo de panel asegurando que esté resaltado en color azul.
5. Seleccione "File/Import Bin Set". Vaya hasta el archivo del bin GeneMapper "Male Factor Infertility_Male Factor Infertility_ bins.txt’ (Figura 5) y proceda a importarlo. Alternativamente, para MFI-Yplus seleccione MFI Y-plus_ MFI Y-plus_bins.txt.
6. Haga clic en "Apply" y luego "OK".
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ANXYAZFES 001 Junio de 2015 Página 21 de 42
Figura 4: Importación del archivo de panel del ensayo Male Factor Infertility
Figura 5: Importación del archivo de panel del ensayo Male Factor Infertility
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ANXYAZFES 001 Junio de 2015 Página 22 de 42
Modificación del archivo de parámetros de análisis
Puede ser necesario modificar los "Analysis Ranges" predeterminados en la configuración del análisis QST*R para tener en cuenta la variación de condiciones de ejecución. El rango de análisis mínimo dependerá de los capilares y polímeros que se utilicen durante la recogida de datos. Para ver la configuración de análisis actual:
1. Abra "GeneMapper Manager" haciendo clic en el icono .
2. Seleccione la pestaña "Analysis Methods". El archivo del producto Male Factor Infertility importado se mostrará como "Male Factor Infertility Analysis Settings" para Male Factor
Infertility o "Male Factor Infertility Y-plus" para MFI-Yplus.
3. Haga clic en "Male Infertility Panel" para Male Factor Infertility o "Male Factor Infertility Y-
plus" para MFI-Yplus. La fila aparecerá ahora resaltada.
4. Haga clic en el botón "Open" y seleccione la pestaña "Peak Detector" (Figura 6)
Figura 6: Rangos de análisis.
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Para encontrar el rango de análisis correcto para su laboratorio
1. Desde la ventana GeneMapper principal, haga doble clic en la carpeta de ejecución importada para ver la lista de archivos .fsa que contiene.
2. Seleccione un archivo .fsa.
3. Al hacer clic en la pestaña "Raw data" (Datos sin procesar) se visualizará el electroferograma de los datos sin procesar.
4. Usando el primer pico del estándar de tamaño (p. ej., 60 bp de GS600LIZv2) a modo de guía,
seleccione un punto de datos de aproximadamente 100 puntos de datos más largo (Figura 7). Esto determina el punto más bajo en el rango analizable.
5. Asegúrese de que el rango de análisis máximo abarca el mayor pico del estándar de tamaño
(600 bp para GS600LIZv2).
6. Introduzca los valores nuevos en el archivo de análisis (obteniendo acceso al mismo como se describe más arriba).
Figura 7: Localización del rango mínimo utilizando datos de muestra sin procesar
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Análisis de archivos de paneles del producto Male Factor Infertility importados
1. En la ventana GeneMapper principal seleccione "Male Factor Infertility Table Settings" Configuración de tabla de Male Factor Infertility) (Figura 8)
Figura 8 Establecimiento de la configuración de tabla
2. En "Analysis Method" seleccione "Male Factor Infertility Analysis Settings" o "Male Factor Infertility Y-plus" para Male Factor Infertility o MFI-Yplus respectivamente. Rellene cada columna pulsando "Ctrl+D". Repita este proceso seleccionando "Male Factor Infertility" o "MFI Y-plus" bajo el encabezamiento "Panel" y "Male Factor Infertility Size Standard" bajo el encabezamiento "Size Standard" (Estándar de tamaño). Recuérdese de rellenar cada vez pulsando "Ctrl+D" para asegurar que cada ajuste se aplica a la lista completa de muestras.
3. Haga clic en para iniciar el análisis de la muestra. Asigne un nombre de proyecto cuando se lo indiquen.
Revisión de datos del producto Male Factor Infertility
1. Seleccione la muestra para el análisis (resaltando la fila de muestras).
2. Haga clic en para "Display Plots" (Visualizar plots).
3. Seleccione "Male Factor Infertility Plot Settings" (Figura 9) o "MFI Y-plus" de acuerdo con el ensayo que se está analizando.
Figura 9: Menú desplegable de configuración de plot de Male Factor Infertility.
4. La ventana de plot visualizará el perfil de la muestra con los datos tabulados (Figura 10). Un máximo de dos picos para cada marcador serán etiquetados automáticamente por GeneMapper. Si tres alelos están presentes en un marcador, el tercer pico no etiquetado debe etiquetarse manualmente (consulte: Edición manual de perfiles a continuación).
Nota: Los rangos de tamaños de alelos para cada marcador se basan en datos observados previamente. Los raros alelos pueden estar fuera del rango de tamaños de marcados determinados y puede ser preciso ajustar el conjunto de bins en consecuencia.
5. Se recomienda que la ventana de plot tenga activado "Single click editing" (Editar con un solo clic). Para hacer esto seleccione "Alleles/set click editing" y asegúrese de que esta opción esté activada.
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Figura 10: Ventana de plot de muestras visualizando datos de rastreo etiquetados y correlacionando
la tabla de genotipos
Edición manual de perfiles
¡ADVERTENCIA!
GeneMapper sólo asignará etiquetas para un máximo de 2 picos por marcador. Así pues, puede ser necesario editar manualmente los perfiles, i.e., cuando se asignan etiquetas al 3er pico (si está presente) o se retiran etiquetas de picos de tartamudeo. Para agregar una etiqueta de pico, haga clic izquierdo en el pico no etiquetado. Le ofrecerán la opción de agregar un comentario sobre el alelo. Haga clic en "OK". El pico será etiquetado ahora con su tamaño en pares de bases y su área de pico. La tabla incorporará automáticamente el pico nuevamente etiquetado. Para retirar una etiqueta de pico, haga clic izquierdo en la etiqueta del pico. Le ofrecerán la opción de suprimir el comentario sobre el alelo. Haga clic en "OK". La etiqueta de pico se retirará ahora. La tabla retirará automáticamente los datos del pico suprimido Copiado de datos de la tabla
1. Resalte todas las filas con la tabla en la parte inferior de la ventana de plot.
2. Copie las filas seleccionadas utilizando las teclas "Ctrl+C".
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Guía de análisis del GeneMarker
Para agregar filas de muestra al GeneMarker Abra el archivo del programa GeneMarker y seleccione "Open Data" (Abrir datos) cuando se lo indiquen. Aparecerá el cuadro Abrir archivos de datos. Haga clic en el botón "Add". Aparecerá el Abrir diálogo. Vaya al directorio que contiene los archivos de datos sin procesar:
1. Seleccione todos los archivos mediante CTRL+A o use las teclas CTRL y/o SHIFT para seleccionar muestras individuales.
2. Haga clic en el botón "Open" (Abrir) en el Abrir diálogo. Los archivos seleccionados aparecerán en el campo Lista de archivos de datos (Figure 11).
Figura 11: Muestras agregadas a la Lista de archivos de datos.
3. Haga clic en el botón "OK" en el cuadro Abrir archivos de datos y las muestras se cargarán en el GeneMarker. El software abrirá entonces automáticamente la ventana de Análisis de datos sin procesar (Figura 12).
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Figura 12: Ventana de análisis de datos sin procesar
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Importación de la configuración del panel GeneMarker del producto Male Factor
Infertility
Es necesario importar la configuración del Male Factor Infertility para el GeneMarker. Este proceso se controla a través de la interfaz "Panel Editor" (Editor de panel). La configuración del panel GeneMarker para el producto Male Factor Infertility está disponible en el sitio web de Elucigene: www.elucigene.com/product-category/reproductive-health/
1. Abra el "Panel Editor" desde el menú desplegable "Tools" (Herramientas) (Figura 13). Figura 13: Selección del Editor de panel
2. Seleccione "Import Panels" (Importar paneles) desde el menú desplegable "File" (Figura 14)
Figura 14: Importación de paneles
3. Vaya hasta el panel GeneMarker MFI.xml o GeneMarker Y-plus y proceda a importarlo. 4. Repita el proceso según proceda para otros archivos de paneles pertinentes.
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Procesamiento de datos Una vez cargados en el GeneMarker, los archivos de datos sin procesar estarán listos para su procesamiento. El paso de procesamiento incluye la aplicación de un estándar de tamaño, el filtrado de picos ruidosos y la comparación con un panel alélico conocido si se desea. GeneMarker combina todos estos pasos en una simple herramienta llamada "Run Wizard" (Figura 15). Para acceder al Run Wizard (Asistente de ejecución) simplemente haga clic en el icono "Run Project" (Ejecutar proyecto) en la barra de herramientas principal.
Run Wizard – Creación de una Plantilla de ejecución Es necesario crear una plantilla de ejecución la primera vez que se utiliza este software para analizar los datos del producto Male Factor Infertility. Esto se hace a través del Run Wizard:
1. Para acceder al Run Wizard simplemente haga clic en el icono "Run Project" en la barra de herramientas principal.
2. Asignación de un Nombre de plantilla, p. ej., QSTR.
3. Seleccione el Panel, Estándar de tamaño, Color estándar y Tipo de análisis como se muestra en la Figura 15 siguiente.
4. Haga clic en "Save" para guardar la plantilla para análisis futuros.
5. Haga clic en "Next" para continuar.
Figura 15: Run Wizard – Ventana de selección de plantilla
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Run Wizard – Procesamiento de datos
La ventana de Procesamiento de datos del Run Wizard permite al usuario seleccionar los parámetros de filtrado de picos.
1. Seleccione la configuración de análisis adecuada en la ventana de Procesamiento de datos como se muestra en la figura siguiente (Figura 16).
2. Haga clic en "Next" para continuar.
Nota: La configuración del rango de análisis dentro del arco de análisis de datos sin procesar variará dependiendo del polímero utilizado en la recogida de datos. El operador debe seleccionar un valor de punto de datos de inicio que incluya el pico del estándar de tamaño de 60 bp.
Figura 16: Run Wizard – Ventana de procesamiento de datos
Nota: Para datos 3500, aumente la intensidad mínima a 150
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Run Wizard – Configuraciones adicionales
No se requieren configuraciones adicionales (Figura 17).
1. Haga clic en "OK" para continuar.
Figura 17: Run Wizard – Configuraciones adicionales
Cuadro de procesamiento de datos
Después de hacer clic en "OK" en el cuadro Configuraciones adicionales de Run Wizard, aparecerá el cuadro de Procesamiento de datos (Figura 18). Los datos sin procesar se procesan y dimensionan, tras lo cual se aplican los parámetros de filtrado y el panel seleccionado.
1. Haga clic en "OK" en el cuadro de Procesamiento de datos cuando se completa el análisis. Figura 18: Cuadro de procesamiento de datos
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Ventana de análisis principal
La disposición de la ventana de análisis principal (Figura 19) del GeneMarker es fácil de usar. Esta disposición incluye:
La lista de archivos de muestras, que aparece en la parte izquierda de la ventana.
La imagen de gel sintético, que aparece en la parte superior de la ventana.
El electroferograma de datos, debajo de la imagen de gel.
Una tabla de informes, que aparece en la parte derecha de la ventana En esta ventana es importante verificar que todos los picos apropiados en cada perfil se han decidido correctamente.
1. Haga doble clic en cada muestra por turno en el árbol de archivos de muestras situado en la parte derecha de la pantalla. Haga clic derecho en cualquiera de los picos en cuestión y elija las opciones en el cuadro de diálogo, p. ej., editar o suprimir alelo, confirmar o anular según proceda.
2. Desde la ventana de Análisis principal seleccione el menú desplegable "Applications" en la parte superior de la pantalla. Seleccione "Trisomy Analysis". Seguidamente se abrirá el cuadro de configuración de Trisomy Analysis (Análisis de trisomía) (Figura 20).
Figura 19: Ventana de análisis principal
Figura 20: Cuadro de configuración de Análisis de trisomía
Nota: Para datos 3500 aumente la intensidad mínima a 150
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Configuración de Análisis de trisomía Dentro del cuadro de configuración del Análisis de trisomía hay dos pestañas disponibles:
1. Pestaña de análisis. 2. Pestaña de plot de estadísticas.
Pestaña de análisis La pestaña de análisis ofrece opciones de configuración de umbral para el análisis de trisomía. Asegúrese de seleccionar "BPG" en el cuadro de análisis tras lo cual aparecerán las configuraciones siguientes:
Altura de pico 50: Debe decidirse una altura mínima de 50 para los picos. (150 si se utilizan datos 3500)
Relación de altura al 30%: Máximo porcentaje del pico principal; el segundo pico debe alcanzarse para poder identificar dos alelos.
Cuantificación por área de pico.
Longitud menor/longitud mayor seleccionada
Los umbrales de la relación de trisomía son 0,80 – 1,40.
Aplique Corrección lineal no seleccionada.
Haga clic en "OK"
Ventana de análisis de trisomía La ventana de análisis de trisomía (Figura 21) permite al operador examinar los datos de la muestra de aneuploidía, visualizar la relación de picos para cada marcador y acceder al informe del GeneMarker. Hay una serie de pantallas que ayudan al operador en el análisis de datos: Estas son:
Lista de muestras
Electroferograma
Plot de relación
Tabla de informes
Por favor tenga en cuenta que el análisis de trisomía no se requiere para los datos de microdeleción del cromosoma Y. Figura 21: Ventana de análisis de trisomía
Para obtener información más detallada sobre las características del análisis de trisomía y su uso, consulte el Manual de GeneMarker.
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Informe de GeneMarker GeneMarker incluye una plantilla de informe compatible con el kit Elucigene Male Factor Infertility (esta función no es necesaria cuando se analizan los datos del ensayo IFM-Yplus). Para acceder al informe haga clic en el icono 'Print' (Imprimir) en la barra de herramientas situada en la parte superior izquierda de la ventana de análisis de trisomía.
Con esto se abrirá la ventana de configuración de impresión de trisomía (Figura 22).
Ventana de configuración de impresión de trisomía La configuración de impresión de trisomía especifica las opciones para incluir y visualizar datos de muestras en el informe del GeneMarker. Seleccione las opciones como se muestra en la Figura 22. Asegúrese de que "Custom Size Range" (Rango de tamaño personalizado) se selecciona en 98 bp (Inicio) y 600 bp (Fin). Figura 22: Ventana de configuración de impresión de trisomía.
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Previsualización del informe de GeneMarker
Haga clic en "Preview" (Previsualizar) para ver el informe de GeneMarker (Figura 23). Desde esta ventana el operador puede examinar e imprimir cada dato de pico de muestra procedente de todos los marcadores, ofreciendo un sencillo informe de muestra de una o dos páginas. Figura 23: Informe de GeneMarker
El informe de GeneMarker incluye las características siguientes:
Cabecera del informe: Contiene información acerca del análisis, proyecto, muestra y parámetros.
Cuadro de la firma: Espacio para la fecha y las iniciales de los revisores.
Electroferograma: Similar a la ventana de análisis de trisomía y visualiza todos los tonos de colorante del trazo de muestra.
Tabla de informes: Visualiza los valores de pico y marcador de la muestra actual. Los resultados de la trisomía se resaltan en color gris. Se incluye una columna adicional para las iniciales del revisor.
Plot de relación corregida: Contiene todos los puntos del plot del conjunto de datos para todos los marcadores en el tono del colorante. Las formas de los símbolos representan marcadores diferentes que pueden descifrarse en la fila "Symbol" (Símbolo) situada en la Tabla de informes. Los símbolos resaltados en color amarillo representan los puntos de datos de la muestra actual. Los símbolos resaltados en color rojo representan los resultados de la trisomía.
Nota: El plot de relación corregida aparece en la segunda página para cada muestra sólo cuando se selecciona plot de relación en el cuadro Configuración de informes Impresión de trisomías.
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APÉNDICE 1: Etiquetas de colorantes
Los marcadores se etiquetan como se indica a continuación:
Male Factor Infertility
NED VIC
sY84 AMEL
sY86 TAF9L
sY127 SRY
sY134 XHPRT
sY254 DXYS218
sY255
ZFX/ZFY
MFI-Yplus
6-FAM
SY82
SY83
SY88
SY105
SY121
SY143
SY153
SY160
SY1182
SY1191
SY1291
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APÉNDICE 2: - Tabla de ubicación de marcadores, Heterocigosidad observada, Rango
de tamaños de alelos
Male Factor Infertility
Marcador Ubicación Heterocigosidad
observada*
Rango de bins
(bp)
Tono del colorante
del marcador
AMEL Xp22.22/Yp11.2 n/a 102.5/112.5 verde
TAF9 3p24.2/Xq21.1 n/a 113/122.5 verde
SRY Yp11.31 n/a 240-252.5 verde
XHPRT Xq26.2 0.72 260.5-304.5 verde
DXYS218 Xp22.32/Yp11.3 0.74 367,5-402.5 verde
SY84 Yq11.1 (221) n/a 323-333 amarillo
SY86 Yq11.1 (221) n/a 312-322 amarillo
SY127 Yq11.223 n/a 267-277 amarillo
SY134 Yq11.223 n/a 297-308 amarillo
SY254 Yq11.1 (223) n/a 375-386 amarillo
SY255 Yq11.1 (223) n/a 118-128 amarillo
ZFX/Y Xp22.11/Yp11.2 n/a 485-495 amarillo
MFI-Yplus
*Las heterozigosidades observadas se basan en el número de alelos observados con el panel de
pruebas de diagnóstico Elucigene. Por consiguiente, es posible que estas cifras discrepen de los datos
publicados y que también varíen en función de la población sometida a ensayo.
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Ubicación de los marcadores STS de microdeleción del cromosoma Y utilizados para
los productos Male Factor Infertility
Región
Marcador STS Inicio de STS Fin de STS
AZFa SY82
AZFa SY84
AZFa SY86
AZFa SY1182
AZFa SY88
AZFb SY105
AZFb SY121
AZFb SY127
AZFb SY134
AZFb SY143
AZFc gr/gr SY1191
AZFb SY153
AZFc SY254
AZFc SY254
AZFc SY254
AZFc SY254
AZFc gr/gr SY1291
AZFb SY153
AZFc SY254
AZFc SY254
AZFc SY254
Terminal SY160
Las coordinadas de genomas fueron recuperadas de MSY Breakpoint Mapper
(breakpointmapper.wi.mit.edu) basado en NCBI Build 38
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APÉNDICE 3: Perfil de GeneMapper
Perfil masculino normal de GeneMapper mostrando las posiciones relativas de los marcadores
detectados por Male Factor Infertility.
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Perfil masculino normal de GeneMapper mostrando las posiciones relativas de los marcadores
detectados por MFI-Yplus.
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Características de rendimiento
Validación interna
24 Muestras de ADN (extraído de sangre entera) se sometieron a un ensayo ciego vía el Elucigene
Male Factor Infertility. 1 muestra no pudo amplificarse lo cual fue asociado a una baja concentración
del ADN y calidad. De los que obtuvieron resultados interpretables 9 fueron normales, 2 mostraron
una microdeleción en la región AZFa, 6 microdeleciones en AZFc y 6 mayores deleciones que
afectaron tanto a AZFb como a AZFc (AZFbc). Todos los resultados analizables mostraron 100% de
especificidad y sensibilidad con resultados obtenidos anteriormente mediante un método establecido
alternativo.
Pruebas de extensión mediante el ensayo Elucigene MFI-Yplus confirmaron la presencia de estas
microdeleciones Y, así como la detección de un número de subdeleciones tales como deleciones
gr/gr (AZFc parcial) en 2 muestras de tipo natural, una deleción AZFa parcial en una muestra AZFbc
y pérdida del marcador SY160 terminal en 5 muestras AZFbc que indicaron una deleción Yq terminal
mayor.
Validación externa
25 muestras se sometieron a ensayo en un sitio externo mediante el uso de Elucigene Male Factor
Infertility. 20 de estas muestras se ensayaron como varones. De estas muestras, 12 se sometieron a
ensayo como de tipo natural para la microdeleción del cromosoma Y, 2 resultaron positivas para
microdeleciones AZFa, 1 para AZFb, 1 para AZFc, 3 para AZFbc y 1 para una microdeleción AZFabc.
Todos los resultados analizables mostraron 100% de especificidad y sensibilidad con resultados
obtenidos anteriormente mediante un método establecido alternativo.
Una muestra parecía demostrar pérdida del pico SY86 (marcador de región AZFa) mientras exhibía 2
picos en el marcador SY134 (marcador de región AZFb). Este resultado probablemente es
consecuencia de una pequeña deleción (aproximadamente 19 bp) que afecta al amplicón SY86 y que
da lugar a la migración de este producto de PCR al vecino bin de marcador SY134 en la
electroforesis capilar (consulte la Guía de análisis para un ejemplo).
Limitaciones aplicables al procedimiento
Este ensayo ha sido diseñado para detectar aneuploidías del cromosoma sexual, así como
deleciones específicas del cromosoma Y como se detalla en las Instrucciones de uso. Puede que no
detecte reajustes estructurales de cromosomas sometidos a ensayo y no podrá detectar
anormalidades en otros cromosomas cualesquiera. Puede que no se detecte el mosaicismo para los
cromosomas sometidos a ensayo.
Nota: Las heterozigosidades de los marcadores utilizados provinieron de un conjunto aleatorio de
muestras presentadas para análisis rutinarios de una población predominantemente caucásica del
norte de Europa. Los cálculos basados en estas heterozigosidades se aplican estrictamente a la
población de la cual se tomaron las muestras. Un pequeño estudio con muestras obtenidas a nivel
local puede realizarse como parte de un estudio de validación para establecer las heterozigosidades
en la población que se va a someter a ensayo. No se espera que la diversidad de la población altere
de manera significativa la capacidad informativa general del ensayo.
Más detalles de los productos Elucigene están disponibles en:
http://www.elucigene.com
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