Pruebas Bioquímicas
1 - Prueba de la Catalasa:
Fundamento: Investigar la presencia en el microorganismo de la
enzima catalasa capaz de descomponer el peroxido de hidrógeno o
agua oxigenada (H2O2) en H2O y O2, que se desprende en forma
de burbujas en el medio.
Técnica: Con un palillo de madera estéril recoger el centro de una
colonia pura de Agar y colocarla sobre un portaobjeto limpio, luego
agregarles 2 a 3 gotas de peroxido de hidrógeno.
Es util para la identificación de los genéros.
Staphylococcus (+)
Srreptococcus (-)
Negativo Positivo
Streptococcus Staphylococcus
Prueba de la catalasa
2 – Prueba de la Coagulasa:
Fundamento: Comprobar la facultad de un microorganismo de
coagular enl plasma por acción de la enzima coagulasa, con
actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el
fibrinogeno en fibrina, provocando la formación de un coagulo
visible.
Tecnica: Tomar una colonia del agar, pasar al caldo soya y
dejarla en la estufa.
Reacción Positiva: SE considera positiva ante cualquier grado
de coagulación dentro del tubo.
Reacción Negativa: Ausencia del coagulo tras 24 – 48 hrs de
incubación.
Es útil para diferenciación de:
S. aureus (+)
S. epidermidis (-)
S. saprophyticus (-)
Coagulasa Positiva Coagulasa negativa
Prueba de la Coagulasa
3 - Prueba DNAsa
Fundamento: Se basa en la presencia de la enzima termoestable DNAsa que
es capaz de clivar los enlaces fosfodiester internos de la molécula de DNA. Se
utiliza un medio sólido que contiene verde de metilo el cual se combina con
DNA altamente polimerizado. Cuando la combinación no ocurre, por acción de
la enzima DNAsa, se produce una decoloración del medio.
Interpretación de resultados: La formación de un halo transparente alrededor
de la siembra indica presencia de DNAsa.
Permite diferenciar S.aureus que es la única especie dentro del Género
Staphylococcus que posee DNAsa de las otras especies.
4 – Prueba D- Manitol Salado Agar
Fundamento
Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta
concentración salina. Los Staphylococcus coagulasa positiva
hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen
rodeadas de una zona amarilla brillante. Los Staphylococcus
coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona
roja o púrpura.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y
se visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona
del mismo color.
Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan
como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o
púrpura
Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el
manitol
Prueba de Manitol sal
5 – Prueba de Trehalosa
6 – Prueba de Sacarosa
Para ambas pruebas su fundamento es muy parecido al de la
Prueba de Manitol; ya que se mide la capacidad de la bacteria
de fermentar un carbohidrato generando compuestos acidos que
torrnan el medio amarillo
7 – Prueba de la Urea:
Fundamento: Mide la capacidad que tienen algunas bacterias para producir
ureasa la cual es una enzima que hidroliza la urea originando amonio lo que
producirá un incremento del pH que puede detectarse con un indicador; como
indicador de pH utiliza Rojo Fenol.
La positividad se evidencia por un color Fucsia
8 – Prueba de Arginina, lisina
Fundamento: Mide la presencia en las bacterias de las enzimas descarboxilasas
que remueven una molécula de dióxido de carbono de un aminoácido para formar
aminas reactivas alcalinas.
Interpretación:
Inicialmente la bacteria metaboliza una pequeña cantidad de glucosa del medio
para producir ácidos mixtos, esto genera un cambio a color amarillo en el indicador
púrpura de bromocresol, posteriormente estos ácidos son desaminados,
alcalinizándose el medio y tomándose de nuevo el color original: morado.
9 – Prueba de MIO: Medio Semisólido Morado
(Motilidad, Indol, Ornitina)
Motilidad: Permite distinguir la movilidda de algunas bacterias la cual es
consecuencia de la presencia de Flagelos.
Interpretación de Resultados:
Turbidez Positivo
Sin Turbidez Negativo
Producción de Indol: Determina la capacidad de una bacteria para
hidrolizar el triptófano mediante la triptofanasa, liberando indol, ácido pirúvico
y amonio.
Interpretación de resultados:
El medio contiene triptófano y la liberación de indol por acción de la enzima
se detecta por la aprición de un anillo de color rojo después de agregar una
solución del Revalador Kovac.
Indol
Kovacks
o de
Erlich
Se emplea para detectar la presencia de la enzima triptofanasa en bacterias,
que degradan el aminoácido triptófano a indol
Descarboxilación de Ornitina: Si la bacteria es capaz de
producir la enzima descarboxilasa, va a transformar la ornitina en
putrescina.
Interpretación de los resultados:
Morado Positivo
Amarillo Negativo
10-Sensibilidad a la Novobiocina
Fundamento: Varias especies del género Staphylococcus son
resistentes a la novobiocina (disco de 5 μg).
Procedimiento: Se siembra una placa de agar MH con un hisopo
embebido en una suspensión de la cepa a estudiar. Luego se
aplica el disco de novobiocina y se incuba a 35º por 18 horas.
Permite diferenciar S. saprophyticus (resistente a la
novobiocina) de los demás estafilococos coagulasa
negativos
Interpretación de resultados: nos permite distinguir en el
laboratorio entre las siguientes dos especies de estafilococos
Staphylococcus saprophyticus y Staphylococcus epidermidis. S.
saprophyticus es resistente a la novobiocina y mientras que S.
epidermidis es sensible
Prueba de la catalasa
Negativo
Streptococcus
hemolítico Gamma-hemolítico
Alfa-hemolítico
11 - Sensibilidad a al Optoquina
Fundamento: Se basa en la sensibilidad de
S.pneumoniae a una concentración menor o igual a
5μg/ml de hidroxicuprina (optoquina).
Procedimiento: Estriar un cuadrante de una placa de
agar sangre en varias direcciones con una suspensión Mc
Farland 0,5. Colocar luego un disco de optoquina en el
centro del área estriada. Incubar 18-24 horas a 37ºC.
Interpretación de resultados: Halos de inhibición
mayores de 14mm son característicos de S.pneumoniae
12- Sensibilidad a optoquina y sensibilidad a bacitracina se realizan
igual
Streptococcus pneumoniae (sensible) , Soluble en bilis,
Prueba de la Optoquina
5μg/ml de hidroxicuprina (optoquina).
Halos de inhibición mayores de 14mm
13 – Prueba de la Bilis Esculina:
Fundamento:
Está basada en la capacidad de ciertas bacterias,
partucularmente los estreptococos del grupo D, de hidrolizar la
esculina en presencia de bilis al 1 o 4%. La esculina es,
químicamente, un derivado de la cumarina.
Interpretación de los resultados:
La positividad se debe a un precipitado Negro
13 – Prueba de la Bilis Esculina:
14 – NaCl al 6,5%
Fundamento: Se basa en la capacidad de los
enterococos de crecer en una concentración de 6,5% de
NaCl. Se trata de un medio de cultivo líquido que
contiene además de NaCl, glucosa y un indicador de pH:
púrpura de bromocresol.
Interpretación de Resultados:
Positivo
turbidez con o sin acidificación
del medio, que se observa como un viraje de color del
púrpura al amarillo
.15- Susceptibilidad a la Bacitracina:
Fundamento:
Los estreptococos del grupo A pyogenes son inhibidos por una baja
concentración de bacitracina (0,02 a 0,04 unidades) en discos de papel
colocados en agar sangre, pero la mayoría de los otros estreptococos no lo
son. 5-15% de estreptococos susceptibles a la bacitracina no
pertenecientes al grupo A Mac Faddin habla que se reporta sensible
cualquier zona alrededor del disco
Susceptibilidad a la Bacitracina 0,02 a 0,04 unidades
Bacilos Gram negativo no
Fermentadores
Colonias lactosa negativas
Prueba de la Oxidasa
Positivo
Bacilos Gram negativo no
Fermentadores
1- Prueba de Oxidasa:
Fundamento:
Presencia del citocromo C oxidasa en ,la cadena de trasporte de e –
puede detectarse utilizando un aceptor de e – artifisial p- fenilendiamina.
Este test para deferenciar pseudomonas (positivo) de enterobacterias
(negativo)
Prueba de la Oxidasa
Positivo
2 – Prueba O-F (oxidación-fermentación)Of – glucosa,Of –
Xilosa, Of – Maltosa
Fundamento:
En condiciones anaerobias las bacterias pueden oxidar la glucosa hasta CO2
gas. El oxígeno es el aceptor final de e – en el metabolismo respiratorio. En
condiciones anaerobicas en ausencia de un aceptor de e- como nitrato, las
bacterias sólo pueden utilizar la glucosa por vía fermentativa. En este test se
evalúa la capacidad de las bacterias para oxidar y/o fermentar produciendo ácido
que se detecta gracias al azul de bromotinol (indicador de pH) es util en lña
distinción de Pseudomonas y Enterobacterias.
Técnica
Se inoculan tubos de medio con asas de punta recta. Uno de los tubos se
recubre con aceite de parafina para aislarlo del oxígeno (tubo de fermentación) y
otro no (tubo de oxidación)
Se usan dos tubos con un medio semisólido con un indicador de pH y un hidrato
de carbono (se pueden investigar varios, aunque si no se especifica, se entiende
que es glucosa).
Positvidad Color Amarillo
OF-Glucosa
Fermentativo control Oxidante
azul de bromotinol (indicador de pH)
Bacilos Gram negativo Fermentadores
1 – Prueba de Kliger
Fundamento:
Permite detectar producción de ácido y gas a partir de la fermentación
de la glucosa y la lactosa.
Técnica:
Punción y estrías
Reacciones:
Bisel alcalino (rojo)/ taco acido (amarillo): la bacteria fermenta
glucosa, no fermenta lactosa.
Bisel acido (amarillo/ taco acido (amarillo): la bacteria fermenta la
glucosa y la lactosa.
Bisel alcalino (rojo) taco alcalino (rojo): las bacterias no fermentan la
glucosa ni lactosa, es característico de los no fermentadores.
K: alcalino (color rojo) A: Acido (color amarillo)
Kliger
Kliger
A
B
tiosulfato sódio
Rojo Fenol
2 – Prueba de Citrato:
Fundamento
Este medio indica la capacidad de las bacterias de
metabolizar el citrato. Contiene citrato como única fuente
de carbono, fosfato de amonio como única fuente de
fosfato y azul de bromotimol como indicador de pH
Interpretación de los resultados:
Azul Positivo
Verde Negativo
Citrato
Contiene citrato como única fuente de carbono, fosfato de amonio
como única fuente de fosfato
azul de
bromotimol
3 – Prueba de Fenilalanina:
Fundamento:
La formación de la enzima desaminasa está condicionada por la alcalinidad
del medio. La fenilalanina es desaminada a ácido fenilpirúvico,
produciéndose una coloración verdosa al agregarse el reactivo.
Revelador CLORURO FERRICO
Interpretación de resultados:
Positivo Verde Oscuro
fenilalanina
negativo
positivo
cloruro férrico
4 – Prueba de Rojo de Metilo y Voges Proskauer:
Fundamento:
Las bacterias pueden metabolizar el piruvato formado a partir de la
fermentación de glucosa por dos vías: la vía ácido mixta y la vía del
butilenglicol.
Revelador Rojo de metilo
Revelador KOH al 40%
Rojo de Metilo
fermentación ácido-mixta: productos finales son ácidos orgánicos
(fórmico, acético, láctico y succínico) y etanol
Voges Proskauer
fermentación butilén glicólica: productos finales son compuestos neutros
como el butanodiol y el etanol, produciéndose acetoína como intermediario.
KOH y alfa-naftol