Date post: | 23-Jun-2015 |
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MC MARISOL CASTILLO MORALESMC MARISOL CASTILLO MORALES
CromatografíaCromatografía
Método usado para la separación de los componentes de una muestra.
Técnica Cromatográfica
Fase Móvil
Fase Estacionaria
Interacción
Ciencia de las separaciones.
Cromato= ccoolloorr/ Grafos= Escritura
separación
AntecedentesAntecedentes
En los tiempos de Aristóteles se utilizaban los efectos absortivos de distintas tierras para tratar el agua de mar.
Sin embargo fue documentada por primera vez por el científico Ruso Tsweet en 1903-1906.
En el cual los componentes son En el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras las cuales es estacionaria, mientras
que la otra es móvil. La fase que la otra es móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un estacionaria puede ser un sólido o un líquido soportado en un sólido o en líquido soportado en un sólido o en
un gel (matriz). Mientras que la móvil un gel (matriz). Mientras que la móvil es un solvente.es un solvente.
Sólido Líquido
G a s
Sólido Liquido
Fluido Supercrítico
Sólido Líquido
Líquido
Modos de crom a togra fía
Sólido
F aseNorm al
F aseReversa
F ase unida Int. Iónico
Exc lus iónpor T am años
Perm eac iónpor G e l
Exc lus ión
C olum na
C apa F ina Pape l
Planar
C rom atogra fíade L íquidos
TIPOS DE CROMATOGRAFÍA
Los métodos cromatográficos son Los métodos cromatográficos son de dos tipos fundamentales:de dos tipos fundamentales:
Cromatografía en columna:Cromatografía en columna:
La fase estacionaria se mantiene La fase estacionaria se mantiene dentro de un tubo angosto y la dentro de un tubo angosto y la fase móvil se hace pasar por el fase móvil se hace pasar por el tubo con presión o por gravedadtubo con presión o por gravedad
Cromatografía planaCromatografía plana
La fase estacionaria esta sujeta por La fase estacionaria esta sujeta por una placa plana en los poros de una placa plana en los poros de un papel. En este caso la fase un papel. En este caso la fase móvil se mueve a través de la móvil se mueve a través de la fase estacionaria por acción fase estacionaria por acción capilar por la influencia de capilar por la influencia de gravedad.gravedad.
las retenciones mencionadas pueden las retenciones mencionadas pueden tener su origen en dos fenómenos de tener su origen en dos fenómenos de interacción que se dan entre las dos interacción que se dan entre las dos
fases y que pueden ser :fases y que pueden ser :La adsorciónLa adsorciónLa absorciónLa absorción
AdsorcionAdsorcion
LaLa adsorción adsorción, , que es la retención de que es la retención de una especie química por parte de los una especie química por parte de los puntos activos de la superficie de un puntos activos de la superficie de un sólido quedando delimitado el fenómeno sólido quedando delimitado el fenómeno a la superficie que separa las fases o a la superficie que separa las fases o superficie interfacial.superficie interfacial.
El sólido adsorbe al componente que inicialmente estaba en fase El sólido adsorbe al componente que inicialmente estaba en fase móvil (liquida o gaseosa) (Fuerzas de Van der Waals). Si una móvil (liquida o gaseosa) (Fuerzas de Van der Waals). Si una mezcla de sustancias disuelta en una fase se pone en contacto con mezcla de sustancias disuelta en una fase se pone en contacto con otra fase, las sustancias se concentran más o menos en la superficie otra fase, las sustancias se concentran más o menos en la superficie de la otra fase; esto se llama adsorción.de la otra fase; esto se llama adsorción.
CROMATOGRAFIA DE ADSORCION LÍQUIDO-GAS:CROMATOGRAFIA DE ADSORCION LÍQUIDO-GAS:
La fase fija es un liquido y la fase móvil un gas.La fase fija es un liquido y la fase móvil un gas.
o CROMATOGRAFIA DE ADSORCIÓN SÓLIDO-GAS:CROMATOGRAFIA DE ADSORCIÓN SÓLIDO-GAS:
La fase fija es un sólido y la móvil un gas.La fase fija es un sólido y la móvil un gas.
o CROMATOGRAFIA DE ADSORCIÓN SÓLIDO-LÍQUIDO:CROMATOGRAFIA DE ADSORCIÓN SÓLIDO-LÍQUIDO:
La fase fija es un sólido y la móvil un líquido. Es la mas usual, se puede La fase fija es un sólido y la móvil un líquido. Es la mas usual, se puede hacer en columna o en capa fina.hacer en columna o en capa fina.
ABSORCIONABSORCION
2. La2. La absorción absorción, , que es la retención que es la retención de una especie química por parte de de una especie química por parte de una masa, y debido a la tendencia que una masa, y debido a la tendencia que esta tiene a formar mezcla con la esta tiene a formar mezcla con la primera, primera, absorción puraabsorción pura, o a , o a reaccionar químicamente con la reaccionar químicamente con la misma, misma, absorción con reacción absorción con reacción química,química, considerando ambas como un considerando ambas como un fenómeno másico y no superficial.fenómeno másico y no superficial.
METODOLOGIAMETODOLOGIA
Algunos de los métodos cromatográficos Algunos de los métodos cromatográficos son:son:
Cromatografía en papelCromatografía en papel
Cromatografía de capa finaCromatografía de capa fina
La cromatografía en capa fina se basa en la
preparación de una capa, uniforme, de un
adsorbente mantenido sobre una placa de
vidrio u otro soporte.
Cromatografía de intercambio iónicoCromatografía de intercambio iónico
Utilizan este método para separarUtilizan este método para separar
isótopos de Litio y Potasio isótopos de Litio y Potasio
utilizando resinas de zeolita.utilizando resinas de zeolita.
Cromatografía de gel-filtraciónCromatografía de gel-filtración
Fodin y Porath en 1958 descubren
que usando como fase estacionaria
geles se consigue separar polímeros sintéticos de alto peso molecular.
Cromatografía de afinidad. Cromatografía de afinidad.
Ideada por Porath en 1967, usando como fuente un péptido o
proteína unida covalentemente a un
ligando y se utiliza para la separación de
moléculas proteicas.
Cromatografía de gas.Cromatografía de gas.
Es una de las técnicas más utilizadas e importantes,
de forma que ha revolucionado el campo de
la química analítica.
APLICACIÓN APLICACIÓN
La cromatografía es un medio muy eficaz La cromatografía es un medio muy eficaz para responder a las mas variadas para responder a las mas variadas
preguntas que tengan relación con las preguntas que tengan relación con las mezclas químicas. mezclas químicas.
En 1906 Tswett : En 1906 Tswett : Método en el cual los componentes de una mezcla son Método en el cual los componentes de una mezcla son
separados en una columna adsorbente dentro de un separados en una columna adsorbente dentro de un sistema fluyentesistema fluyente..
I.U.P.A.C : I.U.P.A.C :
Método usado principalmente para la Método usado principalmente para la separación de los componentes de una separación de los componentes de una muestra, en el cual los componentes son muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de las cuales distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra es móvil. es estacionaria, mientras que la otra es móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido soportado en un sólido o en un gel líquido soportado en un sólido o en un gel (matriz). La fase estacionaria puede ser (matriz). La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna, extendida en empaquetada en una columna, extendida en una capa, distribuida como una película, etc...una capa, distribuida como una película, etc...
Esta versión instrumental de la Esta versión instrumental de la cromatografía convencional cromatografía convencional
resulta más ventajosa debido a resulta más ventajosa debido a los pequeñísimos volúmenes que los pequeñísimos volúmenes que se necesitan para el estudio en se necesitan para el estudio en
cuestión y los resultados se cuestión y los resultados se obtienen en un tiempo mínimo. obtienen en un tiempo mínimo.
Estos aspectos la hacen preferida Estos aspectos la hacen preferida entre las técnicas de separación.entre las técnicas de separación.
APLICACIONAPLICACION
Se ha convertido en una de las herramientas más poderosas para el químico analista en muy diversos campos de aplicación.
¿Qué es H P L C ?¿Qué es H P L C ?
High Pressure
Liquid Chromatograp
hy
Inicios de la instrumentación
High Performance
Liquid Chromatography
Avance de la instrumentación
Técnica que realiza la separación física de una mezcla de compuestos a través de la interacción selectiva entre los solutos, una fase estacionaria y una fase móvil, haciendo uso de instrumentación automatizada de alta resolución.
¿Qué es H P L C ?¿Qué es H P L C ?
SISTEMA CROMATOGRAFICOSISTEMA CROMATOGRAFICO
La cromatografía de líquidos de alta resolución ( HPLC ) es un método fisicoquímico de separación, basado en elprincipio de la PARTICIÓN.
PARTICIÓN: es el reparto o distribución de los componentes de una muestra entre dos fases: una móvil que es un líquido y una fija que puede ser un sólido o un líquido.
MUESTRAFASE MÓVIL FASE FIJA
líquido sólido o líquido
ColumnaColumna
Es un tubo ordinario de acero inoxidable de Es un tubo ordinario de acero inoxidable de diámetro interno uniforme.diámetro interno uniforme.
EmpaqueEmpaque
TIPOS DE COLUMNASTIPOS DE COLUMNAS
ANALITICASANALITICASLong. 5-30 cm.Long. 5-30 cm.Diámetro interno 2 a 10 mmDiámetro interno 2 a 10 mmTamaño de partículas 2 a 10µmTamaño de partículas 2 a 10µm
PreparativasPreparativasLong. 50 – 100 cmLong. 50 – 100 cmDI desde 5cm DI desde 5cm
Tipos de empaqueTipos de empaque
CROMATOGRAFIA EN FASE REVERSA:CROMATOGRAFIA EN FASE REVERSA: La fase estacionaria es apolar, y la fase móvil polar. La fase estacionaria es apolar, y la fase móvil polar.
Las fases estacionarias han sido obtenidas haciendo Las fases estacionarias han sido obtenidas haciendo reaccionar químicamente los centros silanoles reaccionar químicamente los centros silanoles activos de la sílice con un trialquilclorosilano. activos de la sílice con un trialquilclorosilano.
La retención se produce en esta especie de capa La retención se produce en esta especie de capa líquida depositada químicamente como líquida depositada químicamente como consecuencia de la distinta solubilidad relativa entre consecuencia de la distinta solubilidad relativa entre la fase estacionaria ( apolar) y la fase móvil (polar).la fase estacionaria ( apolar) y la fase móvil (polar).
Los compuestos más retenidos son los más apolares. Los compuestos más retenidos son los más apolares. La retención y La retención y selectividadselectividad se controlan se controlan fundamentalmente con la composición de la fase fundamentalmente con la composición de la fase móvil. Para obtener una fase móvil de fuerza de móvil. Para obtener una fase móvil de fuerza de elución óptima, se ensayan mezclas de metanol, elución óptima, se ensayan mezclas de metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano en agua.acetonitrilo o tetrahidrofurano en agua.
CROMATOGRAFIA EN FASE NORMALCROMATOGRAFIA EN FASE NORMALEn esta cromatografía a diferencia de en fase reversa, la fase En esta cromatografía a diferencia de en fase reversa, la fase
estacionaria es polar y la móvil apolar. Las fases estacionaria es polar y la móvil apolar. Las fases estacionarias se obtienen haciendo reaccionar estacionarias se obtienen haciendo reaccionar químicamente los centros silanoles activos de la sílice con químicamente los centros silanoles activos de la sílice con un trialquilclorosilano. un trialquilclorosilano.
La retención también (como la de fase reversa) tiene lugar en La retención también (como la de fase reversa) tiene lugar en esa especie de capa líquida depositada químicamente, esa especie de capa líquida depositada químicamente, como consecuencia de la distinta solubilidad relativa en la como consecuencia de la distinta solubilidad relativa en la fase estacionaria (polar) y la fase móvil (apolar). Donde el fase estacionaria (polar) y la fase móvil (apolar). Donde el analito menos polar será el primero que se eluye y el más analito menos polar será el primero que se eluye y el más polar el último en eluir.polar el último en eluir.
PARTICIONPARTICION
Es el reparto o distribución de los componentes de Es el reparto o distribución de los componentes de una muestra entre dos fases: una muestra entre dos fases: una móvil que es ununa móvil que es un líquidolíquido y y una fija que puede ser un sólido o un una fija que puede ser un sólido o un líquidolíquido
MUESTRAFASE MÓVIL FASE ESTACIONARIA
sólido o líquido
0.009"
0.020"0.040"
Contribución de la columnaContribución de la columna
BOMBABOMBA
RequisitoRequisitoss6000 psi (lb/in6000 psi (lb/in22))Flujo sin pulsacionesFlujo sin pulsacionesCaudal 0.1 a 10 mL/minCaudal 0.1 a 10 mL/minReproducibilidad del caudalReproducibilidad del caudalComponentes resistentes a la corrosiónComponentes resistentes a la corrosiónTeflón, rubí, zafiro, cerámica, TefzelTeflón, rubí, zafiro, cerámica, Tefzel
TIPOS DE BOMBASTIPOS DE BOMBAS
BOMBA RECIPROCABOMBA RECIPROCA
Bomba de Bomba de desplazamientodesplazamiento
Bomba neumáticaBomba neumática
Sistemas de inyecciónSistemas de inyección
ManualManual
AutomáticaAutomática
DETECTORESDETECTORES
INDICE DE REFRACCIONFRESNELDEFLEXIÓNINTERFEROMETRICO
GENERALES
UVFLUORESCENCIAELECTROQUIMICO
SELECTIVO
DETECTORES
REGISTROREGISTRO
REGISTRADORREGISTRADOR
Señal en un grafico X-YSeñal en un grafico X-Y INTEGRADORINTEGRADOR
Incluye tratamiento matemáticoIncluye tratamiento matemático COMPUTADORACOMPUTADORA
Software que incluye grafico, cálculos y Software que incluye grafico, cálculos y almacenamiento de datosalmacenamiento de datos
En el proceso cromatográfico se obtienen En el proceso cromatográfico se obtienen señales o picos:señales o picos:
Res
pues
ta d
el d
etec
tor
Tiempotr= Tiempo de retenciónt’r= Tiempo de retención ajustado
Inyección
tr
t’r
tm
tm= Tiempo de retención de un soluto no
retenido
CROMATOGRAMACROMATOGRAMA Parámetros principales Parámetros principales
tR
tM
tR’ = tR - tM
TEMPO
SIN
AL
tr= Tiempo de retención
t’r= Tiempo de retención ajustado
tm= Tiempo de retención de un soluto no
retenido
Inyección
h = altura del pico
Wb= Ancho del pico en su base
W1/2 = ancho del pico a la media altura
2/12/1212121
12
21
*176.1
)(
*2
)(Re
bb
rWWt
WW
t
WW
ttRsolución
bb
r
bb
rr
ResoluciónResolución
CROMATOGRAMA Parámetros principales:Platos teóricos
tr
Inyecciónt’r
tmWb
W1/2
2
2/1
2
554.516 Teóricos Platos
Wt
Wt
N r
b
r
NL
HHETP c teóricoplatoun a eqivalente Altura
Lc = Longitud de la columna
CROMATOGRAMA Parámetros principales:Platos teóricos
Ecuación Maestra de la Resolución:
4*
1*
1N
kk
RS
Capacidad Selectividad EficienciaFactor
de retenciónFactor
de separación
PlatosTeóricos
El Proceso CromatográficoEl Proceso Cromatográfico
¿Cómo identificar cada compuesto cuando se tiene una seriede picos en un Cromatograma?
Yo lo sé por el Tiempo de
Retención de los picos de Estándares puros
Tiempo
El Proceso CromatográficoEl Proceso Cromatográfico
¿Cómo sé qué cantidad está presente en la muestra?
Yo lo sé por el área y altura de los picos
Medición del área o altura del pico Cálculo de la concentración del analito
– Normalización Interna– Estándar interno– Estándar externo– Estándar agregado
CuantificacióCuantificaciónn
Estándar externoEstándar externo
Es el método de cuantificación más utilizado en HPLC. Consiste en la preparación de estándares de concentración semejante al analito en la muestra y en el ensayo cromatográfico de ambas, muestra y estándar en las mismas condiciones operativas. Su exactitud depende de manera importante de la calidad del estándar utilizado.
P P = (Am Cs / As) D * 100– Am = Area de la Muestra– Cs = Concentración del estándar– As = Area del Estándar– D = Factor de Dilución
GLOSARIOGLOSARIO
ElectronegatividadElectronegatividad PolaridadPolaridad CromatografiaCromatografia Tipos de cromatografiasTipos de cromatografias Fase movilFase movil Fase estacionariaFase estacionaria BombasBombas ColumnasColumnas
Fase normalFase normal Fase reversaFase reversa Exclusion de tamañoExclusion de tamaño quiralidadquiralidad Parámetros Parámetros
cromatograficoscromatograficos Rs. Rt, Vo, To, N, etcRs. Rt, Vo, To, N, etc