Julio de 2015

Agosto 2015

La revista donde la ciencia se convierte en color

La Industria

farmacéutica

Triglicéridos.

¿buen o mal

análisis?

Las

vitaminas

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La cromatografía en toxicología forense para la detección de drogas.

Moreno Nataly

En la actualidad, el uso de sustanciascon efectos psicotrópicos se haconvertido en un grave problema, noexiste país en el mundo que no se veaafectado de alguna manera por elabuso de sustancias que causandependencia, tanto legales comoilegales. Debido a esto, en muchoscasos se necesita determinar lapresencia de sustancias ilícitas ycuantificarlas. Por ejemplo: control dedoping, pruebas para empleo,supervisión laboral, accidentes detránsito, programas de rehabilitación,en medicina, toxicología, asuntoslegales, ciencias forenses, entre otrasáreas. Por tal razón, es de sumaimportancia el análisis confiable demuestras provenientes de fluidosbiológicos y tejidos, con el propósito deaislar, identificar y cuantificar dichassustancias tóxicas.

La detección de drogas en toxicologíaforense puede realizarse tanto enmuestras post-mortem (muestrasrecolectadas en cadáveres durante laautopsia), como pre-mortem (muestrasobtenidas de individuos vivos).

El método de análisis de sustanciasilícitas, de mayor uso a lo largo de lahistoria, ya que posee una altaselectividad y sensibilidad, pero ademáspermite confirmar la naturalezaquímica de la droga, ha sido lacromatografía de gases (GC) acoplada ala espectrometría (MS), siendo laespectrometría una técnica que se basaen la interacción de la radiaciónelectromagnética con un analito paraidentificarlo y determinar suconcentración.

La cromatografía de Gases

La cromatografía de gases tiene dosimportantes características. Por unlado, posee una gran capacidad paraseparar mezclas orgánicas complejas,compuestos organometálicos ysistemas bioquímicos. Por otro lado, esun eficiente método para determinarcuantitativa y cualitativamente loscomponentes de la muestra.

Para el análisis cualitativo se sueleemplear el tiempo de retención o sea eltiempo requerido para que uncompuesto recorra el sistemacromotográfico, que es único para cadacompuesto dadas unas determinadascondiciones (mismo gas portador,rampa de temperatura y flujo) o elvolumen de retención. En la práctica, elnúmero de variables que deben sercontroladas para obtener valoresreproducibles de tiempos de retención,limita la aplicación de la técnica, es poreso que es necesario recurrir a técnicasno cromatográficas como laespectrometría de masas para lograruna identificación certera.

El análisis cuantitativo se basa enque el área bajo los picos esproporcional a la cantidad decompuesto en la muestra. Sin embargo,se debe tener en cuenta que eldetector no da igual respuesta a lamisma cantidad de diferentescompuestos y es necesario hacercorrecciones y curvas de calibracióncon estándares, para lograr unacuantificación confiable, es decir,integrando las áreas de cadacompuesto, con los calibradosadecuados, se obtiene la concentracióno cantidad presente de cada analito.

Tipos de cromatografía de Gases

• La cromatografía gas-líquido (GLC, gas-liquid chromatography) lleva a cabo laseparación por medio del reparto de loscomponentes de una mezcla química,entre una fase gaseosa que fluye (móvil) yuna fase líquida estacionaria sujeta a unsoporte sólido.

• La cromatografía gas-sólido (GSC, gas-

solid choromatography) utiliza unabsorbente sólido como fase estacionaria.La disponibilidad de detectores versátiles yespecíficos, y la posibilidad de acoplar elcromatógrafo de gases a unespectrómetro de masas o a unespectrofotómetro de infrarrojo, amplíanaún más la utilidad de la cromatografía degases.

Procedimiento para la detección dedrogas

La muestra que contiene la droga yque va a ser analizada es introducida en elpuesto de inyección por un dispositivoautomático o con una microjeringa.

En el puesto de inyección la muestraes vaporizada en forma instantánea ytransportada por la fase móvil hacia lacolumna o fase estacionaria, de acuerdo ala afinidad de cada componente se va alograr la separación.

Los compuestos separados llegan aldetector y los registra por la variación dealguna propiedad según su principio deoperación.

La señal que se produce alimenta unregistrador o una estación de datos y elregistro gráfico obtenido se conoce comocromatograma (cada componente va aestar representado por una banda o picode forma gaussiana).

Para el análisis de drogas, se usandetectores convencionales como: detectorde ionización en llama FID, detector denitrógeno y fósforo NPD y detector decaptura de electrones para derivados ECD.

Se comparan los tiempos de retención

(tR) de las sustancias (drogas) con los delmaterial de referencia (patrones). Lacoincidencia de los tR de los analitos(drogas y sustancias patrón) no es

suficiente para la identificaciónconfirmatoria de la sustancia, pues, para la

confirmación positiva de la misma se debedisponer de un sistema de detecciónespectroscópica. Entre los más usados seencuentra el detector selectivo de masas(MSD), que permite obtener y compararlos espectros de masas de la sustanciaanalizada ydel compuesto patrón.

Las columnas cromatográficas capilaresmás usadas son de 5%-fenil-

poli(metilsiloxano), de 25-30m de longitudy 0,25 mm de diámetro interno. Para las

mezclas complejas de algunas drogas quecontienen principios activos, aditivos,adulterantes, solventes residuales,productos de descomposición o reactivosde partida, se analizan en columnas máslargas (50-60 m) o empleando lacromatografía multidimensional.

Referencias:

https://www.scientiachromatog raphica.com/files/v4n1/v4n1a3.pdfhttps://es.wikipedia.org/wiki/Cromatografía_de_gases

https://www.quiminet.com/articulos/la-cromatografia-de-gases-18302.htmhttps://www.criminalistica.com.mx/areas-

forenses/quimica-forense/183-las-drogashttps://www.icf.gobierno.pr/patologia/toxicologia.php

Las aplicaciones de la cromatografía sonmúltiples y la convierten en una de las técnicasde análisis más poderosa que existe.

Moreno Nataly

La Cromatografía en la Separación de Triglicéridos

Por Daniela Camejo

Los triglicéridos son una de las fracciones lipídicas másabundante y al mismo tiempo más compleja de la naturaleza. Por estarazón, es esencial la determinación de sus especies moleculares, asícomo conocer la posición estereoespecífica en que se sitúan losácidos grasos que los componen, para caracterizar las grasasanimales y los aceites vegetales. La técnica más comúnmente

empleada con este fin es la cromatografía líquida de alta eficacia(HPLC), en general utilizando columnas de fase reversa.

Durante mucho tiempo, el análisis de

trigliceridos por HPLC se llevó a cabo conelución isocrática. Sin embargo, para laseparación de triglicéridos de grasascomplejas, se hace necesaria lautilización de gradientes, que implican lavariación del porcentaje de modificador

orgánico en la mezcla. De este modo, esposible resolver mezclas complejas detriglicéridos, como las del aceite depescado, que contiene ácidos grasospoliinsaturados de cadena larga o comolas de la grasa de la leche con un amplio

rango de valores del Número de Partición(NP; NP = NC - 2 ND, donde NC es elnúmero de carbonos totales deltriglicérido y ND es el número de doblesenlaces situados en los ácidos grasosque componen la molécula). Los sistemas

de gradiente pueden ser lineales o no.Generalmente los no-lineales son los quealcanzan mejores separaciones de parescríticos.

Disolvente de la Muestra

El disolvente de la muestra adquiere granimportancia cuando es necesariosolubilizar triglicéridos con grandesdiferencias de polaridad. Además, eldisolvente debe permitir un correcto

contacto entre el soluto y la faseestacionaria. Se han propuesto comodisolventes aceptables el cloroformo, elhexano y la propia fase móvil,rechazándose otros como la acetonaporque no es adecuada para triglicéridos

saturados de alto peso molecular(Tsimidou y Macrae, 1985).

Fase Estacionaria

Las fases estacionarias de fase reversa oinversa, compuestas por partículas deoctadecilsilano (ODS), la mayoría conforma esférica y soportada enempaquetamientos de sílice, han

demostrado proporcionar la mejorselectividad para triglicéridos, sobre todoaquéllas de menor tamaño de partícula,como son las de 3\xn. Generalmente lalongitud de cadena utilizada no supera los30 cm, ya que se ve limitada por las altas

presiones necesarias y por los elevadostiempos de retención resultantes.

Detectores

Prácticamente todos los detectores

posibles han sido probados y empleadospara el análisis de triglicéridos. Cuandose utiliza elución isocrática, los detectoresde índice de refracción ofrecen resultadossatisfactorios, pero cuando es necesarioaplicar sistemas de gradiente, dejan de

tener utilidad debido a la desmesuradaderiva que producen. Los detectores deultravioleta, son compatibles congradientes, pero no con algunos de losdisolventes más utilizados para separartriglicéridos, puesto que absorben en la

misma región del espectro que éstos(200-230 nm, enlace ester). Además lostriglicéridos tienen coeficientes deextinción molar no uniformes, yconsecuentemente es necesario calcularsus factores de respuesta mediante

patrones para un análisis cuantitativo.

Condiciones operativas óptimas para

el análisis de triglicéridos por HPLC

Fase Móvil

La elección de la fase móvil es uno de losfactores que más influyen en el análisis

cromatográfico de triglicéridos. Desde losprimeros experimentos, se estudió cuálpodía ser la mejor combinación dedisolventes para la resolución de lasespecies moleculares de triglicéridoscuando se empleaban columnas de fase

reversa. Pals (1983), concluyó que elacetonitrilo era el más idóneo para serutilizado como disolvente principal, puestoque con él se alcanzaba la mejorseparación de pares críticos. Mientrasque, Hirano y Takahasi (1996) han

establecido las propiedades de la mezclade elución que deben equilibrarse paralograr la óptima eficacia de la columna,proponiendo que la mezcla debe disolverperfectamente los triglicéridos, peroademás deben ser de bajo peso

molecular y viscosidad.

Con el fin de mejorar la solubilidad de loscompuestos, así como proporcionarcambios en su polaridad, y por lo tanto enla selectividad de los picos

cromatográficos, se añade al disolventeprincipal, un disolvente secundario,denominado modificador orgánico, el máscomúnmente empleado es la acetona,dado que absorbe la luz ultravioleta en lasmismas longitudes de onda que los

trigliceridos (200- 237 nm).

Sin embargo, a' toma generalmente

valores cercanos a 121 y cuando a'=2entonces NEC=NP. Takahashi eí a/.,(1985) calculó el valor de a' con larelación entre log k', NC y ND (), donde elvalor de a' es el cociente entre lasconstantes b' y c'. comportamiento de los

triglicéridos en HPLC en fase inversa noacuosa dependía no sólo del NC y ND,sino también del número de ácidosgrasos insaturados en la molécula (NAI),ya que triglicéridos con igual valor deNEC eluían en orden creciente de número

de ácidos grasos saturadosconstituyentes. De acuerdo a estosresultados, Nájera et al., (1998) hanredefinido el NEC como una función quedepende del NC, ND y NAI, como NEC =NC - 2. ND - 0.2. NAL

El proceso de predicción de lostriglicéridos se hace extremadamentecomplicado a medida que aumenta elnúmero de ácidos grasos constituyentes,ya que el número posible de triglicéridos

se eleva enormemente. Por esta razón, ycomo una segunda parte del proceso depredicción, algunos autores hanpropuesto la aplicación de las ecuacionesdesarrolladas por Takahashi et al.,(1985). Estos autores desarrollaron un

modelo matricial cuyas variables eran NCy ND de cada ácido graso que esterificala molécula de glicerol.

Análisis Estereoespecífico

Para la completa caracterización de unagrasa es necesario no sólo conocercuáles son los ácidos grasos quecomponen sus triglicéridos sino tambiénsaber en qué posición estereoespecíficase encuentran localizados dentro de la

molécula de glicerol, ya que de ellodependen algunas de sus propiedades.

La metodología de análisis por HPLC,

que permite conocer la distribuciónestereoespecífica de los ácidos grasos,utiliza mono y diglicéridos como sustratode análisis, se obtienen tras la hidrólisisde los triglicéridos, que generalmente serealiza mediante la reacción de Grignard.

Los productos obtenidos sonposteriormente analizados por HPLCutilizando columnas de fase normal oreversa. La combinación de este análisisjunto con la composición en ácidosgrasos obtenida por cromatografía de

gases permite el cálculo de las posicionesestereoespecíficas de los triglicéridos deuna determinada grasa. En el primercaso, los 1,2 y 1,3 diglicéridos sederivatizan a (S)-(+)-1-(1-naftil)etiluretanos, mientras que en fase reversa

se derivatizan a 3,5-dinitrofenil uretanos.

Finalmente, la utilización del HPLC enfase quiral presenta moléculas adheridasa la sílice, lo que evita tener que utilizarderivados diasteroisoméricos, se han

encontrado importantes desventajas,como altos tiempos de retención y pobreresolución. Este método separa losdiglicéridos 1,2 de los 1,3, queposteriormente deben ser analizadosmediante cromatografía de gases para

determinar su composición en ácidosgrasos.

Referencias:

•http://laboratoriotecnicasinstrumentales.es/analisis-qumicos/cromatografa-de-gases

•http://www.maph49.galeon.com/biomol2/glycerol.html

•http://grasasyaceites.revistas.csic.

es/index.php/grasasyaceites/article

/viewFile/671/682

La introducción del detector de difusión

de luz evaporative ha propiciado un granavance en la detección de triglicéridos,dado que su respuesta es simplementeproporcional a la masa del analito, estedetector no está limitado por lascaracterísticas espectrales de los

compuestos. Además, ya que losdisolventes son eliminados porevaporación antes de la detección, noprovocan deriva de la línea base.

A pesar de su utilidad, los detectores

descritos tienen la desventaja de laidentificación de los picoscromatográficos, que se evita utilizandocomo detector un espectrómetro demasas. Mediante la combinación de unsistema de HPLC y un espectrómetro de

masas de ionización química a presiónatmosférica se pueden obtener datosrelativos al peso molecular de lostriglicéridos, lo que facilita enormementesu identificación.

Identificación de Especies Moleculares

Dada la dificultad que existe aún hoy endía para disponer de un equipo integradode HPLC-espectrómetro de masas, sehan concebido otros sistemas para la

predicción de la identidad de los picoscromatográficos. La relación lineal entreel factor de capacidad (k') y los valores deNP de los triglicéridos fue establecida porprimera vez por Wada et al., (1977).Posteriormente Herslof et al., (1979),

estimaron teóricamente el NúmeroEquivalente de Carbonos (NEC) paratriglicéridos insaturados, en base a sustiempos de retención relativos, a partir deuna relación lineal experimental entreesos tiempos de retención relativos y el

NC. El NEC da cada triglicérido en lamuestra se define como el NEC deltriglicérido saturado hipotético, quetuviera el mismo tiempo de retención. ElNEC es análogo al NP (NEC=NC - a'ND),con la diferencia de que en este caso el

valor de a' depende de cada sistemacromatográfico.

El análisis de las vitaminas en los alimentos es un grandesafío para los analistas dado que se asocia con problemassignificativos. Muchos de estos problemas han sido eliminadosgracias a los recientes avances en la tecnología y el desarrollo denuevos enfoques analíticos. Todos los antiguos métodos biológicosutilizados para determinar o incluso de mostrar la actividadbiológica de las vitaminas, han sido en la actualidad reemplazadospor métodos microbio-lógicos (EMB). Los métodos físico-químicos,principalmente la cromatografía gas líquido (GLC) y lacromatografía liquida de alta presión (HPLC) han sido aplicadospara solucionar muchos problemas relacionados con el análisis devitaminas.

Laboratorio y equipamientoLas mayorías de las vitaminas son sensibles a la luz y algunas seoxidan muy rápidamente. Por lo tanto, debería evitarse la luz solardirecta y la luz brillante. La iluminación artificial es mejorproporcionadas por tubos fluorescente dorados. En ciertos casos,las diferentes etapas en el procedimiento deberían realizarse enmaterial de vidrio ámbar para prevenir la degradación. Dado quele calor también contribuye a la isomerización o una posterioralteración de las vitaminas, deberían evitarse el calor innecesario.Por lo tanto, debe tenerse cuidado que por ejemplo, laevaporación de los solventes se realice lo más suave posibleutilizando un equipamiento adecuado como por ejemplo unevaporador rotatorio con un buen control de la temperatura, unenfriamientoadecuado de los condensadores y un vacío óptimo.

VITAMINAS LIPOSOLUBLESlas vitaminas A,D,E,K y los carotenoides activos deprovitamina A están siendo determinados principalmenteutilizando HPLC. G.F.M. Ball (4) ha escrito una ampliarevisión de los ensayos de vitaminas liposolubles en alimentos.Los métodos para vitaminas A y E son relativamente fáciles deseguir por analistas experimentados, si se observancuidadosamente las etapas mas criticas. La determinación dela vitamina D y vitamina K es mas difícil básicamente debidoal bajo contenido encontrado en los alimentos.

La vitamina A se utiliza como un nombre genérico paradescribir al retinol, sus esteres y los correspondientesisómeros. La vitamina A se encuentra principalmente enproductos animales tales como la leche, crema, mantequilla,queso, huevos, carne, hígado, riñón y aceite de hígado debacalao. Por lo general, se encuentran como esteres de ácidosgrasos de cadena larga pero también se encuentra comoretinol. Los alimentos son fortificados normalmente conesteres de retinol tales como acetato, palmitato o propionatoutilizando formulaciones especiales que mejoran laestabilidad.

Método Cromatográficoprimeramente se determinaba la vitamina A mediante unareacción colorimétrica de retinol con tricloruro de antimonio(reacción de Carr-Price). El retinol obtenido después desaponificar y extraer los componentes no saponificables tieneque ser purificado utilizando cromatografía de columnaabierta con el fin de eliminar los componentes interferentes.La HPLC se ha convertido en la actualidad en el método deelección dado que esta técnica acorta considerablemente elprocedimiento del análisis y aumenta la reproducibilidad yexactitud. Principalmente pueden utilizarse dos modos decromatografía (fase normal y fase reversa) para lacuantificación de la vitamina A.En algunos de los sistemas cromatograficos, se logra unaseparación entre el retinol “solo trans” lo cual es la suma delretinol “solo-trans” y el 13-cis retinol después de corregirconsiderando la menor biopotencia (75% de retinol “solo-trans”). Es importante indicar claramente las unidadesutilizadas para informar los resultados .

Cromatografía gas líquido (GLC) y la cromatografía líquida de alta presión (HPLC)

VITAMINA A

ResumenLa muestra y el extracto de la muestra deben protegerse de laluz y la oxidación.La saponificación bajo reflujo debería llevarse a cabopreferentemente bajo nitrógeno utilizando antioxidantes.Los antioxidantes (BHT) deben agregarse antes de laevaporación de los solventes bajo un vacío parcial y sinexceder 50°C.Separar adecuadamente el retinol y sus isómeros de los otroscomponentes.Control espectrométrico de la pureza del estándar.Informar las unidades relacionadas al resultado.Hacer una referencia a los análisis de carotenoides, dado quealgunos tienen actividadde vitamina A tal como el βcaroteno.

La vitamina E que se encuentra en la naturaleza abarca unaserie de compuestos denominados tocoferoles y tocotrienoles.Estos compuestos tienen diferentes actividades biológicas ypor lo tanto es importante que sean cuantificadosindividualmente si ha de determinarse la actividad biológicade la vitamina E. Entre las fuentes más ricas de vitamina Eestán los cereales, germen de cereales y la mayoría de lassemillas oleaginosas, nueces y aceites a partir de ellos. Lavitamina E también se encuentra en los vegetales con hojas(lechuga, espinaca, repollo, puerro), en la grasa animal ytambién en la leche, mantequilla y queso. El representantemás importante del grupo de la vitamina E es α-tocoferol. Enlos alimentos procesados, la vitamina E puede sersuplementada comoα-tocoferol o acetato deα-tocoferol.

La vitamina D de efecto antirraquítico se encuentra endiversas formas; las dos más importantes son la vitamina D2,ergocalciferol, previamente conocida como calciferol y lavitamina D3, colecalciferol. La vitamina D2 se encuentra enpequeñas cantidades en los aceites de hígado de pescado yalgunas esponjas.La vitamina D3 está más ampliamente distribuida en lanaturaleza y se encuentra en cantidades relativamentegrandes en los aceites de hígado de pescado, y en cantidadesmás pequeñas en pescados tales como arenque, caballa,salmones y sardinas, en huevos, mantequilla y queso crema.El bajo nivel (del orden de 0,03 μg/100g en la leche total) hacedifícil para el analista determinar los niveles naturales de lavitamina D en los alimentos

MétodoAntiguamente, la única manera relevante de determinar laactividad de la vitamina D era por medio de pruebasbiológicas en las cuales se administraban extractosliposolubles a animales (ratas o pollos). Las pruebas medíanla mejoría (prueba curativa) o el desarrollo (pruebaprofiláctica) de la deficiencia de vitamina D en términos delgrado de raquitismo producido. Alrededor de 1970, sedesarrollaron los procedimientos de cromatografía de gas queincluían una saponificación, extracción del material nosaponificable, remoción de las interferencias medianteprecipitación seguida por una cromatografía en alúmina,Sephadex y Florisil, luego la conversión de la vitamina D a laisovitamina previa a la

formación del derivado trimetilsililado y cromatografía de gas(10). Un procedimiento muy largo y laborioso. Cuando sedeterminaba la vitamina D3 en la muestra, se agregabavitamina D2 como estándar interno y viceversa. La HPLCofrece actualmente el método de análisis más adecuado parala determinación de vitamina D en un amplio rango dealimentos incluso a bajos niveles de concentracionesnaturales.

La vitamina K de efecto antihemorrágico, que tiene un rolimportante en regular la coagulación sanguínea se encuentraen una serie de formas; químicamente las moléculas sonderivados del 2-metil-l,4-nañoquinona que tiene una cadenalateral en la posición 3. En el grupo de la vitamina Kj lacadena lateral tiene sólo un enlace doble, mientras que en elotro grupo de la vitamina K3, los dobles enlaces de la vitaminaK3 se repiten regularmente en la cadena lateral. El miembromás importante del grupo es el compuesto dentro de la serieK1 con 20 átomos de carbono en la cadena lateral,generalmente conocido como vitamina K1. Está presente enplantas verdes, vegetales verdes (repollo, espinaca), papas,frutas (tomates, frutillas), escaramujos y también en aceitesde hígado. La suplementación de las fórmulas infantiles convitamina K1 ha recibido alguna atención dado que ayuda aproteger a los recién nacidos en contra de la muerte porhemorragia.

MétodoLos métodos desarrollados en años recientes para ladeterminación de la vitamina K1 se basan principalmente enprocedimientos HPLC. Los problemas relacionados a lacuantificación son similares a aquellos de la vitamina D3:bajas concentraciones e interferencias con las matrices de losalimentos. Por lo tanto, no es sorprendente que el métodomás reciente utilice el mismo enfoque: pre purificación conHPLC semipreparativo seguida por HPLC analítico para lacuantificación (12).

VITAMINA D

VITAMINA E

VITAMINA K

Finalmente se puede deducir que la importancia de lacromatografía radica en que permite separar los componentesde la mezcla, para obtenerlos más puros y que puedan serusados posteriormente (etapa final de muchas síntesis) yademás medir la proporción de los componentes de lamezcla (finalidad analítica). En este caso, las cantidades dematerial empleadas son pequeñas.

Editora: Yorgenys Rodríguez 23,435,313

Departamento de agricultura(S/F).»ANALISIS DE VITAMINAS EN ALIMENTOS».Recuperadode:http://www.fao.org/docrep/010/ah833s/ah833s19.htmCarrero N. (2009). «Cromatografia de liquidosHPLC»recuperadode: http://laboratoriotecnicasinstrumentales.es/analisis-qumicos/cromatografa-de-lquidos-hplc

https://espanol.answers.yahoo.com/question/index?qid=20131017195045AAFcSKv