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Aplicaciones de Q-TOF(Soluciones Analíticas en Identificación con LCMS)
Juan Carlos López Flores, MScMarzo-Abril-Mayo Junio , 2008
ROADSHOW LCMSAMÉRICA LATINA
AGILENT TECHNOLOGIES
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Situación de análisis cualitativo para identificación
• La muestra es desconocida– Puede tenerse alguna idea de la clase de
compuestos, pero no se sabe a ciencia cierta si están o no presentes
•El(Los) compuesto(s) de interés puede estar presente en muy bajas concentraciones
– Se requiere alta sensibilidad•Dado que en LC-MS no existen bibliotecas de espectros (como en GCMS usando EI) se requieren herramientas adicionales a solo MS
– MS de alta exactitud y resolución– Varios pasos de MS (MS/MS, MS3 o MSn)– Combinación de ambos (MS/MS con alta exactitud
en las masas)
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Page 3
Complejidad de muestras, ¿cuantos y cuáles compuestoshay en una muestra?
6x10
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
2.2
2.4
2.6
2.8
Cpd 279:+ ECC Scan CoffeeSpiked12.d
Counts vs. Acquisition Time (min)0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9
Más de 280 compuestos en café con pesticidas añadidos
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9 compuestos coeluyendo en 6 segundos5x10
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
2.2
2.4
2.6
2.8
3
3.2
3.4
Cpd 105:+ ECC Scan CoffeeSpiked12.d
Counts vs. Acquisition Time (min).31 1.315 1.32 1.325 1.33 1.335 1.34 1.345 1.35 1.355 1.36 1.365 1.37 1.375 1.38 1.385 1.39 1.395 1.4 1.405 1.41 1.415 1.42 1.425 1.43 1.435 1.44 1.445
6 segundos
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Extracto de orina realmente complejo > 1000 compuestosAmplio intervalo dinámico – ¿Como se analiza?
6x10
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
2.2
2.4
2.6
2.8
3
3.2
3.4
3.6
3.8
4
4.2
4.4
4.6
4.8
5
5.2
Cpd 932:+ ECC Scan DQC3.d
1417
Counts vs. Acquisition Time (scans)250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400
5x10
-0.2-0.1
00.1
0.20.3
0.40.5
0.60.7
0.80.9
11.1
1.21.3
1.41.5
1.61.7
1.81.9
22.12.2
2.32.4
2.5
Cpd 932:+ ECC Scan DQC3.d
Counts vs. Acquisition Time (min)3.08 3.1 3.12 3.14 3.16 3.18 3.2 3.22 3.24 3.26 3.28 3.3 3.32 3.34 3.36 3.38 3.4 3.42 3.44 3.46 3.48 3.5
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El mayor reto en Proteomics: Encontrar biomarcadores en fluídoshumanos como suero, plasma o Líquido cefalo raquídeo
En el suero humano, las concentraciones de proteínas se estiman están en un intervalo de doce órdenes de magnitud
Number of Proteins
(Órdenes de magnitud)
Aún no resueltas
2D gelesLC-MS
Nivel
121110987654321
Biomarcadoresen tejidos
(mg/ml)
(ug/ml)
(ng/ml)
(pg/ml)
(fg/ml)
- Alta abundancia
- Abundancia moderada
- Baja abundancia
- Muy baja abundanciaCitoquinas
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Retirando las capas de proteínas es el primer paso
Uno de los mayores objetivos es encontrar proteínas útiles desde el punto de vista clínico(biomarcadores). Estas son típicamente proteínas de baja abundancia. Las tecnologías actuales permitenver solo las tres capas superiores.
Level 1
Level 2
Level 3
Level 4
Level 5
Level 6
Ya estudiadas
Las proteínas de interés
Level 7Level 8
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Resultados con instrumento con baja exactitud en masas (MW 609. 2, con solo C, H, O y N)
H25N36O5CH21N40OC33H31N13
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Resultados con instrumento con alta exactitud en masas (MW 609. 28066, con solo C, H, O y N)
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Definiciones
•Una disolución con ácido en concentración 0.0025M
•Una disolución de pH 2.6– pH = -log 0.025
Error en la medición de masas•Error pequeño 200.0 y 200.1• (200.0 – 200.1)/200.0 = 0.0005
•Error en masas exactas(200.0000-200.0016)/200.0000 = 0.000005
•Exactitud en masas = Error x 1,000,0000.00005X1,000,000 = 5 ppm
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Importancia de las mediciones exactas de masas
Reserpina (C33H40N2O9) tiene un ión protonado a m/z 609.28066
Un espectrómetro de masas tipo cuadrupolo reporta masas en +/- 0.1 = 165 ppm
0.1/609.28 x 10e6 = 164.128
Número de fórmulas posibles usando solo C, H, O y N:
• 165 ppm 209• 10 ppm 13• 5 ppm 7• 3 ppm 4• 2 ppm 2
Las masas exactas reducen el riesgo de invertir esfuerzo en la molécula incorrecta
Error en ppm = (error de masa/MW) x 106
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Alta resolución y número posible de fórmulasquímicas
1
10
100
1000
0.1 0.05 0.01 0.005 0.001 0.0005 0.0001
Exactitud de masa (amu)
# de
fórm
ula/
com
pues
tos
posi
bles
176386882134716725687
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Masas Atómicas e isótopos
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Diferencias entre MW promedio, monoisotópico y nominal
Nombre FórmulaMolecular
Masa Promedio(Da)
MasaMonoisotópica
Masa Nominal(Da)
Carbón C 12.1115 12.0000 12Hidrógeno H 1.0080 1.0078 1Nitrógeno N 14.0067 14.0031 14Oxígeno O 15.9994 15.9949 16Azufre S 32.0600 31.9721 32
Un lípido C18H35NO 281.4858 281.2718 281Un azúcar C56H118N4O14 1071.5833 1070.8644 1070Un péptido C101H258N24O24 2193.3288 2191.9704 2190
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Sistemas LC/MS de Agilent, vista por dentro
Rough Pump
Octopole 1
Turbo 1
Turbo 1
Turbo 1
Quad Mass Filter (Q1)
Collision Cell
Lens 1 and 2
Quad Mass Filter (Q3)
10KV Detector
Ion Pulser
Turbo 2
Octopole 1
DC Quad
Rough Pump
Turbo 1
Turbo 1
Turbo 1
Quad Mass Filter (Q1)
Collision CellLens 1 and 2
Octopole 2
Rough Pump
Octopole 1
Turbo 1
Turbo 1
Turbo 1
Quad Mass Filter (Q1)
Lens 1 and 210KV
Detector 6520 Q-TOF6410 QQQ
6100 Series SQ
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Modelo Conceptual de un Espectrómetrode Masas de Tiempo de Vuelo (TOF)
Video TOF
Tubo de vuelo del TOF:Zona libre de campo eléctrico. Opcional: Reflectron (espejo de iones)
0 V
Analizador de Masasde Tiempo de Vuelo (TOF)
Detección Iones
IonizaciónExterna Campo Eléctrico
Pulsante
Resolución Espectral:
“alta”
Técnica “Pulsante”
E = - m v221 v =
m2E
t =length
m2E
2(30000)= 1.0
50200
= 91 μsec
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Posicionamiento de los instrumentos 6210 y 6220 TOF
G6210 Resolución de 4,000 @ 118 m/z (típica)Resolución de 7,000 @ 322 m/z (típica)Resolución de 13,000 @ 2722 m/z (spec)3.5 décadas de intervalo dinámico
G6220 >Cambio 2X – Resolución de 9,000 @ 118 m/z(spec)
Cambio 2X- Resolución de 14,000 @ 322 m/z(spec)
Cambio 1.3X- Resolución de 16,000 @ 2722 m/z(spec)
Cambio 10X- 4.5 décadas de intervalo dinámico
Introducción automática de masas de referenciapara Multimodo, APCI yAPPI
100% MassHunter software
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Posicionamiento de los instrumentos 6510 y 6520 QTOF
G6510Resolución 4,000 @ 118 m/z (típico)
Resolución 7,000 @ 322 m/z (típico)
Resolución 13,000 @ 2722 m/z (spec)
3.5 décadas de intervalo dinámico
Intervalo de masas 4,000 m/z cuad;
12,000 m/z –TOF
G6520>cambio 2X- Resolución de 9,000 @ 118 m/z (spec)
Cambio 2X - Resolución de 14,000 @ 322 m/z (spec)
Cambio de 1.3X – Resolución de 16,000 @ 2722 m/z(spec)
Cambio de 10X - 4.5 décadas de intervalo dinámico
Intervalo de masas 4,000 m/z cuad; 20,000 m/z - TOF -standard
Introducción automática de masas de referencia paraMultimodo, APCI y APPI
8,000 m/z cuad – opción de intervalo de masasextendido (Fase III)
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Diagrama TOF
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Diseño que mejora la transmisión de iones y la resolución
Espejo de iones de dos etapas
Sistema de vacío de 5 etapas
Fuente de ionesortogonal
Detector ópticamenteacoplado con la digitalización ADCAl 25ppm/°C, Acinox 20ppm/oC. Agilent 2ppm/oC
Longitud real del paso de vuelo de 2.0m
Tubo de vuelo con bajo CTE
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Exactitud de masas, extremos ambientales
Inyección cada 15 minutos, desde 11º - 36º C y de 10 a 95 % humedad relativa
Mass Accuracy
-5-4-3-2-1012345
0 50 100 150 200 250 300
Reserpine Injection
Mas
s Er
ror,
ppm
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Fuente dual ElectrosprayDiseño de rociador dual para la muestra y los compuestos de referencia
Rociador de referencia
Rociador analítico
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Universal IRM:
– IRM para fuentes Multimodo(ESI/APCI), APCI y APPI
– Utiliza el sistema de entrega de calibrante para adición de compuestos IRM
– Polaridad positiva y negativa– Disponible para TOF y Q-TOF
• Disponible para sistemas ya existentes
– Disponible en Septiembre 2007
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Correción de masas
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Sistema de entrega de calibrante para tuning automático e introducción de masa de referencia
A B
TOFTOF Ref Mass
CDS entrega ya sea la mezcla de Tune o la disolución de masas de referencia
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Facilidad de uso: Corrección con la masa internade referencia
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000m/z, amu
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Rel. Int. (%
)
279.091691
579.155974
121.050925 301.073403922.010400
Masas de referencia
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Exactitud de masas para tecnología de tiempo de vuelo
–3
–2
–1
0
1
2
3
5 10 15 20 25 30 35 40 45
Mass error (ppm)
Standards from 0.1 to 5 ng/mL Urine samples spiked from 2 ng/mL to 250 ng/mL
Clenbuterol
Ractopamine
Bambuterol
Mabuterol
Run number
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Mejoras en el Time-of-Flight Nueva tecnología de adquisición incrementa el poder de resolución
FIA, 2 scans/sec (6713 transients/scan)2 IRM averaged over five scans
Butyl paraben[M+H]+ 195.10157
Methyl 5-acetylsalicylate[M+H]+ 195.06519
O
O
OH
O
OH
OO
8 bit – 1 GHzCovertidorAnalógico
Digital
195.088679
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)195 195.02 195.04 195.06 195.08 195.1 195.12 195.14 195.16 195.18 195.2
6,100 Resolving Power (FWHM)
8 bit – 4 GHzConvertidorAnalógico
Digital
195.100392
195.066356
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)195 195.02 195.04 195.06 195.08 195.1 195.12 195.14 195.16 195.18 195.2
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)
8,000 Resolving Power (FWHM)
195.101392
195.065349
195 195.02 195.04 195.06 195.08 195.1 195.12 195.14 195.16 195.18 195.2
0.036 Da+ 0.8 ppm
- 0.9 ppm
14,000 de poder de
Resolución(FWHM)
8 bit – 4 GHzConvertidorAnalógico
Digital Picking de
picostransientes
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Uso de alta resolución y alta exactitud
163.063Tyr (Y)Tyrosina156.101Arg (R)Arginina147.068Phe(F)Fenil alanina128.095Lys (K)Lysina128.059Gln (Q)Glutamina113.084Leu (L)Leucina113.084Ile (I)Isoleucina71.037Ala (A)Alanina57.021Gly(G)Glicina
Masa monoisotópica(Da)CódigoAminoácido
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1296.69 seq(c-FH[IL])
Secuenciación por Peptide Ladder
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Saturación espectral y exactitud de masas
XIC of +TOF MS: 409.3 amu Max. 3.7e6 cps.
0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2Time, min
0.0
8.0e5
1.6e6
2.4e6
3.2e6
Intensity, cps
409.30
m/z, amu408.0 408.5 409.0 409.5 410.0 410.5 411.0 411.5 412.00%
20%
40%
60%
80%
100%409.2837
410.2648
409.2597
410.2630
Masa real 409.2598
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Intervalo dinámicoIntevalo estrecho
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Page 33
Intervalo dinámicoIntervalo amplio
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Mediciones exactas de masas: Amplio intervalodinámico
m/z 582.319
100,000 Arb.U
nits
250 Arb.U
nits
m/z 922.010
400x
1.6 ppmerror
TheoreticalMass487.73253450.2364
722.81666417.21191512.25457464.25036519.21717653.3617
435.91023501.79513820.47251526.58871674.32258480.60877582.31897710.84248627.97323474.23075507.81333740.40136784.37501
AbundanceArb. Units
13165304661169108978
12534575
21881555
10141842
31001881
23885490273863
1388124508110169671643
Error(ppm)
0.611.590.642.661.660.730.061.38-0.28-0.040.250.35-1.4
-2.521.57-1.160.551.130.68-0.12-3.49
“Problema”Masas Ref.
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Poder de resolución mejorado –Alta exactitud de masas para isóbaros en un ampliointervalo dinámico
Methyl 5-acetyl-salicylate (MAS)[M+H]+ 195.065185
Butyl paraben (BP)[M+H]+ 195.101571
Counts (%) vs. Mass-to-Charge (m/z)195.02 195.04 195.06 195.08 195.1 195.12 195.14 195.16 195.18 195.2 195.22
0
0.25
0.5
0.75
1
1.25
1.5
1.75
2
2.25
2.5
2.75
3
3.25
3.5
3.75
4
4.25
4.5
4.75
5
5.25
5.5
5.75
6
6.25
6.5
6.75
7
7.25
7.5
7.75
8
8.25
8.5
8.75
9
9.25
9.5
+ Scan (# 3-7, 5 scans) MAS_BP_1_128.d
Counts (%) vs. Mass-to-Charge (m/ z)195.02 195.04 195.06 195.08 195.1 195.12 195.14 195.16 195.18 195.2 195.22
Zoom view128x dilution
+1.3 ppm
-1.4 ppm
-0.8 ppm
-0.2 ppm
Counts (%) vs. Mass-to-Charge (m/z)194.94 194.96 194.98 195 195.02 195.04 195.06 195.08 195.1 195.12 195.14
-1x10
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
2.2
2.4
2.6
2.8
3
3.2
3.4
3.6
3.8
4
4.2
4.4
4.6
4.8
5
5.2
5.4
5.6
5.8
6
6.2
6.4
6.6
6.8
7
+ Scan (# 3-7, 5 scans) BP_MAS_1_128.d
Counts (%) vs. Mass-to-Charge (m/ z)194.94 194.96 194.98 195 195.02 195.04 195.06 195.08 195.1 195.12 195.14
Zoom view128x dilution
+0.5 ppm0.0 ppm
+1.9 ppm
+0.7 ppm
O
OH
OO O
O
OH
Dilute MAS, keep BP constant Keep MAS constant, dilute BP
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Nuevo sistema de adquisición de 4GHzhasta 5 décadas de intervalo dinámico en-espectro
6x10
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
2.2
2.4
2.6
2.8
3
3.2
3.4
3.6
3.8
4
4.2
4.4
4.6
4.8
5
5.2
5.4
5.6
5.8
6
6.2
6.4
6.6
6.8
7
7.2
7.4
7.6
7.8
8
8.2
8.4
8.6
8.8
9
+ Scan (# 31-35, 5 scans) niacinamide_erythromycin.d
* 123.055394
425.138434207.007866 329.056151 1521.971969922.009798659.287715 759.355249 1221.991581
Counts vs. Mass-to-Charge (m/ z)100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400 1450 1500 1550 1600 1650 1700
2x10
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
1.9
2
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
+ Scan (# 31-35, 5 scans) niacinamide_erythromycin.d
734.468956
735.416113
736.387755
Counts vs. Mass-to-Charge (m/ z)734 734.5 735 735.5 736 736.5 737 737.5 738 738.5 739 739.5 740 740.5
In-Scan Dynamic Range
Este ejemplo9x106 / 250 = 3.6 × 104
Máximo3x107 / 250 = 1.2x 105
Max Abd3x107
Erythromycin, 500 fg/µL[M+H]+ = 734.468518 m/zError = +0.6 ppmNiacinamide, 10 ng/µL
[M+H]+ = 123.055289 m/zError = +0.8 ppm
250 cts
9x106 cts
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 37
Mezcla de compuestos en infusión; TIC
8x10
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5+ TIC Scan mix995.d
1
Counts vs. Acquisition Time (min)0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2 2.1 2.2 2.3
Ang: 16 nMCaf: 25 nMRes: 25 uM
Inyección en flujo
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 38
Espectro de masas de mezcla. Notar que solo se ve el picode reserpina en esta escala
5x10
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
1.1
+ Scan (0.678-0.795 min, 8 scans) mix995.d Subtract (1)
609.27982
84.95922 523.77439 922.01114
Counts vs. Mass-to-Charge (m/ z)100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Reserpina:M+H 609.27982, M neutral 608.27254,abundancia 108,725 cuentas,ppm error; + 1.38 ppm
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 39
Espectro de masas de angiotensina
1046.5403
2x10
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
6.5
7
+ Scan (0.678-0.795 min, 8 scans) mix995.d Subtract (1)
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)1040 1042 1044 1046 1048 1050 1052 1054 1056 1058 1060 1062 1064 1066 1068 1070 1072
M+H 1046.54032, M neutral 1045.53304,abundancia 651 cuentas,ppm error; + 1.41 ppm
M+Na 1068.52561, M neutral 1045.53639,abundancia 207 cuentas,ppm error; - 1.8 ppm
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 40
Espectro de masas de cafeína
3x10
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1+ Scan (0.678-0.795 min, 8 scans) mix995.d Subtract (1)
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)193 193.5 194 194.5 195 195.5 196 196.5 197 197.5 198
195.0878Cafeina: M+H 195.08792, M neutral 194.08064, abundance 852 cuentas, ppm error; -1.36
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 41
Results from Mass Hunter Formula calculator
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 42
Reserpina: confirmación
14 equivalentes de enlaces dobles(DBE)
Consistent isotope ratios
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 43
Regla de anillos + enlaces dobles
•“Because of the valances of the elements involved, the total number of rings and double bonds in a molecule of the formula CxHyNzOn will be equal to: ”Interpretation of Mass Spectra, 3rd Edition F.W. McLafferty, pag 23, Univerity Science Books,USA, 1980
•Para la fórmula general CxHyNzOn o el caso general IyIInIIIzIVx dondeI=H,F,Cl,Br; II=O,S; III=N,P y IV=C,Si, etc
Total de anilos más enlaces dobles
Para un ión con número par de electrones (el pseudo-ión molecular), el valor real será acompletado por 1/2
121
21
++− zyx
121
21
++− zyx
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 44
Regla de anillos + enlaces dobles: ejemplos
•C5H5N anillos más dobles enlaces = 5 - 2.5 + 0.5 + 1 = 4
Piridina+. (# impar de electrones, GC/MS)
•C7H5O anillos más dobles enlaces = 7 - 2.5 + 1 = 5.5
Ion benzoilo, C6H5CO+. (# par de electrones)
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 45
Calculadora de Posibles Fórmulas Empíricas
Permite definir los elementos posibles y su nº máximo de átomos
El perfil de relaciones isotópicas indica que la molécula debe contener 2 azufres y 2 cloros (reduciendo así las posiblidades a 2 de los 4 compuestos)
La calculadora de masas incorporada en el software facilita enormemente la identificación de las posibles fórmulas empíricas
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 46
Cuantificación con TOF
•Mito: espectrómetros de masas tipo TOF no se pueden utilizar para cuantificar
•Realidad: históricamente, TOF utilizaba digitalización TDC, por lo que presentan problemas de saturación de señal y no podían cuantificar. En la actualidad, solo un proveedor tiene electrónica TDC.
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 47
Cuantificación de Acrilamida
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 48
Curva de calibración entre 0.25 y 3 µg/L
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 49
XIC of +TOF MS: 334.4 to 335.4 amu from Sample 18 (Blank Poultry+0.5ppb) of Nitrodfuransequence1.wiff Max. 2.0e5 cps.
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5Time, min
0.0
5000.0
1.0e4
1.5e4
2.0e4
2.5e4
3.0e4
3.5e4
4.0e4
4.5e4
5.0e4
5.5e4
6.0e4
6.5e4
6.8e4
Inte
nsity
, cps
123.06
123.05
Nitrofuranos en aves con resolución unitaria335.1352 -0.7+0.3 uma, 334.4352 – 335.4352 (0.5 ppb de NPAMOZ en matriz, recuperación del 50%)
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 50
NPAMOZ 335.1352 ± 0.1uma (335.0352 – 335.2352)
XIC of +TOF MS: 335.0 to 335.2 amu from Sample 18 (Blank Poultry+0.5ppb) of Nitrodfuransequence1.wiff Max. 1.7e5 cps.
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5Time, min
0.0
2000.0
4000.0
6000.0
8000.0
1.0e4
1.2e4
1.4e4
1.6e4
1.8e4
2.0e4
2.2e4
2.4e4
2.6e4
2.8e4
3.0e4
3.2e4
3.4e4
Inte
nsity
, cps
123.06
S/N = 70:1
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 51
NPAMOZ 335.1352 ± 20ppm, 0.009 umas (335.1262-335.1396)
XIC of +TOF MS: 335.1 to 335.1 amu from Sample 18 (Blank Poultry+0.5ppb) of Nitrodfuransequence1.wiff Max. 1.0e4 cps.
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0Time, min
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
1900
2000
2100
2200
2300
2400
2500
2600
2700
2800
2900
3000
3100
3200
Inte
nsity
, cps
123.05
S/N = 214:1
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 52
Curva de calibración NPAMOZ en Pollo
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 53
Number ofTransitionsper group
QQQ inMRM
TOF Full Scan2 ppm Accuracy20-50 pg
1
10
100
300
Instrument Detection Limit10 pg1 pg 100 pg
Screening de pesticidas:Límite de detección por TOF es X y es el “punto de cruce”
QQQ5 msec100+ transitions
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 54
Comparison matrices for Imidacloprid
0.00E+00
1.00E+06
2.00E+06
3.00E+06
4.00E+06
5.00E+06
6.00E+06
7.00E+06
8.00E+06
9.00E+06
1.00E+07
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Concentration (ppm)
Inte
nsity
BufferPepperTomatoLettuceCucumber
Sobreposición de las curvas de calibración paraimidacloprid en 5 matrices
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 55
Imazalil en alimento de bebés: pera, naranja y plátano
m/z 297.0556Exactitud de 1 ppm25 pg en columna
S/N ≅ 10
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 56
6x10
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
2.2
Abundance vs. Acquisition Time (min)0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 11 11.5
+ BPC Scan Bus-contr-MS_0002.d
1 1
6x10
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
2.2
2.4
2.6
+ EIC(386.2570) Scan Bus-contr-MS_0002.d
1 1
Buspirona
Cromatograma pico base
Cromatograma iónico extraídom/z 386.2570
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 57
Espectro de masas de la Buspirona
5x10
00.10.20.30.40.50.60.70.80.9
11.11.21.31.41.51.61.71.81.9
22.12.2
Abundance vs. Mass-to-Charge (m/z)100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 120
+ Scan (6.647 min) Bus-contr-MS_0002.d
386.2558922.0098
121.0509
783.4963663.4541302.1744 537.5374
Teórico: 386.2551Observado: 386.2558Error: -1.8 ppm
Reference mass
Reference mass
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 58
4x10
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
2.2
2.4
2.6
2.8
3
Abundance vs. Mass-to-Charge (m/z)60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420
+ Product Ion (399.3 sec) (386.2536 -> **) Bus-contr-MS_0002.d
122.0717
148.0873
222.1499 265.1934168.1026
386.253998.0966
343.2126292.2099
MS/MS de Buspirona
-3.0 ppm
A=168
H=291
E=150
B=219
N11
12
19
21N4
14
13
20
N1
N22
N26
O28
O27
3
5
2
6
10
247
25
23
15
18
9 8
17
16
C=180D=222
F=265
G=122
Pyrimidine (P)Butyl piperazine
(BP)
Azaspirone decane dione
(ADD)
C-chain
G
AE FD
B
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 59
Cromatograma iónico total de una muestra de carotenoides
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 60
Métodos tradicionales para el análisis de impurezas
Comparación manual de cromatogramas LC/UV y MS de muestras “control” vs “contaminadas”
La La plantaplanta se se parapara…… el el productoproducto fallfallóó.. .. PorPor queque, , cuandocuando, , dondedonde, , comocomo
Fácil.. Contratese una persona con muchaexperiencia y adquiera muchos datos de GCMS y LCMS (de marcas ya con tiempo en el mercado
ArrojarArrojar los los datosdatos a a todostodos los los colaboradorescolaboradores y y quequeencuentrenencuentren laslasdiferenciasdiferencias……
EnfoqueEnfoque manual, susceptible manual, susceptible a a tendenciastendenciasPrimeroPrimero buscarbuscar lo lo queque se se conoceconoceVerVer laslas diferenciasdiferenciasprincipalesprincipales
AunqueAunque pequepequeññaa, , unauna agujaaguja en un en un palarpalar puedepuedecausarcausar mucho dolormucho dolor
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 61
Secuencia de trabajo oara screening de impurezas:
• Objetivo: Detección - ID de impurezas de baja concentración eningredientes activos farmacéuticos
Cuantificacióno
Identificación ID de impurezasRRLC Q(TOF)Control/Muestra (3x)RT, MW, Formulas
Análisispor
objetivo
QQQ MRM
ID CompuestosMass Hunter
MFE(Bases de datos)
Análisisdiferencial
Mass ProfilerID RT, MW
Características únicas
Importar lista de MS/MS objetivoRRLC MS/MS
ID estructuras“AutoMSMS”
EFG MS - MSMS
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 62
3D Plot Before3D Plot Before
Molecular Feature Extraction (MFE)Software de reducción automática de datos
Original TICProcessed TIC
3D Plot No Background
Suma de datos reducidos con intensidad de isótopos, aductos, clusters e iones con carga múltiple
Encuentra las características en datos TOF/QTOF Coeluting Features
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 63
Molecular Feature Extraction (MFE)Genera
FórmulasEmpíricas
Generación de fórmulas moleculares y búsqueda en bases de datos
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 64
Productos de degradación de Amoxicillina y AmoxiClavin
C16H19N3SO5
MW 365.10454Fuente• Tableta 875mg Nueva• Tableta 500mg 09/07
Preparación de la muestra• Tabletas disueltas en 40mL metanol
agua con 0.1% ácido fórmico• Sonicación por 20 minutos• Spin 5 minutos 14000 RPM• Diluír 100 y 1000 veces con agua
S
O
OHO
OOH
N
NH
NH2
CH3
CH3
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 65
Condiciones Experimentales
Cromatografía• Agilent 1200 RRLC• Eclipse Plus C18 2.1x100mm 1.8µm
temp en 50oC• Fase móvil:
– Agua /metanol 0.1% FA– Agua /metanol 5mM NH4Ac
• Prueba de varios gradientes– 0 to 95% in 16 Minutes– 0 to 95% in 13 Minutes
• Flujo: 400-500 µL/min
Espectrometría de masas• Agilent 6520 QTOF• ESI ion positivo• Intervalo de masas m/z 100-
1000• Velocidad de adquisición: 2
spectra/s• Gas de secado: 250oC• Masas de referencia internas
– m/z 121 y 922• Fragmentador: 165V• Modo de alta resolución
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Page 66
Buffer en la fase móvilAumento de 10X con acetato de NH4
0.1% Ac. fórmico
5mM Acetato de NH4
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 67
Efecto del gradiente
0-95% en 13 minutos
0-25% en 13 minutos
10 Productos de degradación separados
14 Productos de degradación separados
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 68
Vía de degradación de Amoxicillin(trabajo con TOF/trampa previo)
NH
O
H NH2 NO
SH
CH3
CH3
H COOH
H
OH
NH
O
H NH2 NH
SH
CH3
CH3
H COOH
H
O OH
OH
NH
O
H NH2 NH
SH
CH3
CH3
H COOH
OH
OH
NH
NH
O
O
NH
S
CH3
CH3
H COOH
NH
O
H NH NO
SH
CH3
CH3
H COOH
H
OH
O
OH
NH2 H
1 2 3
5 4
1 Amoxicillin
2 Amoxicillin penicilloic acid
3 Amoxicillin penilloic acid
4 Diketopiperazine amoxicillin
5 4-Hydroxyphenylglyl amoxicillin
E. Naegele, R. Moritt, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2005, 16, 1670-1676
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 69
Masas exactas con alta resolución
-0.96-2.84340.13352340.1331C15H22N3O4Samoxicillin penilloic acid I and II 34.57
-0.23-0.58398.13826398.13803C17H23N3SO6Amoxicillin Acid5.954
-1.04
-0.4
-0.36
Exactitud de masa[ppm]
Exactitudde masa
[mDa]
MasaDeterminada
MasaCalculadaFórmulaNombre del compuestoRT [min]
-2.85366.11286366.1124C16H20N3O5Sdiketopiperazine
amoxicillin 56.269
1.09366.11222366.1124C16H20N3O5Samoxicillin 13.84
-0.93384.12274384.1229C16H22N3O6Samoxicillin penicilloic
acid 23.71
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 70
Información estructural de MS/MS C16H19N3SO5
NH
O
H NH2 NO
SH
CH3
CH3
H COOH
H
OH
OH
NH
NH
O
O
NH
S
CH3
CH3
H COOH
C6H10NO2S 3.53 ppm Error
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 71
Exclusión Activa - MS y MS/MS de CoeluyentesData-dependent MSn: Active Exclusion
379 543
482
MS/MS of 633
m/z
MS (A)569
633
m/z
MS (B)569
633
m/z
Threshold
478
387
MS/MS of 569
m/z
Tiempo
MS (A)
MS (B)Exclusión activa
“repeat” n=2
….. pico
Maximiza la obtención de información MSn útil evitando la redundante
Los iones precursores ya adquiridos n-veces,
desaparecen de la “lista de exclusión activa” cuando ha
transcurrido el “Exclude time”
Ejemplo auto MS2 con 1 ión precursor, y
exclusión activa con un máximo de 2 repeticiones
Se efectuará el MS/MS de 633, puesto que el de 569 ya se ha adquirido 2 veces
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Page 72
Análisis diferencial usando Mass Profiler
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 73
Análisis de impurezas: SW Mass Profiling
Processed TICProcessed TICProcessed TICGrupo A (Impuro)
Processed TICProcessed TICProcessed TICGrupo B (Control)
Alinea datosRT, Masas, Abundancia
All Data RT/Mass
¿Que cambió? Masas/RT >2 veces de cambio
Lo que es único Impureza Control
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 74
S/N 5:1, Masas 200-600, RT 1-11 minutos 835 Características
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 75
36 características después de filtrarlo
Reducción por patrón isotópico, resta de ruido de fonde y número de iones
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 76
Detección de 17 productos de degradación
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 77
Composición y búsqueda en base de datos
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 78
Software MetID para perfil de impurezas
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 79
Vista general MetID1. Compuesto padre: MW, Formula y estructura
2. Transformaciones: Lista de productos de degradación propuestos
3. Criterio de identificación: Pruebas con diferente valor
4. Encontrar compuestos con MFE: Molecular Feature Extraction
5. Encontrar compuestos por AutoMSMS: para datos MSMS
6. Comparación de la muestra: Mass Profiler para diferencias
7. Filtros por perfil isotópico: Excelente para especies halogenadas
8. Filtro por defecto de masas: De los compuestos propuestos
9. Generación de EIC: Confirma la presencia de los compuestos
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 80
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 81
Entrada del método
Compuesto padreProductos de degradación
propuestos
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 82
Criterios de identificación de metabolitos
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 83
Resultados de metabolitos
La decloronización oxidativa no esta confirmada por la baja relevancia
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 84
Cromatograma iónico extraído
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 85
Ajuste de isótopos
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 86
Ajuste por patrón de isótopos
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 87
Ajuste de isótoposEl patrón ajusta la descloronización oxidativa
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 88
Resultados de metabolitos
Decloronización oxidativa confirmada al 100%
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 89
Predicción de fórmulas elementalesDecloronización oxidativa
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 90
Predicción de fórmula elementalHidroxilación
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
Page 91
Productos de degradación propuestosCalificados por defecto de masas y patrón isotópico
Determinemos la composición de MW 411
SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted
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Las masas exactas generan la composición, hidrólisis ácida (H2O+CO2H-OH)
Masa exacta de los iones fragmento
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Espectros MSMS sobrepuestos Padre/Producto
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MSMS del compuesto MW 380
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¿Para interpretar espectros?
•Moléculas pequeñas de interés ambiental o alimentos– Merck, NIST…
•Moléculas pequeñas tipo metabolitos– Metlib (colaboración con el Scripps Institute
•Proteínas– Spectrum Mill para comparar datos en bases de datos como SwissProt y
obtener identidad de proteínas
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Monograph Number: 5723
Title: MalathionCAS Registry Number: 121-75-5
CAS Name: [(Dimethoxyphosphinothioyl)thio]butanedioic acid diethyl ester
Additional Names: diethyl mercaptosuccinate S-ester with O,O-dimethyl phosphorothioate; S-(1,2-dicarbethoxyethyl) O,O-dimethyldithiophosphate; insecticide no. 4049; carbofos; malathon (obsolete); mercaptothion; phosphothion
Manufacturers' Codes: ENT-17034
Trademarks: Cythion; Derbac-M (International); Malamar 50; Malaspray; Organoderm (Mundipharma); Prioderm (Coates & Cooper); Suleo-M (International)
Molecular Formula: C10H
19O
6PS
2
Molecular Weight: 330.36.Percent Composition: C 36.36%, H 5.80%, O 29.06%, P 9.38%, S 19.41%
Literature References: Cholinesterase inhibitor. Prepn: Johnson et al., J. Econ. Entomol. 45, 279 (1952); Cassaday, US 2578652 (1951 to Am. Cyanamid). Purification: Usui, US 2962521(1960 to Sumitomo). Treatment of Pediculus humanus (head lice) infestation: D. Taplin et al., J. Am. Med. Assoc. 247, 3103 (1982). Toxicity data: T. B. Gaines, Toxicol. Appl. Pharmacol. 14,515 (1969). Review of distribution, transport and fate in the environment: M. S. Mulla et al., Residue Rev. 81, 1-159 (1981); of carcinogenic risk: IARC Monographs 30, 103-129 (1983).
Properties: Deep brown to yellow liq, mp 2.9°. bp0.7
156-157°. Characteristic odor. d425 1.23. n
D25 1.4985. Vapor pressure at 30°: 4 × 10-5 mm Hg. Slightly sol in water (145 ppm).
S
PS
H3COH3CO
O CH3
O
O
O
CH3
Búsqueda en bases de datos
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Búsqueda en bases de datos: Metabolitos
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Búsqueda en bases de datos, Proteínas
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Identificación de proteínas
Traten de leer rápidamente sin detenerse y al final entenderánel mensaje.
“Sgeun un etsduio de una uivenrsdiad ignlsea, no ipmotra el odren en el que las ltears etsan ersciats, la uicna csoaipormtnate es que la pmrirea y la utlima ltera esten ecsritas en la psiocion cocrrtea. El rsteo peuden estar ttaolmntee mal y aunpordas lerelo sin pobrleams. Etso es pquore no lemeos cadaltera por si msima snio la paalbra cmoo un tdoo. Pesornamelnteme preace icrneilbe..."
¡Itresatne vreadd!
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Conclusiones• Para ayuda en la elucidación de identidad, mientras más datos se
tengan, la identificación es más fácil– MS no es suficiente– MS/MS ayuda a construír la molécula como un rompecabezas– MS de alta exactitud brinda mucha ayuda y complementa a MS/MS
• Análisis diferencial: MassProfiler
• Identificación: Personal Metlin Database, Spectrum Mill, etc
• Perfil de impurezas: SW MetID con datos MS/MS
• En suma, Agilent technologies ofrece el portafolio de MS máscompleto
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¿Como funciona un espectrómetro de masas?
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Portafolio LC/MS Agilent 6000 Series
TodasTodas laslas ventajasventajas. . TodoTodo el el tiempotiempo..