USO PRÁCTICO EUSO PRÁCTICO EUSO PRÁCTICO E USO PRÁCTICO E INTERPRETACIÓN DE LA INTERPRETACIÓN DE LA
SEROLOGÍA Y PCR EN CAMPOSEROLOGÍA Y PCR EN CAMPO
Roser Dolz Roser Dolz PascualPascual
Joaquín Girón Joaquín Girón SolsonaSolsona
WPSA, WPSA, Valencia, 2014Valencia, 2014
TIPO ESTUDIO TIPO ESTUDIO LABORATORIALLABORATORIAL
TOMA DE MUESTRASTOMA DE MUESTRASLABORATORIALLABORATORIAL
HISTOPATOLÓGICOÓRGANOS
MICROBIOLÓGICO
SEROLÓGICOTIPO DE MUESTRA
MOLECULAR
PARASITOLÓGICO
MÉTODO CONSERVACIÓN
PATOLOGÍA QUE SE PATOLOGÍA QUE SE SOSPECHASOSPECHA
ETIOLOGÍA
PATOGENIAPATOGENIA
PCR Y TÉCNICAS DE PCR Y TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓNSECUENCIACIÓN
BIOLOGÍA MOLECULARBIOLOGÍA MOLECULAR
BIOLOGÍA MOLECULAR
¿QUÉ DETECTAN LAS ¿QUÉ DETECTAN LAS TÉCNICAS DE BIOLOGÍA TÉCNICAS DE BIOLOGÍA
MOLECULAR?MOLECULAR?
ADNADNMaterial hereditarioADN / ARN
Responsable de la identidad y de laidentidad y de la diversidad de los
individuos
Su estudio permite la identificación y clasificación de los agentes infecciososde los agentes infecciosos
ADNADNNUCLEÓTIDO
TA
CG
ADENINA GUANINA
CG
GC
A G CT AT
A G C T
TIMINA CITOSINA 4 pares de basesT C G A
¿QUÉ INFORMACIÓN NOS ¿QUÉ INFORMACIÓN NOS PUEDEN DAR?PUEDEN DAR?
TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULARTÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULARó d d l l é
DETECCIÓN DETECCIÓN CUANTIFICACIÓN CUANTIFICACIÓN TIPIFICACIÓN TIPIFICACIÓN
Detección y estudio del material genético organismos
MICROORGANISMOMICROORGANISMO
Ausencia o presencia de
MICROORGANISMOMICROORGANISMO MICROORGANISMOMICROORGANISMO
Cantidad de genomas Clasificación en un agente infeccioso (de
su genoma)presentes en una muestra de un
determinado organismo
genotipos
Correlación con fenotipo ( t i id d ti )g (patogenicidad, serotipo)
PCR a tiempo real (cuantitativa)
SecuenciaciónPCR( )
FUNDAMENTOS PCRFUNDAMENTOS PCRAMPLIFICACIÓN Específica
EXTRACCCIÓNEXTRACCCIÓN ADN/ARN
FUNDAMENTOS PCRFUNDAMENTOS PCRADN/ARN Taq DNA
POLIMERASANUCLEÓTIDOS (dNTPs)G
TG
AT TA
TCCG
GGGA
C CTT A
PRIMERS
AT
CAC T
T CG GA GG
TACGT G
ATT A
PRIMERS
C A T T A C A TG C A C T A T A
C A T T A C A T25 pares de bases
C A T T A C A T G G A G G C C T A C G T G A T A TG T A A T G T A C C T C C G G A T G T A A T G T A C C T C C G G A T G C A C T A T A
G G A G G C C T A C G T G A T A TC A T T A C A T G G A G G C C T A C G T G A T A TG T A A T G T A C C T C C G G A T G C A C T A T A
G G A G G C C T A C G T G A T A TC A T T A C A T G G A G G C C T A C G T G A T A T
FUNDAMENTOS PCRFUNDAMENTOS PCRAMPLIFICACIÓN
Específicap
Exponencial
1 PCR 30‐35 CICLOS
X 10 000 000 000X 10.000.000.000
Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3
FUNDAMENTOS PCRFUNDAMENTOS PCR
1 2 3 4 5
225pb
275pb
225pb250pb275pb
70pb
150pb100pb
700pb175pb150pb
100pb70pb
25pb50pb75pb
FUNDAMENTOS PCRFUNDAMENTOS PCR1000pb800pb700pb600pb500pb
2 3 4 5 6 71 8
500pb400pb300pb
200pb
VENTAJASVENTAJAS INCONVENIENTESINCONVENIENTES
Elevada sensibilidad
Rapidez
Coste
Conservación muestras
Posibilidad tipificar No información de la viabilidad del agente infeccioso
Necesidad información genética del agente infeccioso
CATTTACATGGAGGCSECUENCIACIÓNSECUENCIACIÓN
CAC
CATA T
CATTTACATGGAGGC
CATTCATTTCATTTA
CAT
CATTTACATGCATTTACAT
CATTTACCATTTACAGC
CATTTACATGGAGCATTTACATGGACATTTACATGGCATTTACATG
A TCATTTACATGGAGGCCATTTACATGGAGGCATTTACATGGAGA T
C A T T T A C A T G G A G G C
GC
160 170
G
WPSA C A T T T A C A T G G A G G CANÁLISIS DE SECUENCIASANÁLISIS DE SECUENCIASWPSA C A T T T A C A T G G A G G C
STA- CEPA 1 C A T T T A C A T G G A G G CSTA- CEPA 2 C A T T T A C A T G G A G G CSTA- CEPA 3 C A T T T A C A T G G A G A C
STB- CEPA 1 C A T T T A C A A A G A G G CSTB- CEPA 2 C A T T T A C A A A G A G G C
STC- CEPA 1 C A T C C A C A T G G A G G CSTC- CEPA 2 C A T C C A C A T G G A G G C
STA-CEPA2STA-CEPA3
WPSASEROTIPO A
STA-CEPA1STB-CEPA1STB-CEPA2STC CEPA1
SEROTIPO B
STC-CEPA1STC-CEPA2
0.005
SEROTIPO C
D78(at)74
ÁRBOL FILOGENÉTICOÁRBOL FILOGENÉTICO
CEPAS ATENUADAS
D78(at)HARBIN
CEF94PBG98(Be-at)
P2(at)
7480
54
20
99 P2(at)AV-14-08-5
HIPRAGUMBORO-CH/80CU-1(at)
HIPRAGUMBORO-GM97
38
54
3345
B G D
VARIANTES
HIPRAGUMBORO-GM97Int/228E(TW)
VARIANT-E(Usvar)DEL-E(USvar)
GLS(USvar)
100
100
72
24 BAJO GRADO ATENUACIÓN
VARIANTES AMERICANAS
CLÁSICAS Y CLÁSICAS
GLS(USvar)GZ29112
VARIANT-A(USvar)STC(UScl)BURSAVAC(vac)
99
99
45
72
CLÁSICAS Y CLÁSICAS DE VIRULENCIA INTERMEDIA
BURSAVAC(vac)52/70(cl)
Cu-1wt(Gcl)BURSINE2(vac)
BURSINEPLUS(vac)100
100
40
40
vvIBDV
BURSINEPLUS(vac)849VB(BEvv)
UK661(UKvv)HK46(HKvv)
D6948(NLvv)66
98
99
D6948(NLvv)OKYM(Jvv)
NETHERLANDSvv3137
66
0.005
NL-L1449K-04NL-L1449T-04NL-L1449T-04FR-L1450L-05FR-L1450T-05
CASO 364
89
99
100
CASO 3BEAUDETTEM41-M21883Spain/96/334H120-M21970Spain/98/308100
100
56
100
42
64
Spain/98/3084/91-pathogenic4/91attenuatedUK/7/91UK/3/91UK-1233-95
100
100
99
38 UK-1233-95FR-85131-85FR-CR88061-88Spain/00/336IR-3654-VM-Spain/92/3525
10
44
100
Spain/92/35Spain/98/328
Spain/04/221Spain/05/866
Spain/99/316It-497-02-DQ901377
100
73
79
100
QUK-L633-04-DQ901376Italy-02-AJ457137Spain/00/337
ARK99-CU-T2
57
94
79
100
37
E l d di t i éti B1648HOLTEGRAY
JMKD3896D207
100
51
35
51
Escala de distancia genética
Cambios nucleotídicos/posiciónD207D274
D146674
100
0.05
VENTAJASVENTAJAS
Máxima precisión en la caracterización
Relativa rapidez (comparación con métodos clásicos deRelativa rapidez (comparación con métodos clásicos de tipificación)
ió d d l d d ió dComparación con cepas de todo el mundo y detección de cepas nuevas.
INCONVENIENTESINCONVENIENTES
C tCoste
Análisis de resultados es costosa y complejo
No aplicable de forma sencilla a organismos más complejos (bacterias o virus de genomas complejos)
¿CUÁNDO SON TÉCNICAS DE ¿CUÁNDO SON TÉCNICAS DE ELECCIÓN?ELECCIÓN?
Detección y estudio del material genético organismos
N i i l l S d ti á tNo es necesario aislar el microorganismo para su
detección
Se puede estimar un carácter fenotípico (virulencia, serotipo) a partir deldetección serotipo) a partir del
genotipo
Microorganismos de Microorganismos que gaislamiento difícil o lento
Vi
g qrequieran una clasificación
IA – HPAIV/LPAIVVirus
Mycoplasma
IA HPAIV/LPAIVIBV, FAdV, TRT – Serotipo
IBDV – Virulencia
¿CUÁNDO SE DEBEN TOMAR ¿CUÁNDO SE DEBEN TOMAR LAS MUESTRAS?LAS MUESTRAS?
Detección y estudio del material genético organismos
E ll f d l f d d l t lEn aquellas fases de la enfermedad en que el agente causal esté presente en las aves/tejidos
INFECCIÓN AGUDAINFECCIÓN AGUDA INFECCIÓN CRÓNICAINFECCIÓN CRÓNICA
Muestreo se puede retrasar en el tiempo, dado que el
l á
Muestreo temprano en la fase aguda de la enfermedad ( d lí ) agente causal estará
durante más tiempo infectando el ave
(presencia de signos clínicos)
infectando el ave
¿QUÉ MUESTRAS SE DEBEN ¿QUÉ MUESTRAS SE DEBEN TOMAR Y CÓMO SE DEBEN TOMAR Y CÓMO SE DEBEN
CONSERVAR?CONSERVAR?
Se deben tomar muestras de los tejidos u órganos diana donde el agente causal se replique o cree persistenciadonde el agente causal se replique o cree persistencia
1.‐ Tejido diana
2.‐ Hisopo sin medio de transportep p
3.‐ Tarjetas FTA (inactivación del organismo)(inactivación del organismo)
R f i ió /C l ióRefrigeración/Congelación
Selección adecuada de la muestra
Orientar sospecha
Historia clínica (vacunaciones)
SEROLOGÍASEROLOGÍA
G R A C I A S G R À C I E S T H A N K Y O UG R A C I A S G R À C I E S