seminario 2

SEMINARIO N02

ANALISIS CLNICO Pgina 1

OTROS MICROORGANISMOS DE IMPORATANCIA CLNICA

1. ESPIROQUETAS

Las espiroquetas tienen una morfologa en espiral que las asemeja a un resorte metlico;algunas presentan un enrollamiento ms apretado que otras. Sin embrago, lacaracterstica ms distintiva de este orden es el modo en que se mueven, que se basa enel uso de dos o ms filamentos axiales (o endoflagelos) encerrados en el espacioexistente entre una vaina externa y el cuerpo de la clula. Un extremo de cada filamentoaxial se adhiere cerca de un polo de la clula (vanse fig.).

Mediante la rotacin de su filamento axial, la clula rota en direccin opuesta, como untirabuzn, lo que le permite moverse con mucha eficiencia a travs de los lquidos. Paralas bacterias esto es ms difcil de lo que parece. En la escala de una bacteria el agua estan viscosa como la melaza para los seres humanos. Sin embargo, una bacteriatpicamente puede moverse cerca de 100 veces la longitud de su cuerpo en un segundo(o cerca de 50 pm/segundo), mientras que un pez grande, como un atn, slo puedemoverse 10 veces la longitud de su cuerpo en ese tiempo.

En la cavidad oral de los seres humanos se encuentran muchas espiroquetas y esprobable que hubiera espiroquetas entre las primeros microorganismos que vanLeeuvenhoek observ y describi en la saliva y en raspados de diento en la dcada de1603. Una localizacin extraordinaria de las espiroquetas es sobre las superficies dealgunos de los proemios que digieren la celulosa encontrados en las termitas, dondepueden funcionar como sustitutos de los flagelos.

Treponema. Las espiroquetas comprenden varias bacterias que son patgenosimportantes. La que se conoce mejor pertenece al gnero Treponena y es Treponemapallidum, la causa de la sfilis (fig.b).

Borrelia. Los miembros del gnero Borelia causan la fiebre recurrente y la enfermedadde Lyme, enfermedades graves que habitualmente transmiten garrapatas o piojos.

Leptospira. La leptospirosis es una enfermedad que suele transmitirse a los sereshumanos a travs de agua contaminada por especies de Leptospira. Las bacterias son

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excretadas en la orina de Ciertos animales (p. ej.. perros. ratas y cerdos) de modo quelos perros y los patos domsticos por lo general estn inmunizados contra laleptospirosis.1

FIGURA Espiroquetas. Las espiroquetas son microorganismos helicoidales con filamentosaxiales debajo de una vaina externa que les permite realizar un movimiento de rotacin similaral de un tirabuzn. (a) Este corte de una espiroqueta muestra numerosos filamentos axialesentre la clula oscura y la vaina externo. (b) Esta microfotografa electrnica de uno porcinde Treponema pallidum muestra la vaina, que se separ de lo clula durante la preparacinpara la microscopia, y dos filamentos axiales, adheridos cerca de uno de los extremos de laclula bacteriana debaio de la vana.

2. MICOPLASMAS

Los micoplasmas son muy pleomorfos porque carecen de pared celular y puedenproducir filamentos que se asemejan a los hongos, de all su nombre (mykes hongo yplasma = (ormado). Las clulas del gnero Mycoplasma son muy pequeas, con untamao que vara de 0,1 a 0,25 pm y un volumen celular dcl 5% del de un bacilo tpico.Corno su tamao y plasticidad les permita atravesar los filtros que retenan a lasbacterias en un comienzo fueron considerados virus. Los micoplasmas representan losmicroorganismos autorreplicantes ms pequeos capaces de llevar una existenciacelular independiente. Los estudios de su DNA sugieren que estn estricamenterelacionados con el grupo de bacte-rias gramposirivas que abarca los gneros Bacilus.Estreptococos y Lactobacilus pero gradualmente han perdido material gentico. Paradescribir este proceso se ha utilizado el trmino evolucin degenerativa.

Entre los micoplasmas el patgeno humano ms importante es M. pneumoniae, que es

la causa de una forma comn de neumona leve. Otros gneros del orden

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Mycoplasmatales son Spiroplasma, clulas con una morfologa en tirabuzn rgido quecausan enfermedades graves en las plantas y son parsitos frecuentes de los insectos quese alimentan de plantas, y Ureaplasma, denominados as porque pueden degradar la ureade laorina de modo enzimaticoy en ocasiones se asocian con infecciones urinarias.

Los micoplasmas pueden crecer en medios artificiales que les proporcionen esteroles, sies necesario, y satisfagan otros requerimientos nutricionales fsicos especiales. Las

colonias miden menos de 1 mm de dimetro y tienen un apecto caracterstico en "huevofrito" cuando se las observa con aumento. Para muchos propsitos a menudo resultanms satisfactorios los mtodos de cultivos celulares. De hecho, los micoplasmas crecentan bien con estos mtodos que constituyen un problema de contaminacin frecuente enlos laboratorios de cultivos celulares.1

3. RICKETSIAS

Se trata de microorganismos procariotas que se comportan como parsitos intracelularesestrictos. Pertenecen al dominio Bacteria phylum: Proteobacteria, orden: Rickettsiales.

Tienen forma bacilar, cocobacilas o son pleomorficas y su tamao es de alrededor de0.3 por 1.2 um. Son grmenes gramnegativos aerobios.

No se colorean bien con la coloracin de Gram, pero si con las de Giemsa o deGimnez, que permite visualizarlas con el microscopio ptico.

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Tienen dos cidos nucleicos, DNA y RNA, y ribosomas para la sntesis de protenas. Elgeneral no pueden metabolizar la glucosa como sustrato: pueden sintetizar ADP, perono ATP, el cual obtienen de la clula hospedadora.

Se cree que este parasitismo energtico obligado se debe a un sistema inusual detransporte a nivel de sus membranas, mediado por una enzima, la translocasa queintercambia el ADP bacteriano por ATP celular, adems de otros metabolitos esenciales(aminocidos y nucletidos) presentes en el citoplasma de la clula eucariota.

ESTRUCTURA CELULAR

Las rickettsias poseen dos envolturas: la membrana citoplasmtica interna y la paredcelular ms externa en la que es posible identificar dos capas: una interior electrodensade peptidoglucano, cido murmico y cido diaminopimelico y otra ms externa delipopolisacarido, separadas por un espacio periplsmico; estas caractersticasestructurales las relacionan con las bacterias y con los virus por la particularidad derequerir clulas vivas para su desarrollo. No tienen flagelos y estn rodeadas por unabiopelcula poco adherente.

CULTIVO Y REPRODUCCION

Debido a que no se desarrollan en medios inertes, pueden cultivrselas en huevosembrionados, animales de experimentacin o en cultivos de clulas de mamferos oartrpodos a temperaturas de 33 a 35C, donde crecen en abundancia. Se reproducenpor fusin binaria en el citoplasma de las clulas que infectan, principalmente en clulasendoteliales y linfoides circulantes. Son agentes patgenos de muy alto riesgo, por loque se evita su manipulacin para cultivo.

CLASIFICACION Y ACCION PATOGENA

La rickettsiaceae comprende dos generos: Orientia (especie tsutsugamushi: agente deltifus de los matorrales, transmitida por caros) y Rickettsia: con el grupo tifus (especies:R. prowazekki y R. typhy) y el grupo de la fiebre moteada (especies R. rickettsii, R.akari, R. conori, R. siberica y R. africae).La infeccin por rickettsias es transmitida por picaduras de caros o garrapatas y por lasdeyecciones contaminadas de piojos, pulgas y ratas.Las rickettsias penetran en las clulas por medio de un mecanismo de fagocitosisinducida por el parsito y quedan dentro de un fagosoma. Casi inmediatamente laenzima fosfolipasa A2 de las rickettsias destruye la membrana fagosmica, evitan as laaccin ltica de los lisosomas y los microorganismos se esparcen y reproducenactivamente en el citoplasma eucariota hasta que su nmero destruye la clula y seliberan para reiniciar el ciclo. En algunas especies, la liberacin de produce porexocitosis con filopodios o por pasaje intercelular sin lisis.(1)

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4. CLAMIDIAS

Las clamidias son bacterias muy semejantes a las rickettsias, pero tienen un ciclointracelular de reproduccin ms complejo. Comparten con ellas y los virus la condicinde ser parsitos intracelulares estrictos.

Son formas cocoideas, inmviles, con membrana citoplasmtica y ribosomas; no poseenpeptidoglucano en su pared gramnegativa, con aspecto de bicapa separadas por unespacio periplsmico. No poseen capsulas ni flagelos. Pueden tener proyecciones en susuperficie, y un complejo grupo de protenas en la membrana externa responsables de lagran variabilidad antignica, del tropismo y la infectividad. Poseen dos cidosnucleicos, pero no producen su propio ATP, por lo cual las ATP/ADP transferasas estnpresentes en todas las especies de clamidias.

REPRODUCCION

Se multiplican en vesculas dentro de citoplasma de la clula hospedadora, mediante unciclo complejo, con dos etapas (ciclo bifsico).Despus de adherirse al cuerpo elemental (CE) a receptores especficos, penetra en laclula hospedadora por medio de un proceso comparable a la fagocitosis (endocitosis).Estos CE que permanecen dentro del fagosoma e inhiben la fusin de los grnuloslisosomales aumentan de tamao hasta llegar a los 8000-1000 nm y se tornan esfricos,ms frgiles, menos densos y ricos en RNA: en esta etapa del ciclo no son infecciosos,pero si metablicamente activos y se denominan cuerpos reticulados (CR). Dentro delas vesculas fagosmicas, estos se multiplican por fision binaria y producenmicroorganismos pleomrficos. En este estadio pueden visualizarse inclusionesintracitoplasmticas. Una vez que se han multiplicado, los CR se condensan y danorigen a los CE que, por autolisis celular, quedan libres y con capacidad de infectarotras clulas.

CLASIFICACION Y ACCION PATGENA

Pertenecen al Dominio Bacteria Plylum XVI Chamydial.

Los estudios filogenticos efectuados con PCR han generado una reclasificacin delorden Chlamydiales. La familia Chlamydiaceae comprende dos gneros:Chlamydophyla (Cp), con tres especies patgenas para el hombre: Cp. Psittaci, Cp.Pneumoniae y Cp. Abortus. Y el gnero Chlamydia (C), con el patgeno humano,Chlamydia trachomatis.

In vivo las clamidias infectan clulas linfoides, epiteliales no ciliadas, cilndricas ocbicas de diferentes mucosas: conjuntiva, endocervix, recto y endometrio,genitourinarias y trompas de Falopio. La injuria celular se produce por la lisis yprobablemente por accin de toxinas o reacciones autoinmunes.(1)

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DIAGNSTICO POR EL LABORATORIO DE LAS INFECCIONESMICTICAS2

CUADRO 1 Signos Sntomas y agentes etiolgicos de las micosis extrapulmonares1

TIPO DEINFECCIN SIGNOS Y SNTOMAS

Cutnea Lesiones superficiales descamativas, que varan en tamao, forma y color,del trax o de la espalda: tia versicolor secundaria a la infeccin porMalassezia furfurPrurito, lesiones descamativas conocidas como ta: dermatofitosisAfeccin fungoide exofitica e hiperqueratsica que produce engrosamiento ycostras conocida como tia fvica:Trichophyton tonsurans, T. violaceum y T. schoenleiniiLesiones descamativas o con costras limitadas a las zonas intertriginosashmedas de piel sugieren infecciones por levaduras: Candida albicansInfeccin pustular subcutnea primaria en el sitio de inoculacin, condiseminacin proximal y evolucin de lceras cutneas secundarias a lolargo de los trayectos linfticos: Sporothrix schenckii.Pstulas que no curan, lceras o fstulas: enfermedades micticasdiseminadas por hongos dimorfos y micetomas secundarios a una diversidadde hongosLesiones purpricas y quistes subcutneos: feohifomicosisLesiones fungoides. hemorrgicas y con cambio de coloracin:cromomicosis

SNC Comienzo insidioso de cefaleas que aumentan en frecuencia e intensidad,acompaado por naseas, irritabilidad y torpeza: criptococosis

Urinaria Pielitis y pielonefritis asociadas con la administracin prolongada deantibiticos. corticosteroides, inmunosupresores, frmacos antineoplsicos yla insercin durante periodos prolongados de sondas urinarias, en especial enmujeres mayores: candidiasisPiuria limitada, dolor abdominal en hipogastrio, polaquiuria: cistitis nobacteriana en mujeres de mediana edad: Torulopsis glabrata

Ocular Conjuntivitis, infecciones de la crnea y queratoconjuntivitis: especies deFusarium. Aspergillus, Cladosporium Acremonium y otros. Las infeccionesintraoculares, por lo general secundarias a traumatismo o ciruga ocular:Candida albicans, especies de Aspergillus o de Zygomyces.

Endocarditis Fiebre de baja intensidad, soplos cardacos. vegetaciones en laecocardiografa: especies de Candida, de Aspergillus, de Paecilomyces

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Sinusitis Dolor facial e hiperemia cutnea, cefalea, fiebre de baja intensidad,evidencia radiogrfica de senos paranasales ocupados o con niveles lquidos:Aspergillus fumigatus, Sporothrix schenckii, especies de Alternaria yPseudallescheria boydii

I. RECOGIDA DE LA MUESTRA2

Para alcanzar el xito en el diagnstico micolgico partiendo de una sospecha clnica, esfundamental realizar adecuadamente la recogida de la muestra a partir de la lesin, sucorrecta manipulacin para mantener la viabilidad del agente etiolgico y evitarposibles contaminaciones en su transporte y procesamiento, la siembra de la misma enlos medios idneos y a la temperatura adecuada, as como la identificacin einterpretacin correcta de los aislamientos. nicamente con el procesamiento adecuadose puede recuperar el hongo claramente asociado con el proceso infeccioso. A la hora devalorar un crecimiento fngico hay que tener siempre presente la necesidad dediferenciar un aislamiento significativo de otros que no lo son, ya que no es lo mismo

identificar una especie fngica que diagnosticar una micosis.

Consejos generales para optimizar la recogida de las muestras:2

1. Debe disponerse de un protocolo de recogida de muestras que ser actualizadoperidicamente.

2. Es responsabilidad del mdico asegurar una correcta recogida y envo encondiciones adecuadas de las muestras, funciones que no deben ser delegadas enpersonal no cualificado.

3. Es necesario recoger las muestras aspticamente, utilizando contenedoresestriles, remitirlas al laboratorio antes de 2 horas y sembrarlas lo antes posible.

4. La muestra debe recogerse antes de instaurar el tratamiento y siempre de la parteactiva de la lesin (cuando se sospecha una micosis pulmonar es preferible unamuestra respiratoria que un hemocultivo).

5. Se debe evitar la utilizacin de hisopos siempre que el tipo de lesin lo permita,pues estn contaminados frecuentemente con microbiota bacteriana. Sin

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embargo, algunas muestras (conducto auditivo, faringe, vagina, crvix) nopueden ser recogidas de otra forma.

6. Las muestras de lesiones cerradas y abscesos suelen presentar un granrendimiento. Deben aspirarse con jeringa y transferirse a un contenedor estrilcon solucin salina, prestando atencin a la recogida de grnulos, si los hubiese.

7. El raspado de lesiones de piel y faneras puede realizarse con distintos materiales;los ms utilizados son bistur, moqueta o cepillo.

8. En situaciones que requieran un estudio epidemiolgico, debe establecerse lanecesidad de una recogida de muestras ambientales, familiares o animales.

9. El recipiente de recogida se identificar con los datos del enfermo (nombre ylocalizacin), y debe protegerse para que no se rompa en su transporte allaboratorio.

10. Las muestras deben ir acompaadas obligatoriamente del volante de peticinpara Microbiologa. En el cual, al menos, debe hacerse constar la siguienteinformacin: datos del paciente (nombre y apellidos, nmero de historia clnica,fecha de nacimiento y sexo); datos clnicos (orientacin diagnstica, tratamientoantimicrobiano, enfermedad de base y antecedentes de inters); datos del mdicosolicitante.

11. Al laboratorio se le debe informar de la sospecha de presencia de hongospeligrosos. Tambin si se sospecha la presencia de hongos con requerimientosespeciales, as como de viajes u origen de paciente.

Los envases para la recogida de las muestras pueden variar segn el tipo de muestra arecoger y transportar:

Tubos estriles con tapn de rosca: LCR y otros lquidos biolgicos. Frascos estriles de boca ancha con tapn de rosca: orinas, esputos, heces,

fragmentos de tejidos, etc. Torundas o hisopos de algodn estriles: Se usan para tomar muestras de

superficies y orificios corporales (exudados, secreciones). Jeringas estriles: slo se admiten cuando su volumen no permita transferir la

muestra a un medio de transporte adecuado. Frascos de hemocultivo para lquidos biolgicos. Placas de Petri estriles.

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II. TRANSPORTE2,4

Todas las muestras deben enviarse al laboratorio rpidamente, sin conservantes. Lasmuestras deben transportarse en un recipiente estril, humidificado y a prueba devertidos; sin embargo, las muestras dermatolgicas pueden transportarse en unrecipiente seco (placa de Petri, papel de fotografa negro, entre dos portas). En general,no deben introducirse en medios de transporte, a no ser que sea fcil retirar la muestradel medio. Las muestras en que se sospeche la presencia de dermatofitos u hongosdimrficos se conservarn a temperatura ambiente, nunca refrigerados. Los raspadoscorneales y hemocultivos deben sembrase directamente en el medio de cultivoadecuado. Si esto no fuera posible, se usarn medios de transporte adecuados o seconservaran a 4 C. Las condiciones de transporte y almacenamiento vienen reflejadasen la tabla 1, considerando ciertas variaciones segn el agente probable.

III. MANEJO2,3

Todas las muestras deben manejarse como si tuvieran microorganismos potencialmentepeligrosos. Cuando una muestra se recibe en el laboratorio, y antes de procesarse, debesometerse a una inspeccin previa para asegurarse que ha sido bien seleccionada,recogida y transportada. Se rechazar en los siguientes casos: a) muestra no identificada,b) transporte inadecuado o demasiado prolongado, c) muestra derramada, d) cantidadinsuficiente o inadecuada. En todos estos casos se contactar con el mdico solicitantepara pedir nueva muestra o solucionar el problema de la misma.

IV. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA2

Para realizar un buen diagnstico micolgico es importante que la muestra se recoja y setransporte en condiciones idneas y que no se demore su cultivo. Aunque hay pocosestudios sobre la disminucin de la viabilidad de los hongos a temperatura ambiente opor la accin del hielo seco, es conocida la dificultad de recuperar Rhizopus arrhizus enmuestras en las que se demora el cultivo, y tambin, la prdida de viabilidad de algunoshongos por la desecacin, temperatura elevada (>37 C) o baja (

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(muestras de piel, aspirados transtraqueales, aspirados de odo interno, muestras deconjuntiva) deben enviarse a temperatura ambiente.

En trminos generales, los procedimientos utilizados en el laboratorio de bacteriologason adecuados para el cultivo de hongos, pero hay que tener en cuenta que,habitualmente, la carga microbiana es inferior en el caso de los hongos con respecto alas bacterias. Esto obliga a recoger mayor cantidad de muestra para obtener unrendimiento ptimo. Las muestras inaceptables no deben procesarse y el facultativodebe ser informado inmediatamente. Todo laboratorio debe distribuir por escrito lasnormas de rechazo de muestras.

Consejos generales para optimizar el procesamiento de muestras2,4

a. Comprobar que el etiquetado de la muestra es correcto.b. Registrar toda la informacin necesaria que pudiera afectar a la calidad de la

muestra y que represente inters diagnstico (aspecto, color, olor, consistencia,cogulos, etc.), as como todo lo relacionado con su recogida, transporte yconservacin.

c. Durante el procesamiento, deben seguirse todas las medidas de seguridadnecesarias, tanto para el personal como para la muestra.

d. El procesamiento debe llevarse a cabo tan pronto como sea posible paragarantizar la viabilidad del hongo, utilizando el medio de cultivo y latemperatura de incubacin ms adecuada.

e. La recuperacin de los hongos es imprescindible para su identificacin y larealizacin de pruebas de sensibilidad.

f. El tipo de procesamiento y los medios utilizados dependen de las caractersticasde cada muestra.

a) MEDIOS REQUERIDOS Y CONDICIONES DE INCUBACIN3,4

El objetivo fundamental de la utilizacin de los medios de cultivo es optimizar elcrecimiento de los microorganismos. En los medios de cultivo micolgicos, losantimicrobianos se utilizan tanto para inhibir el crecimiento bacteriano como el de otroshongos ambientales.

A. CLASIFICACIN3

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Atendiendo a su composicin, los medios de cultivo pueden ser generales, enriquecidos,selectivos, diferenciales y especializados:

i. Generales: El ms caracterstico y clsico es el agar glucosado de Sabouraud(AGS). Se utiliza como medio de cultivo general y fundamentalmente para larealizar la descripcin de las caractersticas morfolgicas de la mayora de loshongos.

ii. Enriquecidos: Se utilizan especialmente en micosis sistmicas endmicas(histoplasmosis, blastomicosis), para la recuperacin de la fase levaduriforme.Un ejemplo de estos medios es el agar cerebro-corazn con sangre (BHI).

iii. Selectivos: Son medios que favorecen el crecimiento de los microorganismosdeseados impidiendo el de otros. Los componentes ms utilizados como agentesselectivos son antibacterianos (cloranfenicol, gentamicina, penicilina,estreptomicina) y tambin inhibidores de hongos como la cicloheximida que esespecialmente til en las muestras cutneas y respiratorias para el diagnstico demicosis sistmicas endmicas.

iv. Diferenciales: Se utilizan para ayudar a la identificacin del hongo basada en laapariencia de ste en dicho medio, merced a la adicin de determinadoscomponentes como por ejemplo sustancias cromgenas, o indicadores de pHcomo en el DTM.

v. Especializados: Son aquellos medios que contienen algn componente (porejemplo, cido cafeico) destinado a aislar un agente concreto (C. neoformans),favorecer la identificacin de ciertas especies (por ejemplo, el medio deCzapeck), u obtener estructuras de reproduccin sexual (por ejemplo, agaracetato, agar patatazanahoria).

B. PREPARACIN3

La buena calidad de los medios es indispensable para conseguir el aislamiento y laidentificacin de los hongos; por lo tanto, cuando se utilicen medios comerciales esnecesario tener en cuenta la garanta que aporta el proveedor y la calidad de ladistribucin. Cuando se prepara un medio deshidratado deben seguirse rigurosamentelas instrucciones del fabricante, evitando errores en la forma de disolverlos osuspenderlos, en la temperatura y duracin de la esterilizacin para que no se afecte lacalidad del producto final. Algunos antibiticos deben aadirse al medio una vez

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esterilizado y a la temperatura adecuada, para que no se inactiven por las altastemperaturas de la esterilizacin.

C. CONTROL DE CALIDAD3

Para asegurar la correcta utilizacin de los medios, deben controlarse peridicamentesus caractersticas ms importantes: apariencia, esterilidad, pH y funcionamiento. Elfuncionamiento se puede evaluar utilizando las cepas de control adecuadas para cadamedio.

D. SOPORTE3

El soporte habitual para los medios de cultivo en Micologa suelen ser tubos de cristal oplacas de Petri (90 mm). Los tubos tienen la ventaja de soportar incubacionesprolongadas y aumentan la seguridad en el caso de sospecha de micosis endmicas. Sise utilizan tubos, deben incubarse en posicin horizontal las primeras 24 horas para queel inculo no se concentre en el fondo. Los tubos deben de ser de boca ms ancha quelos habituales en bacteriologa, porque en ellos, las colonias no son fciles de aislar. Silos tubos utilizados son de tapn de rosca, el cierre debe mantenerse parcialmenteabierto para garantizar las mejores condiciones atmosfricas. Cuando se eligen placas,es conveniente que contengan 40 ml de medio para evitar que se sequen, y debencerrarse con cinta adhesiva para que no se abran involuntariamente, protegiendo alpersonal de los hongos patgenos y evitando la contaminacin con hongos externos. Elprecintado debe ser permeable al aire, ya que cuando el aire circula libremente sefavorece la produccin de pigmento y la superficie del agar se seca, permitiendo eldesarrollo de micelio areo y esporas.

E. ALMACENAMIENTO3

Los medios se deben guardar refrigerados a 2-8C. Para mejorar su conservacin yprevenir la desecacin, es aconsejable invertir las placas e introducirlas en bolsas deplstico. Las placas de Petri suelen conservarse en buen estado unos tres meses,mientras que los medios semislidos o lquidos en tubo de tapn de rosca se conservanbien hasta 6 meses. Sin embargo, ciertos medios, al contener sustancias inestables(antibiticos, vitaminas, sangre, etc.), no se conservan en buen estado tanto tiempo.Tambin hay que tener presente que algunos componentes de ciertos medios puedenverse afectados por la luz, por lo que estos medios deben almacenarse en contenedores

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opacos. Como norma general, todos los medios deben utilizarse antes de la fecha decaducidad indicada por el fabricante y, antes de su utilizacin, deben atemperarse,durante unos minutos, a temperatura ambiente.

F. ELECCIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO3,4

Los medios ms utilizados en el cultivo de hongos son: agar Sabouraud glucosa (AGS),habitualmente con la modificacin de Emmons, con cloranfenicol y con/sin actidiona;agar infusin cerebro corazn (BHI) con o sin sangre de cordero al 5%, con o sinantibacterianos; agar inhibidor para mohos (MIA); y agar patata glucosa (APG). Sinembargo, los hongos tambin pueden crecer en medios no selectivos, incluidos lamayora de los medios bacteriolgicos, si se incuban el tiempo suficiente. La eleccin yel nmero de medios a utilizar estn condicionados por el coste, la disponibilidad y laspreferencias personales, pero siempre se deben incluir medios con antibacterianos y sinellos. La incorporacin de cicloheximida (actidiona), inhibidor de muchos hongosconsiderados contaminantes, ayuda especialmente en las micosis de la piel, aunquepueda inhibir algunos patgenos fngicos importantes; por ello, debe utilizarse siempreen combinacin con otro medio sin cicloheximida. Los medios de cultivo msempleados en micologa pueden agruparse en dos categoras en funcin de su utilidad:aislamiento e identificacin.

Para el aislamiento, la utilizacin de 3-4 medios prcticamente cubre todas lasnecesidades: AGS con/sin antimicrobianos; un medio con cicloheximida y agar infusincerebro corazn, para las micosis sistmicas endmicas. Para la identificacin, puede sernecesario un nmero mayor de medios que depender del nmero de muestras, lasetiologas ms probables en la zona geogrfica, las posibilidades del laboratorio y elnivel diagnstico esperable segn el tipo de centro.

i. Agar Czapek Dox: se utiliza en el cultivo de hongos saprofitos, especialmenteAspergillus spp.y Penicillium spp. Es el medio de referencia para laidentificacin de Aspergillus spp.

ii. Agar de patata glucosa (APG): es un medio utilizado para la estimulacin de laformacin de conidias, en la preparacin de inculos de hongos miceliales y enla estimulacin de produccin de pigmentos: rojo en Trichosporum rubrum, rosasalmn en Microsporum audouinii y amarillo en Microsporum canis. Se utilizacon frecuencia en microcultivos para observar las caractersticas morfolgicas.

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iii. Agar de Staib. Agar semillas de Nger (Guizottia abyssinica): utilizado paraaislar Cryptococcus spp. y C. neoformans. Este ltimo es el nico que poseefenol oxidasa, que le permite la formacin de un pigmento similar a la melaninaa partir del cido cafeico, un catecol, que posee la semilla. El cloranfenicol loconvierte en medio selectivo. Existen medios semisintticos que incorporan elcido cafeico y evitan la utilizacin de esta semilla.

iv. Agar Dixon modificado: utilizado en el cultivo de Malassezia spp. Puedemodificarse aadiendo cloranfenicol o bien cloranfenicol y cicloheximida.

v. Agar glucosado de Sabouraud modificado por Emmons: es el medio estndarpara el aislamiento, esporulacin y conservacin de muchos hongos. Su pH y laconcentracin de glucosa favorecen la esporulacin.

vi. Agar infusin de cerebro corazn: puede utilizarse como medio enriquecido parafacilitar el crecimiento de C. neoformans a partir de muestras estriles como elLCR y el mantenimiento de la fase levaduriforme de algunas micosis sistmicas,ya sea con sangre o sin ella. En general, est indicado para el aislamiento de unagran variedad de patgenos, incluyendo levaduras, mohos y bacterias comoNocardia. Enriquecido con sangre de carnero al 10%, se utiliza para elaislamiento de todos los hongos, incluyendo los hongos dimrficos. Puedenaadirse antibacterianos (cloranfenicol y/o gentamicina) para convertirlo enselectivo. En algunas ocasiones tambin puede completarse con cicloheximida(facilita el aislamiento de Histoplasma capsulatum y Blastomyces dermatitidis).

vii. Agar inhibidor de mohos: es un medio enriquecido que contiene cloranfenicol ogentamicina, pero no actidiona. Se utiliza en el aislamiento de hongos sensiblesa la cicloheximida (Cryptococcus, zigomicetos, etc.) a partir de muestrascontaminadas. Permite el desarrollo de la mayora de los mohos y de laslevaduras.

viii. Agar Leeming y Notman (ALN): utilizado en el cultivo de Malassezia spp.Puede modificarse aadiendo cloranfenicol o bien cloranfenicol ycicloheximida.

ix. Agar Sabouraud con cicloheximida y cloranfenicol: es un medio selectivoutilizado para el aislamiento de hongos patgenos a partir de muestras muycontaminadas con hongos saprofitos y bacterias. Se utiliza fundamentalmente enel aislamiento de dermatofitos y hongos dimrficos. Inhibe algunas especies de

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hongos de inters mdico (Candida no albicans, Aspergillus, zigomicetos, C.neoformans, etc.).

x. Agar Trichophyton (1 a 7): son siete medios que se utilizan en la identificacinde especies de Trichophyton basndose en sus requerimientos nutricionales.

xi. Agar urea de Christensen: se utiliza en la identificacin de algunos dermatofitos,especialmente Trichophyton rubrum de Trichophyton mentagrophytes y dealgunas levaduras (C. neoformans).

xii. Medios cromognicos para levaduras: contienen diversos sustratos enzimticosque estn unidos a compuestos cromognicos. Muy til para el estudio delevaduras.

xiii. Dermatophyte test medium: medio utilizado para el aislamiento de dermatofitosen muestras muy contaminadas, proporcionando una identificacin presuntiva.Los dermatofitos producen alcalinizacin, virando el medio de amarillo a rojo.Algunas bacterias y algunos hongos tambin pueden producir alcalinizacin.Debido a que se trata de un medio coloreado, no es un medio til para lacaracterizacin de los pigmentos producidos por los dermatofitos. Lacicloheximida inhibe muchos de los hongos saprofitos.

xiv. Agar harina de maz con/sin Tween 80: se utiliza en el cultivo y diferenciacinde especies de Candida basndose en las caractersticas miceliales. El Tween 80se incorpora para demostrar la formacin de clamidoconidias. Si se le aaden 10g de glucosa puede utilizarse en la diferenciacin de T. rubrum y T.mentagrophytes basndose en la produccin de pigmento.

G. INCUBACIN3,4

La temperatura ptima de crecimiento de la mayora de los hongos patgenos es 30 C.Sin embargo, Sporothrix schenckii es una excepcin, crece ms rpido a 2728 C. Haylaboratorios que utilizan la temperatura ambiente en lugar de 30C, pero no esrecomendable, ya que los cambios de temperatura son notables entre el da y la noche enla mayora de los laboratorios. La temperatura de 37C no se recomienda por dosrazones principales: 1) muchas muestras contienen abundantes bacterias que crecen muybien a esta temperatura; 2) algunos hongos crecen mal a esta temperatura o no crecen,especialmente los hongos que infectan la piel. No hay ventaja en incubarsimultneamente a 30C y a 37C. La temperatura de 37C debe reservarse para hongos

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dimrficos o algn hongo que se desarrolle mejor a esta temperatura. No obstante,tambin es necesaria una estufa a 37C para verificar la tolerancia a esta temperatura.Sin embargo, utilizar 37C para el aislamiento del estadio levaduriforme deHistoplasma o Blastomyces no aporta ventajas y, adems, son morfolgicamenteindistinguibles de otras levaduras. Los cultivos de hongos deben incubarse durante 3-4semanas antes de ser desechados, y no deben desecharse cuando se asla un hongo, sinoque debe completarse el periodo de incubacin. Sin embargo, hay muestras que sepueden eliminar antes (por ejemplo, exudado vaginal), a los 7 das, cuando se realizancultivos habituales.

EXAMEN DIRECTO. IDENTIFICACIN DE LOS HONGOS FILAMENTOSOS

La identificacin de hongos filamentosos (mohos) son: el tipo de talo. la morfologamacroscpica del micelio, micelio areo y profundo, es decir, las caractersticascoloniales, tanto de frente como en el reverso. Las colonias de hifas son macroscpicasde variados aspectos y colores(algodonoso, aterciopelado, polvoso). La morfologamicroscpica del micelio se refiere al tipo de hifa estructura y modo de formacin delcuerpo reproductivo sexual, tipo de esporas, tamao, aspecto externo, agrupacin,nmero de clulas, flagelos. Las levaduras forman colonias semejantes a las bacterianas.Para la identificacin de levaduras, se requiere reconocer adems de la morfologa, ladeterminacin de caractersticas fisiolgicas y bioqumicas, especialmente su accinsobre azcares.5

La identificacin de los hongos filamentosos se lleva a cabo por el aspecto de lascolonias y fundamentalmente por la morfologa microscpica del micelio de las esporasy de las estructuras en las que se forman, que suelen ser caractersticas del gnero oincluso de la especie, por tanto, su identificacin se basa en la observacinmicroscpca, aunque algunas caractersticas metablicas pueden ayudar a laidentificacin, particularmente la exigencia en factores esenciales de crecimiento.Cuando se corta con el asa micolgica un fragmento de una colonia micelal y setransfiere a un portaobjetos o incluso si se emplea la tcnica del celo, con frecuencia laestructuras se alteran y fragmentan y no pueden visualizarse intactas, lo que impide lacorrecta identificacin del hongo, aunque permite la diferenciacin entre hongosfilamentosos inferiores y superiores.6

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Para obviar este hecho y poder observar sin distorsin el micelio y las estructuras dereproduccin asexual, es preferible recurrir al microcultivo. La tcnica del microcultivoconsiste en cortar de una Placa Petri con agar Saboraud un dado de 1 cm sobre ydepositarlo sobre un portaobjetos estril situado en otra placa de Petri vaca. A cadalado del cubo de agar se inocula el hongo filamentoso. Se coloca sobre el agar uncubreobjetos y se coloca la tapa de la placa Petri incubndose en ambiente hmedo.Cuando el micelio crece, al cabo de unos das, se expande como una planta trepadorapor la cara inferior del cubreobjetos, el cual puede tomarse con cuidado y ponerse sobreun portaobjetos en el que previamente se haya depositado una gota de colorante decontraste, como el azul de actofenol. as, pueden observarse las estruturas fngicas sindistorsin. Se han comercializaado sistemas que facilitan el desarrollo de esta tcnica.6

La identificacin inicial de los hongos dimrficos suele basarse en las caractersticasmorfolgicas de las estructuras de reproduccin asexual, que se observan sembrando enel hongo en agar Saboraud incubado a 28C, donde crece en la forma

filamentosa(esporulada). Para demostrar sudimorfismo trmico se realizan resiembraen medio con sangre y se incuba a 37Cdurante varios das.2

Consideraciones Generales sobre laidentificacin de los hongosfilamentosos7

Para identificar hongosfilamentosos se requiere una combinacinde:

La velocidad delcrecimiento

Las caractersticasmorfolgicas de las colonias

Las caractersticasmorfolgicas microscpicas

En la mayora de los casos el ltimo item proporciona los datos ms concluyentes parala identificacin. La determinacin de la velocidad de crecimiento puede ser la medidams util cuando se examina el cultivo de un hongo filamentoso pero es posible quetenga un valor limitado porque la velocidad de crecimiento de ciertos hongos vara enfuncin de la cantidad de inculo presente en la muestra clnica. En general la velocidadde crecimiento de los hongosdimorfos como B. dermatidis; h. capsulatum y P.brasiliensis es baja y se requieren de 1 a 4 semanas para que las colonias se tornenvisibles. El crecimiento de C. imunitis suele ser rpido y riesgoso para losbacterilogos. Sin embargo, en algunos casos los cultivos de B. dermatidis e H.capsulatum pueden observarse en el curso de 3 a 5 das, una circunstancia pocofrecuente que se presenta solo cuando hay grandes cantidades de la muestra. Lascolonias de los cigotos pueden aparecer dentro de las 24 horas mientras que los otroshongos hialinos y dematiceos a menudo crecen en 1 a 5 das. En consecuencia, la

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velocidad de crecimiento de un hongo es importante pero debe utilizarse jutno con otrascaractersticas antes de realizar una identificacin definitiva.

Las caractersticas morfolgicas de las colonias pueden tener un valor limitado en laidentificacin de los hongos filamentosos debido a la variacin natural entre losaislamientos y las colonias desarrolladas en medios de cultivo diferentes. SI bien esposible reconocer hongos comunes aislados en formarepetida en el laboratorio , lamorfologa de la colonia es un criterio no fiable y debe utilizarse solo comocomplemento de las caractersticas morfolgicas microscpicas. Deben considerarse lascondiciones de incubacin y los medios de cultivo. Por ejemplo H. capsulatum, que enagar infusin de cerebro y corazn aparece como un hongo filamentoso algodonoso decolor blanco a ocre, puede aparecer levaduriforme cuando se desarrolla en el mismomedio enriquecido con sangre.

En general las caractersticas morfolgicas, microscpicas de los hongos filamentososson estables y su variacin es mnima. l identificacin definitiva se basa en la formacaracterstica, en el modo de reproduccin y en la dispocisin de las esporas; sinembargo el tamao de las hifas tambin proporcionainformacin til. La hifas grandessimilares a cintas y con pocos tabiques de los cigomicetos, se reconocen con facilidadmientras que las hifas pequeas (de alrededor de 2 um de dimetro) pueden sugerir lapresencia de un hongo dimrfico o de un dermatofito.

IDENTIFICACION DE LEVADURAS DE IMPORTANCIA CLINICA

La identificacin de la especie de toda levadura aislada en sangre o en cualquier otrolquido corporal estril est plenamente justificada. Sin embargo, debido a que losorganismos levaduriformes forman parte de la flora normal de piel y mucosas, elaislamiento de levaduras a partir de hisopos nasofarngeos, esputo, lavados bronquiales,orina, raspados de uas, muestras vaginales o heces puede cuestionar su significadoclnico. No obstante, el aislamiento reiterado de levaduras en diferentes muestrasclnicas del mismo paciente es sugestivo de infeccin por el microorganismo aislado yrequiere la identificacin de la especie causal.

1- IDENTIFICACION MEDIANTE CRITERIO MORFOLOGICO

1.1.Criterios macroscpicos

Estos criterios tienen en cuenta el aspecto de las colonias de levaduras al crecer en losdiferentes medios de cultivo.La mayora de los organismos levaduriformes crecen fcilmente en un gran nmero demedios de cultivo usados rutinariamente en el laboratorio de Microbiologa (agarsangre, agar chocolate, agar Cled, etc.). Sin embargo, el agar glucosado de Sabouraud(SDA), con o sin antibiticos aadidos, es el medio de aislamiento por excelencia parala identificacin de levaduras.

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En el medio SDA las colonias de levaduras suelen ser completas, ligeramenteabombadas o planas, de consistencia mantecosa, lisas (Figura 11.1) o rugosas (Figura11.2), con olor dulzn agradable, volvindose ms pastosas a medida que envejecen.Por lo general las colonias de levaduras no desarrollan micelio areo, aunque enocasiones pueden aparecer prolongaciones aracneiformes en la periferia de las colonias.Si se observa un micelio areo definido, debe considerarse la posibilidad de que se tratede un hongo dimrfico o de ciertas especies de levaduras que pueden formar micelioverdadero como Geotrichum (Figura 11.3), Galactomyces, Trichosporon (Figura 11.4)o Blastoschizomyces (su teleomorfo Dipodascus).

Una colonia de aspecto y consistencia mucoide sugiere la formacin de cpsulas ypuede ser el paso inicial para la identificacin de Cryptococcus neoformans (Figura11.5).

Las colonias de color rojo-anaranjado o naranja, de aspecto cremoso o rugoso, soncaractersticas de las especies del gnero Rhodotorula (del gr. rhodo, rojo) (Figura 11.6)y Sporobolomyces (anaranjado), color que manifiestan estas levaduras por su riqueza encarotenoides. Pero no todas las colonias blancas y cremosas son levaduras; las especiesde algas acloroflicas del gnero Prototheca, tras incubacin a 28 C durante 3-4 das,desarrollan unas colonias blancas cremosas muy parecidas a las producidas por elgnero Candida (Figura 11.7).

1.2. Criterios microscpicosCiertas caractersticas microscpicas son muy tiles para la identificacin de algunasespecies de levaduras. Las ms utilizadas en la prctica son las siguientes:

Prueba del tubo germinal o filamentacin precoz.- El tubo germinal es unaextensin filamentosa de la levadura, sin estrechamiento en su origen, cuyo ancho sueleser la mitad de la clula progenitora y su longitud tres o cuatro veces mayor que laclula madre. (Figura 11.8).

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Slo C. albicans es capaz de producir verdaderos tubos germinales; sin embargo, otrasespecies como C. tropicalis pueden producir pseudohifas precoces de aspecto similar alos tubos germinales pero con una zona de constriccin caracterstica adyacente a laclula madre, por lo que esta prueba es til para diferenciar C. albicans del resto de lasespecies de Candida, aunque no est exenta de falsos negativos.

Metodologa1. Emulsionar una porcin de la colonia aislada en 0,5 ml de suero humano o de conejo.2. Incubar a 35 C durante 2 h.3. Depositar una gota de la emulsin sobre un portaobjetos limpio y desengrasado,colocar un cubreobjetos y visualizar a x100, x400 x1.000. Interpretacin: La pruebaes positiva si se visualizan tubos germinales (Figura 11.8). Variante: Adems de latcnica con suero, el test de filamentacin puede realizarse utilizando otros medios decultivo:

a) Plasma de conejo: Berardinelli y Opheim, describieron un medio de induccin detubos germinales constituido por tres partes de coagulasa plasmtica de conejo conEDTA (BBL Microbiology Systems) y dos partes de caldo Try-Soy (Scott Laboratories,Inc). La inoculacin, incubacin e interpretacin son similares a la tcnica con suero.b) Medio de cultivo slido Oxgall-Tween-cido cafeico (TOC): [Oxgall 10 g, agar20 g, Tween 80 (solucin al 10%) 10 ml, cido cafeico 0,3 g, agua destilada 1.000 ml].La utilizacin de este medio permite la visualizacin del tubo germinal y tambin declamidosporas [2]. Para su realizacin se estra una pequea porcin de la colonia sobreal agar TOC y a continuacin se coloca con suavidad un cubre-objetos estril(flamendolo suavemente) sobre la superficie inoculada (para evitar la acumulacin dehumedad es preciso no presionar el cubre-objeto sobre a superficie del agar). Se incubaa 35 C, en 10% de CO2, durante 2 h, manteniendo la tapa de la placa ligeramenteabierta para que todo el cultivo sea alcanzado por el CO2. La prueba es positiva si sevisualizan los tubos germinales en la zona de inoculacin a bajo aumento (x100- x400).

Formacin de hifas, blastoconidias, clamidosporas y artrosporas.- Laformacin de hifas, blastoconidias, clamidosporas o artrosporas por parte de laslevaduras constituye una caracterstica morfolgica de gran importancia para laidentificacin de algunas especies de levaduras.Ante la presencia de estructuras con aspecto de hifas, lo primero que hay quedeterminar es si se trata de pseudohifas (resultantes del proceso de formacin deblastoconidias y, por tanto, con puntos regulares de estrechamiento) o, por el contrario,son verdaderas hifas que se fragmentan en artroconidias. Si el desarrollo en mediosespeciales (ver ms adelante) revela la presencia de seudohifas y blastoco-nidias, lalevadura a identificar pertenece a alguna especie del gnero Candida. Si por elcontrario, revela verdaderas hifas y artroconidias, lo ms probable es que se trate deespecies de Trichosporon, Geotrichum, Galactomyces o Blastoschizomyces.Trichosporon y Blastoschizomyces producen tanto artroconidias como blastoconidias;estas ltimas nacen en brotes de los ngulos de las artroconidias adquiriendo la formacaracterstica de oreja de conejo (Figura 11.9). Las especiesGalactomyces geotrichum (Geotrichum candidum) y Blastoschizomyces capitatus(Geotrichum capitatus) tambin producen blastoconidias a partir del ngulo de laartroconidia, pero, en este caso, forman una estructura denominada palo de hockey(Figura 11.10). C. tropicalis produce pequeas cantidades de blastoconidias, muyesparcidas o en pequeos grupos a lo largo de las hifas. Sin embargo, C. parapsilosis,

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C. kefyr y C. krusei se ordenan a lo largo de una corriente de blastoconidias, siendo estala caracterstica que permite su identificacin; adems, algunas cepas pueden producirhifas gigantes.Las clamidosporas son formas de resistencia, redondas u ovales, de 6-12 m dedimetro y pared gruesa, con aspecto de esporas laterales o terminales. Su produccin escaracterstica y diagnstica de C. albicans [3] (Figura 11.11). Tambin puede hacerseuna identificacin presuntiva de esta especie si se observa la formacin de gruposcompactos de blastoconidias, a intervalos regulares, a lo largo de la pseudohifa.

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2. Identificacin mediante criterios bioqumicos

2.1. Criterios bioqumicos enzimticos

Medios cromognicos

Estos medios estn diseados para el aislamiento e identificacin de algunas especiesdel gnero Candida tras su incubacin a 30-37 C durante 24 a 48 h.El fundamento de los mismos se basa en la deteccin de determinadas actividadesenzimticas por parte de las levaduras mediante la hidrlisis especfica de un sustratocromognico en presencia de un indicador de la enzima. Una de las principales ventajasde estos medios es permitir diferenciar fcilmente los cultivos mixtos.Estos medios pueden ser utilizados como medios de aislamientos primarios o con finesde identificacin, despus del aislamiento de los organismos levaduriformes en losmedios convencionales. Aunque, segn nuestra experiencia, slo debera utilizarsecomo medio de aislamiento primario en aquellas muestras con alta sospecha de micosispor levaduras.

CHROMagar Candida

El medio CHROMagar Candida (CHROMagar) fue descrito por Odds y Bernaerts en1994 para identificar las especies clnicamente importantes del gnero Candida [6].CHROMagar Candida permite diferenciar C. albicans, C. tropicalis, C. krusei, y C.glabrata en funcin de los colores que desarrollan en este medio.La siembra se realiza segn las tcnicas tradicionales y las placas se incuban a 30-37 Cdurante 48 h para que las levaduras desarrollen completamente el color. Al cabo de estetiempo, las colonias de C. albicans son lisas y de color verde esmeralda, a diferencia deC. dubliniensis que desarrolla un color verde oscuro y que, adems, es incapaz de crecera 45 C [7]. C. tropicalis produce colonias azul oscuro con un halo prpura-marrn enel agar que la rodea. C. krusei forma colonias rugosas con el centro rosado y el bordeblanco. C. glabrata manifiesta un color violeta morado. Las dems especies desarrollancolores y tonalidades diversas que no permiten su identificacin por este medio (Figuras11.16 y 11.17).

COLOREX Candida

Colorex Candida (Biomedics) es un nuevo medio cromgenico y diferencial quefacilita la identificacin presuntiva de algunas de la levaduras de mayor importancia enclnica (C. albicans, C. tropicalis y C. krusei).La siembra se realiza segn las tcnicas habituales y las placas se incuban a 30-37C,segn el origen de la muestra, durante 24-48 h. En este medio, C. albicans desarrollacolonias verdes, C. tropicalis azules-grisceas y C. krusei colonias rosas rizadas.

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Cromogen Albicans

Cromogen Albicans (Biomedics) es un medio diferencial y selectivo utilizado para elaislamiento e identificacin de C. albicans en muestras vaginales, rectales, escamas,orina, pus, escobillonadosbucales, etc. La siembra se realiza segn las tcnicas habituales y las placas se incuban a30-37 C, segn el origen de las muestras, durante 24-48 h. Las colonias de C. albicansadquieren un color azul verdoso caracterstico, dependiendo del periodo de incubacin yla temperatura, con formas redondeadas, lisas y ligeramente elevadas. Las otras especiesde levaduras aparecen de color blanco cremoso y necesitan una identificacinbioqumica posterior.

Candida ID

El medio Candida ID (bioMrieux) es un medio cromognico que permite elaislamiento de organismos levaduriformes, la identificacin presuntiva de C. albicans ycierta orientacin para la identificacin de otras especies no albicans. La inoculacin eincubacin son similares a las descritas para otros medios cromognicos.En Candida ID, las colonias de C. albicans son redondeadas, ligeramente convexas,lisas, de bordes netos y de color azul (cuya intensidad vara en funcin del tiempo deincubacin). Las colonias de C. tropicalis, C. lusitaniae, C. guilliermondii y C. kefyrdesarrollan un color rosa a las 48 h de incubacin.Otras especies, como C. famata, C. humicola, y Cryptococcus neoformans, puedenoriginar colonias rosas ms o menos intensas. El resto de las especies desarrolla uncolor blanco-crema, requiriendo una identificacin bioqumica posterior (Figura 11.18).

Albicans ID2

El medio Albicans ID2 (bioMrieux) es muy parecido al anterior. Se ha enriquecido lafrmula para facilitar el aislamiento y la identificacin de las colonias de C. albicansque desarrollan un color azul ms intenso. Adems, permite, la identificacin presuntivade C. tropicalis ya que presenta una tonalidad verdosa en este medio. Las colonias delas dems especies son de color blanco. La inoculacin e incubacin son similares almedio anterior.

Candida ID2 (CAN2)

El medio Candida ID 2 (bioMrieux) es un medio cromognico destinado al aislamientoselectivo de levaduras, identificacin de la especie C. albicans y diferenciacinpresuntiva de un conjunto de especies como C. tropicalis, C. lusitaniae y C. kefyr. Estemedio se ha presentado como una modificacin de la formula anterior (medioCandidaID-CA) . La inoculacin e incubacin se llevar a cabo igual que en los casosanteriores, tras 24-48 h. a 30-37C, se observar el color de las colonias. Azul plido aazul oscuro es propio de C. albicans; rosa es caracterstico de C. tropicalis, C.lusitaniae y C. kefyr, la identificacin de estas especies debe continuarse por pruebasbioqumica y/o inmunolgicas. Las colonias de color blanco crema no puedenidentificarse de forma presuntiva por lo que deben utilizarse tcnicas bioqumicas y/oinmunolgicas

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CandiSelect

El medio CandiSelect (Bio-Rad) es un medio selectivo que permite la identificacin deC. albicans mediante la hidrlisis del sustrato cromognico presente lo que origina eldesarrollo de un color azul por las colonias de esta especie. La inoculacin e incubacinson similares a los otros medios romognicos. C. albicans se identifica por la presenciade colonias lisas azules y el resto de las levaduras manifiesta un color blanco en suscolonias. A las 48 h de incubacin, algunas cepas de C. tropicalis y Trichosporon spp.Pueden tambin desarrollar colonias azules, pero morfolgicamente son diferentes a C.albicans.

Fluoroplate Candida

El Agar Fluoroplate Candida (Merck) permite identificar macroscpicamente C.albicans por su capacidad de hidrolizar el sustracto 4-metilumbeliferil- N-acetil--D-galactosaminida, por la enzimaN-acetil-galactosaminidasa (NAGasa), originando una fluorescencia blanquecina aliluminar la placa con luz ultravioleta. El resto de las especies no presenta fluorescencia.La siembra en este medio se realiza de forma convencional y las placas se incuban a 30-37 C durante 18-24 h. La lectura se realiza, en la oscuridad, colocando las placas sobreun transiluminador de luz ultravioleta de 365 nm (Linus).

2.2. Identificacin basada en mtodos de asimilacin de nutrientes

Auxonograma convencionalSe fundamenta en la aplicacin por separado de diferentes nutrientes, hidrocarbonados onitrogenados, sobre un medio sinttico base para apreciar el crecimiento selectivo deuna levadura en la cercana de los nutrientes necesarios para su desarrollo. Para surealizacin pueden emplearse soluciones acuosas esterilizadas por filtracin, cilindrosde Oxford en pocillos hechos en el agar o bien discos de papel absorbente empapadoscon el nutriente. Sin embargo, las pruebas de asimilacin en medios lquidos no ofrecenninguna ventaja adicional sobre los medios slidos, resultando mucho ms laboriosas ycostosas.Medios de cultivo base. Se prepararan segn la tcnica habitual y no necesitan ajustarel pH. Se expenden deshidratados como media base de levaduras.

Auxacolor

La galera Auxacolor (Bio-Rad) es un sistema de identificacin basado en la asimilacinde 13 azcares que permite identificar 26 especies diferentes de levaduras. Elcrecimiento de la levadura se visualiza por el cambio de un indicador de pH. La galeraincorpora, adems, una prueba de resistencia a la actidiona y otra para la deteccin de laactividad fenol-oxidasa de C. neoformans.

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Sistema Uni-Yeast-Tek

El sistema Uni-Yeast Tek (Remel) est constituido por una placa plstica con mltiplescompartimentos que contienen un medio con agar para la asimilacin diferencial desiete hidratos de carbono.Tambin incorpora una cubeta central con agar harina de maz-Tween 80 paradeterminar el crecimiento micelial y la produccin de clamidosporas. Adems, estprovisto de agar urea, agar para la asimilacin y reduccin de nitratos y de un caldo conextracto de carne al 2,6% (con 0,05% de glucosa) para realizar la prueba del tubogerminal.

2.3. Sistemas semiautomticos

En la actualidad se han comercializado diversos mtodos de asimilacin de nutrientesque simplifican tanto su uso como su interpretacinAPI 20C AUX

La galera API 20 C AUX (bioMrieux) se compone de 20 cpulas con sustratosdeshidratados que permiten realizar 19 pruebas de asimilacin. Las cpulas se inoculancon un medio mnimo semislido y las levaduras slo se reproducen si son capaces deutilizar el sustrato correspondiente.Permite identificar un total de 34 especies diferentes. La lectura de estas reacciones sehace por comparacin con un control de crecimiento y la identificacin se obtiene, apartir de un cdigo numrico, mediante un catlogo analtico o un programainformtico.

Galera ID 32C

La galera ID 32 C (bioMrieux) est compuesta por diferentes pruebas de asimilacin ypor una base de datos especialmente adaptada. Permite identificar 63 especies diferentesde organismos levaduriformes o relacionados y puede ser utilizada manualmente o biende forma automatizada mediante los sistemas ATB Expression o mini API.La galera se compone de 32 cpulas: 29 contienen cada una un sustrato carbonadodeshidratado, una es el control negativo, otra detecta la sensibilidad a la cicloheximida yla ltima es una prueba colorimtrica para la esculina. El procedimiento para lainoculacin de la galera, incubacin e interpretacin es similar al descrito para elsistema API 20 C AUX. La nica diferencia es la posibilidad de realizar la lectura de lagalera, de forma automtica, mediante el sistema ATB Expression o mini API.

Sistema Vitek

Las tarjetas Yeast Biochemical Card (YBC) del sistema Vitek (bioMrieux) permiten laidentificacin de organismos levaduriformes y afines de forma automatizada. Son unastarjetas plsticas desechables que incluyen 30 celdillas: 26 pruebas bioqumicasconvencionales y 4 controles. Por otra parte, el sistema Vitek consta de un mdulo concmara de vaco para inoculacin de las tarjetas, un lector/incubador, un sistemaautomtico de manipulacin de tarjetas, un fotmetro para medir la densidad ptica, unordenador central y una impresora.El sitema Vitek permite identificar 36 especies diferentes de levaduras: 16 especies delgnero Candida, 6 Cryptococcus, 3 Rhodotorula, 2 Trichosporon, 3 Geotrichum, 2

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Prototheca, Hansenula anomala, Pichia ohmeri, Saccharomyces cerevisiae y Yarrowialipolytica.

2.4. Sistemas automticos

Sistema Vitek 2

El sistema Vitek 2 (bioMrieux) es un sistema totalmente automtico para la deteccindel metabolismo fngico que puede identificar levadu-ras y organismos afines en tanslo 15 h. Est basado en ecnologa de fluorescencia y se compone de las tarjetas deanlisis con 63 pocillos, una consola satlite para la recogida de informacin, unmdulo incubador, un mdulo principal donde se procesa la informacin gracias a unsoftware de anlisis y un sistema experto avanzado.

2.5. Identificacin rpida de levaduras mediante pruebas bioqumicas yenzimticas

RapID Yeast Plus System

El RapID Yeast Plus System (Remel) es un sistema compuesto por un panel de 18pocillos; cada uno contiene un sustrato convencional o cromognico que detecta laasimilacin de carbohidratos, cidos orgnicos o aminocidos, as como la hidrlisis dela urea y de cidos grasos. Permite identificar hasta 43 especies de levaduras.

Fongiscreen 4H

Fongiscreen 4H (Bio-Rad) es un sistema basado en el estudio del perfil enzimtico dealgunas levaduras, permitiendo identificar en 4 h C. albicans, C. glabrata, C. tropicalisy C. neoformans. La utilizacin de sustratos deshidratados por las enzimas fngicas semanifiesta por un cambio de color, ya sea espontneamente o despus de aadir unreactivo revelador.

3. Identificacin mediante criterios inmunolgicos

3.1. Bichro-latex albicans

Bichro-latex albicans (Fumouze) es un mtodo para la identificacin rpida deaislamientos C. albicans por aglutinacin de partculas ltex utilizando un anticuerpomonoclonal especfico de C. albicans.

a) bolas de ltex recubiertas con anticuerpos monoclonales que reaccionanespecficamente con el antgeno de C. albicans localizado en su pared celular, yb) un agente disociante que permite la exposicin al antgeno.

3.2. Krusei-color

Krusei-color (Fumouze) es un mtodo para la identificacin de aislamientos de C.krusei por aglutinacin de partculas de ltex, mediante un anticuerpo monoclonal quereacciona especficamente con el antgeno localizado en su pared.

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3.3. Bichro-Dubli

Bichro-Dubli (Fumouze) es un mtodo para la identificacin rpida de C.dubliniensis, basado en la coaglutinacin de blastosporas de esta especie con partculasde ltex recubiertas con anticuerpos monoclonales, el cual permite la deteccinespecifica de un antgeno de C. dubliniensis localizado en la superficie de la clula. Laemulsin de colonias de C. dubliniensis en el reactivo Bichro-Dubli revela unacoaglutinacin, visible a simple vista, entre las blastosporas que portan el antgeno y lasparticulas de ltex sensibilizadas con anticuerpos monoclonales, aglutinados azules queprogresivamente se extienden hacia la periferia, formando un borde azul alrededor de unrea central roja/rosa.

11.5. Identificacin de levaduras lipfilas

Debido a su requerimiento de cidos grasos, las levaduras lipfilas no pueden seridentificadas con los sistemas y medios habituales para otras levaduras, por lo que suidentificacin merece un comentario diferenciado.Durante mucho aos se ha venido utilizando el binomio Malassezia furfur para designarla fase micelial de las levaduras lipfilas encontradas en la piel humana, en tanto sereservaban los trminos Pityrosporum ovale y Pityrosporum orbiculare para los dostipos morfolgicos de la fase levaduriforme.La taxonoma del gnero Malassezia ha sido recientemente revisada y comprende en laactualidad siete especies: M. furfur, M. pachydermatis, M. sympodialis, M. globosa, M.obtusa, M. restricta y M. slooffiaeEs factible recuperar estos microorganismos en cultivos en SDA o en agar sangre decarnero al 5% si los cubrimos con cidos grasos de cadena larga, como los contenidosen el aceite de oliva. Tras incubacin a 35 C durante 2 a 4 das se desarrollan unascolonias de consistencia cremosa muy parecidas a las producidas por las otraslevaduras.Adems de los medios suplementados, tambin se puede utilizar medios especficospara el aislamiento de las especies de este gnero, como son el medio Agar de Dixonmodificado y el de Leeming. A partir de su crecimiento en estos medios, laidentificacin de las especies de Malassezia se lleva a cabo mediante criteriosmicroscpicos y bioqumicos [13]. Entre estos ltimos: produccin de catalasa;crecimiento en SDA o suplementado con lpidos a 32 C; crecimiento en Agar Dixonmodificado a 32 C, 37 C y 40 C; utilizacin de Tween 80, Tween 40 y Tween 20. (8)

FUNGIGRAMA:

Las levaduras del gnero Cndida se encuentran ampliamente difundidas en lanaturaleza. maz, agar papa, caldo para ureasa y suero en la humano para filamentacin.Son componentes naturales de la microbiota en las personas entrndose en piel, boca,intestino y genitales.

Est reportado que un 75% de la poblacin femenina presentar por lo menos unepisodio de vulvovaginitis por Cndida en su vida.

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El gnero Candida es un grupo de levaduras muy difundidas en la naturaleza, que puedecausar patologas en el ser humano, siendo una de las ms habituales la vulvovaginitis.Si bien, Candida albicans se asla con mayor frecuencia, en los ltimos aos ha habidoun incremento en los aislamientos de Candida glabrata, Candida guillermondii yCandida krusei. Estos microorganismos presentan sensibilidad disminuida o nula alFluconazol. Es por eso que el objetivo es caracterizar las diferentes especies de candidashalladas en muestras de exudado vaginal, y evaluar la sensibilidad a los antifngicos delas especies de candida no albicans encontradas.

El diagnstico definitivo en pacientes con sospecha clnica de onicomicosis se realizacon KOH y microcultivo y se instituye el perfil de sensibilidad a antifngicos comoalilamnicos e imidazlicos. 9

Las enfermedades micticas adquiridas como padecimiento secundario por uso defrmacos inmunosupresores, aplicacin de tcnicas invasivas (catteres intravenosos) yportadores de enfermedad primaria con inmunosupresin (diabetes, lupus eritematososistmico, etctera) han aumentado considerablemente. Las ms importantes son lasmicosis superficiales por la cantidad de consultas mdicas y costos que generan;mientras que las sistmicas, adems de afectar piel y faneras, involucran rganos cuyaafeccin pone en riesgo la vida del paciente. 9

El tratamiento est afectado por aparicin de resistencia a los antifngicos de usofrecuente, su relativa alta toxicidad y uso de antimicticos en proceso de investigacin.Todos estos parmetros aumentan la poblacin susceptible de adquirir infeccinfngica, ocasionan cambios en la epidemiologa, agravamiento del diagnstico nitratamiento de las mismas; an ms si la eleccin teraputica habitual no tiene evidenciadel agente etiolgico ni su sensibilidad/resistencia a drogas de uso habitual.En este contexto, es importante el papel de apoyo diagnstico y decisin teraputicadado por los laboratorios de micologa.10

SEMINARIO N02


REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

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SEMINARIO N02


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http://www.revistabioanalisis.com/arxius/notas/cr1A7WLV.pdf

11. Onicomicosis: agente causal, correlacin clnica y sensibilidad a alilamnicos eimidazlicos. 2011. Acceso: 20/04/2014. Disponible en:

http://www.medigraphic.com/pdfs/patol/pt-2011/pt114f.pdf

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