Inhibidores enzimáticos
Descubrimiento de Drogas
Compuesto Líder:
Prototipo a mejorar.
Tienen características indeseadas: Toxicidad, insolubilidad, inestabilidad, pobre
absorción oral, etc.
Cómo se llega a ese Compuesto Líder?
Ensayos
“in vivo” ej: ensayo directo en ratones
“in vitro” ej: inhibición de una enzima
Descubrimiento de Drogas
Descubrimiento de Compuesto Líder
1.- Screening al azar (Random screening)
Screening
al azarcompuestos síntéticos
Productos naturales
Ej: muestras tomadas del suelo llevaron al descubrimiento de
antibióticos como streptomicina y tetraciclinas.
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Descubrimiento de Compuesto Líder
2.- Screening racional
Menos indiscriminado. Ej: compuestos de estructura parecida a otro
compuesto muy débilmente activo, compuestos con diferentes grupos
funcionales, evitando grupos que produzcan toxicidad.
3.- Estudio del metabolismo de las drogas conocidas
Metabolitos de drogas son los productos de degradación de las drogas
“in vivo”.
Se estudia si éstos o la droga en sí misma es la causante de la
actividad
Descubrimiento de Drogas
Descubrimiento de Compuesto Líder
4.- Observaciones clínicas
Drogas para una enfermedad pueden ser finalmente útiles para otra a
partir de los efectos secundarios.
Ej:
Primero antihistamínico, ahora se utiliza para
prevenir mareos
Primero antibacteriano, ahora antidiabético
Descubrimiento de Drogas
Descubrimiento de Compuesto Líder
5.- Diseño racional
Primero se deben conocer las causas bioquímicas de la enfermedad
Reconocido el sistema bioquímico interviniente, el diseño racional tomará el
sustrato natural de la enzima o el agonista del receptor como primer compuesto
líder.
• Invasión organismo externo (inhibidores o
interferencia en la biosíntesis)
• Crecimiento desproporcionado de células
(objetivo: ADN)
• Desbalance de un determinado compuestos químico
(corregido por un inhibidor o antagonista)
Descubrimiento de Drogas
Descubrimiento de Compuesto Líder
5.- Diseño racional
Ej:
progesterona 17b-estradiol
La hormonas esteroidales progesterona y 17b-estradiol fueron
compuestos líderes hacia el descubrimiento de los contraconceptivos
norgestrel y 17a-etinilestradiol
norgestrel
17a-etinilestradiol
Descubrimiento de Drogas
6.- Diseño de fármacos asistido por computadora
Screening virtual basado en el ligando
Descubrimiento de Drogas
6.- Diseño de fármacos asistido por computadora
“Docking”
Descubrimiento de Drogas
7.- Química Combinatoria
Descubrimiento de Drogas
Resistencia a los fármacos
Mecanismos de resistencia:
1.- Evitar la llegada de la droga al sitio de acción
Ej: cambio en la carga de la membrana plasmática
Sinergismo de fármacos
Antes de entrar de lleno a tratar el tema de los inhibidores enzimáticos
debemos detenernos a analizar dos puntos de importancia en cuanto al
diseño y acción de fármacos son:
Mecanismos de resistencia:
Descubrimiento de Drogas
Mecanismos de resistencia:
2.- Sobreproducción de la enzima
Resistencia causada por alteración de la
dihidrofolato reductasa (el sustrato se sigue
uniendo…)
La droga induce copias extras del gen que codifica la enzima
3.- Alteración de la enzima o sitio de acción
Efecto: unión más debil enzima-inhibidor
Ej: antibacteriano trimetoprima
Ej: dihidrofolato reductasa
trimetoprima
Descubrimiento de Drogas
Mecanismos de resistencia:
4.- Producción de una enzima destructora de la droga
Las b-lactamasas destruyen los compuestos b-lactámicos y evitan su acción
Ej: b-lactamasas
Descubrimiento de Drogas
Mecanismos de resistencia:
5.- Supresión de la enzima que activa la prodroga
Especialmente en el caso de antitumorales….
Resistencia a la 6-mercaptopurina, droga contra la leucemia, por supresión de
la enzima que lo activa (hipoxantina fosforibosil transferasa)
Prodroga:
Compuesto farmacológicamente inactivo
que se activa por transformación
metabólica en el organismo
Descubrimiento de Drogas
Mecanismos de resistencia:
6.- Superproducción del sustrato de la enzima
Es una forma común de resistencia a las sulfas.
Las bacterias aumentan la producción del ácido p-aminobenzoico, que es el
sustrato de la dihidropterato sintetasa.
7.- Nuevo camino para la obtención del producto que cataliza la enzima
objetivo
El organismo sintetiza el metabolito por un camino alternativo…..
Inhibidor reversible, por lo tanto varía el equilibrio enzima-inhibidor
Descubrimiento de Drogas
Sinergismo:
Dos o más drogas suministradas en combinación producen un efecto mayor
que la suma de cada una usada individualmente
Ejemplos de sinergismo
Ej: Acido clavulánico y amoxicilina
1.- Inhibición de la enzima que destruye la droga:
El sinergismo es una herramienta frente a los problemas de resistencia…
Descubrimiento de Drogas
Sinergismo:
Inhibición de más de un paso del camino metabólico.
Se usa con inhibidores reversibles. Se evita el uso de gran exceso de droga que
podría ser tóxico (disminuye las posibilidades de resistencia)
2.- Bloqueo secuencial
Cuando hay más de una ruta metabólica para un mismo metabolito
3.- Inhibición de enzimas de diferentes caminos metabólicos
Para células tumorales o bacterias mutantes.
En promedio 1 de cada 107 bacterias resisten una droga,
1 de cada 1014 resisten dos drogas y
1 de cada 1021 resisten tres drogas…
4.- Varias drogas para el mismo objetivo
Minimiza la posibilidad que bacterias mutantes resistentes proliferen…..
Descubrimiento de Drogas
Sinergismo:
Para células tumorales o bacterias mutantes.
En promedio 1 de cada 107 bacterias resisten una droga,
1 de cada 1014 resisten dos drogas y
1 de cada 1021 resisten tres drogas…
4.- Varias drogas para el mismo objetivo
Minimiza la posibilidad que bacterias mutantes resistentes proliferen…..
Antituberculoso
Inhibición Enzimática
Porqué inhibir una enzima?
Los inhibidores enzimáticos son los más prometedores en cuanto al
diseño racional de drogas se refiere:
• Enzimas fáciles de purificar (más fáciles que los receptores)
• Generalmente la estructura del inhibidor similar al sustrato
• Conocimiento del mecanismo de acción de enzimas puede
usarse para diseñar distintos tipos de inhibidores
Inhibidor ideal: es aquel que sólo inhibe la enzima requerida.
En la realidad no existe el inhibidor ideal, se buscan inhibidores de alta selectividad
Alta selectividad → enfermedades infecciosas (diferentes metabolismos del
organismo extraño y el hospedador). Ej: penicilinas
Baja selectividad → células tumorales (diferenciación difícil)
Inhibición Enzimática
Clasificación de inhibidores
Existen varias clasificaciones según qué se toma en cuenta.
Generalmente los límites entre las diferentes clases de inhibidores no son muy
claros
1.- Reversibilidad
Reversibilidad
Irreversibles (generalmente covalentes)
Reversibles (generalmente no covalentes)
Inhibición Enzimática
Clasificación de inhibidores
2.- De acuerdo a la competitividad (reversibles)
No competitivos: Cuando el inhibidor induce cambios
conformacionales en la enzima que hacen que ésta no
se pueda unir correctamente al sustrato
Competitivos: compiten con el sustrato por el sitio activo
No se puede diseñar un inhibidor no competitivo….
Inhibición Enzimática
Clasificación de inhibidores
3.- Fuerza y velocidad de la interacción (reversibles)
1.-Clásicos (unión rápida)
2.- Unión fuerte
3.- Unión lenta
4.- Unión lenta y fuerte
4.- Por analogías (reversibles)
Análogos del estado de transición
Análogos del multisustrato
Inhibición Enzimática
Clasificación de inhibidores
5.- Clasificación de inhibidores irreversibles
Marcadores de afinidad (compuestos de afinidad marcada)
Basados en el mecanismo
Inhibición Enzimática
Inhibidores reversibles competitivos
Los más comunes. Compiten con el sustrato por el sitio activo
El equilibrio depende de la [E], [S] y [I], como [E] es constante y baja, depende
de [S] y [I].
[I] alta: equilibrio hacia
[I] baja: equilibrio hacia
Efecto farmacológico: [I] alta (saturación del sitio activo).
Requiere administración repetida
Inhibición Enzimática
Inhibidores reversibles competitivos
El diseño de un inhibidor es típicamente de un inhibidor reversible competitivo,
tomando como compuesto líder al sustrato natural de la enzima.
Si se conoce la estructura tridimensional de la enzima (cristalografía de rayos
X), la propia enzima se puede tomar como el “líder”, utilizando el diseño de
fármacos asistido por computadora
Inhibición Enzimática
Inhibidores reversibles competitivos. Ejemplos
Drogas antihipercolesterolémicas:
● Inhibidores de la absorción de colesterol adquirido en la dieta.
● Inhibidores de la biosíntesis de colesterol
(Compactina y Mevinolina)
Colesterol Aterosclerosis colesterol
Inhibición Enzimática
● Inhibidores de la biosíntesis de colesterol
(Compactina y Mevinolina)
El paso determinante de la biosíntesis del colesterol es la conversión de la 3-hidroxi-3-
metilglutaril coenzima A (HMG-CoA, 5.68) en ácido mevalónico (5.69). Esta reacción es
catalizada por la HMG-CoA reductasa
colesterol
Inhibición Enzimática
Ki (Compactina) = 1.4 x 10-9 M
Ki (Mevinolina) = 6.4 x 10-10 M
Km (sustrato) = 10-5 M
● Inhibidores de la biosíntesis de colesterol
(Compactina y Mevinolina)
En 1976 en Japón se descubrieron, luego de analizar compuestos obtenidos de 8000
cepas de microorganismos (screening al azar), dos inhibidores de la HMG-CoA
reductasa: la Compactina (5.18) y luego otro más activo mevinolina (o lovastatina)
(5.19)
Mecanismo de acción:
Potentes inhibidores reversibles competitivos:
Km= cte. disociación del
complejo enzima-sustrato
Afinidad 7000 a 16000 veces
mayor que el sustrato
Inhibición Enzimática
● Inhibidores de la biosíntesis de colesterol (Compactina y Mevinolina)
El inhibidor real es 5.20 (producto de la
hidrólisis de 5.18 o 5.19)
Esta gran afinidad tiene que ver con la similitud entre
etapas del proceso biosíntético y el inhibidor 5.20
(comparar con 5.70)
Inhibición Enzimática
● Inhibidores de la biosíntesis de colesterol (Compactina y Mevinolina)
La forma activa 5.20 se asemeja al
intermediario 5.70 por lo que algunos
autores clasifican a estos inhibidores como
análogos del estado de transición
La forma activa de la compactina tiene
DOS sitios de unión:
●Parte superior: se une al dominio HMG
(hidroximetil glutaril)
●Parte inferior (decalina): se une a un
bolsillo hidrofóbico de la enzima.
Scheme 5.4
Inhibición Enzimática
● Inhibidores de la biosíntesis de colesterol (Compactina y Mevinolina)
MODIFICACIONES ESTRUCTURALES (SAR)
Debe abrirse la lactona, formarse el carboxilato y el OH
debe tener configuración eritro
Puente lactona-decalina no mayor de dos carbonos
Modificación de decalina baja la potencia (salvo bifenilos
análogos)
SH o NH2 dan menor potencia que OH
Agregado de metilo alfa al éster aumenta la potencia
(compuesto comercial)
Epímero en C-5 es inactivo
C-5 ceto es activo (reducción a compactina por la
enzima)
Inhibición Enzimática
● Inhibidores reversibles competitivos. ANTIHIPERTENSIVOS
Sistema Renina-Angiotensina
Captopril, Enalapril, Lisinopril (inhibidores de la enzima ACE)
B. Houssay
Inhibición Enzimática
● Inhibidores reversibles competitivos. ANTIHIPERTENSIVOS
Captopril, Enalapril, Lisinopril
La angiotensina II es responsable del incremento de la presión arterial por diversos
mecanismos:
• Actúa como hormona, siendo un potente vasocontrictor
• Estimula la liberación de Aldosterona (retención de líquidos)
Además. la enzima ACE metaboliza un vasodilatador, la bradiquinina
Inhibidores de la ACE son
objetivos terapéuticas de mucha
importancia
Inhibición Enzimática
Captopril, Enalapril, Lisinopril
Nueve péptidos aislados del veneno de víboras yarará (Brasil)
Estructura determinada por (M.A. Ondetti – Squibb)
Primer inhibidor de ACE comercial: nonapéptido llamado TEPRÓTIDO (problema:
mala absorción oral).
Descubrimiento del Líder:
Pyr-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-Pro-Pro
Estudio (modificaciones y mecanismo)
•Tripéptidos N-acilados son sustratos de la enzima
•Aminoácidos preferidos: Prolina en posición C-terminal, Alanina en la penúltima posición,
aminoácido aromático en la antepenúltima
•Metaloenzima (cofactor Zn++)
Miguel A. Ondetti
(1930-2004)
Inhibición Enzimática
Captopril, Enalapril, Lisinopril
Se decidió tomar el acido (R)-2-bencilsuccínico como modelo y la
prolina como aminoácido C-terminal
Sitio activo hipotético de la carboxipeptidasa AHipótesis del inhibidor que contienen todos
los productos
Inhibición Enzimática
Captopril, Enalapril, Lisinopril
Se decidió tomar el acido (R)-2-bencilsuccínico como modelo y la
prolina como aminoácido C-terminal
En función de esto surgió los compuestos tipo
5.22 que demostraron ser inhibidores de la
enzima ACE, aunque débiles
Cambiando el carboxilato por un SH se
mejora grandemente la actividad (mejor coordinación con el Zn++)
Inhibición Enzimática
Captopril, Enalapril, Lisinopril
De esta manera surge el CAPTOPRIL como el compuesto más activo de la serie, el
primer inhibidor de la ACE de administración oral
(suministrado con un diurético)
Efectos secundarios del captopril: pérdida del gusto y picazón
ENALAPRILAT tenía un IC50 veinte
veces menor que Captoril, sin embargo
no tenía buena absorción oral. Por ello
se desarrolló el ENALAPRIL
Inhibición Enzimática
Estudio (modificaciones y mecanismo)
•Tripéptidos N-acilados son sustratos de la enzima
•Aminoácidos preferidos: Prolina en posición C-terminal,
Alanina en la penúltima posición, amiinoácido aromático
en la antepenúltima
•Metaloenzima (cofactor Zn++)
Inhibición Enzimática
Lisinopril: nueva droga basada en el Enalapril.
Ventajas:
●No es un profármaco
●Alta vida media (administración una vez por día)
Inhibición Enzimática
Inhibidores de unión lenta y fuerte
Inhibidores de unión lenta: el equilibrio E∙I es lento
Inhibidores de unión fuerte: la inhibición se produce a [I] y [E] comparables
(necesita poco inhibidor)
Inhibidores de unión lenta y fuerte: combinan ambas propiedades
Es una inhibición dependiente del tiempo: Cinética bastante similar a los inhibidores
irreversibles.
Análogos del estado de transición exhiben cinética de unión lenta y fuerte
Inhibidores análogos del estado de transición1959. Berhnard y Ogel teorizaron que un inhibidor que se pareciese al estado de transición de
la reacción E-S debería estar más fuertemente unido a la enzima que el propio sustrato.
Para diseñar inhibidores análogos del estado de transición es necesario conocer el
mecanismo de reacción de la enzima para saber cual es el estado de transición a imitar.
Muchas reacciones catalizadas por enzimas tienen estados de transición similares (Ej: serin-
proteasas), por lo tanto, un análogo del estado de transición de una enzima puede ser
modificado para obtener análogos de otra enzima del mismo tipo.
Biosíntesis de colesterol
Inhibición Enzimática
Ejemplos de Inhibidores de unión lenta y fuerte - Análogos del estado de transición
Peptidil trifluormetil cetonas – Inhibidores de la HLE
Mecanismo de acción
de la enzima:
HLE: enzima liberada por el
sistema inmune en el
pulmón. Asiste defensas
antinflamatorias.
Degradación proteolítica de
microorganismos invasores y
tejido muerto.
Desbalance con inhibidores
naturales hace que la HLE
destruya proteínas
estructurales (colágeno,
fibronectina, elastina)
EFISEMA PULMONAR,
FIBROSIS QUÍSTICA,
ARTRITIS
Inhibición Enzimática
Peptidil trifluormetil cetonas – Inhibidores de la HLE
Ejemplo de inhibidor
covalente reversible
imita estado de transición
Inhibición Enzimática
Ejemplos de Inhibidores de unión lenta y fuerte - Análogos del estado de transición
Pentostatina (5.58)
Potente inhibidor análogo del estado de transición
Inhibe el enzima Adenosina deaminasa
2’-desoxiadenosina
2’-desoxiinosina
Inhibición Enzimática
Clasificación de inhibidores
3.- Fuerza y velocidad de la interacción (reversibles)
1.-Clásicos (unión rápida)
2.- Unión fuerte
3.- Unión lenta
4.- Unión lenta y fuerte
4.- Por analogías (reversibles)
Análogos del estado de transición
Análogos del multisustrato
Inhibición Enzimática
Análogos del Multisustrato
N-fosfonoacetil-L-aspartato (5.67, PALA)
Carbamil fosfato
El PALA se une a la enzima tres veces más fuerte de lo que se unen los dos sustratos en
conjunto
N-carbamil-L-aspartato
Inhibición Enzimática
Inhibidores Irreversibles
Marcadores de afinidad
(o compuestos de afinidad marcada)
(compuestos reactivos)
Basados en el mecanismo
(compuestos no reactivos activados
por la misma enzima)
Inhibidores Irreversibles
Inhibición Enzimática
Inhibidores Irreversibles - Marcadores de Afinidad
Kinact = constante de inactivación
KI = constante de formación del complejo E-I
Los marcadores de afinidad son compuestos que contienen un grupo químicamente reactivo
que reacciona con el sitio activo de la enzima dado un aducto irreversible. Luego de formarse
el complejo reversible E∙I, se produce la reacción con algún nucleófilo del sitio activo para
formar la unión covalente y estable con la enzima
Si el grado de disociación del complejo E∙I es relativamente rápido respecto a la formación
del enlace covalente (kinact), éste último paso es el determinante de la velocidad de reacción.
En estos casos, la cinética es dependiente del tiempo, tal como los inhibidores reversibles de
unión lenta y fuerte.
Problema de los agentes marcadores de afinidad:
Muy reactivos poca selectividad potencialmente tóxicos
Sin embargo HAY marcadores de afinidad NO TÓXICOS…..
Inhibición Enzimática
Marcadores de Afinidad NO TÓXICOS (Ejemplos)
Antibióticos β-lactámicos
Inhibidores de transpeptidasa (cataliza el entrecruzamiento de cadenas
del peptidoglicano constituyente de la pared celular de las bacterias)
Inhibición Enzimática
Marcadores de Afinidad NO TÓXICOS (Ejemplos)
Antibióticos β-lactámicos
Mecanismo acción transpeptidasa
Los antibióticos β-lactámicos actúan inhibiendo la última etapa de la biosíntesis de
la pared celular: el entrecruzamiento de las cadenas de peptidoglicano
Inhibición Enzimática
Marcadores de Afinidad
NO TÓXICOS (Ejemplos)
Inhibición de transpeptidasas
por antibióticos β-lactámicos
Inhibición Enzimática
Marcadores de Afinidad
NO TÓXICOS (Ejemplos)
Antibióticos β-lactámicos: Han sido consideradas drogas maravillosas, altamente
selectivas y sin problemas serios de toxicidad. En algún momento se consideró utilizarlas
como un complemento dietario…
Problema de los antibióticos β-lactámicos: La aparición de cepas resistentes lo que se
agrava con el uso intensivo de estos antibióticos…..
Inhibición Enzimática
Inhibidores basados en el mecanismo (Irreversibles)
Un inhibidor (o inactivador) basado en el mecanismo es un compuesto inactivo que, al
unirse con el sitio activo de la enzima, se transforma en un producto altamente reactivo que,
en la mayoría de los casos, reacciona con la enzima para unirse covalentemente e
inactivarla.
Cinética: Tiene un paso adicional respecto a los marcadores de afinidad:
Tiene dos complejos E∙I, uno que lleva al compuesto reactivo y el segundo que produce la
unión covalente E-I.
Relación de partición: k3/k4 (relación producto liberado/inactivación)
Lo ideal (aunque casi nunca se logra) es: relación de partición 0 (no se
forman metabolitos potencialmente tóxicos)
Inhibición Enzimática
Inhibidores basados en el mecanismo (Irreversibles)
Ventajas para el diseño de fármacos:
NO son reactivos de por sí● Baja toxicidad
● Pocos efectos secundarios
Estos inactivadores son muy buenos candidatos a fármacos. Por ejemplo: la Eflornitina
(antiprotozoario) se puede administrar en dosis de hasta 30g por día sin efectos
secundarios.
Sin embargo, no hay en la actualidad en el mercado fármacos diseñados racionalmente
para ser inhibidores basados en el mecanismo. Sólo luego de su descubrimiento por otro
método se determinó que se trataba de inhibidores basados en el mecanismo
Inhibición Enzimática
Inhibidores basados en el mecanismo. Ejemplos
Vigabatrin (anticonvulsivante)
Epilepsia: Toda enfermedad del sistema nervioso central caracterizada por convulsiones
● Idiopática: No se conoce la causa
● Sintomática: Debida a tumores, sílifis, esclerosis múltiple,
mal de Alzheimer, intoxicación con plomo, etc.
No se conoce el mecanismo que lleva a la epilepsia. Se cree que son muchos los
mecanismos involucrados. Se sabe de la importancia del ácido gama-amino butírico (GABA)
Epilepsia:
La concentración de GABA en el cerebro está regulada por dos enzimas: una lo sintetiza
(glutamato
decarboxilasa, GAD)
y otra lo degrada
(GABA amino
transferasa, GABA-AT)
Disminución del nivel de
GABA en el cerebroConvulsiones
Inhibición Enzimática
Inhibidores basados en el mecanismo. Ejemplos
Vigabatrin (anticonvulsivante)
Inhibidor de GABA amino transferasa, GABA-AT
Ácido 4-amino-5-hexenoico
Mecanismo de inactivación:
Inhibición Enzimática
Inhibidores basados en el mecanismo. Ejemplos
Vigabatrin (anticonvulsivante)
Ácido 4-amino-5-hexenoico
El Vigabatrin atraviesa la barrera hematoencefálica mientras que el GABA no.
El agregado de un grupo vinilo al GABA aumenta el carácter lipofílico de la molécula ya que
éste es un atractor de electrones, disminuye la basicidad del grupo amina y, por lo tanto, es
menor la contribución en el equilibrio de la forma iónica (zwitterion).
Inhibición Enzimática
Inhibidores basados en el mecanismo. Ejemplos
Inhibidores de β-lactamasas
Inactivación de penicilinas por β-lactamasas
Gran número de β-lactamasas descriptas, cada año se descubren nuevas:
La resistencia por β-lactamasas es un problema no resuelto:
•Heterogeneidad
•Descubrimiento de nuevas β-lactamasas
•Transferencia genética
Inhibición Enzimática
Inhibidores basados en el mecanismo. Ejemplos
Inhibidores de β-lactamasas
Inhibición Enzimática
Inhibidores basados en el mecanismo. Ejemplos
Inhibidores de β-lactamasas
Inhibición Enzimática
Inhibidores basados en el mecanismo. Ejemplos
Inhibidores de β-lactamasas