Tècniques ràpidespel diagnòstic de la
pneumònia
Andrea Vergara Gómez Dto. Microbiología
Hospital Clínic de Barcelona
20 octubre 2018
¿Por qué tanta urgencia?
Técnicas rápidas disponibles
Perspectivas de futuro
¿Por qué tanta urgencia?
4º
1º
6º
Neumonía Adquirida en la Comunidad (NAC)
Neumonía Intrahospitalaria (NIH)
Neumonía Asociada a la Ventilación Mecánica (VAP)
Neumonía Asociada a Cuidados Sanitarios
Neumonía Adquirida en la Comunidad (NAC)
Neumonía Intrahospitalaria (NIH)
Neumonía Asociada a la Ventilación Mecánica (VAP)
Neumonía Asociada a Cuidados Sanitarios
Neumonía intrahospitalaria: 20 casos/1000 ingresos
1/3 en UCI
>90% NAV
Pico entre los días 5-9 de ventilación
Hospital-acquired pneumonia and ventilator-associated pneumonia: recent advances in epidemiology and managementBarbier et al. Curr Opin Pulm Med. 2013 May;19(3):216-28.
Incidencia de la NAV
Of 87 337 patients staying in an ICU for more than twodays, 8% acquired pneumonia, which in 97.5% of the
cases was associated with intubation.
Source: ECDC, HAI-Net patient-based and unit-based data, 2014
2,6 / 1000 mil días de estancia en UCI
2 / 100 pacientes UCI
5 / 100 pacientes ventilados
6,3 / 1000 días de ventilación mecánica
Incidencia de la NAV
Estudio Nacional de Vigilancia de Infección Nosocomial en UCI (Registro ENVIN-UCI). Informe 2017
Distribución de las infecciones adquiridas en UCI
Estudio Nacional de Vigilancia de Infección Nosocomial en UCI (Registro ENVIN-UCI). Informe 2017
Impacto de la NAV
> duración ventilación mecánica
> estancia UCI
> estancia hospitalaria
> morbi-mortalidad asociada
> $
Dificultades para diagnosticar NAV
Signos clínicos inespecíficos
Radiografía difícil de interpretar
Confirmar con cultivo microbiológico:
Colonización/Infección
Distribución heterogénea en pulmón
Tratamiento empírico
5% NAVM sin diagnóstico etiológico (Informe ENVIN 2017)
Técnicas rápidas disponibles
1-2 días 1-varias semanas1 día 1-2 días
CULTIVO ID ANTIBIOGRAMA TIPAJE
1-2 días 1-varias semanas1 día 1-2 días
CULTIVO ID ANTIBIOGRAMA TIPAJE
CULTIVO
ID +/- INFORMACIÓN SOBRE RESISTENCIAS
1-varias semanas1-2 días 1-2 días
ID + ANTIBIOGRAMA TIPAJE
Métodos moleculares de diagnóstico de infecciones respiratorias. ¿Ha cambiado el esquema diagnóstico? Vila et al. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2016;34(Supl 3):40-46
€280–300
€40
€100-120
Laboratory diagnosis of pneumonia in the molecular age.Torres A. Eur Respir J 2016; 48: 1764–1778
LAMPLoop-mediated isothermal amplification
Método de amplificación de ácidos nucleicos simple, rápido y económico
Temperatura constante mediante reacción de “desplazamiento de cadena”
Amplificación y detección en un único paso
Alta eficiencia: 109 copias a partir de <10 en aprox. 1 h
Alta sensibilidad y especificidad
Loop-mediated Isothermal Amplification of DNA (LAMP): A New Diagnostic Tool Lights the World of Diagnosis of Animal and Human Pathogens: A Review. Dhama et al. Pak J Biol Sci. 2014; 17:151-166
4 primers basados en 6 regiones del gen diana: F3c, F2c y F1c en el extremo 3’ B1, B2 y B3 en el extremo 5‘
2 primers opcionales que aceleran la reacción: LF, LB
ForwardInner
Primer
ForwardOuterPrimer
BackwardOuterPrimer
Backward Inner Primer
Enzima
“the hearth of the LAMP”
DNA polimerasa + capacidad de desplazamiento de cadena
Bst polymerase (Bacillus stearothermophilus)(66ºC)Bsm polymerase (Bacillus smithii) (60ºC)
LAMP vs. PCR
Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP): A Rapid and Sensitive Tool for Quality Assessment of Meat Products. Kumar et al. Comp Rev Food Sci Food Saf. 2017;16:1359-78.
Métodos moleculares de diagnóstico de infecciones respiratorias. ¿Ha cambiado el esquema diagnóstico? Vila et al. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2016;34(Supl 3):40-46
LAMP
Extract Boiling Direct
Sensitivity(%, CI95%)
88.0 (67.7-96.8) 80.0 (58.7-92.4) 80.0 (58.7-92.4)
Specificity(%, CI95%)
95.7 (76.0-99.8) 95.7 (76.0-99.8) 95.7 (76.0-99.8)
PPV(%, CI95%)
95.7 (76.0-99.8) 95.2 (74.1-99.8) 95.2 (74.1-99.8)
NPV(%, CI95%)
88.0 (67.7-96.8) 81.5 (61.3-93.0) 81.5 (61.3-93.0)
LAMP may be useful as a rapid screening tool to detect HSV-1 in BALF
Aceptado en EIMC
Microorganismidentified by
culture
Total nº of samplestested
Concordance Minorerrors
Majorerrors
Comments
S. aureus 19 15 2A,B 2C,D ALAMP: SAUR+SMAL detectedBLAMP: SAUR+PAER detected(GNB in GRAM)C,DCulture: Few cfu SAUR
P. aeruginosa 11 9 - 2E,F ECulture:< 1000cfu PAER, LAMP: SAUR positiveFCulture:<1000cfu PAER, all LAMP negative
S. maltophilia 6 6 - - -
K. pneumoniae 4 2 - 2G GCulture:<1000cfu KPNE (twocases)
E. coli 3 3 - -A. baumannii 2 1 - 1H HCulture:100000ufc ABAU
Negative 7 6 1I - ILAMP:KPNE detected (GNB in GRAM)
Mixed flora 6 3 3J,K,L - JLAMP:PAER detectedKLAMP:SAUR detectedLLAMP:KPNE detected
TOTAL 58 45 6 7Artículo en preparación
LAMP method may be useful to detect the most frequent bacteria causing VAP from BAL samples
Microorganismidentified by culture
Total nº of samplestested
Concordance Minorerrors
Majorerrors
Comments
K. pneumoniae 13 10 3A,B - ALAMP: KPNE + ECOL (two cases)BLAMP: KPNE+PAER
S. aureus 10 7 2C,D 1E CLAMP: SAUR+KPNE DLAMP: SAUR+ECOL ECulture: <1000cfu SAUR
P. aeruginosa 11 9 2F - FLAMP: PAER + ECOL (two cases)
E. coli 8 3 5G,H,I,J - GLAMP: ECOL + PAER HLAMP: ECOL + PAER + SAUR +SMAL ILAMP: ECOL + KPNE JLAMP: ECOL + PAER + SMAL (twocases)
S. maltophilia 2 2 - - -
Polymicrobial 10 3 4 3 See table in supplementary material.
Other 10 7 3K,L,M - KLAMP: ECOL + KPNELLAMP: PAERMLAMP: PAER + SAUR + SMAL
Mixed flora 10 10 - - -
Negative 9 9 - - -
TOTAL 83 60 19 4
Artículo en preparación
LAMP method may be useful to detect the most frequent bacteria causing VAP from AT/BAS samples
The presence/absence of carbapenem-hydrolyzing enzymes was correctly determined
for all isolates in <30 min.
82 Acinetobacter spp: 15 sensibles (OXA-51)19 OXA-40 24 OXA-5820 OXA-233 NDM 1IMP-2
Evaluation of a Loop-Mediated Isothermal Amplification-Based Methodology To Detect Carbapenemase Carriage in Acinetobacter Clinical Isolates. Vergara et al. Antimicrob Agents Chemother. 2014;58:7538–40.
Strain Concentration (cfu/mL)
Eazyplex SuperBugcomplete A (min:seg)
OXA-23 producing A.baumannii 103 14:00102 16:15
OXA-40 producing A.baumannii103 12:50102 13:15
OXA-58 producing A.baumannii103 16:10102 18:30
OXA-23 producing A.baumannii R308 103 11:45102 -
OXA-40 producing A.baumannii R329 103 16:15102 -
OXA-58 producing A.baumannii R80103 20:00102 -
NDM producing A.pitii 103 20:00102 -
NDM producing A.dijkshoorniae 103 18:30102 -
Datos no publicados
Detección directa de carbapenemasas en BAL
Strain Concentration (cfu/mL) Xpert Carba-R (Ct) Eazyplex SuperBug CRE
(min:seg)
NDM producing K. pneumoniae 103 27.2 18:45102 29.3 -
OXA-48 producing K. pneumoniae 103 28.3 18:00102 30.4 -
VIM producing K. pneumoniae 103 28.3 27:00102 31.1 -
NDM + CTXM1 producing E. coli103 27.2 NDM 7:45, CTXM1 6:00
102 30.6 NDM 10:30, CTXM1 8:15
OXA-48 producing E. coli 103 28.3 20:00102 31.3 -
VIM producing E. coli 103 29.1 12:20102 33.5 19:50
KPC + CTXM15 producing E. asburiae
103 30.4 KPC 18:45, CTXM1 14:00
102 33.1 KPC 25:30, CTXM1 26:00
NDM+OXA-48+CTXM1 producing K. pneumoniae
103 NDM 31.4 OXA 31.2 CTXM1 12:00102 NDM 33.4 OXA 33.4 -
NDM+CTXM1 producing K. pneumoniae
103 30.5 NDM 17:00 CTXM1 10:15102 35.4 CTXM1 16:30
KPC producing K. pneumoniae 103 31.1 -102 35.3 -
Detección directa de carbapenemasas en BAL
Datos no publicados
Perspectivas de futuro
Bacterias
Virus
Resistencias
Hongos
Bacterias
Virus
Resistencias
Hongos
Rapid Whole-Genome Sequencing for Detection and Characterization of Microorganisms Directly from Clinical Samples.Hasman et al. J Clin Microb. 2014;52:139-146.
WGS + Metagenómica
Early insights into the potential of the Oxford Nanopore MinION for the detection of antimicrobial resistance genes. Judge et al. J Antimicrob Chemother 2015;70.2775-78
Rapid Pathogen Identification in Bacterial Pneumonia Using Real-Time Metagenomics. Pendleton, K.M. et al. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 2017;196:1610-12
Rapid Diagnosis of Lower Respiratory Infection using Nanopore-based Clinical Metagenomics. Charalampous et al. bioRxiv 2018
This study demonstrates that nanopore metagenomics can rapidly and accurately characterise bacterial lower respiratory infections when combined with efficient human DNA depletion.
• Se requiere un diagnóstico rápido en los casos de
neumonía.
• El cultivo es necesario, ya que nos permite aislar al
microorganismo causante.
• Las técnicas moleculares son de gran ayuda, aunque
no están exentas de limitaciones.
• La metagenómica (Nanopore) puede suponer un gran
avance en el diagnóstico de la neumonía.