Date post: | 14-Jun-2015 |
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DEPARTAMENTO DE QUÍMICA Y CCMM
“Prof. J.C. Vilchez Martín”
TEMA 4 Calibraciones y regresión
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“Prof. J.C. Vilchez Martín”
TEMA 4 Calibraciones y regresión
Métodos clásicos (vía húmeda)
Métodos Volumétricos
Métodos gravimétricos
VentajasAnálisis de buena precisiónAnálisis de materiales patronesMétodos absolutos
InconvenientesLentosSensibilidad limitada
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TEMA 4 Calibraciones y regresión
Métodos instrumentales
Cromatografía de gases (GC)
ICPHPLC
Absorción atómica de llama (AAS)
VentajasGran sensibilidadPotencia de análisisMás rápidosAutomatizaciónControl computarizadoTratamiento de datosDatos gráficosEvaluación estadísticaComparación espectrosControl de parámetros
Técnicas electroquímicas
Algunos ejemplos
Absorción molecular UV-vis (EAM)Espectrometría de masas
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¿Qué tienen en común?
Patrones secundarios de concentraciones conocidas oPatrones primarios certificado
Hay que establecer la relación Señal / Concentración
Calibración
Patrón primario certificado
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Y en el ensayo…
Muestra
Concentración?
Interpolar la señal en la curva de calibración
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Patrones de calibraciónConcentración conocidaCubrir el rango de concentración de las muestras a analizar en los ensayosMismos disolventes y reactivos que en el ensayoMatriz lo más parecida posible que la muestra realIncluir el blanco en la curva (no restar)
Gráfica de calibraciónSeñal instrumental en ordenadaConcentración, cantidad en abcisaHabitualmente lineal y = a + bx (no siempre)
ErroresCoeficiente variación de señal instrumental 2-3%Preparación del patrón < 0,1% (despreciable)Si se realiza varias medidas punto calibración : Distribución gaussiana normal
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Centro de gravedad de la calibración(, )
Se establecen pares (xi, yi)
Se incluye el blanco (0, y0)
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La calibración es realmente lineal?
Rango de valores -1 r +1+1 Correlación positiva perfecta. Ajuste perfecto-1 Correlación negativa perfecta. Ajuste perfecto 0 No existe correlación
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Que valores de r indican una buena calibración?
Se puede realizar un contraste estadístico en función del número de puntos de calibraciónH0 r es pobre, x e y no guardan relación t calc < t crit
H1 r es significativo, buena correlación t calc > t crit
Para t crítica = t n-2, 0.05 (tabla dos colas)
t calc
Generalmente para alrededor de 5 puntos de calibraciónr2 > 0,995 Es aceptable
Asegura una relación lineal? No
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Malinterpretaciones de r
Estupendo r2 > 0,995 = Relación lineal
Falso
La relación entre x e y es una función polinómica de segundo grado
y = cx2+bx2+a
2
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Malinterpretaciones de r
r =0 No existe relación entre x e y
Falso
Si hay relación entre x e y pero no es lineal sino parabólica
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iii eyy ˆResiduos
Para un xi de un patrón, diferencia entre el valor de señal yi y la que le correspondería en la recta de calibración
Correlación linealDistribución de residuos gaussiana y de media 0 (simétricas)
Correlaciones no linealesDistribución de residuos no gaussina normal
Linealidad de la gráfica de control
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Homocedasticidad de residuos
HomocedasticidadLa dispersión (desv.std) de la población independiente de x (concentración)
Todos los puntos en calibración igual pesoCalibración no ponderada
HeterocedasticidadLa dispersión (desv.std) de la población depende de x (concentración)
Los puntos en calibración no deben de tener igual peso al realizar la regresión
Calibración ponderada
Calibración ponderada
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Ponderar o no ponderar
¿Como podemos evaluar si las desviaciones de la señal a lo largo de las
concentraciones difieren o no?
Repitamos n1 veces un patrón de calibración a baja concentración del rangoCalculemos s1
Repitamos n2 veces un patrón de calibración a alta concentración del rangoCalculemos s2
Dos s, averiguar si son significativamente la misma precisión…¿A que suena esto?
Al clásico test de FischerH0 Fcal < Fcrit s1=s2 Se asume que la precisión en el rango de concentraciones
de calibración es la misma ( homocedástico, no ponderar)H1 Fcal > Fcrit s1=s2 Son diferentes a lo largo del rango (heterocedástico,
ponderar)
Dos s, averiguar si son significativamente la misma precisión…¿A que suena esto?
Al clásico test de FischerH0 Fcal < Fcrit s1=s2 Se asume que la precisión en el rango de concentraciones
de calibración es la misma ( homocedástico, no ponderar)H1 Fcal > Fcrit s1=s2 Son diferentes a lo largo del rango (heterocedástico,
ponderar)
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Condiciones del modeloYa hemos ido viendo algunas1.Calibraciones donde los errores de concentración (cantidad) en la preparación de los patrones (0,1%) es despreciable frente a los errores aleatorios de la señal instrumental
2.La relación con la señal es lineal en el intervalo de concentración considerado
3.Los residuos son homocedásticos, misma precisión independiente de la concentración
4.La distribución de los residuos es normal y su media es cero
No No
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Es la recta que minimiza la suma de los cuadrados de los residuos
Se establece una recta lineal que relaciona x e yy = bx + a
Donde
Pendiente/ sensibilidad instrumental
Ordenada en el origen
Ejemplo
La recta pasa necesariamente por (, )Centro de gravedad de la calibración
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Recordad condición 1, el error en la preparación de patrones es despreciable (< 0,1%) respecto a la dispersión de la señal (2-3%)
Utilicemos los cuadrados de los residuos para hallar una medida de los errores aleatorios en la ordenada (señal)
Parecida a la desviación estándar de medidas repetidas de una distribución gaussiana excepto que ahora trabajamos con una recta (n-2)
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Ahora podemos hallar los errores y límites de confianza de la pendiente y de la ordenada en el origen
Desviación estándar de la pendiente Desviación estándar de la ordenada en el origen
Intervalo de confianza de la pendiente
b ± t(n-2) sb
Intervalo de confianza de la ordenada en el origen
a ± t(n-2) sa
Para n-2 grados de libertad y la confianza/probabilidad deseada (preferiblemente al 95%)
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Tenemos la relación lineal entre concentraciones y señal del instrumento
Analicemos una muestra de concentración desconocida
¿ Cual será el error de la medida de concentración interpolada?
Depende de la precisión de la señal instrumental (recuerda que era apreciable)Depende de la incertidumbre/error de la calibración efectuada (sb y sa)Expresión del error global muy compleja !!!
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Se utiliza una expresión aproximada
Siendo y0 valor de la señal experimental de la muestran Nº de patrones utilizados en calibraciónxi Concentraciones de patrones de calibración
Que se puede transformar en
Siendo m Repeticiones de la medida de la muestra
Si realizamos más de una medida de la muestra
Intervalo de confianza de la concentración interpolada (x0)
x0 ± t(n-2) sx0
Para n-2 grados de libertad y la confianza/probabilidad deseada (preferiblemente al 95%)
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Tiende a 0 cuando la señal se encuentra en la zona central de la calibración
Se minimiza sx0
Se minimiza los errores y la incertidumbre
x0 ± t(n-2) sx0
Los menores errores en el centro de la calibración
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Interesa seleccionar bien cual es el rango de concentración que queremos cubrir antes de calibrar
Zona central calibración = Rango de concentración esperado de las muestras
x0 ± t(n-2) sx0 mínimo Medida con bajo error asociado
x0 ± t(n-2) sx0 máximo Medida con alto error asociado
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¿Como se calculan?
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Definición
“Aquella concentración de analito que proporciona una señal en el instrumento significativamente diferente de la señal de ruido de fondo o señal de un blanco”
¿Donde situar la frontera entre ruido y señal de analito?
Definición abierta a interpretación
Situémoslo en Lc para α (p.e. 0,05) distribución normal de la señal de ruido o blanco (yb) Imaginemos que son 2 ppb
Cualquier señal que de una concentración > 2 ppm se debe al analito y no a ruido
Podemos cometer error !!! Hay ocasiones (α) en las que damos por señal de analito lo que es ruido
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Estamos diciendo que nuestro técnica ve a partir de 2 ppb pero…
¿Qué pasa con los valores de señal y concentración < 2 ppb que se deben a analito?
Erróneamente decimos que es ruido cuando es señal de analito
No podemos definir LOD de esta forma, demasiado error
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Debemos aumentar el límite de detección para tener menos errores α y β
Si distancia LD – YB = 3 Sblanco Se demuestra que los errores α y β < 7%Error razonable que es asumible
σ0 = σD Recuerda !!! que s es igual en todo el rango de concentración calibradoHOMOCEDASTICIDAD
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Hemos definido LOD
YLOD = YB + 3 SBlanco
También se utiliza LOQ
YLOQ = YB + 10 SBlanco
El criterio de utilización es puramente arbitrario, pero hay que indicar el
método utilizado
Interpolar en recta calibrado para averiguar
concentraciones LOD o LOQ
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Recuerda!!! HOMOCEDASTICIDAD de residuos
Obtención del valor de YBlanco
Podemos tomar el valor a (ordenada en el origen) de la calibración
Podemos pasar 10 veces un disolución blanco y realizar promedio de señal
Obtención del valor de SBlanco
S es igual en todo el rango de concentración calibrado
Podemos tomar S Blanco = S y/x de los puntos de calibración
Podemos realizar la S de las 10 medidas de señal de blanco
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Interpolar en recta calibrado para
averiguar concentraciones
LOD o LOQ
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La adición de patrón es apropiada cuando la composición de la muestra es desconocida o compleja y afecta a la señal analítica
No siempre podemos aislar el analito de interés del resto de componentes que lo
acompañan en la muestra
¿Influirán en la señal del analito?
ICP
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¿Influirán en la señal del analito?
La respuesta es posiblemente sí
En función deTécnica analítica empleadaNaturaleza de componentes que acompañanConcentración de estos componentes
pueden influir en la señal del analito:
Interfiriendo directamente la señal de analito
Inhibiendo/activando el proceso fisico-químico que produce la señal
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Si realizamos calibración con disoluciones puras de Zn (II) en agua destilada estaríamos cometiendo un error ya que la relación Señal/concentración Zn(II) nada tiene que ver el de las muestras reales (interferidas por Na+)
Queremos analizar Zn en agua de marAlrededor de 11000 ppm Na+
SoluciónReproduzcamos lo mejor posible
condiciones de salinidad de muestras añadiendo 11000 ppm de Na+ a cada patrón
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Ahora queremos analizar Zn en agua de ría¿ppm Na+?
En función de las mareas y entrada de agua de mar a la ríaRango desde unos pocos ppm hasta 11000 ppm
SoluciónMétodo de adición de patrón
No podemos realizar unas condiciones de calibración que reproduzca el número infinito de posibilidades de concentración en Na+ en
muestras a distinta salinidad
No podemos realizar unas condiciones de calibración que reproduzca el número infinito de posibilidades de concentración en Na+ en
muestras a distinta salinidad
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¿En que consiste?
Adición de cantidades conocidas (excepto a una) de concentración de analito de interés a volúmenes iguales de la muestra a analizar
¿Concentración en Zn de la muestra analizada?
Extrapolar
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ExtrapolaciónSxE algo diferente a la expresión para una calibración normal por interpolación
¿Cómo mejorar la precisión?
Aumentando en número de adiciones n (al menos n=6)
Maximizando (xi- )2, Deben cubrir un intervalo suficientemente grande
Si No
Intervalo de confianza de la concentración extrapolada (xE)
xE ± t(n-2) sxE
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Cantidad de muestra disponible grande
Cada muestra requiere su propia gráfica de calibración
La extrapolación es menos precisa que interpolación
¿Cómo comprobar si existe efecto matriz y si debemos realizar adición patrón?
Se representa calibración normal (disoluciones de analito puro) y adición de patrón sobre una muestraNo hay efecto matrizPendientes iguales (líneas paralelas)Hay efecto matrizPendientes desiguales
Desventajas de adición de patrón
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Útil para la calibración de impurezas de disolvente orgánico
Cromatografía de gases (GC)
Queremos calibrar las impureza DAA y otras de la acetona
Utilizamos patrones en acetona (idéntica matriz que muestras) añadiendo
concentraciones conocidas de DAA y demás impurezas
ProblemaNo existe una acetona perfectamente pura, siempre tiene DAA y demás impurezas
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Obtendremos una curva de calibración similar a las de adición de patrón (igual para resto de impurezas)DAA
En este tipo de casos no hay mayor efecto matriz una vez los patrones se preparan en el propio disolvente
Misma pendiente de respuesta que si la acetona para preparar patrones de calibración fuera totalmente pura
Se le descuenta la señal en el origen que pertenece a la concentración de DAA que lleva la acetona con la que se prepararon los patrones
DAA
y = a + bx
y = bx
Nos quedamos con el factor de respuesta
instrumental respecto a la DAA
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HeterocedásticoLa desviación estándar aumenta con la concentración
Los puntos de calibración a baja concentración son más de fiar que los de alta
Debemos darle más peso en la calibraciónPONDERAR
¿Como lo haremos?Aplicando un factor de peso inversamente proporcional a desviación estándar de cada punto
Necesitamos más información (s en cada punto)
Cálculos más complicados
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¿Como cambian las parámetros de recta de calibración?
Siendo ahora los valores del centro de gravedad
¿Y el error de concentración en la interpolación sobre la recta de calibración?
En la dirección y En la concentración tras interpolación
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Los valores de centro gravedad en calibración ponderada más próximos a valores bajos
(w, w)
En la práctica para simular el efecto de ponderación en regresiones no ponderadas se suelen utilizar concentraciones que no varían de forma uniforme forzando la recta a ajustarse a valores bajos de concentración
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¿Qué es un patrón interno?
Compuesto que no pertenece ningún componente de la muestra a analizar que se añade siempre en la misma cantidad a todas los patrones y muestras a analizar
Patrón Interno
+ 10 ppm P.I.
¿Para qué?Para corregir la fluctuación de señal de respuesta del equipo, especialmente en aquellas técnicas con un Sy/x alto
Errores aleatorios de detectorErrores de caudal de líquidos/gases portadoresErrores aleatorios de control de parámetros de
equipoFluctuaciones de tensión eléctrica, etc.
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¿Cómo?
El P.I. se añade siempre en la misma cantidad, debe dar siempre misma señal YLas variaciones de Y del P.I. serán las mismas que sufran las de nuestros analitosCon esta información se realiza corrección
¿Mala calibración debido a la mala precisión de la señal del equipo?
Añadamos P.I. a cada patrón de calibración
ppm analito
Área pico
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Área pico Analito / Área P.I.
ppm analito
Se divide el área de pico del analito por el área de pico del P.I. cancelándose mutuamente las fluctuaciones del equipo en un nuevo índice “libre” de ellas
La precisión de la calibración mejora enormemente
Se procede igual para muestras (añadiendo la misma cantidad de P.I.), ahora la señal de interpolación será
Área analito muestra/ Área P.I.
+ 10 ppm P.I.
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Requisitos patrón interno
No debe ser un componente de la muestra
Zona de señal libre de interferencias de los componentes de la muestra
Con características fisico-químicas similares a los analitos que se analizanDeben sufrir con la misma intensidad las fluctuaciones de señal del equipoEn ocasiones se utilizan más de 1 patrón interno para cubrir distintas zonas del espectro o cromatograma
No reactivos con ninguno de los componentes de la muestra
Estables