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CUIBFACULTAD DE MEDICINA
ESTUDIO DE CANALES PERMEABLES A CALCIO
DE MEMBRANAS INTRACELULARES
DE CLULAS VEGETALES
Tesis para obtener el grado de
Doctor en Ciencias Fisiolgicas
Presenta:
M.C. Vadim Prez Koldenkova
Asesor:
Dr. Igor Pottosin
Colima, Col. Junio de 2007
i
ndice ndice ............................................................................................................................................... i Abreviaturas ................................................................................................................................. iii 1. Introduccin ............................................................................................................................... 1
1.1 Generalidades ......................................................................................................................... 1
1.1.1 Concentraciones y transporte de Ca2+ en las plantas....................................................... 2
1.1.2 Depsitos intracelulares de Ca2+ en plantas.La vacuola ltica y el retculo endoplsmico................................................................................................................... 3
1.1.3 Transporte de Ca2+ en las vacuolas y el retculo endoplsmico....................................... 5
1.1.4 Transduccin de seales por calcio en clulas vegetales................................................. 8
1.2 Antecedentes ........................................................................................................................ 13
1.2.1 Canales vacuolares, permeables a Ca2+. ........................................................................ 13
1.2.2 SVel nico canal vacuolar permeable a Ca2+ establecido firmemente. ..................... 15
1.2.3 Canales permeables a Ca2+ del retculo endoplsmico .................................................. 28
2. Objetivos del proyecto............................................................................................................. 32 2.1 Hiptesis............................................................................................................................... 32
2.2 Objetivos .............................................................................................................................. 32
3. Metodologa.............................................................................................................................. 34 3.1 Preparaciones ....................................................................................................................... 34
3.1.1 Objeto de estudio. .......................................................................................................... 34
3.1.2 Obtencin de vacuolas. Soluciones de trabajo............................................................... 34
3.1.3 Obtencin de fraccin microsomal enriquecida de RE ................................................. 36
3.1.4 Obtencin de liposomas gigantes. Tcnica de deshidratacin-rehidratacin. ............... 36
3.2 Registros electrofisiolgicos ................................................................................................ 37
Patch Clamp............................................................................................................................ 37
3.2.1 Generalidades................................................................................................................. 37
3.2.2 Fabricacin de micropipetas .......................................................................................... 38
3.2.3 Registros de actividad de canales en las configuraciones attached, vacuola-completa, parche aislado. .............................................................................................................. 38
3.2.4 Medicin del potencial a travs de la membrana vacuolar. ........................................... 38
3.2.5 Protocolos de voltaje para el estudio del canal vacuolar SV. Obtencin de relacin corriente-voltaje del canal unitario................................................................................ 40
ii
3.2.6 Determinacin de la probabilidad de apertura. .............................................................. 40
3.2.7 Calibracin del efecto de Ca2+ vacuolar sobre el canal SV. .......................................... 41
3.2.8 Estimacin del nivel de calcio vacuolar libre, utilizando la curva de calibracin......... 41
3.2.9 Protocolos de voltaje para el estudio de canales permeables a Ca2+ del retculo endoplsmico................................................................................................................. 43
Microelectrodos ionoselectivos .............................................................................................. 43
3.2.10 Mediciones de la actividad de cationes vacuolares con la tcnica tradicional de electrodos ionoselectivos............................................................................................... 43
3.2.11 Tcnica MIFE (Microelectrode Ion Flux Estimation). ................................................ 44 4. Concentraciones libres de los principales cationes fisiolgicos vacuolares y sus efectos
sobre el canal SV. .................................................................................................................... 47 4.1 Introduccin. ........................................................................................................................ 47
4.2 Resultados. ........................................................................................................................... 47
4.2.1 Osmolaridad y valor del pH del jugo vacuolar. ............................................................. 47
4.2.2 Registros en configuracin attached. ............................................................................. 49
4.2.3 Concentraciones vacuolares fisiolgicas de K+, Na+, Ca2+ y Mg2+. .............................. 51
4.2.4 Efecto del pH vacuolar sobre el umbral de activacin del canal SV. ............................ 53
4.2.5 Efecto del Na+ vacuolar sobre la curva de activacin del canal SV en condiciones de pH fisiolgico...................................................................................................................... 56
4.2.6 Efecto conjunto de los cationes fisiolgicos ms importantes H+, Na+, Mg2+, Ca2+ que modulan la cintica de activacin del canal SV. .................................................... 60
4.2.7 Evaluacin de la actividad del canal SV en condiciones inicas fisiolgicas. .............. 62
4.3 Discusin.............................................................................................................................. 69
5. Estudios de canales permeables a Ca2+ del RE. .................................................................... 75 5.1 Introduccin. ........................................................................................................................ 75
5.2 Resultados. ........................................................................................................................... 75
5.2.1 Selectividad.................................................................................................................... 77
5.2.2 Modulacin por voltaje. ................................................................................................. 77
5.3 Discusin.............................................................................................................................. 77
6. Conclusiones............................................................................................................................. 82 Agradecimientos .......................................................................................................................... 84 Bibliografa................................................................................................................................... 85 Appndice ................................................................................................................................... 102
iii
Abreviaturas
ABA cido abscsico (fitohormona),
cADPR adenosin-fosfato-ribosa cclico,
CAX (cation exchangers), en este trabajo intercambiadores Ca2+/H+,
IP3 inositol-3,4,5-trisfosfato,
LCIC liberacin de calcio inducida por calcio,
MIFE (microelectrode ion flux estimation) tcnica de estimacin de flujo inico con microelectrodos,
RE retculo endoplsmico,
SV (slow vacuolar channel) canal vacuolar lento,
TPC (two pore channel) canal de doble poro,
V1% potencial de apertura de 1% del total de canales abiertos registrados.
1
1. Introduccin
1.1 Generalidades
A diferencia de otros seres vivos, las plantas no tienen la capacidad de escoger el entorno
en el que ocurre su crecimiento y desarrollo. Por esta razn, los organismos vegetales requieren
de mecanismos especficos, destinados a asegurar el funcionamiento normal de sus clulas en el
rango de condiciones que se puedan presentar en su medio ambiente. Entre los factores con
mayor variabilidad para las plantas se encuentra el suministro mineral procedente del suelo. En
base a las concentraciones de nutrientes disponibles en el suelo y las necesidades de las plantas,
stos pueden encontrarse en deficiencia o en exceso, obligando a las plantas a poner en
funcionamiento los mecanismos correspondientes para el mantenimiento de la homeostasis inica
celular. El mecanismo que tiene la mayor distribucin en el reino vegetal es el almacenamiento o
acumulacin, utilizado por las plantas tanto para la prevencin de deficiencias, como para la
eliminacin de excesos de nutrientes en el citoplasma y el aislamiento de metabolitos y
substancias txicas.
El calcio es uno de los elementos esenciales para la vida, que, sin embargo, se encuentra en su
mayor parte almacenado en organelas especiales o en el exterior de la clula el apoplasto, y se
encuentra en mnimas y rigurosamente mantenidas concentraciones (alrededor de 100-200 nM en
condiciones de reposo) en el citoplasma. Su alto grado de compartimentacin es una necesidad
para evitar su precipitacin en el citoplasma con el fosfato inorgnico (Sanders y col., 1999), y la
competencia por los sitios de unin con el Mg2+ citoslico (Marschner, 1995). La gran diferencia
de concentraciones entre el citoplasma, por una parte, y el apoplasto y los compartimentos
intracelulares, por la otra, probablemente son la razn del uso de las seales de Ca2+ como
vnculo entre los estmulos extracelulares y las respuestas intracelulares1. Actualmente, esta ruta
de sealizacin se encuentra en tal grado de desarrollo que permite con tan solo un evento la
elevacin del calcio citoplsmico generar respuestas opuestas, como, por ejemplo, el cierre o
1 Maathuis F. Ligand-gated ion channels. En: Blatt M.R. (Ed.) Membrane transport in plants. Blackwell Publishing, CRC Press, 2004, p. 199.
2
la apertura de las clulas de guarda en respuesta a la aplicacin de las hormonas reguladoras
ABA (cido abscsico) o IAA (cido indolilactico).
En las plantas la elevacin del Ca2+ citoslico en numerosos casos es el resultado del influjo a
travs de la membrana plasmtica. Sin embargo, muchos procesos fisiolgicos requieren la
participacin de depsitos intracelulares de calcio. Su presencia permite localizar la seal de Ca2+
y su tiempo de vida (patrn espacio-tiempo), y, por otra parte, amplificar y prolongar la seal
inicial de calcio, as como disear su forma (patrn amplitud-frecuencia) de manera especfica
para cada estmulo (Allen y col., 2001). Por esto, el estudio de los canales inicos permeables a
calcio los componentes primarios que permiten la entrada y la elevacin del nivel de Ca2+ en
el citoplasma es una de las principales tareas para el entendimiento del funcionamiento de la
maquinaria llamada sealizacin por calcio.
1.1.1 Concentraciones y transporte de Ca2+ en las plantas.
En las plantas que crecen en condiciones adecuadas de calcio en su medio habitual, el
contenido promedio de calcio en los tallos es de 0.1-5% de su masa seca (Marschner, 1995) o, en
trminos de concentraciones 0.3-16.5 mM (White y col., 1992; de Silva y col., 1998). Estos
valores reflejan tanto la disponibilidad del calcio en el suelo, como las diferentes necesidades de
las plantas en este mineral. La deficiencia por calcio raramente se presenta en la naturaleza pero
ocurre con ms frecuencia en la horticultura y se debe principalmente a la indisponibilidad
momentnea del mineral para los tejidos en desarrollo, causada por la imposibilidad de su
redistribucin de los tejidos ms maduros va la floema (White y Broadley, 2003). Por su relacin
al calcio, las plantas son agrupadas en calcfugas (calcifuges, de suelos cidos pobres en calcio) y
calccolas (calcicoles, habitantes de suelos calcreos). Aunque es la tolerancia a Al, Mn y Fe lo
que principalmente determina la flora de los suelos cidos, y la insensibilidad a la deficiencia de
P y Fe lo que determina la flora en suelos calcreos (Lee, 1999), las calcfugas generalmente
crecen bien en bajas concentraciones de calcio en la rizsfera y no presentan amplia respuesta al
incremento de calcio. Al contraste, se considera que los mecanismos que le permiten a las
calccolas mantener en su hbitat natural un bajo nivel de Ca2+ en el citoplasma, no les permiten
crecer en condiciones de bajo suplemento de ste, induciendo deficiencia por calcio (Lee, 1999).
Probablemente, calcio, al igual que otros iones, penetra por las puntas de las races, de donde
se mueve por el apoplasto hacia los vasos de la xilema (Ferguson y Clarkson, 1976; Clarkson,
3
1993; White, 2001), en los cuales principalmente ocurre su movimiento, siguiendo el flujo de
agua causado por la transpiracin (Epstein y Bloom, 2005). Por otra parte, en las races de cebolla
(Allium cepa) existen evidencias de que el transporte de calcio a la xilema puede ocurrir a travs
del simplasto (Cholewa y Peterson, 2004). Se considera que en esta ruta los iones de calcio entran
al simplasto a travs de canales permeables a calcio de la membrana plasmtica, siendo
bombeados despus a los tejidos de conduccin por las Ca2+-ATPasas y los intercambiadores
H+/Ca2+ (White y Broadley, 2003) los transportadores de Ca2+ ms importantes de las clulas
vegetales.
1.1.2 Depsitos intracelulares de Ca2+ en plantas. La vacuola ltica y el retculo endoplsmico.
La capacidad de secuestrar el calcio citoplsmico en las clulas vegetales ha sido probada
para la vacuola, el retculo endoplsmico, las mitocondrias y los cloroplastos (Bush, 1995). No
obstante, son escazos los estudios sobre las concentraciones de calcio libre presentes en estos
compartimentos, y generalizados sus resultados, a pesar de que las mediciones de calcio total
demuestran claramente una distribucin no uniforme de ste a nivel de rganos, tejidos e incluso
a nivel celular, en dependencia de la disponibilidad de Ca2+ en el suelo y las caractersticas
funcionales de los tejidos (Dietz y col., 1992; Fricke y col., 1995; Karley y col., 2000).
En las clulas vegetales la vacuola central o ltica es el mayor depsito (ms del 80% del
volumen de la clula) de calcio intracelular. A pesar de esto, existe solo un reporte ampliamente
conocido de la actividad del Ca2+ en vacuolas de las plantas superiores Riccia fluitans (en
rizoides) y Zea mays (en races) 2.3 y 1.5 mM, respectivamente (Felle, 1988).
Sorprendentemente, estos datos insuficientes han sido puestos en base de la opinin de un alto
nivel de calcio libre, existente en las vacuolas, y son utilizados en modelos de transporte a travs
de la membrana vacuolar, aunque estudios de tan solo calcio total demuestran una localizacin
asimtrica de este catin en las hojas con patrones distintos para diferentes tejidos (Fricke y col.,
1995; aparte Karley y col., 2000). Incluso as, ha sido mostrado que la concentracin de calcio
en los tejidos se encuentra en funcin del calcio presente en el suelo (Dietz y col., 1992) y
depende de la estacin del ao, sufriendo cambios en vacuolas de tejidos dedicadas al
almacenamiento en poca de invierno (Stelzer y col., 1990, 1993) y manipulndose de diferentes
4
formas en hojas deciduas e invernales (en Larix decidua es acumulado en vacuolas del
endodermo y desechado durante el deshoje; en la planta de hojas perenes Picea abies el Ca2+ es
almacenado hasta la primavera en las vacuolas y en el apoplasto del mesfilo; Gierth y col.,
1998; Stelzer y col., 1990).
Se considera, que la mayor parte del Ca2+ vacuolar se encuentra ligado por aniones orgnicos
(oxalato, citrato, isocitrato, malato) formando, en muchos casos, complejos de baja solubilidad
precipitados en forma de cristales (principalmente de oxalato de calcio). Las funciones
primarias de estos complejos son la regulacin de alta capacidad del calcio vacuolar (tanto
almacenamiento de Ca2+, como la precipitacin de sus excedentes en una forma osmtica- y
fisiolgicamente inerte), la defensa contra herbvoros, as como la detoxificacin de Al3+ y
metales pesados (ver Franceschi y Nakata, 2005 para una revisin reciente). En las plantas
conocidas como precipitadoras de oxalato (a las que pertenece el betabel (White y Broadley,
2003) el objeto de estudio del presente trabajo) en los tejidos en crecimiento se encuentran
clulas especializadas idioblastos que precipitan en sus vacuolas en forma de oxalato el
calcio del apoplasto impidiendo as que ste interfiera con el crecimiento de las clulas
inmaduras, que, debido a su pobre vacuolacin, tienen una capacidad reducida para secuestrar el
calcio (Franceschi y Nakata, 2005). Es interesante, que los idioblastos poseen una densa red de
retculo endoplsmico, cuya principal tarea, por lo visto, es el rpido secuestro del calcio entrante
al citoplasma y su transportacin a la vacuola central para su precipitacin (Kostman y col., 2003;
Franceschi y Nakata, 2005). Estos datos pueden revelar las funciones de los dos mayores
depsitos de calcio celulares: el retculo endoplsmico (como secuestrador de Ca2+) y la vacuola
central (como su almacn), en el mantenimiento de la homeostasis de calcio en la clula vegetal,
discutidos ms adelante (ver. p.1.1.3)
El retculo endoplsmico (RE) es el segundo depsito intracelular de calcio ms importante en
las clulas vegetales, despus de la vacuola. La concentracin libre de calcio en el RE fue
igualmente determinada en un solo trabajo y estimada en alrededor de 3 M (en clulas aleurnicas de cebada; Bush y col., 1989). Por otra parte, la similitud de las funciones del RE en
las clulas eucariotas permite considerar como cercana la actividad de Ca2+ en el RE de las
clulas vegetales a la observada en clulas animales y cuyos valores varan entre 0.1-2 M (Kendall y col., 1994, 1996) y 100-400 M (Solovyeva y Verkhratsky, 2003). El RE de las plantas pudiera presentar similar variacin en el nivel de Ca2+ libre lumenal en dependencia de la
5
presencia de calreticulina protena de gran capacidad para secuestrar el calcio con baja
afinidad, la funcin de la cual es mantener un alto nivel de Ca2+ en el lumen del RE (Persson y
col., 2001; Wyatt y col., 2002).
En otros organelos la concentracin libre de calcio en reposo determinada es menor que la
estimada para la vacuola, aunque presenta elevaciones en respuesta a diversos estmulos. La
concentracin de Ca2+ libre en mitocondrias, determinada con la tcnica camalen, en
condiciones de reposo se encuentra alrededor de 200 nM y puede aumentar hasta 800 nM durante
diferentes estreses (Logan y Knight, 2003). En cloroplastos el nivel de Ca2+ en reposo tambin es
relativamente bajo (menos de 150 nM), pero el cambio de exposicin luz-oscuridad genera una
elevacin transitoria del nivel de calcio hasta 5-10 M (Johnson y col., 1995). Igualmente, en el ncleo la concentracin libre de calcio es menor de 100 nM, pero presenta una breve elevacin
hasta cerca de 500 nM en condiciones de estrs (van der Luit y col., 1999).
1.1.3 Transporte de Ca2+ en las vacuolas y el retculo endoplsmico.
En general, los sistemas intracelulares de aislamiento de Ca2+ realizan cuatro importantes
tareas, necesarias para el funcionamiento normal de las clulas vivas (Sanders y col., 2002):
1. Mantienen el calcio citoplsmico al nivel de reposo y ayudan de esta forma a la extincin
de seales de calcio.
2. Acumulan el Ca2+ en compartimentos tales como el RE y la vacuola para liberarlo de forma
regulada durante el proceso de sealizacin.
3. Suplementan Ca2+ a organelos especficos que requieren un alto nivel de calcio para el
curso normal de sus reacciones bioqumicas. Por ejemplo, estas condiciones son necesarias
para el procesamiento adecuado de las protenas que van a ser secretadas desde el RE
(Rudolph y col., 1989; Gill y col., 1996).
4. Aislando el Ca2+, evitan su precipitacin con el fosfato inorgnico (Pi) en complejos de
baja solubilidad (Sanders y col., 1999).
Las protenas que ejercen el transporte de calcio en las clulas vegetales son los H+/Ca2+-
intercambiadores (del tipo CAX, por las siglas en ingls CAtion eXchangers) y las bombas de
calcio o Ca2+-ATPasas. Para el transporte de Ca2+ en direccin opuesta a su gradiente, los CAX
utilizan el gradiente de pH a travs de la membrana, generado y mantenido por la actividad de la
6
pirofosfatasa (PPiasa) y las bombas de protones (H+-ATPasas), mientras que las Ca2+-ATPasas
para este fin utilizan la energa del ATP.
La actividad de los intercambiadores H+/Ca2+ ha sido demostrada en vesculas de tonoplasto
de diferentes especies, por lo que se estima su amplia distribucin en el reino vegetal (Schumaker
y Sze, 1985; Blumwald y Pool, 1986; Blackford y col., 1990; Chanson, 1991; Hirschi y col.,
1996; Ueoka-Nakanishi y col., 1999). La primer isoforma definida de estos transportadores fue la
CAX1, localizada en vacuolas de Arabidopsis thaliana (Hirschi y col., 1996). El CAX1
intercambia H+ vacuolar por Ca2+ citoslico en razn de 3 por 1 y, en comparacin con las Ca2+-
ATPasas, con poca afinidad al calcio Km 10-13 M caracterstica general de los intercambiadores Ca2+/H+ (Schumaker y Sze, 1985; Blumwald y Pool, 1986; Hirschi y col., 1996;
Hirschi, 2001); no obstante, en comparacin con las Ca2+-ATPasas, la capacidad de transporte de
estas enzimas es ms alta (Hirschi, 2001) Vmax = 25 nMmin1mg1protena (Ueoka-Nakanishi
y col., 1999). De los miembros de la familia CAX investigados (que incluye 12 isoformas en el
genoma de Arabidopsis (Sanders y col., 2002) de las cuales han sido caracterizadas cuatro), solo
el CAX1 y el CAX2 (con menor afinidad) poseen la capacidad confirmada de transportar Ca2+
(Hirschi y col., 1996). Los otros miembros de esta familia (incluyendo el CAX2), al parecer,
confieren a las plantas tolerancia a otros metales potencialmente txicos (Mn2+, Cd2+, Zn2+)
mediante su aislamiento del citoplasma, y sus capacidades de transporte de Ca2+ se desconocen
(Sanders y col., 2002). Aparte de la vacuola, existen evidencias de la presencia de los CAX en la
membrana citoplasmtica (Kasai y col., 1990).
Al igual que los CAX, las Ca2+-ATPasas aslan el Ca2+ del citoplasma, transportndolo adentro
de organelos-depsitos de Ca2+ o hacia el apoplasto, pero con una mayor afinidad Km 1-10 M (Evans y Williams, 1998) y menor capacidad de transporte (White y Broadley, 2003) Vmax = 6
nMmin1mg1protena (Ueoka-Nakanishi y col., 1999).
Las Ca2+-ATPasas de las clulas vegetales pertenecen a la superfamilia de las P-ATPasas y
estn representadas por dos familias (Geisler y col., 2000a; Axelsen y Palmgrem, 2001): IIA (4
miembros identificados en el genoma de A. thaliana; nombrados, respectivamente, ECA1-4) y
IIB (reguladas por calmodulina o protein-kinasas dependientes de Ca2+ (CDPKs), 10 miembros
identificados en A. thaliana AtACA1, 2, 4 y 7-13, respectivamente). La localizacin interna de
las Ca2+-ATPasas tipo IIA incluyen el RE y el aparato Golgi (AtECA1, en A. thaliana; Liang y
7
col., 1997), y la membrana plasmtica y el tonoplasto (LeLCA1, en tomate Lycopersicon
esculentum; Ferrol y Bennet, 1996; Navarro-Avino y col., 1999), aunque en Arabidposis no
existen reportes de la presencia de Ca2+-ATPasas de ninguna de las dos familias en la membrana
vacuolar (Maeshima, 2001). Las Ca2+-ATPasas del tipo IIB residen en la membrana plasmtica
(AtACA8; Bonza y col., 2000), en el RE (AtACA2; Liang y col., 1997; Hong y col., 1999) y en
la membrana interna de los plstidos (AtACA1; Huang y col., 1993). Una alta actividad de Ca2+-
ATPasas en membranas vacuolares fue inicialmente reportada en clulas de raz de maz (Zea
mays; Gavin y col., 1993; Pfeiffer y Hager, 1993; estos dos estudios en el mismo objeto se
distinguen drsticamente en los niveles reportados de actividad de Ca2+-ATPasas asociada con el
RE). La presencia de una bomba de Ca2+ del tipo IIB fue demostrada en vesculas de tonoplasto
de Brassica (Askerlund, 1996; sta fue denominada ms tarde BCA1 por Malstrm y col., 1997).
Aparte, una gran actividad de Ca2+-ATPasas ha sido reportada en vesculas de la misma fraccin
de membranas de diferentes especies de plantas (Sze y col., 2000), aunque el contenido de
protena fue insuficiente para su deteccin como banda en gel de SDS-poliacrilamida. Estudios
ms detallados en Arabidopsis mostraron la presencia de Ca2+-ATPasas (isoforma AtACA4) en
vacuolas pequeas, pero no en la membrana de la vacuola ltica (Geisler y col., 2000b). Por lo
tanto, queda abierta la cuestin estn las Ca2+-ATPasas asociadas con el tonoplasto o con
membranas de la misma fraccin, pero pertenecientes a organelas particulares.
En base a las propiedades de transporte de Ca2+ la capacidad de transporte y la afinidad al
Ca2+ de los CAX y las Ca2+-ATPasas, a estas protenas les fueron asignados diferentes papeles
en el mantenimiento de la homeostasis de Ca2+ en el citoplasma. En condiciones fisiolgicas, la
concentracin de Ca2+ libre en el citosol es de alrededor de 0.1 M, aumentando sta a centenas de nanomoles e incluso micromoles durante la aplicacin de diversos estmulos (McAinsh y
Hetherington, 1998) y pudiendo, probablemente, alcanzar el valor 10 M en regiones anexas a la vacuola durante el inicio de la sealizacin (Ueoka-Nakanishi y col., 1999). La gran capacidad de
transporte de Ca2+ de los CAX permite rpidamente disminuir este incremento, sin afectar, por su
baja afinidad al Ca2+ (Km 10-15 M), las enzimas Ca2+-dependientes y Ca2+-activadas del citosol, el Km de las cuales al Ca2+ se encuentra en el rango micromolar (Ueoka-Nakanishi y col., 1999).
Por otra parte, la poca afinidad al Ca2+ no permite a los CAX lograr un nivel de Ca2+ citoslico
menor de 1 M (Ueoka-Nakanishi y col., 1999). Es estimado que el nivel de Ca2+ citoslico es regresado a sus valores de reposo (alrededor de 0.1 M) por las Ca2+-ATPasas que poseen una
8
mayor afinidad (Km 1-10 M) al Ca2+ (Ueoka-Nakanishi y col., 1999). En otras palabras despus de la elevacin del Ca2+ citoslico, los CAX cumplen la funcin de la rpida
disminucin de ste a niveles en los cuales el Ca2+ es menos txico y las Ca2+-ATPasas se
encargan de la subsecuente disminucin de la concentracin de Ca2+ citoslico y de su
manutencin en un rango estrecho en condiciones de reposo.
Esta hiptesis es sostenida por las observaciones hechas en Saccharomyces cerevisiae
utilizadas como modelo de procesos de transporte en plantas, en las cuales los intercambiadores
H+/Ca2+, pero no las Ca2+-ATPasas, participan en la eliminacin de las seales de calcio despus
de la aplicacin de un choque hipertnico (Denis y Cyert, 2002). No, obstante, el mutante de
Arabidopsis det3 que posee una baja actividad de H+-ATPasa vacuolar y, probablemente, de
intercambio H+/Ca2+, presenta una relativamente alta concentracin de Ca2+ citoplsmico (Allen y
col., 2000) y las plantas tratadas con bafilomicina inhibidor de H+-ATPasas tipo V
presentan una mayor elevacin de Ca2+ citoslico en respuesta a choques hiperosmticos
(Takahashi y col., 1997).
1.1.4 Transduccin de seales por calcio en clulas vegetales
Los efectos de calcio pueden ser agrupados en 3 tipos, que describen su papel fisiolgico en
las clulas vegetales (Plieth, 2005): 1) Ca2+ como protector (un gran nmero de evidencias
demuestra una disminucin del efecto de estreses inico o toxicidad mineral en presencia de una
alta concentracin de Ca2+ en el apoplasma; ver Plieth, 2005 para ms detalles y referencias); 2)
Ca2+ como switch (interruptor) qumico (activador de canales y protenas dependientes y/o
reguladas por calcio); 3) Ca2+ como acarreador de la informacin codificada sobre los estmulos
que causan su liberacin.
La elevacin de la concentracin de calcio libre citoslico [Ca2+]cit es causada por numerosos
factores fisiolgicos y externos (Tabla 1), y es considerada un elemento clave para la generacin
de la respuesta fisiolgica adecuada (White y Broadley, 2003). Sanders y col. (1999) propusieron
su aparicin en el proceso evolutivo en base de la necesidad del mantenimiento de un nivel muy
bajo de [Ca2+]cit, en el fondo del cual las seales de calcio podran conferir sensibilidad y
velocidad a las respuestas originadas por estmulos de diferente naturaleza. Actualmente se
considera, que, para evocar la respuesta adecuada, la alteracin del [Ca2+]cit (Ca2+-signature
firma de Ca2+) generada por cada estmulo es nica. sta exclusividad se manifiesta en su
9
TABLA 1. Ejemplo de procesos de desarrollo y respuestas a estmulos biticos y abiticos, iniciados por la perturbacin en [Ca2+]cit (White y Broadley, 2003).
Evento de desarrollo o respuesta a estmulo externo Perturbacin de [Ca
2+]cit Liberador de Ca2+
al citosol Referencias selectas
Elongacin de tubos polinarios
Oscilaciones de alta [Ca2+]cit apical
Apoplasto e interno
Malh y Trewavas, 1996; Holdaway-Clarke y col, 1997; Malh y col., 1998, 2000; Messerli y col., 2000; Rudd y Franklin-Tong, 2001
Respuesta de autoincompatibilidad del tubo polinario
Onda de [Ca2+]cit en el tallo Apoplasto e interno (IP3 dependiente)
Rudd y Franklin-Tong., 2001; Straatman y col., 2001; Franklin-Tong y col., 2002
Polarizacin celular despus de fertilizacin
Onda de [Ca2+]cit desde el sitio de penetracin del espermo, causa la elevacin de [Ca2+]cit sostenida
Apoplasto Antoine y col., 2001
Divisin celular Elevacin de [Ca2+]cit Bush, 1995
Germinacin de semillas (giberelinas)
Elevacin lenta de [Ca2+]cit Bush, 1995; Anil y Sankara Rao, 2001
Apoptosis Elevacin lenta y sostenida de [Ca2+]cit
Levine y col., 1996
Luz roja Elevacin de [Ca2+]cit Apoplasto Shacklock y col., 1992; Malh y col., 1998
Luz azul Picos cortos de elevacin de [Ca2+]cit (segundos)
Apoplasto Malh y col., 1998; Baum y col., 1999
Ritmos circadianos Oscilaciones circadianas de [Ca2+]cit
Johnson y col., 1995; Wood y col., 2001
Cierre de clulas de guarda (ABA, esfingosina-1-fosfato)
1. Elevacin de [Ca2+]cit en la periferia celular 2. Elevacin de [Ca2+]cit alrededor de la vacuola 3. Oscilaciones de [Ca2+]cit
1. Apoplasto 2.Vacuola 3. Apoplasto e interno
McAinsh y col., 1992; Allen y col., 1999,2000; Blatt, 2000a,b; White, 2000; Anil y Sankara Rao, 2001; Evans y col., 2001; Ng y col., 2001a,b; Schroeder y col., 2001; Klsener y col., 2002
CO2 Elevacin de [Ca2+]cit en clulas de guarda
Apoplasto Webb y col., 1996
Incremento de Ca2+ en el apoplasto
Oscilaciones de [Ca2+]cit en clulas de guarda
Apoplasto McAinsh y col., 1995; Allen y col., 1999, 2000
Respuestas a auxinas 1. Elevacin lenta y prolongada de [Ca2+]cit 2. Oscilaciones de [Ca2+]cit
Felle, 1988; Malh y col., 1998; Ng y col., 2001b; Plieth, 2001; Plieth y Trewavas, 2002
Elevacin de K+ en el xilema
Elevacin de [Ca2+]cit De Boer, 1999
Exocitosis Elevacin de [Ca2+]cit Battey y col., 1999; Camacho y Malh, 2003
Elongacin de clulas de raz
Elevacin sostenida de [Ca2+]cit Apoplasto Cramer y Jones, 1996; Demidchik y col., 2002
Elongacin de pelos radiculares
Elevacin sostenida de [Ca2+]cit en el pex
Apoplasto Wymer y col., 1997; White, 1998; Bibikova y col., 1999
Inhibicin de la ciclsis citoplsmica
Elevacin de [Ca2+]cit Ayling y Clarkson, 1996
Nodulacin Elevacin inicial de [Ca2+]cit, con subsecuentes oscilaciones
Apoplasto Crdenas y col., 2000; Wais y col., 2000; Walker y col., 2000; Lhuissier y col., 2001; Shaw y Long, 2003
Senescencia Elevacin sostenida de [Ca2+]cit Huang y col., 1997
10
Radiacin UV Elevacin lenta de [Ca2+]cit, elevacin de [Ca2+]cit sostenida por minutos
Apoplasto Frohnmeyer y col., 1999
Estrs trmico Elevacin de [Ca2+]cit sostenida por 15-30 minutos
Apoplasto e interno (IP3-dependiente)
Gong y col., 1998; Malh y col., 1998
Estrs de fro 1. Picos unitarios de [Ca2+]cit 2. Oscilaciones de [Ca2+]cit
1. Apoplasto Knight y col., 1991; Malh y col., 1998; White, 1998; Plieth y col., 1999; van der Luit, 1999; Allen y col., 2000; Kiegle y col., 2000; Knight, 2000; Cessna y Low, 2001; Plieth, 2001
Enfriamiento gradual Bifsica 1. Picos cortos de elevacin de [Ca2+]cit (segundos) 2. Elevacin lenta de [Ca2+]cit
1. Apoplasto 2. Apoplasto e interno (IP3-dependiente)
Knight y col., 1996; Plieth y col., 1999; Knight, 2000; Knight y Knight, 2000; Moore y col., 2002
Estrs oxidativo (paraquat, superxidos, H2O2, ozono)
1. Picos cortos de elevacin de [Ca2+]cit 2. Elevacin sostenidade [Ca2+]cit 3. Oscilaciones de [Ca2+]cit
1. Apoplasto 2.Apoplasto e interno (IP3-dependiente)
Price y col., 1994; Levine y col., 1996; McAinsh y col., 1996; Knight y col., 1998; Malh y col., 1998; Clayton y col., 1999; Allen y col, 2000; Kawano y Muto, 2000; Knight, 2000; Klsener y col., 2002; Lecourieux y col., 2002
Anoxia Bifsica 1. Picos cortos (duracinminutos) 2. Elevacin sostenida de [Ca2+]cit (horas)
1. Apoplasto 2. Interno, incluyendo mitocondrias
Subbaiah y col., 1994, 1998; Sedbrook y col., 1996; Malh y col., 1998; Plieth, 2001
Sequa / Estrs hiperosmtico (mannitol)
Bifsica 1. Picos cortos (duracin de minutos) 2. Elevacin sostenida de [Ca2+]cit (horas)
Apoplasto y vacuola
Knight y col., 1997; Malh y col., 1998; Kiegle y col., 2000, Cessna y col., 2001; Pauly y col., 2001; Plieth, 2001
Estrs salino (NaCl) Bifsica Ondas de elevacin de [Ca2+]cit en tejidos 1. Picos cortos (de minutos de duracin) 2. Elevacin sostenida de [Ca2+]cit (horas) 3. Disminucin de [Ca2+]cit (das)
Apoplasto y vacuola (IP3-dependiente)
Knight y col., 1997; Kiegle y col., 2000; Knight, 2000; DeWald y col., 2001; Pauly y col., 2001; Moore y col., 2002; Halperine y col., 2003
Estrs hipoosmtico Bifsica 1. Pequea elevacin de [Ca2+]cit 2. Gran elevacin de [Ca2+]cit
1. Apoplasto 2. Apoplasto e interno
Takahashi y col., 1997; Malh y col., 1998; Knight y col., 2000; Cessna y Low, 2001; Cessna y col., 2001; Pauly y col., 2001; Plieth, 2001
Estimulacin mecnica (movimiento, roce, viento)
Picos unitarios de [Ca2+]cit (segundos) Onda de elevacin de [Ca2+]cit en tejidos
Interno Knight y col., 1991, 1992; Haley y col., 1995; Legu y col., 1997; Malh y col., 1998; van der Luit, 1999; Plieth, 2001 Fasano y col., 2002
Estrs de Al elevacin de [Ca2+]cit Zhang y Rengel, 1999
Patgenos (elicitors) Bifsica 1. Picos lentos de elevacin de [Ca2+]cit (duracin de minutos) 2. Elevacin sostenida de [Ca2+]cit (horas) 3. Oscilaciones de [Ca2+]cit (la magnitud relativa de las diferentes fases dependen del patgeno)
1. Apoplasto 2. Apoplasto e interno (IP3-dependiente)
Knight y col., 1991; Malh y col., 1998; Mithfer y col., 1999; Blume y col., 2000; Fellbrich y col., 2000; Grant y col., 2000; Cessna y Low, 2001; Cessna y col., 2001; Rudd y Franklin-Tong, 2001; Klsener y col., 2002; Lecourieux y col., 2002
11
localizacin subcelular y/o en su cintica o magnitud de la alteracin de [Ca2+]cit (Mcainsh y
Hetherington, 1998; Trewavas, 1999; Rudd y Franklin-Tong, 2001). Para la coordinacin de la
respuesta celular, son producidas ondas de [Ca2+]cit que involucran sucesivamente canales
dependientes de Ca2+. Varios mecanismos han sido propuestos para la generacin de estas ondas
(ver White y Broadley, 2003 para ms detalles y referencias): la generacin por la elevacin de
[Ca2+]cit de segundos mensajeros (IP3, cADPR) que a su vez activan canales de Ca2+ distantes; la
activacin de canales de Ca2+ mecanosensibles (por la penetracin del espermo durante la
fecundacin); influjo repetitivo a travs de la membrana plasmtica (en la respuesta de
autoincopatibilidad durante el crecimiento del tubo polinario); la activacin sucesiva de canales
de la membrana plasmtica activados por hiperpolarizacin y canales activados por ligandos en el
tonoplasto (en clulas de guarda tratadas con ABA).
Sin embargo, la elevacin de [Ca2+]cit no puede ser prolongada, ya que de otra forma causara
la muerte de la clula (la elevacin sostenida del Ca2+ citoslico se encuentra implicada en la
apoptosis, tanto durante el desarrollo normal, como en respuestas de hipersensibilidad; White y
Broadley, 2003) y, por lo tanto, debe ser transitoria o de pequea amplitud. Entre los patrones
que caracterizan la distribucin temporal de la alteracin de [Ca2+]cit se destacan los siguientes
(ver Tabla 1.): 1. evento transitorio elevacin de [Ca2+]cit inmediata y transitoria, con la
restauracin del nivel de Ca2+ de reposo en minutos (causada por estmulos mecnicos no dainos
y choque de fro cold shock); 2. respuesta bifsica elevacin inmediata y transitoria de
[Ca2+]cit seguida por una elevacin de [Ca2+]cit ms prolongada (minutos-horas; inducida por
choque trmico, estrs salino agudo, estrs hiperosmtico, anoxia, estrs oxidativo; aplicacin
prolongada de temperaturas menores a las umbrales; patgenos y elicitors); 3. oscilaciones
con variaciones en su duracin, periodicidad y amplitud, as como en su forma, en dependencia
de la intensidad y la combinacin de estmulos especficos; los modelos propuestos para su
generacin incluyen (i) el vaciado y rellenado sucesivo de depsitos de Ca2+ agotables, (ii) la
activacin / desactivacin sucesiva de canales de Ca2+ mediante cascadas de sealizacin
concurrentes, (iii) la distensin y relajacin de la membrana (White y Broadley, 2003). En cuanto
al origen espacial del Ca2+ este puede provenir tanto del exterior de la clula el apoplasto,
como de depsitos internos. En la Fig. 1 se representan el origen y la localizacin de seales de
calcio en respuesta a algunos estmulos especficos.
Luz / Oscuridad
Fro,Sequa
Polarizacin,Choque hipoosmtico
ABA,Seales polarizantes endgenas,
Choque osmtico,Fro,
Sequa
Vacuola1-3 mM Ca
2+
0.1-200 M Ca2+
RE
Cloroplasto
0.1-10 MCa
2+
Citoplas
ma
0.1-10M
C
a2+
Fig.1 Representacin esquemtica de las seales conocidas que inician la liberacinde calcio en la clula vegetaln (fuente: Sanders y col., 2002, modificado).
Las flechas sealan a los compartimirnetos celulares, donde es notada la liberacin de Ca , originadapor los estreses mencionados.
2+
13
1.2 Antecedentes
1.2.1 Canales vacuolares, permeables a Ca2+.
Actualmente existe un gran nmero de reportes de canales vacuolares permeables a Ca2+,
tanto dependientes de voltaje, como activados por ligandos. A continuacin son mencionados
algunos de ellos y sus caractersticas.
SV (Slow Vacuolar channels; Hedrich y col., 1986) es el canal permeable a calcio ms comn
de la membrana vacuolar, y, probablemente, como es discutido ms adelante es el nico canal
permeable a Ca2+ firmemente establecido en el tonoplasto. Este canal posee una severa
rectificacin saliente y modulacin por Ca2+ por ambos lados de la membrana vacuolar, y es
regulado por numerosos factores. Una descripcin ms detallada del canal SV es realizada en el
p.1.2.2.1.
VVCa (Vacuolar Voltage-gated Ca2+ channels; Johannes y col., 1992; Allen y Sanders, 1994b,
Johannes y Sanders, 1995) fueron reportados en vacuolas de la raz napiforme de Beta y en
clulas de guarda de Vicia faba y caracterizados como rectificadores-entrantes activos a
potenciales fisiolgicos y activados por Ca2+ vacuolar. La ausencia de corrientes generadas por
este canal en parches en la configuracin vacuola-completa (anlogo de whole-cell) y la
comparacin cuantitativa de la conductancia, selectividad y de los valores absolutos de la
modulacin por calcio y por voltaje, les permiti a Pottosin y Schnknecht (2007) concluir que
en los experimentos reportados se trataba del canal SV, registrado en parches invertidos (con una
orientacin opuesta a la asumida por los investigadores). Aparte, otra corriente de Ca2+ de
rectificadores-entrantes distinta a la del VVCa fue reportada en vacuolas de betabel (Gelli y
Blumwald, 1993), aunque, segn Pottosin y Muiz (2002), la existencia de canales permeables a
Ca2+, permanentemente abiertos a potenciales fisiolgicos es poco probable, ya que mediaran
una rpida liberacin de Ca2+ al citoplasma, que causara la muerte de la clula.
Canales permeables a Ca2+, activados por ligandos (IP3, cADPR) pudieran encontrarse en la
membrana vacuolar. Varios estudios sostienen esta suposicin:
14
Estudios en clulas completas: (i) tanto IP3, como cADPR causan el cierre de la estoma en las
clulas de guarda (Blatt y col., 1990; Leckie y col., 1998); (ii) el tratamiento con ABA induce,
por una parte el aumento del nivel de cADPR (Wu y col., 1998), por otra una onda de
Ca2+ en el citosol, que inicia la liberacin de calcio de depsitos intracelulares, inhibida por
rianodina (Grabov y Blatt, 1999); (iii) el bloqueo de la fosfolipasa C (PLC, enzima-productora
de IP3) elimina los efectos de ABA oscilaciones de [Ca2+]cit y el cierre de las clulas de
guarda (Staxen y col., 1999); (iv) choques hiperosmticos (NaCl, en raz de Arabidopsis)
producen IP3 y la simultnea movilizacin del Ca2+ intracelular (DeWald y col., 2001).
Estudios en preparaciones de membranas: (i) IP3 causa la liberacin de Ca2+ en vesculas de
membrana vacuolar (de avena Avena Shumaker y col., 1987; y Beta Allen y col., 1995).
Un estudio ms detallado (Muir y Sanders, 1997) en coliflor (Brassica) mostr la asociacin
de este efecto del IP3 principalmente con la fraccin de membrana plasmtica, y en menor
grado con la fraccin enriquecida de RE y la de membranas vacuolares; (ii) cADPR induce
la liberacin de Ca2+ en vesculas de RE (pero no en membranas plasmticas) de Brassica
(Navazio y col., 2001); (iii) al igual que IP3, cADPR induce la liberacin de Ca2+ en vesculas
de membrana vacuolar de Beta (Allen y col., 1995).
Aparte, se ha reportado la participacin de ligandos en la mediacin de respuestas a diversos
estmulos: IP3 media la respuesta a los estreses salino e hiperosmtico (Drobak y Watkins, 2000;
DeWald y col., 2001) y gravitropismo (Perera y col., 1999) y cADPR participa en la activacin
de genes de defensa (Durner y col., 1998) y en la transduccin de la seal generada por ABA
(Wu y col., 1997; McAinsh y Htherington, 1998). No obstante, a pesar de estos encuentros, los
canales-responsables de la liberacin de Ca2+ todava no han sido caracterizados.
Alexandre y col. (1990) reportaron la existencia de canales activados especficamente por IP3
en vacuolas de raz de betabel. Este fue el nico trabajo en clulas vegetales, en el que fueron
registrados canales unitarios activados por ligandos, no obstante, estos registros no pudieron ser
reproducidos posteriormente en varios trabajos (Chasan y Schroeder, 1992; Gelli y Blumwald,
1993). Allen y Sanders (1994a, 1995) mostraron la generacin de corrientes a travs de la
membrana vacuolar de Beta con la aplicacin de IP3 y cADPR. No obstante, en ambos casos la
corriente registrada constituy una pequea fraccin sobre la corriente de fuga no especfica y
probablemente es un artefacto causado por el intercambio de solucin. Adems, a diferencia de
los canales activados por ligandos de clulas animales, las corrientes generadas por IP3 y cADPR
15
en estos trabajos fueron independientes del nivel de Ca2+ citoslico hasta concentraciones
milimolares, en contraste con el reporte de Leckie y col (1998) de un Km de ~100 nM para la
inhibicin por Ca2+ citoslico de corrientes vacuolares originadas por cADPR en clulas de
guarda. No obstante, este valor de Km para calcio coincide con el Km de inhibicin del canal
vacuolar rpido (Fast Vacuolar channel FV), las corrientes del cual no fueron eliminadas en
este estudio. Otra de las evidencias en contra de los estudios realizados para la determinacin de
canales activados por ligandos en clulas vegetales es la alta concentracin de rojo de rutenio
100 M con la que fue inhibida la corriente inducida por cADPR (la concentracin utilizada es 100 veces mayor a la empleada para el bloqueo del receptor de ryanodina en las clulas
animales).
De esta manera, de todos los canales permeables a Ca2+ reportados, la existencia y la
permeabilidad a Ca2+ hasta el momento solamente han sido establecidas para el canal SV uno
de los objetos de estudio del presente trabajo.
1.2.2 SVel nico canal vacuolar permeable a Ca2+ establecido firmemente.
Los primeros estudios de los mecanismos de transporte a travs de la membrana vacuolar
fueron realizados utilizando como objetos experimentales hojas enteras de plantas y grandes
cantidades de vacuolas por lo que estos experimentos no permitan distinguir la aportacin de
transportadores individuales como canales inicos o bombas (Hedrich y col. 1986). Con el fin de
detallar estos mecanismos, en 1986 Hedrich y col. aplicaron la tcnica de patch-clamp a vacuolas
individuales aisladas del mesfilo de cebada en una configuracin analga a la whole-cell
conocida como whole-vacuole. Entre otros resultados, este trabajo revel la presencia en el
tonoplasto de un canal rectificador entrante ( del lado vacuolar) no selectivo que
posteriormente (Hedrich y Neher, 1987), debido a su lenta cintica de activacin, recibi el
nombre de canal vacuolar lento (SV del ingls slow vacuolar) y fue el primer canal de la
membrana vacuolar caracterizado.
La relativamente alta expresin del canal SV en la membrana vacuolar, as como la
modulacin de su actividad tanto por el calcio citoslico como vacuolar, hizo de este canal un
blanco muy atractivo para numerosos estudios de selectividad, permeabilidad, bloqueo-activacin
y, recientemente de participacin en la sealizacin por Ca2+; todos stos realizados en objetos
16
y condiciones inicas muy diferentes que dificultan enormemente el anlisis comparativo de los
datos obtenidos.
La adopcin de la convencin sobre mediciones electrofisiolgicas en endomembranas (Bertl
y col, 1992) sirvi como primer paso para la estandarizacin de la tcnica de obtencin de
registros, particularmente, de las corrientes vacuolares. Por esta convencin, el potencial Vm a
travs de las endomembranas es registrado respecto al potencial del citoplasma y calculado para
la vacuola como Vm = Vcytosol Vvacuola. En este caso, las corrientes positivas o salientes
representan el flujo de cationes fuera del citosol (entrantes a la vacuola). Siguiendo esta
convencin, el canal SV actualmente es caracterizado como canal-rectificador saliente.
1.2.2.1 Localizacin y Estructura del Canal SV Localizacin
Originalmente, la presencia del canal SV fue reportada en vacuolas de raz de betabel (Beta
vulgaris; Coyaud y col., 1987; Hedrich y Neher, 1987). En estudios posteriores fue demostrado
que el canal SV est ampliamente distribuido en reino vegetal y se encuentra presente en
diferentes tejidos de las plantas (Tabla.2). Canales de la misma familia, aparte, se encuentran
presentes en animales (Ishibashi y col., 2000 ver Peiter y col., 2005).
TABLA 2. Especies de plantas en las que ha sido mostrada la presencia del canal SV (fuente: elaboracin propia).
Especie Referencia Musgos y heptica Trebacz y Schnknecht., 2000 Posidonia oceanica Carpaneto y col., 1997
Allium cepa Amodeo y col., 1994 Eichhornia crassipes Paganetto y col., 2001
Triticum aestivum Wherret y col., 2005 Hordeum sp. Bethke y Jones, 1994; Pottosin y col., 1997
Oriza sativa Furuichi y col., 2001; Hashimoto y col., 2004; Kurusu y col., 2004 Chenopodium rubrum Reifarth y col., 1994
Plantago sp. Maathuis y Prins, 1990 Vicia faba Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995
Beta vulgaris Hedrich y Neher, 1987; Pottosin y col., 2004; 2005 Daucus carota Scholz-Starke y col., 2004
Lycopersicon sp. Pantoja y col., 1989 Raphanus sativus Gambale y col., 1993; Carpaneto, 2003
Arabidopsis thaliana Colombo y col., 1994; Peiter y col., 2005
17
En las plantas antofitas, el canal SV ha sido registrado ordinariamente en la membrana vacuolar
de distintos tejidos (Tabla 3.). No obstante, en trabajos recientes en arroz (Oriza sativa) se ha
apuntado que el TPC1 (TPC two-pore channel, que, segn Peiter y cols (2005) corresponde al TABLA 3. Localizacin del canal SV en tejidos de plantas superiores (fuente: elaboracin propia).
Tejido o tipo de clula Referencia Hojas Hedrich y col., 1986 Raz Gambale y col., 1993; Pottosin y Schnknecht, 2007
Mesfilo Pottosin y col., 1997
Clulas de guarda Ward y Schroeder, 1994; Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995 Clulas aleurnicas Bethke y Jones., 1994 Clulas cultivadas Colombo y col., 1988; Weiser y col., 1990
canal SV de la membrana vacuolar, se localiza en la membrana plasmtica celular (Furuichi y
col., 2001; Hashimoto y col., 2004; Kurusu y col., 2004) aunque no se presentan claras
evidencias de ello y, probablemente, esta conclusin es errnea.
En las vacuolas la expresin del canal SV es relativamente alta, alcanzando valores de varios
miles de copias por vacuola (Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995; Pottosin y col., 1997) que pueden
mediar una corriente de 100-1000 pApF-1.
Estructura
La estructura del canal SV fue revelada recientemente por Peiter y col. (2005) en
experimentos con plantas modificadas de Arabidopsis thaliana. Segn este trabajo, el canal SV
pertenece a la familia de canales de doble poro TPC ampliamente presentada en mono-,
dicotiledneas, gimnospermas, musgos, as como en animales (ver. Peiter y col., 2005). La
estructura del canal SV (TPC1, producto de la expresin del gen tpc1) comprende dos unidades
similares al canal Shaker, con 6 dominios transmembranales cada una y un sitio de unin en el
lado citoslico con dos motivos EF-hand (Fig.2) y varios sitios de fosforilacin. Interesante, que
la estructura presentada potencialmente explica la sensibilidad del canal SV al Ca2+ citoslico
(por la presencia de los motivos EF-hand) pero no incluye motivo conocido que explicara la
afinidad del SV al Ca2+ vacuolar.
Dobrovinskaya y colaboradores (1999b) en un estudio con bloqueadores permeables del canal
SV determinaron algunas de las caractersticas fsicas del poro del canal SV. ste, en su parte
ms angosta, tiene un dimetro mayor al del catin cuaternario permeable tetrametilamonio
(TMA+) de aproximadamente 5.5 , pero es menor que el catin impermeable tetraetilamonio
(TEA+) de aprox. 8 (Fig. 2). Adems, utilizando las propiedades estructurales de poliaminas
1 2 3 4 5+
+6 7 8 9 10 11 12
P P
EF EF
+
+
Vacuola
Citosol
Fig.2 Estructura del canal TPC1, correspondiente al SV, y representacin esquemtica(fuente: A. Peiter y col., 2005; B. elaboracin propia).
.A Es considerado que el canal TPC1, la estructura del cual fue revelada recientemente, corresponde al canalSV. El gen codifica una protena que presenta una estructura similar a dos unidades de Shakerfusionadas, con dos estructuras EF-hand en el lado citoslico, residuos bsicos en el cuarto dominio decada unidad (+) que, probablemente, constituyen el sensor de voltaje, y dominios formadores de poro entrelos quintos y sextos dominios transmembranales. B. Representacin esquemtica de la estructura del canalSV, mostrando caractersticas fsicas del poro del canal, obtenidas en experiementos con bloqueadorespermeables (Dobrovinskaya y cols., 1999b).
TPC1
vacuola
citosol
20
8
19
(bloqueadores permeables del canal SV; especficamente espermina (Spm4+), espermidina
(Spd3+) y putrescina (Put2+) y apoyndose en los registros con TMA+ y Tris+, en este estudio fue
determinada la asimetra de la localizacin de la mayor barrera elctrica (probablemente el
filtro de selectividad) dentro del tonoplasto a una distancia de 30% de el lado vacuolar (en
trminos de distancia elctrica). Utilizando la espermidina y putrescina (por su rigidez y cargas
uniformemente distribuidas a lo largo de las molculas que las permitieron utilizar como reglas)
fue calculado el largo fsico del poro del canal que constituye alrededor de 20 (Fig. 2). La
aproximacin del poro a un cilindro de 8 de dimetro y 20 de largo resulta (en condiciones
de 0.1 M K+ simtrico) en una conductancia mxima calculada de 206 pS, que concuerda bien
con el valor experimental de 208 8 pS registrado (Dobrovinskaya y col., 1999).
1.2.2.2 Caractersticas del canal SV Selectividad y Permeabilidad
Originalmente, el canal SV fue caracterizado como canal selectivo para cationes
monovalentes permeable al K+ y al Na+ (Coyaud y col., 1987; Colombo y col., 1988; Pantoja y
col., 1989; Maathuis y Prins, 1990; 1991), que, adems, pudiera presentar una notable
permeabilidad a aniones (Hedrich y col., 1986; Coyaud y col., 1987; Hedrich y Kurkdjian, 1988).
Sin embargo, sta ltima propuesta, deducida del anlisis de los potenciales de inversin en
gradientes de KCl, no fue sostenida por experimentos con sustitucin de Cl por aniones
impermeables (Colombo y col., 1988; Lado y col., 1989; Amodeo y col., 1994; Allen y col.,
1996) y experimentos donde se estableca un potencial de inversin para Cl diferente del
potencial de inversin para los otros iones (Ward y col., 1995). Finalmente, Pottosin y col. (2001)
mostraron que la permeabilidad a Cl del canal SV no sobrepasa el 1% de su permeabilidad al K+.
En trabajos posteriores fue mostrada la permeabilidad del SV para Ca2+, Ba2+ (Pantoja y col.,
1992; Ward y Schroeder, 1994; Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995) y Mg2+ (Pottosin et al., 2001).
Los diferentes valores de la permeabilidad relativa PCa : PK, obtenidos en estos trabajos, le
permitieron a Allen y col. (1996) sugerir que el canal SV posee un poro multiinico, para el cual
es caracterstico la dependencia anmala de fracciones molares (anomalous mole-fraction
dependence) el valor de la permeabilidad relativa disminuye con el aumento de la relacin de
concentraciones [K+] / [Ca2+]. La permeabilidad absoluta para los cationes divalentes es en un
orden de magnitud menor a la misma para los cationes monovalentes (Ward y Schroeder, 1994) y
20
los cationes divalentes en su moviemiento a travs del poro se comportan como bloqueadores
permeables (Pottosin y col., 2004).
Las filas de selectividad determinadas para los canales SV de diferentes especies de plantas,
son mostradas en la Tabla 4.
TABLA 4. Selectividad y permeabilidad del canal SV (fuente: elaboracin propia). Especie Fila Referencias
Allium cepa Selectividad: Na+ > K+ > Rb+ > Cs+ Amodeo y col., 1994 Beta vulgaris, Vicia faba Selectividad: Ba2+ > Ca2+ > Mg2+ Pottosin y col., 2001; 2000
Permeabilidad relativa a: K+ +4NH > Rb
+ > Cs+ >> TMA+ TEA+ Dauca carota
Conductancia : K+ > Rb+ > Cs+ > +4NH >> TMA
+ TEA+
Scholz-Starke y col., 2004
a. Determinado por los potenciales de inversin.
Conductancia
En diferentes objetos la conductancia del canal SV vara entre 26 y 280 pS en condiciones
de 100 mM KCl simtrico y potenciales entre 20 y 80 mV, con actividad media del canal
(Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995). La mayor conductancia en estas condiciones la presentan los
canales SV de las clulas de guarda 280 pS (Vicia faba, Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995) y
210 pS (Allium cepa, Amodeo y col., 1994). La conductancia mas baja corresponde al canal SV
de vacuolas de reserva de aleurona 26 pS (Bethke y Jones, 1994). La conductancia del canal
unitario SV depende principalmente de la concentracin de K+, con los parmetros de Km ~ 100
mM y Gmax ~ 280 pS determinados para vacuolas de betabel (Gambale y col., 1996; Pottosin et
al., 2001).
El incremento de la concentracin libre de cationes divalentes en el lado vacuolar afecta la
conductancia del canal SV. En presencia de 100 mM KCl y pH 7.5 simtricos y 2 mM Ca2+ del
lado citoplsmico, el aumento de calcio o magnesio vacuolar libre de nanomoles a 10 mM causa
la reduccin dependiente de voltaje de la corriente del canal unitario, siendo esta reduccin
mayor a potenciales ms negativos (Pottosin y col., 2004): a 200 mV la corriente relativa del
canal unitario para condiciones de 10 mM de Ca2+ o Mg2+ vacuolar, respectivamente, constituye
solamente el 21 y 28% de la corriente en control, mientras que a potenciales positivos (+200 mV)
no hay diferencia en las corrientes del control y con la aplicacin vacuolar de uno de los cationes
divalentes; a 0 mV (potenciales fisiolgicos) la corriente relativa representa el 35 o 50% (Ca2+,
Mg2+, respectivamente) de la corriente en el control. Los potenciales negativos (citoslicos)
21
favorecen la aproximacin de Ca2+ y Mg2+ al sitio de unin dentro del poro. A la vez, estos
ltimos impiden el flujo libre de cationes monovalentes. Bloqueadores
En la Tabla 5. se muestran algunos de los bloqueadores del canal SV, con las respectivas
caractersticas del bloqueo. Interesantemente, el canal SV es bloqueado por concentraciones
submicromolares de rojo de rutenio agente qumico empleado como bloqueador del receptor
de ryanodina (RR) e inhibidor de la liberacin de calcio inducida por calcio en clulas animales,
lo que pudiera sugerir cierta similitud de los papeles que juegan el RR y el SV en los respectivos
organismos.
TABLA 5. Bloqueadores y caractersticas del bloqueo del canal SV (fuente: elaboracin
propia). Bloqueadores Caractersticas del bloqueo Referencias
Fisiolgicos Ca2+, Mg2+ vacuolar y
citoslico Dependiente de voltaje, Kd ~ 1-3 mM (Beta)
Ca2+ citoslico causa la rectificacin saliente de la corriente Pottosin y col., 2000
Poliaminas citoslicas Dependiente de voltaje, Spm4+ > Spd3+ > Put2+ Kd: 30; 400;
2,500 M (Beta) Dobrovinskaya y col., 1999a, b Zn2+ Kd = 5 M Hedrich y Kurkdjian, 1988
No fisiolgicos DIDS, SITS Kd = 1 M Hedrich y Kurkdjian, 1988
A-9-C Kd = 25 M Charibdotoxina Kd = 20 nM Tubocurarina Kd = 60 M Quinacrina Kd = 15 M
Weiser y col., 1990, 1991a, 1993
Rojo de rutenio
22
TABLA 6. Factores moduladores de la actividad del canal SV (fuente: elaboracin propia). Factor Modulacin Referencias
Voltaje
El SV es activado por voltaje positivo. Los potenciales de punto medio se encuentran en funcin del Ca2+ y Mg2+ citoslicos y del Ca2+ vacuolar. El SV es modulado por el potencial de superficie. El apantallamiento inespecfico del potencial de superficie por el cambio de 10 a 100 mM K+ reduce por 81 mV el desplazamiento total del umbral tcnico V1%, causado por el cambio de 0 a 0.5 mM Ca2+vac.
Pottosin y col., 2004 Carpaneto y col, 1997 (determinacin de dependencia de voltaje en ausencia de cationes divalentes) Pottosin y col., 2005
Cationes divalentes Ca2+, Mg2+
El alto Ca2+ citoslico es necesario para la activacin del canal (Kd ~100 M a +100mV; Beta, Hordeum, Vicia). El aumento de la concentracin de Ca2+ vacuolar disminuye la probabilidad de apertura del canal. Aplicado en el lado citoslico, el Mg2+ refuerza el efecto del Ca2+ citoslico (sensibilizacin del SV al Ca2+). En presencia en el lado vacuolar, el Mg2+ tiene un efecto ms modesto.
Pottosin y col., 2000; Pottosin y col., 1997; Pei y col., 1999. Pottosin y col., 2000; Pottosin y col., 1997; Pei y col., 2001
Calmodulina No tiene efecto sobre la corriente del canal unitario, pero aumenta la probabilidad de apertura del canal SV. Inhibidores de calmodulina (W-7, TFP, R 24571) disminuyen la probabilidad de apertura del canal. Este efecto es reversible con la agregacin de calmodulina de plantas
Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995; Allen y Sanders., 1995; Bethke y Jones, 1994; Weiser y col., 1991b
pH
Regulacin negativa por protones en los lados citoslico y vacuolar, pK=6.9 y 5.0 (Beta). Regulacin insignificante por pH vacuolar en presencia de Ca2+ vacuolar > 50 M (Hordeum) En Dauca carota, el canal SV presenta la mayor conductancia en condiciones de pH citoslico neutro (pH 7.0), disminuyendo con la acidificacin o alcalinizacin del medio. El pH ptimo se encuentra en dependencia de la presencia de agentes oxidantes-reductores (es recorrido a valores ms bsicos con el aumento de la concentracin de agentes reductores)
Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995 Pottosin y col., 1997 Scholz-Starke y col., 2004
Agentes oxidantes-reductores
Los agentes reductores DTT, GSH (1 mM; pH neutro), cido ascrbico incrementan la probabilidad de apertura del canal SV. Cloramina-T (agente oxidante) causa la inhibicin irreversible del canal.
Scholz-Starke y col., 2004; 2005; Carpaneto y col., 1999
Fosforilacin
Activacin por la fosfatasa calcineurina (0.4 unidades/ml). El aumento de la concentracin de calcineurina causa la disminucin de las corrientes registradas. Se proponen dos sitios de fosforilacin del canal SV, con distintos efectos: +, sensible al cido okadaico inhibidor de fosfatasas, y , sensible a H-7 inhibidor de kinasas
Allen y Sanders, 1995 Bethke y Jones, 1997
Protenas 14-3-3 La 14-3-3B (100 nM) reduce la corriente acarreada por el SV en un 80% (1/2 = 5s). La dependencia de voltaje no es afectada. Van den Wijngaard y col., 2001
Metales pesados Ni2+ citoslico (Km = 99 M, Eichornia crassipes; Km = 25 M, Beta vulgaris) disminuye la corriente del canal SV y afecta moderadamente la corriente del canal unitario, unindose a un sitio diferente al del Ca2+.
Paganetto y col., 2001; Carpaneto, 2003;
Al3+ 1.4 M Al3+ vacuolar causa la reduccin en un orden de magnitud la probabilidad de apertura por desplazamiento de la dependencia de voltaje.
Wherret y col., 2005
Neomicina neomicina en el citosol causa los siguientes efectos: a) (10-200 M) aumenta el tiempo de activacin (modestamente) y desactivacin (>100 veces) del canal, b) >10 M causa el desplazamiento de la dependencia de voltaje a potenciales ms negativos, sin afectar la carga de compuerta.
Scholz-Starke y col., 2006
Na+ (especficamente)
Aumento de Na+ vacuolar causa el desplazamiento de la dependencia de voltaje a potenciales ms positivos (en el cambio de 150 mM K+ a 150 mM Na+, 0 Ca2+, el desplazamiento total es por ~80 mV).
Ivashikina y Hedrich., 2005
23
actividad del canal son el resultado de la accin directa sobre l, o sobre protenas-reguladoras
adicionales, cooexpresadas junto con en el canal SV en la membrana vacuolar.
La regulacin del canal SV es efectuada por los lados tanto vacuolar como citoslico y puede
consistir igualmente en la disminucin de la probabilidad de apertura del canal, como en su
aumento (Tabla 6.). Entre todos los agentes que regulan la actividad del canal SV, los cationes
monovalentes (K+, Na+) y los divalentes (especialmente Ca2+, Mg2+), son, probablemente, los
factores conocidos ms importantes que modulan la actividad del canal SV en condiciones
fisiolgicas.
K+ y Na+, a pesar de ser cationes monovalentes, regulan al canal SV de maneras diferentes. La
modulacin causada por K+ (Tabla 6.) es de carcter inespecfico y es efectuada a travs del
cambio del potencial de superficie del tonoplasto, que se encuentra en funcin de la fuerza inica
del contenido vacuolar. La sustitucin de K+ en este caso por una concentracin equivalente de
otros cationes orgnicos impermeables devuelve el mismo resultado la disminucin de la
sensibilidad al voltaje aplicado con el aumento de la fuerza inica de la solucin vacuolar
(Pottosin y col., 2005). El efecto de Na+ vacuolar, en contraste, al parecer es de carcter
especfico, ya que no es reproducido por el reemplazamiento de un concentracin equivalente de
K+ (Tabla 6., Ivashikina y Hedrich., 2005), y puede, segn los autores, jugar un papel importante
en el mantenimiento de la homeostasis inica durante el estrs salino.
Los efectos de Ca2+ y Mg2+ en ambos lados del tonoplasto sobre la actividad del canal SV son
similares (Tabla 6.), aunque el SV presenta una afinidad superior al Ca2+ que al Mg2+: para
evocar los efectos del primero es necesario aplicar una concentracin mucho mayor (en rdenes
de magnitud) de Mg2+. El aumento de la concentracin libre de Ca2+ o Mg2+ en el lado citoslico
causa el desplazamiento de la curva de activacin del canal SV a potenciales ms negativos. El
canal SV es activado ya por concentraciones micromolares de Ca2+ citoslico (Bethke y Jones,
1994; Reifarth y col., 1994; Schulz-Lessdorf y Hedrich., 1995; Allen y col., 1996), aunque los
valores del desplazamiento de la dependencia de voltaje difieren en los trabajos mencionados,
principalmente por la presencia de Mg2+ en las soluciones de trabajo. Para originar una activacin
similar a la causada por micromoles de Ca2+, son necesarias concentraciones milimolares de Mg2+
(Pei y col., 1999; Carpaneto y col., 2001), aunque en Hordeum el canal SV no era activado ni en
la aplicacin de 50 mM Mg2+ citoslico + EGTA agente quelante de Ca2+ (Pottosin y col.,
1997). No obstante, el Mg2+ citoslico fue propuesto como sensibilizador del canal SV al Ca2+
que pudiera jugar cierto papel en la regulacin del canal SV durante la elevacin fisiolgica del
24
Ca2+ citoplsmico (Pei y col., 1999; Carpaneto y col., 2001) mediante la sensibilizacin del canal
SV a las bajas concentraciones de Ca2+ presentes en el citoplasma.
A diferencia de sus efectos en el lado citoslico, el aumento de la concentraciones de
Ca2+/Mg2+ en el lado vacuolar disminuye la probabilidad de apertura del canal SV mediante el
desplazamiento de la dependencia de voltaje a potenciales ms positivos (Pottosin y col., 1997;
Ward y Schroeder, 1994; Pei y col., 1999; Pottosin y col., 2004). En un estudio detallado de la
modulacin del SV por cationes divalentes, Pottosin y col. (2004) determinaron que la
dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura del canal en funcin del Ca2+ vacuolar
aplicado es bifsica y no se describe con la simple ecuacin de Boltzmann. A potenciales ms
negativos la dependencia de voltaje es muy abrupta, pero esta funcin disminuye drsticamente
su pendiente a potenciales ms positivos. Por esta razn, segn los autores, el esquema cintico
mnimo que describe la transicin del canal SV entre los estados cerrado y abierto debe contener
3 estados:
C2 C1 O. Cada uno de los procesos de transicin C2C1 y C1O es descrito por la ecuacin de
Boltzmann y es caracterizado por sus potenciales de punto medio (midpoint potentials, V2 y V1),
en los cuales la ocupacin de los respectivos estados se encuentra en equilibrio, y por sus cargas
de compuerta (gating charges; z2 y z1), que definen la pendiente de la transicin dependiente de
voltaje entre los respectivos estados. La probabilidad de apertura del canal, de esta forma, es
determinada con la ecuacin
1 1 2 2
1
1 exp(- ( - ) ) (1 exp(- ( - ) ))Po
F Fz V V z V VRT RT
=+ +
,
parte del modelo matemtico, elaborado por Pottosin y col. (2004) que describe las transiciones
del canal y permite describir de una manera muy exacta la dependencia de voltaje de la
probabilidad de apertura del canal en presencia de diferentes niveles de calcio vacuolar. En
concordancia con el modelo, la transicin al estado abierto del canal (C1O) es la menos dependiente de voltaje (z1 = 0.7), mientras que la precedente (C2C1) es caracterizada por una mayor dependencia de voltaje (z2 = 2.9). Aparte, fue determinado, que ambos equilibrios V1
(C1O) y V2 (C2C1) son afectados por el incremento de la concentracin de calcio vacuolar, aunque de distinta manera: en condiciones de bajo calcio vacuolar V2 es menor que V1 y
25
predomina la transicin C1O. El aumento del calcio vacuolar causa el desplazamiento del equilibrio hacia el estado C1 y el umbral de activacin del canal se recorre a potenciales ms
positivos. Un aumento mayor de la concentracin del calcio vacuolar trae como consecuencia el
desplazamiento del equilibrio hacia el estado C2 de la transicin C2C1. En otras palabras, el incremento del calcio vacuolar suprime efectivamente la actividad del canal: un aumento del
calcio vacuolar de 0 a 10 mM causa el desplazamiento de la probabilidad de apertura del canal a
potenciales ms positivos (a nivel 1% de canales abiertos desde 80 a +70 mV). A potenciales
fisiolgicos (alrededor de 0 mV) en presencia de 2 mM de Ca2+ simtricos la probabilidad de
apertura del canal SV es menos de 0.01% o menos de un canal por vacuola, incluso en
condiciones que favorecen la activacin del canal (2 mM Ca2+ citoplsmico) (Pottosin y col.,
2004). La modulacin causada por Mg2+ vacuolar es similar a la originada por Ca2+, aunque su
efecto es ms modesto: un incremento del Mg2+ vacuolar de 0 a 10 mM causa el desplazamiento
de la dependencia de voltaje de solo unos 70 mV (desde 80 hasta 10 mV) a 1% de canales
abiertos.
El modelo propuesto por Pottosin y col. (2004) indica la existencia de una unin cooperativa
de varios cationes divalentes para la regulacin de la apertura del canal SV, especifica la etapa
limitante (C1O) de la activacin del canal y predice correctamente la dependencia de los tiempos medios de activacin y desactivacin del canal en funcin de la concentracin vacuolar
de los cationes divalentes. No obstante, este modelo describe la regulacin de la compuerta
(gating) del canal SV en condiciones lejanas de las fisiolgicas pH vacuolar neutro
(probablemente, presentado solo en vacuolas aleurnicas de almacenamiento, pero no en
vacuolas lticas, utilizadas en los experimentos de ese trabajo) y alto Ca2+ citoslico (2 mM),
empleado para activar las corrientes del canal SV. Por lo tanto, no es posible estimar la
probabilidad de apertura del canal en condiciones fisiolgicas y determinar si la elevacin del
calcio citoslico es suficiente para la activacin del canal SV.
Posibilidad de la participacin del canal SV en la Liberacin de Calcio Inducida por Calcio, LCIC (Calcium-Induced Calcium Release, CICR).
La permeabilidad del canal SV al calcio, as como su activacin por el incremento del calcio
citoslico, permiti a Ward y Schroeder (1994) proponer la participacin del canal en la
liberacin de calcio inducida por calcio (LCIC; de calcium-induced calcium release) en la
regulacin del cierre de las clulas de guarda y en las clulas vegetales en general. Esta propuesta
26
rpidamente recibi amplia aceptacin sin revisin previa (Allen y col., 1996; Barkla y Pantoja,
1996; Ward y col., 1995). Segn Ward y Schroeder (1994) la liberacin de calcio, mediada por el
canal SV, requiere un incremento inicial del calcio citoslico, inducido por un estmulo (por
ejemplo, por la fitohormona ABA). La subsecuente activacin de canales de potasio dependientes
de Ca2+ (VK) pudiera causar un desplazamiento del potencial a travs de la membrana vacuolar a
valores ms positivos. Finalmente, el aumento del calcio citoslico y el potencial positivo de la
membrana puede causar la apertura de los canales SV, permeables a calcio, dando paso, de esta
forma, a la liberacin de calcio de la vacuola (Ward y col., 1995; 1994).
Pottosin y col. (1997) argumentaron que en condiciones fisiolgicas, caracterizadas por un
nivel bajo de calcio citoslico y alto dentro de la vacuola, as como por potenciales negativos
a travs de la membrana vacuolar, la probabilidad de apertura del canal SV es muy baja. Para
aumentar la probabilidad de la apertura del SV en presencia del alto calcio vacuolar, como fue
mencionado ms arriba, se requiere Ca2+ citoslico en el rango de micromoles, as como
potenciales positivos de varias decenas de milivoltios. Sin embargo, estas condiciones reducen la
fuerza motriz de la liberacin del calcio de las vacuolas de mesfilo de cebada (Pottosin y col.,
1997). Aplicando concentraciones de calcio en el rango 13-2000 M en el lado citoplsmico en presencia de 50 M o 2 mM en el lado vacuolar, este grupo de colaboradores determin que la probabilidad de la apertura del canal depende en un mayor grado del gradiente de calcio aplicado
a travs de la membrana vacuolar, que de la concentracin del calcio citoslico sola. En
condiciones de nula fuerza motiva neta para calcio (Ca = V ECa = 0), la probabilidad de apertura del canal SV es de 0.35% o, aproximadamente, 10 canales abiertos por una vacuola
tpica de 20 m de dimetro. Para las condiciones que favorecen la liberacin de calcio de la vacuola (Ca < 0) esta probabilidad es menor todava asumiendo una actividad de calcio vacuolar 1000 veces mayor que en el citoplasma (ECa = +87 mV) y un pequeo potencial de
membrana, estos autores calcularon una actividad promedia mucho menor de 1 canal abierto por
vacuola (Po = 0.0025%), y solo en condiciones que favorecen la acumulacin de calcio dentro de
la vacuola esta probabilidad de apertura aumentaba considerablemente (Pottosin y col., 1997).
Esta observacin les permiti a los autores sealar la dificultad de la participacin del canal SV
en la liberacin de calcio inducida por calcio.
Este resultado, a su vez, fue criticado por Bewell y col. (1999), argumentando que en
presencia de milimoles de Mg2+ citoslico, como sensibilizador, el umbral de activacin del
canal SV puede recorrerse a potenciales ms negativos obtenindose as las condiciones para la
27
liberacin de calcio a potenciales fisiolgicos. Este mecanismo fue respaldado por Carpaneto y
col. (2001). En condiciones de 10 mM de Mg2+y nanomoles de Ca2+ en el citoplasma, y 2 mM y 1
mM, respectivamente, de Mg2+ y Ca2+ vacuolar condiciones que favorecen la salida de calcio
de las vacuolas, fue obtenida la actividad del canal SV, aunque solamente a partir de +100
mV. El aumento del calcio citoslico recorre el umbral de activacin del canal y el potencial de
reversin de calcio ECa a potenciales ms negativos. Pero a 100 M de calcio citoslico el potencial de reversin ECa es ms negativo que el potencial del umbral de activacin del canal SV
y en estas condiciones el calcio a travs de los canales SV puede fluir solamente desde el citosol
adentro de la vacuola. Adicionalmente, estos autores remarcan que la concentracin citoplsmica
utilizada (10 mM), puede corresponder solamente al Mg total en las clulas vegetales y es lejana
de la concentracin libre de magnesio citoslico, aunque ya su cambio en el rango fisiolgico
(0.1-1 mM; Bruggemann y col., 1999) puede causar el desplazamiento del potencial de
membrana unos 20 mV hacia potenciales ms negativos. No obstante, el umbral de activacin del
canal SV sigue situado considerablemente lejos del potencial vacuolar en condiciones
fisiolgicas. Por esta razn, la presencia de activadores adicionales es requerida para la liberacin
de calcio (Carpaneto y col., 2001).
Trabajos ms recientes se han centrado en la bsqueda de agentes que pudieran actuar como
activadores adicionales del canal SV y que le permitieran participar en la liberacin de Ca2+
inducida por Ca2+. Como tales posibles factores fueron determinados los agentes reductores
particularmente DTT, la forma reducida de glutationa (GSH) y el cido ascrbico (Tabla 6.;
Carpaneto y col., 1999; Scholz-Starke y col., 2004; 2005) y recientemente el antibitico
neomicina. Este ltimo agente mostr la mayor potencia de modulacin positiva del canal SV,
desplazando el umbral de activacin a potenciales negativos (Scholz-Starke y col., 2006). No
obstante, probablemente estos resultados muestran ms que nada la posibilidad de una activacin
adicional del canal SV en condiciones fisiolgicas por algn agente, no precisamente neomicina,
que pueda determinar la especificad de la liberacin de Ca2+ desde la vacuola como respuesta a
diferentes estmulos (ver. Tabla. 1).
1.2.2.3 Funcin del Canal SV
Actualmente, la funcin del canal SV en las clulas vegetales no est determinada. Por una
parte, su amplia distribucin en el reino vegetal y el alto nmero de canales expresados en una
vacuola llevan a considerar como muy importante el papel que puede jugar este canal. Por otra
28
parte, lneas de Arabidopsis con knock-out por el gen tpc (tpc1-2 SALK_125658, tpc1-1
SALK_145413) no presentan genotipos letales e incluso, aparentemente, las plantas modificadas
llegan a reproducirse (Peiter y col., 2005). Sin embargo, es necesario sealar que las condiciones
experimentales, utilizadas en este trabajo (agua desionizada, 10 mM MES-KOH, pH 6.0 como
substrato), son lejanas de las que se presentan en cualquier suelo; adems, de el artculo no se
entiende si las semillas transgnicas examinadas fueron obtenidas de plantas cultivadas en ese
medio o con suministro de una composicin inica mas compleja. Por esto, existe la posibilidad
que no se hayan cumplido las condiciones necesarias para revelar la funcin del canal SV a travs
de disfunciones a nivel de organismo.
Ward y Schroeder (1994) propusieron la participacin del canal SV en procesos vinculados
con la liberacin de calcio inducida por calcio (ver p.1.2.2.2), basndose principalmente en la
permeabilidad del SV al Ca2+, as como por su activacin por el Ca2+ citoplsmico, mostrada ya
en 1987 en el trabajo de Hedrich y Neher. Esta propuesta fue argumentada por el encuentro que
en clulas de guarda la actividad del canal SV aumenta con la alcalinizacin del medio de
cualquier lado de la membrana vacuolar (Shulz-Lessdorf y col., 1995) efecto inducido en
condiciones fisiolgicas en el lado citoslico por la fitohormona ABA durante el cierre de las
clulas de guarda (Irving y col., 1992; Blatt y Armstrong, 1993). De este modo, la actividad del
canal SV refleja la direccin de los cambios de Ca2+ y pH citoslicos que acompaan el cierre de
las clulas de guarda2 . No obstante, en experimentos con vacuolas de mesfilo de cebada
(Hordeum) y en base del estudio de Shulz-Lessdorf y Hedrich (1995) en clulas de guarda de
Vicia faba, Pottosin y col. (1997) descartaron la posibilidad de la participacin del canal SV en la
sealizacin de calcio mediante la liberacin de calcio inducida por calcio.
1.2.3 Canales permeables a Ca2+ del retculo endoplsmico
Actualmente existen reportes de solamente dos canales permeables a calcio en el retculo
endoplsmico de las clulas vegetales: el primero fue descubierto en los rganos
mecanoreceptivos de Bryonia dioica (BCC1, de Bryonia Calcium Channel; Klsener y col.,
1995; 1997) y el segundo fue reportado en el retculo endoplsmico del pex de raz de lechuga
2 Allen G.J., Sanders D. Vacuolar Ion Channels in Higher Plants. En: Roger A. Leigh, Dale Sanders (Eds.) The Plant Vacuole. Advances in Botanical Research incorporating Advances in Plant Pathology. V. 25. Acdemic Press, 1997, p. 227.
29
Lepidium sativum (LCC1, de Lepidium Calcium Channel; Klsener y col., 1999), estudiados
ambos con la tcnica de bicapas lipdicas.
El canal BCC1 presenta actividad en rfagas y posee al menos dos estados abiertos (Klsener
y col., 1995; 1997), mientras que el LCC1 tiene solamente un estado abierto, caracterizado por su
tiempo medio de 2.8 ms (Klsener y col., 1999). En la Tabla.7 se hace una comparacin de estos
dos canales reportados.
Aunque los estudios presentes fueron realizados en bicapas lipdicas y la orientacin absoluta
de los canales no se puede determinar, las caractersticas registradas permiten solo una
orientacin compatible con las condiciones fisiolgicas, esta es permitiendo la salida de Ca2+
del RE al citoplasma (Klsener y col., 1995, 1997, 1999). El canal BCC1 fue propuesto para la
participacin en la transduccin de las seales en los rganos mecanoreceptivos de Bryonia,
TABLA 7. Caracterstica de los canales catinicos del RE reportados en plantas superiores
Parmetro BCC1 (Klsener y col., 1995; 1997) LCC1 (Klsener y col., 1999)
Conductancia
Es funcin del gradiente de Ca2+ aplicado (Km = 8.8 mM):
50/50 mM Ca2+ 29 pS 50/5.0 mM Ca2+ 23.6 pS 50/0.5 mM Ca2+ 14.4 pS
Ca2+ Gmax(100 mM) = 27.9 pS (Km = 7.3 mM)
Selectividad Ba2+ Ca2+ > Sr2+ > Mg2+ > X+
PCa:PK = 6.6 Ca2+ > Ba2+ > Sr2+
PCa:PK = 9.4
Bloqueadores Gd3+ EC50 1.1 M Cu2+ EC50 1.2 M Zn2+ EC50 3.4 M La3+ EC50 9.0 M Cd2+ EC50 100 M
(obstruyen la entrada del poro del canal)
Eritrosina-B EC50 1 M
Verapamila (10-30 M) causa 2 efectos: i) reduce tiempo de apertura dentro de rafagas de actividad ii) aumento de intervalos entre paquetes
NO causan efecto: Ryanodina (70 M), thapsigargina (inhibidor de Ca-ATPasas, 20 M), trifluoperazina (antagonista de CM, 40
M)
Cu2+ EC50 5 M La3+ EC50 5 M
Gd3+ EC50 10 M
Eritrosina-B EC50 1.8 M
NO tiene efecto:Verapamila (10-100 M)
30
Regulacin
Voltaje
pH
Otros
Activacin por potenciales positivos. Los potenciales de punto medio son funcin del gradiente de Ca2+ aplicado:
V1/2 50/50 mM Ca2+ +46.2 mV V1/2 50/5.0 mM Ca2+ +15.7 mV V1/2 50/0.5 mM Ca2+ 16.6 mV
La elevacin citoplsmica del pH disminuye la conductancia del canal (de 29 a 16 pS en el rango pH 7.0 - 7.75) NO tienen efecto: IP3 (10 M), ADP o ATP (2 mM) H2O2 citoslico (0.1-1 mM) inhibe la actividad del canal (a 1 mM completamente)
Activacin por potenciales positivos.Con el aumento del potencial disminuye el tiempo medio del estado cerrado. El tiempo medio del estado abierto no es afectado.
formando junto con la Ca2+-ATPasa del RE un oscilador de Ca2+ que permite la identificacin
espacio-temporal del estmulo (Klsener y col., 1995).
Por otra parte, la inhibicin del canal LCC1 (as como el BCC1) por el inhibidor de Ca2+-
ATPasa eritrosina-B en bajas concentraciones pudiera ser indicacin de que estos canales pueden
aparecer como resultado del desacoplamiento de la Ca2+-ATPasa, cuyos dominios
transmembranales, como se ha mostrado en el caso de protenas de retculo sarcoplsmico,
pueden actuar como canales permeables a Ca2+ (de Meis y col., 1996). Este desacople, segn
Klsener y col. (1999), puede fcilmente ocurrir durante el procedimiento de extraccin de la
membrana, por lo que estudios ms minuciosos son requeridos.
Aparte, en varios estudios fue reportada la liberacin de Ca2+ de vesculas de RE, causada por
ligandos cADPR, NAADP (Navazio y col., 2000; 2001). Martinec y col (2000) reportaron en
este compartimiento la presencia de sitios de unin a IP3. Sin embargo, en ninguno de estos
trabajos fueron determinados o caracterizados los canales sensibles a ligandos responsables de la
liberacin de calcio.
En la Fig.3 son resumidos los mecanismos de transporte y liberacin de Ca2+ conocidos hasta
hoy en las membranas intracelulares, especficamente del tonoplasto y el retculo
endoplsmico, de las clulas vegetales.
Ca2+
ATP
ADP+Pi
ADP+Pi
H+
PPi
ATPADP+Pi
H+
Ca2+
Ca2+
Vacuola
1-3 mM
0.1-200 M Ca2+
RE
Citoplasma 0.1-20 M Ca2+
H -ATPasa+
H -PPasa+
CAX
SVACA
pH 4..6.5
ACAECA
ATP
ADP+PiBCC1LCC1
Fig.3 Rutas conocidas de transporte de Ca en los mayores depsitos de Caen las clulas vegetales (fuente: elaboracin propia)
2+ 2+
ATPasas
Transportadores
Canales
: ACA - ATPasas con mecanismo de autoihibicin y regulacin por calmodulina, ECA - ATPasas
tipo RE; H -ATPasa, H -PPasa - respectivamente, bomba de protones y pirofosfatasa vacuolares que
generan el gradiente de H , necesario para el funcionamiento de los CAX.
: CAX - intercambiadores H /Ca .: SV - canal vacuolar lento, el nico establecido firmemente hasta el momento en la membrana
vacuolar con permeabilidad al Ca ; BCC1, LCC1 - canales determinados en vesculas del retculoendoplsmico.
+ +
+
+ 2+
2+
32
2. Objetivos del proyecto
2.1 Hiptesis
La actividad del Ca2+ en vacuolas vegetales vara. En el rango micromoles-1 mM es posible
realizar el monitoreo de la actividad de Ca2+ en la vacuola