1Manipulacin del ADN y transformacin de clulas vegetales. Pasos en el desarrollo de un sistema de transformacin. Sistemas y estrategias. Transformacin estable y transitoria. Elementos de un vector de transformacin. Promotores habituales. Seleccin. Genes seleccionables, marcadores e informantes. Nuevas estrategias de seleccin

2-Cultivo de meristemos-Microinjerto

-Propagacin clonal-Saneamiento del material vegetal

-Cultivo de pices caulinares-Cultivo de yemas axilares-Morfognesis directa-Semilla artificial

-Reproduccin vegetativa

-Cultivo de anteras-Cultivo de microsporas

-Obtencin de lneas puras(diplo-haploides)

-Seleccin celular-Seleccin somaclonal

Aprovechamiento de la variacin somaclonal(intraespecfica)

-Cultivo embriones zigticos-Fusin de protoplastos-Hibridacin somtica

Aprovechamiento de la variacin interespecfica

MEJORA

PRODUCCION

Transformacin gentica

3Transformacin gentica

Es la introduccin controlada de cidos nucleicos en un genoma receptor (Tacchini et al. 1987).

Organismo Modificado Genticamente: (OMG) es un "Organismo cuyo material gentico ha sido modificado de una manera distinta del apareamiento y/o recombinacin natural".

Los genes de un organismo que son insertados en otro se denominan transgenes y tienen la capacidad de conferirle a este ltimo una determinada caracterstica.

La transformacin exitosa depende de la incorporacin estable del gen nuevo en el genoma de la planta receptora y su subsiguiente transmisin a sucesivas generaciones.

4 INDUCCIN DE VARIABILIDAD GENTICA: AUSENCIA DEL CARACTER FENOTPICO INVESTIGADO EN EL MBITO DE

LA ESPECIE. EXPRESIN DE NUEVAS FORMAS ALLICAS DE GENES QUE YA ESTN

PRESENTES EN EL GENOMA DE LA PLANTA. EXPRESIN DE SECUENCIAS CODIFICANTES PRESENTES EN EL GENOMA

PERO BAJO EL CONTROL DE NUEVAS SECUENCIAS REGULADORAS QUE MODIFIQUEN SU NIVEL O PATRON DE EXPRESIN.

INHIBICIN DE LA EXPRESIN DE GENES RESIDENTES EN EL GENOMA.

COMPLEMENTO Y/O ALTERNITAVA A LOS PROGRAMAS DE MEJORA GENTICA POR VA SEXUAL:

DIFICULTAD DE TRANSFERIR EL CARACTER ESTUDIADO DE UNA VARIEDAD O CLON A OTRA, SIN RIESGO DE ALTERAR EL RESTO DE CARACTERSTICAS FENOTPICAS.

EXCESIVA DURACIN Y COMPLEJIDAD DE LOS PROCESOS DE CRUZAMIENTO Y SELECCIN.

POR QUE TRANSFORMAR UNA ESPECIE?

5MANIPULACIN DEL ADN Y TRANSFORMACIN DE CLULAS VEGETALES

MEDIADA: Mtodo Indirecto (Biolgico), basado en un vector natural

AgrobacteriumAgrobacterium tumefaciensAgrobacterium rhizogenes

Virus

DIRECTA:Quimica

PEGFisica

ElectroporacinBiobalstica

6 BIOLGICOS Protocolos de Regeneracin- Clulas

Competentes Protocolo de Transformacin- Clulas

Competentes Protocolo de Seleccin y Regeneracin

de Plantas Transformadas PRCTICOS

Disponibilidad de material vegetal Protocolo de transformacin

Simple Eficaz Econmico Reproducible Seguro

FACTORES QUE AFECTAN A LA EFICIENCIA DE TRANSFORMACIN

Genotipo de la planta

Tipo de tejido

Estado fisiolgico del explanto Mtodo de transformacin

Reduccin del stress, agente selectivo

TIPOS DE REQUERIMIENTOS BSICOS EN UN PROCESO DE TRANFORMACIN

7Especies transformadas relacionadas. Analizar.

Identificar clulas regenerables

Construccin de plsmidos adecuados

Regeneracin de plantas transgnicas

Accesibilidad a clulas regenerables

Optimizacin infeccin con

Agrobacterium

Optimizacin parmetros bombardeo

Expresin transitoria

Valoracin dao celular SatisfactorioCaracterizacin

Disponibilidad de explantos competentes

Medios de cultivo y fitohormonas

Protocolo de regeneracin.Frecuencia

Agentes selectivos / Estrategia de seleccin

Transformacin

Desarrollar el cultivo in vitro de la especie

Seleccin de transformantes

PASOS EN EL DESARROLLO DE UN SISTEMA DE TRANSFORMACIN

8Para valorar la idoneidad del cultivo diana, destacan:

- una elevada tasa de multiplicacin, que permita disponer de material de partida en cantidad suficiente y con rapidez.- una elevada tasa de regeneracin de planta, que proporcione una frecuencia de regeneracin de individuos transgnicos satisfactoria y favorezca la obtencin de mltiples clones transgnicos.- una simplicidad tcnica y un mnimo tiempo en cultivo, con el fin de evitar la variacin somaclonal y reducir los costes econmicos

9Por otra parte, para estimar la validez del sistema de transformacin hay que considerar que:- el mtodo de seleccin de las clulas transformadas sea inequvoco.- el protocolo de transformacin sea aplicable a varios genotipos.- los transformantes no sean quimricos.- se den patrones simples de integracin de los transgenes, para reducir la probabilidad de interrupciones de genes endgenos por insercin y el silenciamiento gnico asociado a la integracinde mltiples copias.- los patrones de expresin sean estables, correspondindose con lo esperado en funcin de las secuencias controladoras de los genes insertados.- la variacin aleatoria para un fenotipo de inters no implique una caracterizacin extensiva en campo de cada transformante hasta dar con el deseado. De otro modo, el valor de la transformacin en la mejora se restringira a caractersticas que no se pudieran obtener mediante mejora convencional-la sencillez y peligrosidad sean mnimas para el operador, a fin de reducir los riesgos laborales-Entre los factores citados, el ms importante es que existan gran cantidad de clulas susceptibles de ser transformadas y que stas mantengan su capacidad regenerativa, pues una elevada tasa de multiplicacin no implica necesariamente un nmero importante de clulas competentes para la transferencia gentica.

10

Identificacin del gen inters

Modificacin del gen

Haciendo una planta transgnica

Esta es una de las etapas limitantes

Para asegurar que el gen introducido se exprese en el lugar y tiempo debidos es necesario que se acople a un promotor adecuado.

Conocemos muy poco de los genes especficos que determinan las caractersticas vegetales.

Actualmente se estn realizando enormes esfuerzos de secuenciacin y compresin de las funciones de los genes , particularmente aquellos de inters agronmico.

Tamao?

Color?Tolerancia al calor ?Sa

bor?

Organismo donador del gen Extraccin

del DNA Aislamiento del gen

Previas a su introduccin en el

genoma de la planta En ocasiones es conveniente modificar la secuencia del gen para optimizar su expresin.

11

Principios generales

El cdigo gentico es universal, pero los elementos (secuencias) reguladores no.

Cualquier gen podra expresarse, en mayor o menor grado, si tiene:1. Un promotor adecuado y una seal de terminacin.2. Unas seales de inicio de transcripcin y traduccin apropiadas.3. Un cdigo de codones optimizado.

Genes mltiples tambin se pueden expresar simultneamente a partir de un constructo, pero su prctica est limitada por:

1. El tamao del inserto, cuanto mas grande menos eficiente.2. El tamao del vector, cuanto mayor sea mas difcil de manipular.

Secuencia gnicaPO T

12

Seleccin

Solo una pequea fraccin de las clulas vegetales son transformadas.

Para obtener plantas transgnicas es necesario cultivar en unas condiciones que favorezca la regeneracin a partir de las clulas transformadas, es decir una presin selectiva.

LB RB

ori

kanR

YFG

MCS

SELECCIN:

POSITIVA

CONDICIONADA

NO CONDICIONADA

NEGATIVA

13

Gen: b-glucoronidasaSustrato: X-Glu

14

Agrobacterium-un ingeniero natural Bacterias Gram negativo que se encuentran en el suelo. Invaden heridas de diversas plantas e inducen a la planta a producir tumores

y molculas utilizadas por la bacteria. Agrobacterium es una bacteria patgena para dicotiledneas y algunas

conferas. Agrobacterium tumefaciens crown gall disease (tumors) Agrobacterium rhizogenes hairy root disease (hairy roots)

Las Monocotiledneas presentan resistencia natural a Agrobacterium. Agrobacterium es un ingeniero gentico natural(1983). Es un mecanismo de transferencia entre reinos

Transformacin indirecta

15

PlsmidoTi o plsmido Ri: Genes de sntesis de opinas: responsables de la sntesis de

nuevas opinas. Opinas: derivados de aminocidos o azcares producidos

por tejidos vegetales infectados que son metabolizados por Agrobacterium como nica fuente de carbono/nitrgeno.

Clasificacin de los plsmidos Ti y Ri: Plsmidos Ti: plsmidos nopalina

Octopine plasmid Agropine plasmid Succimanopine plasmid

Plsmidos Ri: plsmidos Manopina Agropine plasmid Cucumopine plasmid

16

Genes involucrados en la transferencia del T-DNA

- Secuencias de los bordes: LB y RB

Localizados en cualquier regin del plsmido Ti:4. Genes de virulencia (A, B, D, G, H / C, E)

Localizados en el cromosoma de Agrobacterium (4 loci)Sntesis de fibrillas de clulosa por Agrobacterium para cubrir la

superficie de la clula vegetal (irreversible). Clusters de Agro son entrampadas en la red de fibrillas de celulosa.

chvA ychvB (linked): sntesis y excrecin de 1,2-glucan cel locus: sntesis de fibrillas de celulosa pscA locus: afectan la sntesis de cicloglicanos y cido

succinilglicano att locus: afecta protenas de la superficie celularAlgunos de estos loci se encuentran conservados en otras

bacterias del suelo que se nter-asocian con plantas

17

NOS-P NOS-pAnptII uidA-intPIV2Ubi1 NOS-pA

HindIII HindIII4.4Kb

RB LB

pBINUbiGUSint

BglII 3.3 Kb

18

Vectores cointegrados vs. binarios

1. Desventajas: Se necesitan amplias regiones de homologa entre plasmido Ti y vectores de clonacin en E. coli plasmids (pBR322).

2. Relativa ineficiencia de transferencia.

1. Desventajas: Depende de la orientacin. Plasmidos con dos origenes de replicacinsuelen ser inestables en E. coli

2. Ventajas: vectores pequeos, mayor eficiencia de transferencia de E. coli a Agrobacterium. No se necesita recombinacin intermolecular.

19

Especies transformadas relacionadas. Analizar.

Identificar clulas regenerables

Construccin de plsmidos adecuado

Regeneracin de plantas transgnicas

Accesibilidad a clulas regenerables

Optimizacin infeccin con

Agrobacterium

Optimizacin parmetros bombardeo

Expresin transitoria

Valoracin dao celular SatisfactorioCaracterizacin

Disponibilidad de explantos competentes

Medios de cultivo y fitohormonas

Protocolo de regeneracin.Frecuencia

Agentes selectivos / Estrategia de seleccin

Transformacin

Desarrollar el cultivo in vitro de la especie

Seleccin de transformantes

PASOS EN EL DESARROLLO DE UN SISTEMA DE TRANSFORMACIN

20

TRANSFORMACIN GENTICA DEL ALCORNOQUE (Quercus suber L)

21

Transformacin va Agrobacterium: desafos:

Uso de Agrobacterium para realizar recombinacin homloga o sitio-especfica: frecuencia de intregracinbaja. Expresin predecible de los transgenes en la planta: efectos de posicin, cromatnicos y de integracin del ADN-T sobre el silenciamiento gnico. Modificacin del genoma de Agrobacterium: alteracin del perfil de expresin de acuerdo con distintos hospedadores vegetales. Transformacin de hongos vegetales y animales mediante Agrobacterium: transformacin de ms especies de hongos. Transformacin de clulas animales y humanas mediante Agrobacterium posibles usos en terapia gnica.

22

Identificar especies relacionadas que hayan sido transformadas

Diseo y desarrollo de construcciones gnicas

Eleccin del vector de

transformacin

Empleo de genes delatores/Bsqueda de genes de inters

Disponibilidad de explantos

Medios de cultivo y fitohormonas

Protocolo de regeneracin

Accesibilidad a las clulas regenerables

Optimizacin de la eliminacin de Agrobacterium

Expresin transitoria

Valoracin del dao celular

Especie/individuo de inters

Desarrollo de un sistema de cultivo eficiente en

proliferacin y frecuencia de regeneracin

Desarrollo de un sistema de cultivo eficiente en

proliferacin y frecuencia de regeneracin

Determinacin de la mejor combinacin de estrategia de

seleccin/agente selectivo

Determinacin de la mejor combinacin de estrategia de

seleccin/agente selectivo

Transferencia de los genes

Regeneracin

Caracterizacin

Localizacin y seleccin de las clulas transformadas

SATISFACTORIO

SATISFACTORIO

23

Tiempo (das)20 40 60 80 100

PFR acumulado

0

2

4

6

8

Tiempo (das)20 40 60 80 100

PFR

0

1

2

3

4012,5 25 37,550 75

Kan (mg/L)

Sensibilidad de los embriones somticos de la lnea M10 a la kanamicina

Se cultivaron tres rplicas de 200-500 mg de agregados embriognicos, en oscuridad y a 25 1 C, en placas Petri con 10 mL de medio slido MSSH con kanamicina en el rango de 0-75 mgL1. Los datos representan los incrementos de peso fresco relativo (PFR, izquierda) y los incrementos de peso fresco relativo acumulado (PFR acumulado, derecha) entre los subcultivos de 20 das.

24

25

Tiempo (das)20 40 60 80 100

Tiempo (das)20 40 60 80 100

Tiempo (das)20 40 60 80 100

PFR

-1

0

1

2

3

4 012,5 25 37,5 50 75

M10 Alm1Alm5

Comparacin de la sensibilidad de los embriones somticos de las lneas M10, Alm5 y Alm1 a la kanamicina

Se cultivaron tres rplicas de 200-500 mg de agregados embriognicos, en oscuridad y a 251 C, en placas Petri con 10 mL de medio slido MSSH con kanamicina en el rango de 0-75 mgL1. Los datos representan los incrementos de peso fresco relativo (PFR) entre los subcultivos de 20 das en tres lneas embriognicas de Q. suber (M10, Alm5 y Alm1).

26

Sensibilidad de los embriones somticos de la lnea M10 al Finale

Tiempo (das)20 40 60 80 100

PFR acumulado

0

2

4

6

8

Tiempo (das)20 40 60 80 100

PFR

0

1

2

3

402,557,510

glufosinatoamnico (mg/L)

Se cultivaron tres rplicas de 200-500 mg de agregados embriognicos, en oscuridad y a 25 1 C, en placas Petri con 10 mL de medio slido MSSH con Finale (forma comercial del herbicida glufosinato amnico), utilizando de 0 a 10 mgL1 de principio activo. Los datos representan los incrementos de peso fresco relativo (PFR, izquierda) y los incrementos de peso fresco relativo acumulado (PFR acumulado, derecha) entre los subcultivos de 20 das.

Los embriones y agregados embriognicos se cultivaron en oscuridad y a 25 1 C, en placas Petri con 10 mL de medio slido MSSH con Finale(forma comercial del herbicida glufosinatoamnico), utilizando de 0 a 10 mgL1 de principio activo. A, B, C, D y E, fotografas tomadas los das 0, 20, 40, 60 y 80, contando desde el inicio del experimento; F, control sin Finale a los 80 das de cultivo.

27

Identificar especies relacionadas que hayan sido transformadas

Diseo y desarrollo de construcciones gnicas

Eleccin del vector de

transformacin

Empleo de genes delatores/Bsqueda de genes de inters

Disponibilidad de explantos

Medios de cultivo y fitohormonas

Protocolo de regeneracin

Accesibilidad a las clulas regenerables

Optimizacin de la eliminacin de Agrobacterium

Expresin transitoria

Valoracin del dao celular

Especie/individuo de inters

Desarrollo de un sistema de cultivo eficiente en

proliferacin y frecuencia de regeneracin

Desarrollo de un sistema de cultivo eficiente en

proliferacin y frecuencia de regeneracin

Determinacin de la mejor combinacin de estrategia de

seleccin/agente selectivo

Determinacin de la mejor combinacin de estrategia de

seleccin/agente selectivo

Transferencia de los genes

Regeneracin

Caracterizacin

Localizacin y seleccin de las clulas transformadas

SATISFACTORIO

SATISFACTORIO

28

Estructura y mapa de restriccin simplificado del plsmido binario pBINUbiGUSint (Humara et al. 1999)

pBINUbiGUSint (~14,4 kpb)

nos 5nos 5 nos 3nos 3nptIInptII uidA-intPIV2 uidA-intPIV2PIV2Ubi1Ubi1 nos 3nos 3

Hind III Hind IIIHind III4364 pb

RBRB LBLBBgl II

RB y LB, bordes derecho e izquierdo, respectivamente, del ADN-T; nos 5, promotor de la nopalina sintasa; nptII, gen de la neomicina fosfotransferasa II; nos 3, terminador de la nopalina sintasa; UbiI, promotor de la poliubiquitina de maz; uidA-int, gen de la -glucuronidasa de Escherichia coli con el intrn PIV2 de patata. En el esquema se sealan los puntos de corte de las enzimas de restriccin Hind III y Bgl II.

Explantos empleados en la transformacin gentica

A, embrin somtico aislado; B, agregado embriognico (barra, 1mm para ambas imgenes).

29

Etapas del proceso de transformacin gentica de Q. suber

Los explantos, embriones aislados y agregados embriognicos (A; barra, 4 mm), se inocularon con la cepa de A. tumefaciens AGL1 pBINUbiGUSint (DO600 = 0,5) durante 20 min a 25 C. El cocultivo, de dos das, se realiz en placa Petri a 25 C y en oscuridad (B). Despus de unos 2-3 meses subcultivndose en medio selectivo (500 mgL1 cefotaxima + 100 mgL1 kanamicina) se detectaron embriones secundarios putativamente transgnicos (C, flecha), que se mantuvieron en medio selectivo durante dos subcultivos ms (D), antes de aislarlos como lneas independientes. Las lneas putativamente transgnicas se subcultivaron durante un mnimo de cuatro meses ms en presencia de kanamicina, pero sin cefotaxima, antes de realizar los ensayos histoqumicos y moleculares.

30

Ooms et al. (1981)

spec, strep

rifpAL4404octopinaAch5Ach5LBA 4404

Hood et al. (1993)

rifpTiBo542TL-L-succinamopinaagropina

C58A281EHA 105

Lazo et al. (1991)

rif, carbpTiBo542TL-L-succinamopinanopalina

C58A281AGL1

Ref.Resist. pTi

Resist. cromos.

pTiTipo de opinaCromosoma bacteriano

Cepasilvestre

Cepadesarmada

Rif, rifampicina; carb, carbenicilina; spec, espectinomicina; strep, estreptomicina. Los plsmidos Ti de AGL1 y EHA105 son resultado de deleciones diferentes del ADN-T

Cepas de Agrobacterium tumefaciens

EHA105

LBA4404

AGL1

ineficaz

0,6 %

4 %

31

Desarrollo de las clulas transgnicas a lo largo del proceso de seleccin

Se inocularon con A. tumefaciens AGL1 pBINUbiGUSint (DO600 = 0,5) agregados embriognicos y embriones somticos aislados de Q. suber durante 20 min a 25 C, que se cocultivaron en oscuridad a 25 Cdurante dos das antes de transferirlos a medio de cultivo selectivo. A las 3, 6, 8 y 10 semanas del momento de la inoculacin se realiz un ensayo histoqumico que sirvipara determinar el estado de desarrollo de las clulas transformadas con el gen uidA. Puede observarse que, aunque aparecen eventos de transformacin en los cotiledones, los puntos GUS se localizan preferentemente en la zona del pice radicular de los embriones. La aparicin de embriones secundarios se da a las 8 semanas, coincidiendo con las descripciones de Puigderrajols et al. (1996), y sugiriendo que ni la kanamicina, ni las clulas no transformadas, afectan sensiblemente al crecimiento de las clulas transformadas; cabe destacar que algunas clulas transformadas no parecen continuar con su desarrollo (8 semanas, flecha), lo que sugiere que Agrobacterium podra no tener una preferencia exclusiva por las clulas meristemticas, suposicin apoyada por el hecho de que en los cotiledones tambin aparecen eventos de transformacin que no dan lugar a embriones secundarios. Finalmente, puede observarse tambin que las quimeras son un fenmeno frecuente en los primeros estadios de la seleccin (8 y 10 semanas), aunque tras un perodo de varios meses de subcultivos con kanamicina puedan obtenerse embriones homogneos (no mostrado en esta imagen).

32

Deteccin de los genes nptII (700 pb) y uidA (1400 pb) mediante PCR

Geles de agarosa al 0,7% con los productos de PCR de los genes nptII (arriba) y uidA(abajo). Calles: 1, 11, marcadores de peso molecular [PCR 100-bp low-molecular-weightladder (Sigma) arriba, lambda DNA/EcoRI+Hin dIII (Promega) abajo]; 2-7, clones resistentes a kanamicina obtenidos tras la inoculacin con A. tumefaciensAGL1 pBINUbiGUSint; 8, clon resistente a kanamicina obtenido tras la inoculacin con A. tumefaciens LBA4404 pBINUbiGUSint; 9, clon no inoculado; 10, plsmido pBINUbiGUSint.

Anlisis de Southern de los clones de alcornoque transformados

Los ADNs de varios clones cuyo carcter transgnico (uidA+) se haba analizado mediante PCR se digirieron con Hin dIII (a) o Bgl II (b) y se hibridaron con una sonda marcada radiactivamente [32P]. La sonda se prepar a partir de un fragmento del plsmido pBINUbiGUSint que contena el gen uidA, obtenido con Hin dIII (a) o Hin dIII-Bgl II (b). En A, se indica el peso molecular en referencia al tamao de la banda del control positivo; en B, se indica en referencia a un marcador de peso molecular lambda DNA/EcoRI+Hin dIII no marcado radiactivamente.a. Calles: 1-4, 6, 8-11, ADN de clones transformados de alcornoque; 5, clon no transformado; 7, patata uidA+ (control positivo). El mismo tamao de todas las bandas confirma que los clones contienen ntegra la construccin Ubi1-uidA-nos3'.b. Calles: 3-8, clones transformados de alcornoque; 2, clon no transformado; 1, patata uidA+ (control positivo). Puede observarse un nmero de inserciones variable entre clones. Los clones de las calles 3, 4, 7 y 8 se obtuvieron de explantos independientes; en cambio, los clones de las calles 5 y 6 surgieron del mismo explanto y se establecieron por separado como lneas independientes, pero su idntico patrn de hibridacin sugiere que se originaron probablemente en el mismo evento de transformacin.

Agregados embriognicos y embriones somticos aislados de Q. suber que se inocularon con A. tumefaciens AGL1 pBINUbiGUSint (DO600) durante 20 min a 25 C, y se cocultivaron en oscuridad a 25 C durante dos das antes de transferirlos a medio de cultivo selectivo (500 mgL1 cefotaxima + 100 mgL1 kanamicina). Los embriones secundarios resistentes a kanamicina se siguieron subcultivando en presencia del antibitico, y la expresin de -glucuronidasa (GUS) se ensay en una muestra de cada lnea embriognica. Imagen A, explantos subcultivados durante cuatro meses en presencia de kanamicina, que presentan diferentes niveles de expresin GUS, junto con un explantono transgnico barra, 1mm; B, detalle de un embrin probablemente quimrico analizado tras un mes en presencia de kanamicina

pBINUbiGUSint (~14,4 kpb)

nos 5nos 5 nos 3nos 3nptIInptII uidA-intPIV2 uidA-intPIV2PIV2Ubi1Ubi1 nos 3nos 3

Hind III Hind IIIHind III4364 pb

RBRB LBLBBgl II

33

Efecto del tiempo de cocultivo y la densidad de inculo bacteriano

15,4 8,1 bc11,4 13,6 c14,3 13,7 bc3

27,0 31,4 a16,7 8,4 bc20,8 16,92 b2

10,50,25

Densidad de inculo (DO600)Cocultivo (das)

87,5 17,7 c3,3 2,6 bembrin

87,1 10,0 c27,5 29,7 aagregado

GUS+ (%)kanR (%)Explanto

Efecto del tipo de explanto inoculado

Los datos representan la media y el error estndar de dos ensayos (n = 300). Cada tipo de explanto (i.e. agregados embriognicos y embriones aislados) se inocul con A. tumefaciens AGL1 pBINUbiGUSint (DO600 = 0,5) durante 20 min a 25 C y se realiz un cocultivo en oscuridad durante 2 das a 25 C. Al final del experimento (4 meses de cultivo en presencia de 100 mgL1 de kanamicina) se anot el porcentaje de embriones inoculados que produjeron lneas resistentes a kanamicina (kanR), en las que seguidamente se analiz la actividad -glucuronidasa (GUS+). Distinta letra acompaando a cada valor indica que se hallaron diferencias estadsticas en un test de X2 (p < 0,001).

1,3 0,830,0 5,726

2,4 1,633,3 13,524

6,4 5,241,4 10,822

GEIGTemperatura (C)

Efecto de la temperatura durante el cocultivo

Los datos representan la media y el error estndar de tres ensayos (n = 186). Los agregados embriognicos y embriones aislados se inocularon con A. tumefaciens AGL1 pBINUbiGUSint (DO600 = 0,5) durante 20 min a 25 C y se cocultivaron en oscuridad durante dos das a tres temperaturas diferentes: 22, 24 y 26 C. Tres semanas despus de la inoculacin se realiz una prueba GUS, anotndose el porcentaje de explantos inoculados que presentaban puntos GUS (IG) y el nmero de puntos GUS por cada explanto GUS+ (GE). No se obtuvieron diferencias significativas tras aplicar un test ANOVA (p > 0,05). A los datos percentuales se les realiz una transformacin angular para ajustarlos a una distribucin normal.

oscuridad

fotoperodo

88,93,6c

100,00,0c

100,00,0c

7,42,8ab

11,6 3,8 a

5,4 3,5 b

luz

GUS+ (%)kanR (%)Tratamientos

Efecto de la luz durante el cocultivo

Los datos representan la media y el error estndar del porcentaje de tres ensayos (n = 666) de explantos inoculados que produjeron lneas resistentes a kanamicina (100 mgL1) tras 4 meses de cultivo en su presencia. Los agregados embriognicos y embriones aislados se inocularon con A. tumefaciens AGL1 pBINUbiGUSint (OD600 = 0,5) durante 20 min a 25 C, y se cocultivaron con la bacteria en oscuridad durante 2 das a 25 C. Distinta letra acompaando a cada valor indica que se hallaron diferencias estadsticas (p < 0,05) tras analizar los datos dos a dos con un test X2.

34

Efecto del momento de recoleccin de los explantos

2,7 1,519,8 7,2b5,0 1,029,3 ,4ab8,6 0,747,1 2,4atotal

2,04,86,627,88,847,13

1,06,94,028,69,564,72

5,047,84,531,67,529,61

GEIGGEIGGEIG

34 d27 d20 dRplica

Edad de los explantos

Los datos representan la media y el error estndar de tres ensayos (n = 192). Se recolectaron embriones aislados y agregados embriognicos 20, 27 y 34 das despus del subcultivo a medio fresco, que se inocularon con A. tumefaciens AGL1 pBINUbiGUSint(DO600 = 0,5) durante 20 min a 25 C y se cocultivaron en oscuridad durante dos das a 25 C. A las tres semanas se realiz una prueba GUS de los explantos, anotndose el porcentaje de explantos inoculados que presentaban puntos GUS (IG) y el nmero de puntos GUS por cada explanto GUS+ (GE). Distinta letra indica que los valores fueron significativamente diferentes en un test 2 (p < 0,05, aplicado a IG). No se encontraron diferencias entre los GE en un test de Kruskal-Wallis.

35

Se inocularon agregados embriognicos y embriones somticos aislados con A. tumefaciens AGL1 pBIN19-sGFP(DO600 = 0,5) durante 20 min a 25 C, que se cocultivaronen oscuridad a 25 C durante dos das antes de transferirlos a medio de cultivo selectivo (500 mgL1cefotaxima + 100 mgL1 kanamicina). Unos 2-3 meses despus comenzaron a aparecer embriones secundarios resistentes a kanamicina, que se siguieron subcultivando en presencia del antibitico durante dos meses ms. Al cabo de este tiempo se analiz la expresin de GFP en una muestra de cada lnea embriognica, mediante deteccin de fluorescencia.Las fotografas fueron tomadas unos 5 meses despus de la inoculacin de los explantos. Arriba, imagen confocal de fluorescencia (A) e imagen de transmisin (B) de un mismo agregado embriognico. Centro, imgenes tomadas con un microscopio de fluorescencia de un embrin en estado cotiledonar (C) y de un agregado embriognico (D). Abajo, imgenes confocales de fluorescencia GFP (E) y de autofluorescencia (F) que revelan la presencia de tejidos no transgnicos (zonas que no presentan fluorescencia en E pero s en F) y, por lo tanto, que la muestra analizada es quimrica

Deteccin de la fluorescencia de sGFP

36

bar

pAHC25

EcoRI

Ubi 1 uidAnos 3' nos 3'

HindIII HindIII

pBIN19

nptIInos5'

RB

nos 3'

HindIII

EcoRI

LB

Ubi 1Ubi 1

nptIInptII barUbi1Ubi1

Bgl IIRB LB

pBINUbiBar (14,661 kpb)

Bgl IIHind III1,6 kpb

bar

pUCUbiBar (5534 pb)

HindIII EcoRIEcoRI

Ubi 1

2884 pb

barbar

pUCUbiBar (5534 pb)

HindIII EcoRIEcoRI

Ubi 1Ubi 1

2884 pb

bar

Digestin con Hind III y religacin

Digestin con Hind III y disgestin parcial con EcoRI

Insercin direccional del fragmento UbiBar en pBIN19

Esquema de la construccin del plsmido binario pBINUbiBar. Las secuencias de inters (marcadas en lnea continua) se extrajeron del plsmido pAHC25 y se insertaron direccionalmente en el pBIN19. Ubi1, promotor de la poliubiquitina de maz; uidA, gen de la -glucuronidasade Escherichia coli; bar, gen de la fosfinotricinaacetiltransferasa de Streptomyces hygroscopicus; nos5, promotor de la nopalina sintasa de A. tumefaciens; nos3, terminador de la nopalina sintasa de A. tumefaciens; nptII, gen de la neomicina fosfotransferasa de E. coli; RB, LB, bordes derecho e izquierdo, respectivamente, del ADN-T.

Lneas transgnicasM10 58 53 3 9 41 25 4 7

ePAT

/pf (

%)

0

2

4

6

8

10

12

14U/mg (pmolL-1s-1mg-1)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0ePAT/pf (%)U/mg pfU/mg ePAT

Mediante una precipitacin diferencial (30-60%) en sulfato amnico se realiz un enriquecimiento en fosfinotricinaacetiltransferasa (PAT) del extracto proteico extrado de ocho clones transgnicos bar (58, 53, 3, 9, 41, 25, 4 y 7) y una muestra de embriones no inoculados de la lnea M10. La actividad PAT se determinmediante un ensayo enzimtico y se calcularon las unidades enzimticas: U/mg pf (unidades por mg de peso fresco) y U/mg ePAT (unidades por mg de protena determinada en el extracto enriquecido), normalizadas ambas con respecto a la actividad detectada en el control. Asimismo, se calcul el porcentaje relativo de extracto enriquecido obtenido a partir del peso fresco inicial (ePAT/pf), con el fin de tener una idea aproximada del nivel de expresin de PAT en las muestras.

Expresin de PAT en las lneas transgnicas

37

ObtenciObtencin de plantas transgn de plantas transgnicas de patatanicas de patata

Transformacin

Seleccin y regeneracin

A. tumefaciens LBA 4404

Vector binario

Aclimatacin

38

Deteccin de los genes VP60 y Npt II mediante PCR

5,1-4,2-3,5

21,2

2-1,91,5-1,3

0,94-0,83

0,56

Kb

D C1 K2C2 K2 K3 K3 M

Npt IIVP60

D.- Planta control sin transformarC.- ControlK2.- Plantas transgnicas pK2-VP60K3.- Plantas transgnicas pK3-VP60K3T7.- Plantas transgnicas pK3T7-VP60UBI.- Plantas transgnicas pKUBI-VP60Tub2T7.- Plantas transgnicas pTub2T7-VP60 M.- Marcadores de ADN de tamao conocido.

VP60

Npt II

9,416

4,361 - 2,322

23,130

6,557

2,027564

MM D C K2 K3 K3T7 UBI Tub2T7

9,416

4,361 - 2,322

23,130

6,557

2,027564

Kb

39

Transcripcin del gen VP60D K2 K3 K3T7 UBITub2T7

VP60

L700

D.- Planta control sin transformarK2.- Plantas transgnicas pK2-VP60K3.- Plantas transgnicas pK3-VP60K3T7.- Plantas transgnicas pK3T7-VP60UBI.- Plantas transgnicas pKUBI-VP60Tub2T7.- Plantas transgnicas pTub2T7-VP60

IN.- Hojas (In vitro)Ex.- Hojas (Invernadero)TUB.- Tubrculo

Tub2T7

IN EX TUB

K2

IN EX TUB

K3

IN EX TUB

K3T7

IN EX TUB

VP60

L700

40

1 2 3 VP60

Conservacin de la protena VP60 en tubrculos almacenados a 4 C

1 2 3 4 5 6 7D Vp60

- 94

- 67

- 43

kDa

- 30

M 1 2 3 4 5 6 7D Vp60

- 94

- 67

- 43

kDa

- 30

Niveles del antgeno VP60 en los tubrculos

VP601 2 3

Cuantificacin de la protena VP60 en extractos de tubrculos frescos y liofilizados

SobrenadanteFrescoLiofilizado1 Mes 2 Meses

Fresco

Liofilizado Homogeneizado en H2O

Fresco

Homogeneizado en H2O

2

1

Centrifugacin

3

41

Protocolo general de infeccin de cotiledones de Pinus pinea con cepas desarmadas de Agrobacterium tumefaciens

Cubierta o testa Asepsia

Imbibicin 4C, 48 h.

Semilla

Cotiledones aisladosRealizacin de las

heridas: IntactoRaspadoBombardeoSAAT

Placa con 10 ml 1/2LP1 y los cotiledones

Pin

Inoculacin: 5 o 30 minutos

Transferencia a medio 1/2LP1 slido COCULTIVO

(48-72 h, oscuridad)

42

GUS positive cotyledons (%)

Mean SE number of GUS foci/cotyledon

% Cotyledonsforming buds

5.1 a 2.05 0.73a 42.5 ab0.4 b 10.33 b 48 a0.4 b 1 0.33 b 31 b

Agrobacteriumtumefaciens strain

EHA105LBA4404

C58Control 0 c 0 c 86.5 c

GUS activity and percentage of cotyledons forming buds were quantified 7 and 30 days after inoculation respectively. Data presented as mean number of at least 4 different experiments " SE. In each column, values with different letters are significantly different (P # 0.05).

EFFECT OF DIFFERENT DISARMED STRAINS OF A. TUMEFACIENS HARBOURING THE PLASMID p35SGUSint ON UIDA EXPRESSION IN P. PINEA

COTYLEDONS

43

EFECTO DEL TIEMPO DE COCULTIVO

Letras distintas indican diferencias significativas (P

44

1 2 3 4 50

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

Scraped cotyledons, EHA105 p35SGUSint strainData measured 7days after inoculation

0.25 0.5 1

Coculture(days)

2 32 3 2 3

a bbcd c d

e f

c f

e

Bacterialconcentration

Treatment

NUM

BER

OF

GUS

FOCI

PER

TRE

ATM

ENT

6

Data presented as mean number of at least 4 different experiments. Values with different letters are significantly different (P # 0.05).

EFFECT OF BACTERIAL DENSITY AND COCULTURE TIME ON A. TUMEFACIENS-MEDIATED UIDA GENE TRANSFER EFFICIENCY IN P.

PINEA COTYLEDONS

45

. .WOUNDINGPROCEDURE

PERCENTAGE OF GUS-POSITIVE COTYLEDONS

MEAN NUMBER OF GUS FOCI

COTYLEDONSE

NONE 338 4.1 0.73 a

SCRAPE 311 2.57 0.3 a

BOMBARDMENT 281 4.26 1.11 aSAAT 318 Diffuse staining

NUMBER OF ASSAYED

COTYLEDONS

CONTROL 153

16.6 a

8.4 b5.3 b27.7 c

0d

0b

Stone pine cotyledons with different types of wounds were inoculated with A. tumefaciens EHA105 p35SGUSint according to treatment 6 (inoculation for 5 min, bacterial concentration 1, coculture 3 d). Data were measured 7 days after infection and are presented as mean number of at least 4 different experiments " SE. In each column, values with different letters are significantly different (P # 0.05).

EFFECT OF DIFFERENT WOUNDING PROCEDURES ON A. TUMEFACIENS-MEDIATED UIDA GENE TRANSFER INTO P.

PINEA

46

Intact Scrape Bombard. SAAT

Wounding procedure

0

20

40

60

80

100

% c

otyl

edon

sfo

rmin

gbu

d

Non infected Infected

ab a b

c

A

B B C

% SURVIVAL ONE MONTH AFTER INOCULATION

Stone pine cotyledons with different types of wounds were inoculated with A. tumefaciens EHA105 p35SGUSint according to treatment 6 (inoculation for 5 min, bacterial concentration 1, coculture 3 d). Cotyledons that were not infected were used as controls. Data are presented as mean number of at least 4 different experiments. Values with different letters are significantly different (P # 0.05).

EFFECT OF DIFFERENT WOUNDING PROCEDURES ON PERCENTAGE OF COTYLEDONS FORMING BUDS

47

Bacterial concentration(OD600nm)

% Survival one month afterinfection

Control 0,01 0,1 0,25 0,5 10

10

20

30

40

50

% C

otyleo

nsfo

rming

bud

a

c cc c

b

Data presented as mean number of at least 4 different experiments. Values with different letters are significantly different (P 0.05).

Bacterial concentration

(OD600nm)

Percentageof GUS positive

cotyledons

Mean SE number of

GUS foci/cotyledon

1 320 49.7 a Manchas

0,5 376 27.7 b Manchas

0,25 337 28.5 b Manchas

0,1 350 23.1 b 10.2 1,5

0,01 328 13.4 c 6.25 1,03

Number ofassayed

cotyledons

Data were measured 7 days after inoculation

EFFECT OF BACTERIAL DENSITY ON A. TUMEFACIENS-MEDIATED UIDA GENE TRANSFER INTO P. PINEA COTYLEDONS

48

Ubi 1 Ubi 1uidA bar

'pAHC25

HindIII EcoRIHindIII

Ubi 1 uidA

Digestin con HindIII

4175 pb+ Ubi 1 bar

5534 pb

Religacin

HindIIIHindIIIHindIII HindIII

Digestiones parciales

con EcoRI

2884 pb

pBIN19

nptIInos5'

RB LBEco

RI

Hin

dII I

Ubi 1 bar

HindIII EcoRI EcoRI

Ubi 1 bar

pUCUbiBar (5534 pb)

HindIII EcoRI EcoRI

pBIN19

nptIInos5'

RB LB

Eco RI

HindIII

pBINUbiBar

Digestin con HindIII y

EcoRI

nos 3' nos 3'

nos 3'

Digestin con HindIII

+

pUC18

HindIIIHindIII

pUC18 abierto en HindIII y defosforilado

p35SGUSint

35S

uidA-int

Intrn PIV2

Digestin SnaBI y MscI Digestin SnaBI y MscI

Ubi 1 uidA

HindIIIHindIII

pUCUbiGUS

SnaB

IM

scI

pUCUbiGUS abierto

Fragmento de 426 pb (intrn PIV2 + 237 pb uidA)

SnaB

I

Msc

I

Digestin HindIII

Ubi 1 Ubi 1uidA barnos 3'

pAHC25

HindIII EcoRIHindIII

4175 pb

HindIII

Ubi 1 uidA

HindIII

Ubi 1 bar

5534 pb

HindIHindIII

pUCUbiGUSint

uidA-intUbi 1

HindIIIHindIIIHindIIHindIII

Ubi 1 uidA-int

4364 pb

pBIN19 abierto y defosforilado

nptIInos5'

RB LB

pBINUbiGUSin

Ligacin

Ligacin

237 pb

PIV

2

HindIII

HindIII

nos 3'

nos 3'

49

500 pb

pBINUbiBar14.610 pb

gen bar nos3'

EcoR

I

Sal I

PstI

Kpn

ISp

hI

Sal I

Xba

ISa

l IPs

tI

Bam

HI

Sal I

Eco

RI

Bgl

II

Sph

IH

indI

II

PstI

Xba I

Xba

I

Xba

I

Xba

I

promotor Ubi 1

Xba

ISa

l IPs

tI

Bam

HI

Sal I

Eco

RI

Bgl

II

Sph

IH

indI

II

PstI

SmaI

gen uidA-int nos3'

SacI

PIV2

Eco

RI

pBINUbiGUSint16.141 pb

Xba I

Xba

I

Xba

I

Xba

I

Hin

dII

Ipromotor Ubi 1

LB

RB

RB

LB

Nuevos vectores binarios para la transformacin de Pinus pinea

50

promotor Ubi 1

Xba

ISa

l IPs

tI

Bam

HI

Sal I

Eco

RI

Bgl

II

Sph

IH

indI

IIPs

tI

SmaI

gen uidA-int nos3'Sa

cIPIV2

Eco

RI

pBINUbiGUSint16.141 pb

Xba I Xba

I

Xba

I

Xba

I

Hin

dII

I

Gene elements are drawn to scale. The pBIN19 portion of the plasmid is not shown. Abbreviations: Ubi1, ubiquitin gene promoter; uidA-int, uidA gene with the intron PIV2 from potato; nos3', polyadenylation signal from the nopaline synthase gene; RB and LB, right and left borders of the T-DNA.

Structure and restriction map of a portion of the T-DNA of pBINUbiGUSint

51

Expresin del gen uidA (pBINUbiGUSint) mediada por A. tumefaciens en cotiledones de Pinus pinea heridos por raspado

Cepa EHA105 p35SGUSint o pBINUbiGUSint. Protocolo B, infeccin 5 minutos y cocultivo 3 das.

Densidad de infeccin

(A 600 nm)

Plsmido binario % Cotiledonescon respuesta

GUS +

Unidadesexpresin /

cotiledn

% CFY al mesde inoculacin

0,01

1

Control

p35SGUSint

pBINUbiGUSint

p35SGUSint

pBINUbiGUSint

-------

0 a

15,2 b

0 a

7,5 1,2 b

8,2 c

41,4 d

3,3 0,6 c

7,1 0,6 b

25,9 2,3 a

21,3 2,2 a

1,9 0,7 b

2,4 0,8 b

0 a ----- 70,4 2,1 a

Letras distintas indican diferencias significativas (P < 0,05).

52

500 pb

promotor Ubi 1

Xba

ISa

l IPs

t I

Bam

HI

Sal I

Eco

RI

Bgl I

I

Sph

IH

indI

II

Pst I

SmaI

gen uidA-int nos3'

SacI

PIV2

Eco

RI

pBINUbiGUSint16.141 pb

Xba I

Xba

I

Xba

I

Xba

I

Hin

d II

I

LB RB

Woundingprocedure

Binary plasmid % of GUSpositive

cotyledons

Mean number ofGUS

foci/cotyledon "SE

% of BFC(1) 30

days after

inoculation " SE

p35SGUSint 0 a 0 a 25.9 " 2.3 a

pBINUbiGUSint 15.2 b 7.5 " 1.2 b 21.3 " 2.2 aScrape

----- Control 0 a 0 a 70.4 " 2.1 b

p35SGUSint 2.1 a 1.2 " 0.4 a 1.5 "0.6 a

pBINUbiGUSint 33.8 b 9.5 " 1.1 b 0.3 " 0.2 aSAAT

----- Control 0 c 0 a 58.1 " 2.3 b

--- Control Non-inoculated 0 ---- 89.8 " 2.2

(1) BFC: Bud forming cotyledons.

Bacterial density used for inoculation (OD600nm) was 0.01. Data are presented as mean number of at least three different experiments " standard error (SE). In the column and for each wounding procedure, values with different letters are significantly different (P # 0.05).

gen uidA NosCaMV35Sp35SGUSint PIV2

500 pb

EFFECT OF PLASMID P35SGUSint AND THE NEW DESIGNED VECTOR, PBINUBIGUSINT, ON UIDA EXPRESSION IN PINUS PINEA COTYLEDONS SEVEN DAYS AFTER THE INOCULATION WITH AGROBACTERIUM TUMEFACIENS EHA105

53

Transformacin gentica mediada por virusObtencin de partculas virales quimeras

Infeccin

Virus vegetal

Partculas virales quimeras

Pptido

Extraccin

+

54

1. Expresin de protenas en plantas- Vector de expresin-Protenas virales supresoras del silenciamiento post-transcripcional

2. Anlisis funcional de genes en plantas- Vector de silenciamiento post-transcripcional

Usos de los virus de plantas en biotecnologa e investigacin

55

Transformacin gentica . Mtodos directos. Biobalstica. Electroporacin. Microinyeccin. Ejemplos. Estado actual y perspectivas.

56

Sistemas de transferencia de ADN basadosen vectores biolgicos

- Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciensy Agrobacterium rhizogenes- Sistemas basados en virus vegetales

Sistemas de transferencia directa de ADN- Transferencia por bombardeo de micropartculas o biobalstica- Transferencia mediada por electroporacin y/o mtodos qumicos- Transferencia con whiskers de carburo de silicio- Transferencia por microinyeccin

57

Ventajas- Son considerados sistemas universales porque, al no depender deorganismos vectores, pueden aplicarse a cualquier especie vegetal- No requieren eliminar las clulas del organismo vector de los tejidos o plantas transgnicas- Requieren construcciones ms simples y pequeas- Son apropiados para estudios de expresin transitoria

Desventajas- Pueden resultar en un alto nmero de copias y/o copias truncadas del transgn y del vector en varios sitios del genoma de las clulas transformadas- Se caracterizan por la alta frecuencia de aparicin dere-arreglos en los transgenes

*Se recomienda tomar ciertas precauciones: a) reducir el nmero de transgenes a transferir, b) evitar el uso de mltiples copias del mismo promotor o terminador y c) evitar el uso de promotores y transgenes con un alto grado de similitud a promotores o genes endgenos.

58

Transferencia de genes mediante disparo de partculas o Biobalstica

Biolistics: Partculas esfricas (0,4-1,2 m ) de oro o wolframio recubiertas con ADN que se aceleran e impulsan a alta velocidad (3-600 metros/seg) con gas comprimido (helio), impactando, atravesando las paredes de las clulas vegetales y depositandose en el citoplasma y orgnulos (ncleo, mitocondrias y cloroplastos).

Se puede transformar un amplio rango de cultivos celulares y tejidos:, suspensiones, callos, meristemos, embriones, coleoptilos y polen, especialmente de especies nossusceptibles a Agrobacterium, como son las monocotiledoneas.

59

Bombardeo de micropartculas

1984. Sandford et al., describen la tcnica de bombardeo de micropartculas para la transferencia directa de ADN (Universidad de Cornell, EEUU).

Diseo del primer acelerador de micropartculas impulsadas por explosin de plvora

60

Bombardeo de micropartculas1987. Klein et al. demuestran la utilidad del mtodo al observar expresin transitoria en clulas epidrmicas de Allium cepa usando un dispositivo de impulsin a plvora y micropartculas de tungsteno recubiertas de ADN. 1988. Christou et al. demuestran la utilidad del mtodo para transferir ADN biolgicamente activo en clulas vivas y obtener transformantes estables.1988. Johnston et al. logran transformar por primera vez microorganismos y organelas.1988. Wang et al., Mc Cabe et al., Christou et al. obtienen plantas superiores transgnicas.1991. Williams et al. demuestran la transformacin de animales in vitro e in vivo.

61

Parmetros fsicos y qumicos que influyenen la transferencia del ADN

- Mtodo de aceleracin de las micropartculas- Naturaleza qumica y fsica, densidad y volumen de las micropartculas- Naturaleza, preparacin, adherencia y concentracin del ADN- Vaco y distancias de bombardeo- Dimetro de apertura de la placa de retencin- Nmero de bombardeos

Parmetros relacionados con la construccingentica utilizada

- Vector, promotores, intrones, genes reporteros ygenes marcadores de seleccin

La transformacin por biobalstica depende de factores fsicos, qumicos y biolgicos

62

Sistemas alternativos de aceleracin de micropartculas

63

La aceleracin de las micropartculas puedegenerarse por:

- Explosin qumica de plvora seca- Descarga de helio a alta presin- Descarga de aire, CO2 o N2 comprimido- Descarga elctrica de alto voltaje y baja capacitanciao bajo voltaje y alta capacitancia- Flujo de partculas o flujo de helio a baja presin por aspersin- Flujo de helio con can de precisin

64

Modelo comercial actual

Medidor de presin de helio

Tubo de aceleracin de gas

Interruptoresde control

Medidor de vacoPortador del discode ruptura

Portador del macroproyectil

Ensamblaje del propulsorde microproyectiles

Cmara de bombardeo

Controles del flujode aire y de vaco

Clulas blanco

Soporte del blanco

Vlvula de medicin de helio

Acelerador de micropartculas PDS 1000/He por descarga de helio a alta presin

65

La transformacin por biobalstica depende de factores fsicos, qumicosy biolgicos

Parmetros fsicos y qumicos que influyen en la transferencia del ADN

- Mtodo de aceleracin de las micropartculas

- Naturaleza qumica y fsica, densidad y volumende las micropartculas

- Naturaleza, preparacin, adherencia y concentracin del ADN

- Presin, vaco y distancias de bombardeo

- Dimetro de apertura de la placa de retencin

- Nmero de bombardeos

Parmetros relacionados con la construccin gentica utilizada

- Vector, promotores, intrones, genes reporteros y genes marcadores de seleccin

66

Embrin aislado

Esterilizacin

Semilla Imbibicin4 C, 48 h

Induccin durante2, 4, 8, 16 y 35 d

Elongacin 60 d

Cotiledonesexcindidos

LPB LPC

Hay programa de mejora gentica.De cada cruce controlado se pueden obtener cientos de semillas. De cada semilla un rbol.Con tcnicas de cultivo in vitro se pueden producir cientos de plntulas a partir de una semilla.

Caso prctico: Amplificacin de progenie en Pinus pinea.

67

Transformacin de cotiledones de Pinus pinea mediante bombardeo de micropartculas

PION de Pinus pinea

Cubierta o testa ASEPSIA

(Perxido de hidrgenos 7,5 %, 45 minutos)

Imbibicin 4C, 48 h.

Semilla

Embrin aislado

Escisin de los cotiledones

Cotiledones escindidos

Placas de bombardeo (1/2LP1)

Cultivo 24 h oscuridad

1/2LP0

BiolisticHe-1000

68

500 pb

gen uidA NosCaMV35SPBI 121

Este gen GusA codifica para la enzima glucuronidasa cuya actividad se determina por los mtodos 1) histoqumico en el cual la -glucuronidasa hidroliza al sustrato X-Glu produciendo una coloracin azul y 2) fluoromtrico donde la glucuronidasa hidroliza el sustrato Metil Umbeliferil Glucuronido liberando el grupo fluorgeno Metil Umbeliferona(MU).

69

Letras distintas indican diferencias significativas (P

70

EFECTO DEL DIMETRO DE LAS PARTCULAS SOBRE LA EXPRESION DEL GEN gusA

Letras distintas indican diferencias significativas (P

71

EFECTO DE LA CANTIDAD DE ADN POR DISPARO SOBRE LA EXPRESIN DEL GEN gusA

Letras distintas indican diferencias significativas (P

72

EFECTO DEL PERODO DE CULTIVO DE LOS COTILEDONES SOBRE LA EXPRESIN DEL GEN gusA

Letras distintas indican diferencias significativas (P

73

500 pb

PBI 364

pRC 31

pRD 330

PBI221

pRC 30

74

EFECTO DE LOS INTRONES Sh1-int1 Y Adh1-int1 SOBRE LA EXPRESION DEL GEN gusA

Letras distintas indican diferencias significativas (P

75

Vectores utilizados en el estudio del efecto de las secuencias promotoras sobre la expresin transitoria del gen uidA en cotiledones de Pinus pinea

pA1GusN

PBI 364

pCGU 1

pAHC25

Nos

pAct1-D

500 pb

35S35S gen uidA

gen uidA

gen uidA NosUb B1 delecionado

Adh 1 Nos

gen uidA NosUbi1

Act1-D gen uidA Nos

gen uidA NosCaMV35Sp35SGUSint PIV2

gen uidA NosCaMV35SPBI 121

76

Efecto de las secuencias promotoras sobre la expresin transitoria del gen uidA en cotiledones de Pinus pinea

0

45,9

26,4

55,150,5 50,8

2 8,9 30,3

570,6

316,7

8,2 15,3 11,5

Control

PBI 1

21

PBI 3

64

pCGU

D1

pAHC

25

p35S

GUSin

t

pAct1

-D

pA1G

usN

010203040506070

Unida

des

de e

xpre

sin

/ c

otile

dn

0100200300400500600700 Picom

olesM

U / m

g/ m

in

Ensayo histoqumico Ensayo fluoromtrico

a

b

a a aa

cba ac ac

Letras distintas indican diferencias significativas (P < 0,05).

Parmetros: distancia 6 cm, oro 1 m, presin 900 psi, cantidad de ADN 0,8 g / disparo.

c

77

78

500 pb

pBINUbiBar14.610 pb

gen bar nos3'

EcoR

I

Sal I

Pst

I

Kpn

ISp

hI

Sal I

Xba

ISa

l IPs

tI

Bam

HI

Sal I

Eco

RI

BglI

I

Sph

IH

indI

II

Pst

I

Xba I Xba

I

Xba

I

Xba

I

promotor Ubi 1

Xba

ISa

l IPs

tI

Bam

HI

Sal I

Eco

RI

BglI

I

Sph

IH

indI

II

Pst

I

SmaI

gen uidA-int nos3'

SacI

PIV2

Eco

RI

pBINUbiGUSint16.141 pb

Xba I

Xba

I

Xba

I

Xba

I

Hin

dII

Ipromotor Ubi 1

LB

RB

RB

LB

Nuevos vectores binarios para la transformacin de Pinus pinea

79

2,1843,81

270,75

9,86

Control pBINUbiGUSint pAHC25 p35SGUSint

Plsmido bombardeado

050

100150200250300

pmol

MU /

mg

/ min

Expresin del gen uidA del plsmido pBINUbiGUSint en cotiledones de Pinus pinea : Comparacin con pAHC25 y p35SGUSint

Parmetros: distancia 6 cm, oro 1 m, presin 900 psi, cantidad de ADN 0,8 g / disparo.

Letras distintas indican diferencias significativas (P < 0,05).

a b

c

d

80

81

- Transferencia de genes a clulas, tejidos y rganos vegetales

- Transferencia de genes a microorganismos, clulas eucariticas y orgnulos

- Estudio de expresin transitoria

- Anlisis de promotores y de deleccin de genes

- Estudio de mecanismos de expresin y regulacin de genes

- Estudio de infecciones virales

- Transferencia de ARN viral

- Estudio de vas metablicas

- Estudio del desarrollo de plantas

La biobalstica puede utilizarse con diversos fines experimentales

82

Transferencia de ADN mediada por electroporacin y/o mtodos qumicos

Suspensin celular

FILTRADO

Plsmido +

Ca(NO3)2

TransformacinEnsayo GUS

Hoja seccionada

Proliferacin de callo

83

AISLAMIENTO Y ELECTROPORACIN DE PROTOPLASTOS DE Pinus nigra Arn

PLNTULAS DE 8 DAS

DIGESTIN RESUSPENSIN EN MANITOL

ELECTROPORACIN

Duracell

Protoplasto

Fuente de alimentacin

84

200 300 400CAPACIDADES

0500

10001500200025003000350040004500

pmol

MU/m

gpr

otena

min

200 300 400CAPACIDADES

0102030405060708090

100VI

ABI

LIDAD (%)

FUERZAS DE CAMPO APLICADAS

500 V/cm

625 V/cm

750 V/cm

EFECTO DE LA CAPACIDAD Y EL VOLTAJE SOBRE LA EXPRESION TRANSITORIA DEL GEN gusA EN

PROTOPLASTOS DE Pinus nigra Arn.

85

Plsmido pmol MU / mg de protena min

control 7,8 1,9 e

225,2 29 d

27,3 2,7 b

4425,8 585 a

35,3 6,9 b

1434 340 c

22 3,5 b

EFECTO DEL PROMOTOR SOBRE LA EXPRESIN DEL GEN gusA EN PROTOPLASTOS ELECTROPORADOS DE Pinus nigra Arn.

Letras distintas indican diferencias significativas (P

86

La clula vegetal tiene varios cloroplastos. (cientos o decenas) y slo un ncleo.

Los cloroplastos expresan los genes bacterianos con mayor facilidad debido a su origen procaritico.

La expresin del material gentico es ms estable. Integracin por recombinacin homloga. Evitamos el silenciamiento gnico. Poseen ARNm policistrnico. Se transmite, con excepciones (en ciertas conferas y

otras), por va materna.

Transformacin de plastidios

Plantas transplastmicas

87

-Genes dominantes de la resistencia a antibiticos: - aadA (Spectinomicina)- nptII (kanamicina)

-Genes recesivos que restauran el crecimiento de fotoauttrofos.

- Alternativas para evitar la resistencia antibitica: Gen productor de betaina aldehido deshidrogenasa (BADH) y el gen GFP .

Marcadores

88

TRANSFORMACIN DE CLOROPLASTOS

1- Evitar contaminacin gentica por parte de las plantas transgnicas a las silvestres.

2- Proteger a los consumidores de dichas especies transgnicas de intoxicaciones.

3- Producir grandes cantidades de una protena extraa interesante para el hombre.

4- Alcanzar el mximo rendimiento en la produccin de plantas transgnicas.

89

La expresin de toxina Cry de Bacillus thurigiensis en cloroplastos confiere amplia resistencia contra insectos

Protenas Cry de Bacillus thuringiensis

-Poseen potente actividad insecticida contraInsectos lepidpteros, dpteros y colepteros.

Resultados:Se obtuvieron altos niveles de expresinde la toxina (aproximadamente 2-3 % de peso total soluble) asociados a una alta tasa de mortalidad (~100 %) para Heliothis virescens, Helicover pazea y Spodopteraexigua en los ensayos de infestacin.

La transformacin de cloroplastos podra ser un sistema apropiado para acumular altos niveles de la -entomotoxina Cry debido al origen procariota del gen.