UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
PERFIL DE TESIS
“EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICÓTICA IN-VITRO DE Aristolochia
pilosa Kunth (Amarun Waska)”
Autor: Viviana Alexandra Carrillo Balseca
Tesis para optar por el Título Profesional de:
QUÌMICA FARMACÉUTICA
Tutora: Dra. Liliana Naranjo
QUITO – SEPTIEMBRE 2016
ii
Carrillo Balseca, Viviana Alexandra (2016). Evaluación de la
actividad antimicótica in-vitro de Aristolochia pilosa Kunth
(Amarun Waska). Informe final de Investigación para optar
por el grado de Químico Farmacéutico. Carrera de Química
Farmacéutica. Quito: UCE.
iii
DEDICATORIA
Dedico este trabajo a Dios y a la Virgen Dolorosa por siempre iluminarme en los momentos
más difíciles de mi vida, por mostrarme el camino y la señal de esperanza que he necesitado
cuando más quería rendirme.
A mis padres y hermano por su apoyo incondicional, por buscar la manera de sacar adelante a
la familia y mostrarme a su manera su amor y comprensión. Dios les pague.
A mis abuelitos Carmen Amelia (+), Rosendo (+), Rosa, Baltazar por haberme regalado
bonitos momentos que formaron parte de mi vida personal y mi carrera.
A mi familia paterna y materna en general, por compartir alegrías, animarme a seguir
adelante.
A mis mejores amigas Adri y Gaby por ser una bendición en mi vida y alentarme a seguir
adelante y luchar por las cosas que quiero a pesar de los sacrificios.
iv
AGRADECIMIENTOS
Agradezco principalmente a Dios y a mi Mamita Dolorosa por darme la fortaleza en los
momentos que más sentía rendirme y mostrarme que con fe y constancia todo se puede.
A mis padres y hermano por darme el empuje en los momentos difíciles, por enseñarme que
la recompensa llega con grandes sacrificios y por darme lo necesario para cumplir mi meta.
A mi tutora, Dra. Liliana Naranjo por compartir sus conocimientos, por ser una profesional
de ejemplo y ser una gran guía.
A la Dra. Carmita Reyes por su paciencia, responsabilidad y apoyo en mi trabajo de
investigación.
Al Dr. Walter Remache por su confianza, rectitud y enseñanzas.
A mis profesoras Dra., Dayana Borja y Dra. Ximena Chiriboga por su experiencia compartida
en cada situación de la carrera y de este trabajo de investigación, además por su colaboración
y entrega en este proyecto.
A PRIMS Laboratorios y sus doctores por haberme dado la apertura y las facilidades con los
equipos y laboratorios para realizar una parte fundamental en mi trabajo de investigación.
A mi mejor amigo Jorgito, gracias mijo por ser incondicional siempre y estar en las buenas y
en las malas.
A mis buenas e incondicionales amigas Paty y Gaby gracias por su apoyo, su humildad y
fuerza para nunca desmayar en todas las cosas que íbamos realizando juntas.
A mis amigas y amigos Adri, Magy, Wendy, Daysi, Marce, Mayrita, Vero, Tammi, Andrés,
Jonathan, Diego, Jimmy, Jorge Luis por estar cuando más los necesité y haber compartido
muchas alegrías y buenos momentos, los quiero.
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
INFORME DE APROBACIÓN DE LA TESIS POR PARTE DEL TUTOR
Por la presente, dejo constancia que he leído el trabajo de investigación presentado por la
señorita Viviana Alexandra Carrillo Balseca, para optar por el título profesional de Químico
Farmacéutico, cuyo tema es: “Evaluación de la Actividad Antimicótica In-Vitro de
Aristolochia pilosa Kunth (Amarun Waska)”, la misma que reúne los requerimientos y los
méritos suficientes para ser sometido a evaluación por el Tribunal Calificador.
En la ciudad de Quito, a los 30 días del mes de Junio del 2016
vi
vii
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORIA INTELECTUAL
Yo, Viviana Alexandra Carrillo Balseca en calidad de autor del Informe Final de
investigación realizado “Evaluación de la Actividad Antimicótica In-Vitro de Aristolochia
pilosa Kunth (Amarun Waska)”, por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD
CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o de
parte de los que contienen esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente autorización,
seguirán presentes a mi favor; de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 y
demás pertinentes a la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento.
Quito, a los 30 días del mes de Junio del 2016
____________________________________
Viviana Alexandra Carrillo Balseca
C.I. 1722491592
viii
LUGAR DONDE SE REALIZÓ LA INVESTIGACIÓN
El proceso de recolección de las muestras, se realizó en la Comunidad San Roque,
Provincia de Orellana.
El proceso de molienda de la corteza, obtención del extracto y análisis fitoquímico se
realizó en la Universidad Central del Ecuador, Facultad de Ciencias Químicas, en el
Laboratorio de Productos Naturales.
El proceso de determinación de la Concentración Mínima Inhibidora (CMI) se realizó en
el laboratorio de Microbiología de la Empresa PRIMS LABORATORIOS.
ix
TABLA DE CONTENIDO
CAPÍTULO I ---------------------------------------------------------------------------------------------- 1
1. EL PROBLEMA ------------------------------------------------------------------------------------ 1
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ------------------------------------------------------ 1
1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ---------------------------------------------------------- 2
1.3 OBJETIVOS ---------------------------------------------------------------------------------------- 2
1.3.1 Objetivo general: -------------------------------------------------------------------------- 2
1.3.2 Objetivos específicos: --------------------------------------------------------------------- 2
1.4 JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA DE LA INVESTIGACIÓN ----------------------- 3
CAPÍTULO II --------------------------------------------------------------------------------------------- 5
2. MARCO REFERENCIAL O MARCO TEORICO ----------------------------------------- 5
2.1 ANTECEDENTES ---------------------------------------------------------------------------- 5
2.2 FUNDAMENTO TEÓRICO. -------------------------------------------------------------------- 6
2.2.1 Fundamento Botánico. -------------------------------------------------------------------- 6
2.2.1.1 DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA Y HÁBITAT: ------------------------------- 7
2.2.1.2 DESCRIPCIÓN BOTÁNICA: ----------------------------------------------------- 8
a) Vástagos ------------------------------------------------------------------------------- 8
b) Hojas ----------------------------------------------------------------------------------- 8
c) Flores ----------------------------------------------------------------------------------- 9
2.2.1.3 ETNOFARMACOLOGÍA Y MODO DE EMPLEO: -------------------------10
2.2.2 FUNDAMENTO FARMACOLÓGICO ----------------------------------------------11
2.2.2.1 LA PIEL ------------------------------------------------------------------------------11
2.2.2.2 ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LA PIEL -----------------------------------11
2.2.2.3 PREPARADOS TÓPICOS --------------------------------------------------------12
2.2.2.4 ENFERMEDADES MICÓTICAS DE LA PIEL Y LAS UÑAS ------------12
2.2.2.4.1 MICOSIS CUTÁNEAS -------------------------------------------------------14
a) Tinea corporis --------------------------------------------------------------------15
b) Tinea cruris -----------------------------------------------------------------------17
c) Tinea pedis ------------------------------------------------------------------------18
d) Tinea manuum (tinea de manos) -----------------------------------------------18
e) Tinea unguium (onicomicosis) -------------------------------------------------19
f) Tinea capitis ----------------------------------------------------------------------20
g) Tinea barbae ----------------------------------------------------------------------22
x
2.2.2.5 TIPOS DE HONGOS DÉRMICOS ----------------------------------------------22
a) TRYCHOPHYTON ------------------------------------------------------------------23
2.2.2.6 DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES MICÓTICAS ---------------24
2.2.2.7 TRATAMIENTO DE LAS ENFERMADES MICÓTICAS ------------------25
2.2.2.8 ANTIMICÓTICOS -----------------------------------------------------------------25
2.2.2.8.1 TERBINAFINA ----------------------------------------------------------------26
a) Descripción: -----------------------------------------------------------------------26
b) Estructura: -------------------------------------------------------------------------26
c) Clasificación ATCC -------------------------------------------------------------27
d) Mecanismo de acción ------------------------------------------------------------27
e) Constantes Farmacocinéticas: --------------------------------------------------28
f) Propiedades Farmacocinéticas -------------------------------------------------28
g) Interacciones ----------------------------------------------------------------------29
h) Reacciones adversas -------------------------------------------------------------30
i) Contraindicaciones ---------------------------------------------------------------30
j) Indicaciones -----------------------------------------------------------------------30
k) Posología y vías de administración --------------------------------------------31
2.2.3 ANÁLISIS FITOQUÍMICO ------------------------------------------------------------------31
2.2.3.1 METABOLITOS SECUNDARIOS FRECUENTES EN LAS PLANTAS ---32
1. Alcaloides: ------------------------------------------------------------------------------32
2. Flavonoides: ----------------------------------------------------------------------------33
3. Cardiotónicos: --------------------------------------------------------------------------34
4. Saponinas: -------------------------------------------------------------------------------35
5. Cumarinas: ------------------------------------------------------------------------------36
6. Quinonas: --------------------------------------------------------------------------------36
7. Taninos: ----------------------------------------------------------------------------------37
8. Esteroles y/o Triterpenoides: ---------------------------------------------------------38
2.2.4 PROCESO DE RECOLECCIÓN DE LA MATERIA PRIMA--------------------39
1. Procesamiento pos-cosecha -----------------------------------------------------------40
2. Secado -----------------------------------------------------------------------------------40
3. Almacenamiento -----------------------------------------------------------------------41
4. Molienda ---------------------------------------------------------------------------------41
5. Maceración ------------------------------------------------------------------------------42
6. Obtención del extracto vegetal -------------------------------------------------------42
7. Proceso de reflujo ----------------------------------------------------------------------43
xi
2.2.5 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICÓTICA ------------------------44
2.2.5.1 CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI) -----------------------44
2.2.5.2 MÉTODO DE DILUCIÓN CON SUSPENSIÓN DE ESPORAS -----------44
2.2.5.3 CONTEO DE ESPORAS EN CÁMARA DE NEUBAUER -----------------44
2.3 FUNDAMENTACION LEGAL ---------------------------------------------------------------45
2.4 HIPÓTESIS ----------------------------------------------------------------------------------------49
2.4.1 HIPÓTESIS NULA: ---------------------------------------------------------------------49
2.4.2 HIPÓTESIS ALTERNATIVA: --------------------------------------------------------49
2.5.1 Variable dependiente. -----------------------------------------------------------------49
2.5.2 Variable Independiente. --------------------------------------------------------------49
CAPÍTULO III -------------------------------------------------------------------------------------------50
3. METODOLOGÍA -------------------------------------------------------------------------------50
3.1 DISEÑO DE INVESTIGACIÓN ----------------------------------------------------------50
3.1.1 De campo --------------------------------------------------------------------------------50
3.1.2 Experimental ------------------------------------------------------------------------------50
3.2 POBLACIÓN Y MUESTRA ---------------------------------------------------------------50
3.2.1 Población ----------------------------------------------------------------------------------50
3.2.2 Muestra ------------------------------------------------------------------------------------50
3.3 MATERIALES Y REACTIVOS: ---------------------------------------------------------51
3.3.1 Materiales de recolección del material vegetal ---------------------------------------51
3.3.2 Materiales de laboratorio ----------------------------------------------------------------51
3.3.3 Equipos de laboratorio -------------------------------------------------------------------51
3.3.4 Reactivos ----------------------------------------------------------------------------------52
3.4 MATERIAS PRIMAS ---------------------------------------------------------------------------52
3.5 MÈTODOS: ---------------------------------------------------------------------------------------52
3.5.1 OBTENCIÓN DEL EXTRACTO VEGETAL DE Aristolochia pilosa Kunth
(Amarun Waska) --------------------------------------------------------------------------------52
3.5.2 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICÓTICA ------------------------53
3.5.2.1 Activación de las cepas de hongos ------------------------------------------------53
3.5.2.2 MÉTODO DE DILUCIÓN CON SUSPENSIÓN DE ESPORAS -----------54
3.5.3 MARCHA FITOQUÍMICA ------------------------------------------------------------55
3.5.3.1 DROGA SECA Y PULVERIZADA ---------------------------------------------56
3.5.3.2 INVESTIGACION DE ALCALOIDES: ----------------------------------------57
a) Extracción: ------------------------------------------------------------------------------57
xii
b) Identificación ------------------------------------------------------------------------57
3.5.3.3 IDENTIFICACIÓN DE: ESTEROLES, FLAVONOIDES,
ANTRAQUINONAS, TANINOS Y SAPONINAS. ------------------------------------58
3.5.3.3.1 Esteroles -------------------------------------------------------------------------58
a) Extracción: ------------------------------------------------------------------------58
b) Identificacion ---------------------------------------------------------------------58
3.5.3.4 FLAVONOIDES, ANTRAQUINONAS, ANTOCIANOS TANINOS Y
SAPONINAS ---------------------------------------------------------------------------------59
a) FLAVONOIDES: -------------------------------------------------------------------59
b) REACCIÓN PARA ANTOCIANOS:--------------------------------------------59
c) ANTRAQUINONAS: --------------------------------------------------------------60
d) TANINOS: ---------------------------------------------------------------------------60
e) SAPONINAS ------------------------------------------------------------------------61
3.5.3.5 HETERÓSIDOS CARDIOTÓNICOS: ------------------------------------------61
a) Extracción: ---------------------------------------------------------------------------61
b) Identificación: -----------------------------------------------------------------------62
3.6 TECNICAS DE PROCESAMIENTO Y ANÁLISIS DE DATOS ------------------------62
3.6.1 DISEÑO DE BLOQUES COMPLETAMENTE AL AZAR (DBCA) -----------62
3.6.3 PRUEBA DE TUKEY ----------------------------------------------------------------63
3.6.4 DECODIFICACIÓN GENERAL DEL ESTUDIO ------------------------------64
CAPÍTULO IV -------------------------------------------------------------------------------------------65
4. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ------------------------------------------65
4.1 MATERIAL VEGETAL --------------------------------------------------------------------65
4.2 RESULTADOS-------------------------------------------------------------------------------67
4.2.1 OBTENCIÓN DE CONCENTRACION DE CADA EXTRACTO
HIDROALCOHÓLICO ------------------------------------------------------------------------67
4.2.2 OBTENCIÓN DE CONCENTRACION FINAL DE TERBINAFINA (C4) ----68
4.2.3 MEDIDA DEL HALO DE CRECIMIENTO DEL HONGO en mm EN
EXTRACTO VEGETAL (𝒙 ̅) ------------------------------------------------------------------68
4.2.4 MEDIDA DEL HALO DE CRECIMIENTO DEL HONGO en mm DEL
MEDICAMENTO CONTROL – TERBINAFINA (𝒙 ̅) ------------------------------------69
4.2.5 PORCENTAJE DE CRECIMIENTO DEL HONGO POR CONCENTRACIÓN
DE EXTRACTO VEGETAL -----------------------------------------------------------------70
4.3 DISEÑO ESTADÍSTICO -----------------------------------------------------------------------70
xiii
4.3.1 DISEÑO ESTADÍSTICO PARA T. rubrum -----------------------------------------71
Obtención del porcentaje de crecimiento de T. rubrum ---------------------------------71
4.3.1.1 ANÁLISIS DE VARIANZA PARA % CRECIMIENTO - SUMA DE
CUADRADOS TIPO III --------------------------------------------------------------------71
4.3.1.2 PRUEBA DE TUKEY ----------------------------------------------------------72
4.3.2 DISEÑO ESTADÍSTICO PARA T. mentagrophytes -------------------------------73
Obtención del porcentaje de crecimiento de T. mentagrophytes ----------------------73
4.3.2.1 ANÁLISIS DE VARIANZA PARA %CRECIMIENTO - SUMA DE
CUADRADOS TIPO III --------------------------------------------------------------------74
4.3.2.2 PRUEBA DE TUKEY -------------------------------------------------------------74
4.4 RESULTADOS MARCHA FITOQUIMICA ------------------------------------------------76
CAPITULO V---------------------------------------------------------------------------------------------77
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES --------------------------------------------77
5.1 CONCLUSIONES ---------------------------------------------------------------------------77
5.2 RECOMENDACIONES --------------------------------------------------------------------78
REFERENCIAS -----------------------------------------------------------------------------------------79
ANEXOS --------------------------------------------------------------------------------------------------82
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Constantes farmacocinéticas Terbinafina--------------------------------------------------28
Tabla 2. Interacciones de la Terbinafina -------------------------------------------------------------29
Tabla 3. Identificación de alcaloides ------------------------------------------------------------------57
Tabla 4. Identificación de esteroles -------------------------------------------------------------------58
Tabla 5. Identificación de Flavonoides ---------------------------------------------------------------59
Tabla 6. Identificación de Antocianos ----------------------------------------------------------------59
Tabla 7. Identificación de Antraquinonas ------------------------------------------------------------60
Tabla 8. Identificación de Taninos --------------------------------------------------------------------60
Tabla 9. Diferenciación taninos hidrolizables de no hidrolizables -------------------------------61
Tabla 10. Identificación de saponinas ----------------------------------------------------------------61
Tabla 11. Identificación de Cardiotónicos -----------------------------------------------------------62
Tabla 12. Esquema de ADEVA -----------------------------------------------------------------------63
Tabla 13. Decodificación general ---------------------------------------------------------------------64
xiv
Tabla 14. Datos peso planta y volumen solución ---------------------------------------------------67
Tabla 15. Resultados concentración extractos -------------------------------------------------------67
Tabla 16. Medida del halo de crecimiento Thr ------------------------------------------------------68
Tabla 17. Medida del halo de crecimiento Thm -----------------------------------------------------69
Tabla 18. Medida del halo de crecimiento Thr - Terbinafina -------------------------------------69
Tabla 19. Medida del halo de crecimiento Thm - Terbinafina ------------------------------------69
Tabla 20. Porcentaje de crecimiento de hongo Thr -------------------------------------------------70
Tabla 21. Porcentaje de crecimiento de hongo Thm------------------------------------------------70
Tabla 22. Porcentaje de Crecimiento T. rubrum ----------------------------------------------------71
Tabla 23. Resultados ANOVA T. rubrum -----------------------------------------------------------71
Tabla 24. Prueba de Tukey para % Crecimiento T. rubrum ---------------------------------------72
Tabla 25. Resultados % Crecimiento T. mentagrophytes ------------------------------------------73
Tabla 26. Resultados ANOVA T. mentagrophytes -------------------------------------------------74
Tabla 27. Prueba de Tukey para % Crecimiento T. mentagrophytes -----------------------------74
Tabla 28. Resultados Marcha Fitoquímica Extracto Vegetal --------------------------------------76
LISTA DE ILUSTRACIONES
Ilustración 1. Bejuco de Aristolochia pilosa Kunth (Amarun Waska) --------------------------- 8
Ilustración 2. Hoja de Aristolochia pilosa Kunth (Amarun Waska) ------------------------------ 9
Ilustración 3. Flor de Aristolochia pilosa Kunth (Amarun Waska) ------------------------------ 9
Ilustración 5. La piel como blanco de la acción de fármacos -------------------------------------11
Ilustración 6. Tinea corporis con lesiones anulares ------------------------------------------------16
Ilustración 7. Granuloma de Majochii ---------------------------------------------------------------16
Ilustración 8. Tinea incógnita en cara con elementos postulo-costrosos ------------------------17
Ilustración 9. Tinea cruris en área púbica -----------------------------------------------------------17
Ilustración 10. Tinea pedis con presencia descamativa --------------------------------------------18
Ilustración 11. Tinea manuum crónica ---------------------------------------------------------------19
Ilustración 12. Tipos de Tinea unguium (onicomicosis) -------------------------------------------20
Ilustración 13. Tinea capitis donde se aprecia descamación. ------------------------------------21
Ilustración 14. Querion con su típica alopecia donde se aprecian pústulas y costras. ---------21
Ilustración 15. Tinea barbae con inflamación severa ----------------------------------------------22
Ilustración 16. Especies representativas de Trichophyton -----------------------------------------24
Ilustración 17. Estructura funcional de Terbinafina ------------------------------------------------26
xv
Ilustración 18. Acción de Terbinafina al inhibir la síntesis de ergosterol del hongo. ---------28
Ilustración 19. Estructura química de algunos alcaloides -----------------------------------------33
Ilustración 20. Estructura química de algunos flavonoides ---------------------------------------33
Ilustración 21. Estructura química de algunos cardiotónicos -------------------------------------35
Ilustración 22. Estructura química de algunas saponinas ------------------------------------------36
Ilustración 23. Estructura química de algunas cumarinas -----------------------------------------36
Ilustración 24. Estructura química de algunas quinonas -------------------------------------------37
Ilustración 25. Estructura química de algunos taninos ---------------------------------------------38
Ilustración 26. Estructura química de algunos esteroles -------------------------------------------39
Ilustración 27. Equipo de destilación por reflujo ---------------------------------------------------43
Ilustración 28. Marcha fitoquímica preliminar ------------------------------------------------------56
Ilustración 29. Voucher de Aristolochia pilosa Kunth (Amarun Waska) -----------------------65
Ilustración 30. Certificado de identificación botánica de Aristolochia pilosa Kunth (Amarun
Waska) -----------------------------------------------------------------------------------------------------66
Ilustración 31. Prueba de Tukey % Crecimiento vs. Conc. T. rubrum --------------------------73
Ilustración 32. Prueba de Tukey % Crecimiento vs. Conc. T. mentagrophytes ----------------75
LISTA DE ECUACIONES
Ecuación 1. Porcentaje de crecimiento del hongo _________________________________ 55
Ecuación 2. Valor teórico para Tukey __________________________________________ 63
Ecuación 3. Error estándar de las medias _______________________________________ 64
Ecuación 4. Concentración extracto____________________________________________ 67
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Proceso de Obtención del Extracto Vegetal ----------------------------------------------82
Anexo 2. Método de activación de cepas de hongos ------------------------------------------------83
Anexo 3. Método de dilución con suspensión de esporas ------------------------------------------86
Anexo 4. Siembra de la suspensión de esporas en extracto vegetal ------------------------------87
Anexo 5. Crecimiento T. rubrum para cada concentración ----------------------------------------87
Anexo 6. Crecimiento T. mentagrophytes para cada concentración ------------------------------88
Anexo 7. Reacciones Marcha Fitoquímica ----------------------------------------------------------88
xvi
RESUMEN
El presente trabajo de investigación tiene por objetivo evaluar la actividad antimicótica in-
vitro de Aristolochia pilosa Kunth (Amarun Waska) frente a 2 tipos de hongos dérmicos
Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes, para utilizarlo como una alternativa en
las enfermedades presentes en la Comunidad de San Roque – Provincia de Orellana.
Para poder determinar la actividad antimicótica in-vitro de Aristolochia pilosa Kunth
(Amarun Waska), se obtuvieron primeramente 3 extractos con proporciones de solvente
alcohol – agua 70:30 (E1), 60:40 (E2), 50:50 (E3), los cuales presentaron concentraciones de
0,80 mg/ml (C1), 0,91mg/ml (C2), 1,00 mg/ml (C3) respectivamente, posteriormente se
utilizó el Método de Dilución por Suspensión de esporas para obtener el porcentaje de
crecimiento de cada hongo frente a cada concentración de extracto, de donde finalmente se
obtuvo la CMI (concentración mínima inhibitoria) dependiendo del que presentó menos % de
crecimiento.
Los resultados obtenidos tanto para Trichophyton rubrum como para Trichophyton
mentagrophytes para la CMI fue de 1,00mg/ml que pertenece a la C3 de proporción 50:50 de
solvente, ya que en ambos casos el porcentaje de crecimiento del hongo fue menor
comparado con las demás concentraciones de extracto, sin embargo al obtener un valor
mayor al 25% de crecimiento de hongo significa que la inhibición es negativa comparado con
un medicamento sintético (Terbinafina crema 1%), de donde se establece que la fórmula de
mercado sigue siendo la opción de tratamiento para este tipo de enfermedades, sin embargo el
uso de la planta Amarun Waska para la comunidad que la utiliza sigue siendo una buena
opción mientras se accede al respectivo tratamiento medicamentoso.
PALABRAS CLAVES: ACTIVIDAD ANTIMICÓTICA, EXTRACTO, AMARUN
WASKA (Aristolochia pilosa Kunth), INFECCIONES DÉRMICAS, CONCENTRACIÓN
MÍNIMA INHIBITORIA (CMI).
xvii
ABSTRACT
This investigative work aims to evaluate the antifungal activity in vitro of Aristolochia pilosa
Kunth (Amarun Waska) against 2 types of skin fungi Trichophyton rubrum and Trichophyton
mentagrophytes, for use as an alternative to the diseases in the Community San Roque -
Orellana Province.
To determine the antifungal activity in vitro of Aristolochia pilosa Kunth (Amarun Waska),
were first obtained three extracts with solvent proportions of alcohol - water 70:30 (E1),
60:40 (E2), 50:50 (E3) which had concentrations of 0.80 mg / mL (C1), 0,91mg / ml (C2),
1.00 mg / mL (C3) respectively, then used the Dilution Method for Spore Suspension to
obtain the percentage growth of each fungus against each concentration of extract, where
finally the MIC (minimum inhibitory concentration) was obtained depending on who had less
% growth.
The results for both Trichophyton rubrum and Trichophyton mentagrophytes as for CMI was
1,00mg / ml belonging to the C3 of 50:50 solvent, since both cases the percentage of fungus
growth was lower compared with other concentrations of extract, but to get more value to
25% of fungal growth means that inhibition is negative compared to a synthetic drug
(Terbinafine cream 1%) of where it is established that the formula market continues to be the
choice of treatment for this type of disease, however the use of Amarun Waska plant for the
community that uses it is still a good option while accessing the respective drug treatment.
KEYWORDS: ANTIFUNGAL ACTIVITY, EXTRACT, AMARUN WĄSKA (Aristolochia
pilosa Kunth), SKIN INFECTIONS, MINIMUM INHIBITORY CONCENTRATION (MIC).
xviii
ABREVIATURAS
CMI --------------- Concentración Mínima Inhibitoria
mL ----------------- mililitros
ufc ------------------ unidades formadoras de colonias
g --------------------- gramos
mg ------------------- miligramos
µg -------------------- microgramos
Thm ------------------ Trichophyton mentagrophytes
Thr -------------------- Trichophyton rubrum
E1---------------------- Extracto 1
E2 ---------------------- Extracto 2
E3 ---------------------- Extracto 3
C1 ---------------------- Concentración 1
C2 ---------------------- Concentración 2
C3 ---------------------- Concentración 3
1
CAPÍTULO I
1. EL PROBLEMA
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Hasta la década de los cuarenta, el interés por las plantas para el tratamiento sintomático o
etiológico de algunas enfermedades había quedado relegado al campo de la medicina popular,
es decir aquella practicada directamente por el pueblo. Y no es un tema desconocido que
actualmente las personas que viven en el campo sigan utilizando a la naturaleza como medio
para encontrar la salud, la cura para sus enfermedades y porque no decir la prevención de las
mismas (Naranjo P., 1995).
En base a esto, los ancestros se han dejado llevar por conocimientos empíricos o por
tradiciones que van de generación en generación, probando miles de plantas que tienen a su
alrededor y comprobando en muchas de ellas que la cura y/o prevención se puede lograr.
La utilización de plantas medicinales, en las comunidades indígenas de la Amazonía, es
una práctica diaria y el único medio para curar sus enfermedades. En tales circunstancias, es
necesario avalar estos conocimientos ancestrales y difundir sus usos y bondades al resto de
comunidades (Naranjo P., 1995).
Para lograr avalar los conocimientos ancestrales en cuanto a plantas, es necesario probar
las actividades de las mismas, es decir identificar la parte de la planta y los metabolitos que le
dan la característica de ser medicinal.
En nuestro caso, los habitantes de la comunidad de “San Roque” en la Provincia de
Orellana han utilizado la planta Amarun Waska para curar los hongos de la piel en forma
empírica, utilizando cantidades de la planta de acuerdo a como han observado la cura o
mejoría o por los conocimientos que han adquirido de sus ancestros. Lo que busca la
comunidad es explotar en el buen sentido los recursos con los que ellos cuentan,
aprovechando en este caso las plantas y su actividad frente a las enfermedades.
2
Lo que se busca con este trabajo de investigación es establecer la concentración exacta de
dicha planta para eliminar los hongos dérmicos y que posteriormente apoyado en
fundamentos científicos sirva para poder obtener un sustento para dicha comunidad.
1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
El propósito de esta investigación radica en evaluar la actividad antimicótica de
Aristolochia pilosa Kunth (Amarun Waska), en diferentes concentraciones de extracto de la
corteza de la misma, utilizando diferentes tipos de hongos y basándose en la utilización
empírica y ancestral de los habitantes de la comunidad “San Roque” de la Provincia de
Orellana.
Toda esta investigación servirá en un futuro para obtener de alguna manera recursos para
autogestión de la comunidad.
1.3 OBJETIVOS
1.3.1 Objetivo general:
Evaluar la actividad antimicótica de la corteza de Aristolochia pilosa Kunth (Amarun
Waska) procedente de la Comunidad “San Roque” en la provincia de Orellana.
1.3.2 Objetivos específicos:
Colectar e identificar botánica y científicamente Aristolochia pilosa Kunth (Amarun
Waska).
Determinar los metabolitos secundarios presentes en el extracto hidroalcohólico de
Aristolochia pilosa Kunth (Amarun Waska).
Obtener el extracto de diferente proporción de solvente de extracción (70:30, 60:40,
50:50) alcohol – agua y determinar la concentración de cada extracto.
Evaluar la actividad antimicótica de cada extracto hidroalcohólico de Aristolochia
pilosa Kunth (Amarun Waska) para los hongos: Trichophyton rubrum y Trichophyton
mentagrophytes.
3
Establecer la concentración mínima inhibitoria (CMI) de cada extracto de
Aristolochia pilosa Kunth (Amarun Waska) y determinar el más efectivo para cada
tipo de hongo.
Comparar la actividad antimicótica entre el extracto con mejor CMI y una de acción
medicamentosa de referencia presente en una formulación comercial.
1.4 JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA DE LA INVESTIGACIÓN
Gracias a la tradición oral y escrita sobre la medicina popular se sabe que el hombre desde
tiempo inmemorial ha conocido y aprovechado la actividad curativa de un sinnúmero de
hierbas. A pesar de los avances en la producción de la medicina “moderna”, las plantas
medicinales no han perdido su importancia. Por el contrario, el desarrollo de los
medicamentos modernos ha sido resultado de formas cada vez más complejas de aprovechar
las plantas medicinales, y su producción sigue dependiendo en gran parte del uso de plantas
como materia prima (Hoogester, 1994).
En lo que respecta a plantas superiores existen alrededor de una 500 000 en el mundo
dentro de las cuales hoy en día se conoce que solamente un pequeño porcentaje tienen
actividad terapéutica que está comprobada biológica y fitoquímicamente. Estos estudios
adquieren importancia en el ámbito clínico y farmacológico ya que se toma en cuenta a los
principios activos que se encuentran contenidos en la naturaleza y específicamente en las
plantas, lo que resulta también atractivo para las empresas farmacéuticas y los profesionales
ya que se aprovechan los recursos naturales y constituyen una gran ayuda en la terapia
farmacológica (Hoogester, 1994).
Aquellas personas que viven en zonas rurales y que conviven con las plantas han
adquirido a lo largo del tiempo un conocimiento empírico por así decirlo de las propiedades
que las plantas les brindan para diferentes enfermedades propias de cada zona. Se han basado
solamente en evidencias físicas y que se transmiten a través de las generaciones (Hoogester,
1994).
Por esta razón y aprovechando el acceso a estos conocimientos y evidencias de la
comunidad de “San Roque” de la Provincia de Orellana, Aristolochia pilosa Kunth (Amarun
Waska) se convierte en una candidata para reconocer en ella los metabolitos secundarios que
la hacen tener actividad antimicótica y que deseamos comprobar, evaluar la actividad frente a
4
hongos y de qué manera inhibe el desarrollo del hongo in vitro. Además que se trata de una
planta que no posee estudios bibliográficos en cuanto a la actividad frente a hongos dérmicos
y que solamente nos basamos en conocimientos empíricos proporcionados por la comunidad
que nos permite interesarnos en su estudio.
Los países de la región de América Latina se los conoce por poseer una diversidad
biológica grande en el mundo. Existen algunos estudios de compuestos contenidos en plantas
que han sido aislados y han demostrado propiedades antimicóticas, esto es un punto de
partida importante para continuar con la búsqueda de plantas medicinales que favorecen tanto
a la comunidad que vive cercano a ella como a la industria farmacéutica regresando siempre a
lo natural de donde emergió la verdadera farmacia (Hoogester, 1994).
Los hongos han surgido en las últimas dos décadas como principales causas de infecciones
dérmicas humanas, especialmente entre los huéspedes inmunocomprometidos. Producen
micosis invasivas graves en individuos sometidos a trasplantes de órganos o la quimioterapia
antineoplásica. También producen infecciones fúngicas superficiales no sólo en huéspedes
inmunocomprometidos, sino también en individuos sanos, incluidos los niños de los países
menos desarrollados que reciben atención sanitaria deficiente y por ende se disminuye su
calidad de vida (Razzaghi-Abyaneh, 2013).
Los hongos de la piel son bastante frecuentes en zonas húmedas, de poca higiene o en
lugares donde la transpiración es abundante y la ventilación casi nula. Estas enfermedades
son de gran interés a nivel médico y farmacológico. Las micosis superficiales son motivo de
consulta de un sinnúmero de pacientes y las cuales se pueden presentar como leves,
moderadas o graves, razón por lo cual constituye un tema muy importante a ser abordado
(Razzaghi-Abyaneh, 2013).
Según lo citado por Zuluaga (1994), la mayoría de productos medicinales obtenidos
científicamente han tenido como base estudios etnobotánicos, lo que demuestra que la forma
correcta de estudiar las plantas medicinales es preguntar a los campesinos e indígenas
(García Cruzatty, et. al., 2008).
5
CAPÍTULO II
2. MARCO REFERENCIAL O MARCO TEORICO
2.1 ANTECEDENTES
Las plantas medicinales se remontan a épocas prehistóricas, desde cuando la trilogía
médico sacerdote-botánico se convirtió en una unidad. Los conocimientos acerca de las
especies vegetales enervantes y las que alivian dolencias se han convertido en secretos
tribales, que son transmitidos de generación en generación, acrecentados por la intervención
de otras culturas, conformándose una fuente de sabiduría “popular”, no pocas veces
subestimada y hasta ridiculizada por aquellos que no se adentran en el conocimiento de las
propiedades de las plantas (Fraume, 2005).
Las plantas medicinales representan la terapia más antigua en el mundo. Actualmente dos
tercios de la población mundial utilizan fitoterapia. Numerosas medicinas modernas son
obtenidas directamente o en alguna forma alterada de plantas. Mundialmente más de 20 000
diferentes especies de plantas se aplican como hierbas medicinales. El uso terapéutico de las
hierbas se basa en una tradición de larga duración de la medicina popular. En algunos casos,
los medicamentos hechos a base de plantas tradicionales resultaron experimentalmente
mejores que los efectos producidos por medicamentos modernos los cuales sólo se prueban
en ratones o ratas blancas (Roth, 2002).
La región amazónica cubre una superficie de siete millones de kilómetros cuadrados y
contiene el más extenso bosque húmedo tropical en el mundo. Se estima que de 25 000 a 50
000 especies de plantas superiores se encuentran en este territorio, ya que la vegetación
mundial incluye medio millón de plantas, el bosque lluvioso amazónico contiene el 16% del
total del número de especies. La abundancia de la flora se incrementa hacia el oeste del
Amazonas, que incluye un área como la vertiente ecuatoriana. Existen alrededor de 178
plantas listadas por los Kichwas de las riberas del Rio Napo de las cuales se conocen su
botánica, sus nombres vernáculos, preparaciones simples y compuestas y sus precauciones
particulares. Desafortunadamente menos del 50% de estas plantas están identificadas
6
taxonómicamente y no hay información relacionada con las propiedades químicas,
farmacológicas y toxicológicas de las especies identificadas. De estas observaciones es obvio
que el bosque tropical Amazónico del Ecuador representa una fuente rica y relativamente
inexplorada de agentes medicinales potenciales (Tafur, 2005).
A lo largo de la historia ecuatoriana se han realizado muchas investigaciones con respecto
a las plantas y sus usos. Algunas han pretendido proporcionar productos comerciales a un
reino, gobierno o empresa potencial aunque la mayoría se llevaron a cabo para poner el
conocimiento a disposición de la comunidad en general. Estos estudios se han realizado para
rescatar un conocimiento que está en riesgo de perderse, por un afán de documentación de
sitios inexplorados o peculiares, o bien para profundizar en el uso y manejo de especies o
grupos de plantas en las zonas de origen, y con ello, ofrecer mejoras o alternativas de
explotación (De la Torre, et. al., 2008).
Las plantas para tratar infecciones e infestaciones constituyen el 26% del total de especies
medicinales. En esta categoría se incluyen las especies utilizadas para tratar afecciones
causadas por bacterias, virus, hongos, protozoos, platelmintos, nematodos, etc. El uso de
plantas para tratar afecciones fúngicas es común sobre todo en las zonas bajas del Ecuador
occidental y nororiental, el 18% de especies se utilizan para este fin (De la Torre, et. al.,
2008).
La propuesta para el desarrollo de este trabajo de investigación es evaluar la actividad
antimicótica de Aristolochia pilosa Kunth (Amarun Waska), una planta que prácticamente es
desconocida en cuanto a su actividad farmacológica y así validar el uso ancestral que tiene
dicha planta frente a los hongos dérmicos.
2.2 FUNDAMENTO TEÓRICO.
2.2.1 Fundamento Botánico.
AMARUN WASKA
(Aristolochia pilosa Kunth)
7
Nombre científico: Aristolochia pilosa Kunth
Familia: ARISTOLOCHIACEAE
Nombres comunes:
Amarun Waska
Zaragoza
Huancahuisacha
Trogucha (Costa Rica)
Guaco estrella (Costa Rica)
Sinonimia de nombres científicos:
Aristolochia amazonica Ule ex Pilg.
Aristolochia costaricensis (Klotzsch) Duch.
Aristolochia costaricensis var. zamorensis Hieron.
Aristolochia ferruginea Brandegee
Aristolochia haughtiana Hoehne
Aristolochia pannosa Mast.
Aristolochia pilosa var. ligulifera Mast. ex Donn.Sm.
Howardia costaricensis Klotzsch
Howardia pilosa (Kunth) Klotzsch
(IBUNAM:MEXU:OAX1034618", I.d., 2011)
2.2.1.1 DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA Y HÁBITAT:
Las Aristolochiaceae forman parte de la vegetación tropical y subtropical, aunque la
mayor densidad de especies está en la franja tropical (Orlando, 1990).
El límite austral de algunas especies procedentes de Centroamérica se encuentra en
Colombia; otras se extienden hacia el sur, hasta Perú, Ecuador e incluso hasta Argentina,
Bolivia y Paraguay, entre la que destaca Aristolochia pilosa. Los hábitats de estas especies
son bosques húmedos, formaciones subseriales o lugares intervenidos. En Ecuador se la
8
encuentra en las regiones amazónicas mayormente en las Provincias de Napo, Orellana y
Sucumbíos (Orlando, 1990).
2.2.1.2 DESCRIPCIÓN BOTÁNICA:
Se trata de un bejuco delgado con corteza fisurada muy llamativa, con abundante corcho
de color café claro. Flor de color café cerca de los bordes y negro hacia el centro, carnosa,
zigomórfica, con aroma muy desagradable. Delgada liana que trenza, pilosa visible en la
mayoría de las partes (Burgess, et. al., 2004).
a) Vástagos
Las lianas alcanzan hasta 6cm de diámetro, al formarse con el tiempo una capa fisurada de
corteza; los bejucos adquieren poca o ninguna consistencia leñosa y el diámetro del tallo rara
vez supera los 15mm, a pesar que en ocasiones la región basal también se solidifica (Burgess,
et. al., 2004).
Ilustración 1. Bejuco de Aristolochia pilosa Kunth (Amarun Waska)
Fuente: (flickr.com, 2015).
b) Hojas
Hojas alternas, peciolos delgados, de 7cm de largo, láminas ovaladas, agudas en el ápice,
profundamente cordadas en la base, 6-25cm de largo, 5-15cm de ancho (Burgess, et. al.,
2004).
9
Ilustración 2. Hoja de Aristolochia pilosa Kunth (Amarun Waska)
Fuente: (conabio.inaturalist.org, 2015).
c) Flores
Flores solitarias en las axilas, manchado blanco y marrón-púrpura; cáliz se expande como
un globo elipsoide corto de 3cm de largo, cerrada oblicuamente en una campanilla de 2.5cm
de largo, finalmente se abre en una estrecha extremidad con flecos de 1.5 a 2.5cm de largo;
carece de corola; 6 estambres, las antera sésiles. Florecen principalmente de enero a mayo, a
veces más tarde dependiendo de la temporada de lluvias (Burgess, et. al., 2004).
Ilustración 3. Flor de Aristolochia pilosa Kunth (Amarun Waska)
Fuente: (plantsystematics.org, 2015).
10
2.2.1.3 ETNOFARMACOLOGÍA Y MODO DE EMPLEO:
Aristolochia: nombre genérico que deriva de las palabras griegas aristos = "que es útil" y
locheia = "nacimiento", por su antiguo uso como ayuda en los partos. Sin embargo, según
Cicerón, la planta lleva el nombre de un tal "Aristolochos", que a partir de un sueño, había
aprendido a utilizarla como un antídoto para las mordeduras de serpiente
(biovirtual.unal.edu.co, 2015).
La Aristoloquia se llamó así por parecer que a las mujeres socorría en el parto. Se lo utiliza
para contrarrestar el daño de las serpientes y de cualquier veneno mortífero si se bebe un
extracto de las hojas con vino y se aplica también un emplasto en la piel
(biovirtual.unal.edu.co, 2015).
Es de gran ayuda en el parto. Realizando una bebida con pimienta y la sustancia resinosa
que expele el tronco de la planta, ayuda a la criatura a salir del vientre de la madre
(biovirtual.unal.edu.co, 2015).
La decocción de la raíz se usa en medicina popular como tratamiento para la mordedura de
culebra (biovirtual.unal.edu.co, 2015).
En la Amazonía Ecuatoriana Aristolochia pilosa más conocida como Amarun Waska, se la
utiliza para el tratamiento y en ocasiones la cura de hongos de la piel (Comunicación
Personal - Cirilo Capinoa, 2015).
Modo de uso popular: Cocinar 2 gajos o porciones de bejucos, es decir entre 6 a 10
trozos del bejuco de la planta, hasta hervir (Comunicación Personal - Cirilo Capinoa, 2015).
Se obtiene una sustancia amarillo-verdosa y la persona se baña con esta preparación 3
veces al día durante una semana en caso de que el hongo se encuentre bien avanzado y la
lesión sea grave. La preparación sirve para dos o tres baños. (Comunicación Personal - Cirilo
Capinoa, 2015).
Para los niños es muy fuerte y tóxico. (Comunicación Personal - Cirilo Capinoa, 2015).
11
2.2.2 FUNDAMENTO FARMACOLÓGICO
2.2.2.1 LA PIEL
La piel desempeña innumerables funciones esenciales como protección, termorregulación,
reactividad inmunitaria, síntesis bioquímica, detección sensorial y comunicación social y
sexual. Las estrategias para corregir la disfunción de cualquiera de estas actividades pueden
basarse en el uso de agentes químicos que se administren por vías sistémica, intralesional o
tópica y agentes físicos a los que se puede exponer la piel, incluidas radiaciones ultravioletas
y ionizantes (Goodman & Gilman, 2006).
2.2.2.2 ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LA PIEL
La piel hace las veces de una barrera bimodal que evita lo mismo la absorción de agua y
electrolitos que su pérdida. La barrera reside en la capa más externa de la epidermis, que es el
estrato córneo, según lo denotan los índices casi iguales de penetración de sustancias
químicas por el estrato córneo aislado o por toda la piel. Los corneocitos en dicho estrato no
son viables porque perdieron su núcleo y sus organelos citoplasmáticos. Las células son
aplanadas y los queratinocitos fibrosos están alineados en macrofibras unidas por puentes de
disulfuro, vinculadas con la filagrina, que es el principal componente proteínico del gránulo
de queratohialina. (Ver Ilustración 4) (Goodman & Gilman, 2006).
Ilustración 4. La piel como blanco de la acción de fármacos
Fuente: (Goodman & Gilman, 2006).
12
A partir de los enlaces de involucrina y queratohialina cada célula produce una cubierta
cornificada, un exoesqueleto insoluble, que brinda un soporte rígido a los filamentos de
queratina interna. Los espacios intracelulares están llenos de lípidos hidrófilos en disposición
laminar, provenientes de los gránulos que revisten la membrana. La combinación de células
hidrófilas cornificadas, dentro del material intracelular hidrófobo, opone una barrera contra
sustancias hidrófilas e hidrófobas por igual. En las enfermedades de la piel, la epidermis
engrosada puede reducir aún más la penetración de agentes farmacológicos por la dermis
(Goodman & Gilman, 2006).
2.2.2.3 PREPARADOS TÓPICOS
Las moléculas penetran la piel por tres vías: por el estrato córneo intacto, por los
conductos sudoríparos y por los folículos sebáceos. El estrato córneo comprende más del
99% de toda la superficie cutánea que puede usarse para la absorción percutánea. El paso por
dicha capa externa es una fase cineticolimitante de esta forma de absorción. Las principales
etapas de este fenómeno son el establecimiento de un gradiente de concentración que genera
la fuerza impulsadora para que el fármaco se desplace a uno y otro lado de la piel; la
liberación del fármaco desde el vehículo (coeficiente de partición) y la difusión del producto
medicamentoso a través de las capas de la piel (coeficiente de difusión) (Goodman & Gilman,
2006).
2.2.2.4 ENFERMEDADES MICÓTICAS DE LA PIEL Y LAS UÑAS
La piel es más susceptible a los microorganismos que pueden resistir presiones osmóticas
altas y humedad baja. Por ende, no resulta sorprendente que los hongos ocasionen varios de
los trastornos de la piel. Toda infección por hongos del cuerpo se denomina micosis (Ordi,
2012).
A efectos terapeúticos resulta útil clasificar las infecciones por hongos en cutaneomucosas,
y profundas o sistémicas (Ordi, 2012).
Las micosis cutaneomucosas pueden subdividirse en:
13
a) Dermatofitosis o tiñas, producidas por diversas especies de hongos: Epidermophyton,
Trichophyton y Microsporum (Flórez, 2008).
b) Candidiasis cutaneomucosas o superficiales, producidas por varias especies del
género Candida: Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida pseudo-tropicalis,
etc., siendo sin duda Candida albicans la cultivada con mayor frecuencia. La infección
por Candida puede aparecer en cualquier localización, pero su incidencia es mayor en
diversas mucosas (orofaríngea, esofágica, vaginal, rectal, etc.); es especialmente
importante la candidiasis cutaneomucosa, que afecta sobre todo a pacientes
inmunodeprimidos o debilitados (Flórez, 2008).
En general las micosis superficiales se trata con antimicóticos de aplicación tópica, pero si
están producidas por algunos hongos más resistentes, o afectan al pelo o las uñas o a
pacientes de riesgo, pueden exigir la administración prolongada de fármacos por vía
sistémica, por ejemplo: griseofulvina, o derivados imidazólicos o terbinafina por vía oral
(Flórez, 2008).
Las micosis profundas, sistémicas o invasivas son causadas por diferentes hongos, entre
los que destacan: Aspergillus, Candida, Cryptococcus, Histoplasma, Blastomyces,
Coccidioides y Paracoccidioides y Mucor. La frecuencia de muchos de ellos está en aumento
debido al crecimiento de poblaciones inmunodeprimidas. Estos hongos penetran en el
organismo en general por vía respiratoria o mucocutánea (esto último es característica de
Candida spp.) y posteriormente se pueden diseminar por vía sanguínea a otros órganos. Los
hongos productores de cromomicosis y esporotricosis penetran en el organismo por la piel y
se extienden a los tejidos próximos. Todas estas formas de micosis requieren tratamiento con
antifúngicos por vía sistémica (Flórez, 2008).
Es importante señalar el incremento en el número de infecciones de cualquier localización
producidas por hongos y su gravedad. Esto se debe fundamentalmente: a) al uso creciente de
fármacos inmunosupresores en el tratamiento del cáncer, enfermedades hematológicas y en la
prevención del rechazo en los trasplantes de órganos; b) la existencia de enfermedad asociada
a déficit inmunitario (como el sida), y c) la utilización de antibióticos de amplio espectro
durante períodos prolongados. Además, las infecciones sistémicas por hongos, como ocurre
con muchas infecciones bacterianas, se ven favorecidas por las múltiples vías de entrada
generadas por la moderna diagnóstica y terapéutica (Flórez, 2008).
14
Generalmente, las enfermedades que se producen en la piel son debidas a infecciones.
Estas infecciones pueden ser bacterianas, víricas, fúngicas o parasitarias. Determinadas
personas representan un grupo de riesgo para contraer infecciones en la piel, como por
ejemplo los diabéticos, sobre todo en las manos y en los pies debido a la falta de irrigación
cutánea, personas con el grupo inmunológico deprimido, las pieles dañadas por los efectos
del sol, pieles con rascaduras, etc. La desnutrición, las enfermedades que debilitan a la
persona y una higiene defectuosa son factores que predisponen a sufrir micosis superficiales
(Guardeño, 2004).
2.2.2.4.1 MICOSIS CUTÁNEAS
Los hongos que colonizan al pelo, las uñas y la capa exterior (estrato córneo) se denomina
dermatofitos y crecen en la queratina que se halla en esos sitios. Las infecciones por hongos
reciben el nombre de dermatomicosis, las que se conocen de manera informal como tineas
(Suárez, 2013).
Las dermatofitosis o tineas están causadas por un grupo de hongos miceliales, los
dermatofitos, que invaden los tejidos queratinizados. La prevalencia de dermatofitosis es muy
alta, aunque no se conoce exactamente, y la incidencia de las distintas especies varía según
las áreas geográficas (Lorenzo, et. al., 2004).
Con relación a la edad y al sexo, también ocurren variantes importantes; la tinea corporis,
por ejemplo, es más frecuente en niños, en tanto que la tinea cruris predomina en hombres
adultos. La ocupación también puede ser un factor a considerar, así la tinea barbae es más
frecuente entre granjeros y veterinarion y la tinea pedis entre militares y deportistas como los
nadadores y atletas. Aunque las tineas se presentan en individuos inmunocompetentes, su
frecuencia aumenta en inmunosuprimidos y atópicos y algunas formas clínicas se asocian con
fallas anatómicas y la edad avanzada. Otros factores que favorecen su incidencia son el
hacinamiento (aglomeración), la maceración de los tejidos, la humedad, el calor, la oclusión y
los microtraumas repetidos (Arango, 2003).
Algunas de las especies de dermatofitos tienen un hábitat geofílico, otras zoofílico y otras
antropofílico; todas, sin embargo, muestran tendencia a asociarse con la queratina del hombre
y animales. Causan enfermedades comunicables, adquiridas a partir del contacto con
pacientes o animales contaminados, siendo las artroconidias y las clamidoconidias las
15
estructuras micóticas más asociadas con la infección, dada su resistencia a factores
ambientales (Arango, 2003).
Las lesiones características de las tineas son el resutado conjunto de la invasión del estrato
córneo por el hongo, la liberación de sus productos metabólicos, algunos con propiedades
antigénicas y enzimáticas (queratinasas, colagenasas, elastasas), así como de la respuesta
inflamatoria del hospedero, expresada en la epidermis y la dermis. En las dermatofitosis
también es frecuente observar reacciones alérgicas que se manifiestan a distancia, las
llamadas dermatofitides; estas lesiones son estériles y suelen presentarse como vesículas
pruriginosas o áreas de descamación semejantes a otras enfermedades dermatológicas como
la dishidrosis, dermatitis de contacto o la tinea misma (Arango, 2003).
Esta reacción aunque se presentan con mayor frecuencia en las manos, puede darse en
cualquier parte de la piel. Las lesiones se presentan en piel glabra o lampiña (tinea corporis),
en el ángulo interno del muslo (tinea cruris), en las uñas (tinea unguium), pies y manos (tinea
pedis y tinea manumm), en cabello (tinea capitis) y en barba (tinea barbae) (Arango, 2003).
a) Tinea corporis
En la piel glabra o lampiña, las lesiones son anulares, de bordes infiltrados y definidos,
secas, descamativas y eritematosas (Ver Ilustración 5); puede además, presentar vesículas,
pápulas y costras. A medida que la infección progresa, el centro se vuelve inactivo; si las
lesiones son múltiples, pueden unirse y formar un “mapa”. En las áreas de pliegues las
lesiones son continuas, en placas, pero retienen las características descritas, excepto el centro
limpio y adicionalmente, la humedad del lugar y la respuesta del hospedero puede hacer
variar su aspecto (Arango, 2003).
La tinea corporis puede dar lesiones atípicas difíciles de reconocer, así por ejemplo, el
algunos pacientes el hongo invade el tejido subcutáneo con formación de granulomas y senos
de drenaje (seudomicetoma). En otros, hay invasión perifolicular con penetración al plano
subcutáneo y formación de lesiones elevadas, pustulares y costrosas. Algunas de ellas son de
carácter crónico y se conocen como granuloma de Majochii (Ver Ilustración 6). Puede
presentarse una foliculitis nodular en las piernas, más en mujeres que se depilan; el hongo
penetra el folículo piloso y se forman nódulos, la piel adyacente está gruesa, seca,
descamativa y enrojecida. En pacientes con defectos de la inmunidad celular, la tinea
16
corporis reviste aspectos bizarros, con lesiones exentas que adoptan el aspecto de pápulas,
pústulas, siendo mínimos el eritema y la descamación. Finalmente el uso de corticoides puede
inducir cambios en el aspecto de la micosis, fenómeno que se conoce como “tinea incógnita”
(Ver Ilustración 7) (Arango, 2003).
Ilustración 5. Tinea corporis con lesiones anulares
Fuente: (Arango, 2003).
Ilustración 6. Granuloma de Majochii
Fuente: (Arango, 2003).
17
Ilustración 7. Tinea incógnita en cara con elementos postulo-costrosos
Fuente: (Arango, 2003).
b) Tinea cruris
Corresponde a la infección por dermatofitos localizada en el ángulo superior e interno del
muslo, la cual puede extenderse a todo el muslo, a las áreas púbica, perianal y, rara vez, al
escroto y pene. (Ver Ilustración 8). La lesión consiste en una placa rojiza o de color marrón,
de límites definidos y bordes más o menos levantados, algunas veces con vesículas y
vesiculopústulas; en casos crónicos las áreas infectadas son secas y cubiertas de escamas
finas. El prurito y el ardor son los síntomas más frecuentes (Arango, 2003).
Ilustración 8. Tinea cruris en área púbica
Fuente: (Arango, 2003).
18
c) Tinea pedis
A menudo esta dermatofitosis del pie empieza en los espacios interdigitales, los cuales
aparecen secos, descamativos y con fisuras; sin embargo en algunos casos hay humedad,
maceración, y base eritematosa, tal como si se tratara de una candidiasis. (Ver Ilustración 9).
La lesión, de evolución usualmente crónica, puede extenderse a la superficie de los dedos, a
las plantas y al dorso del pie, donde se presentan áreas de descamación fina o gruesa. En el
compromiso agudo se producen múltiples vesículas o lesiones ampollosas ubicadas en el
reverso de los dedos así como en la zona media plantar; estas lesiones son pruriginosas y al
abrirse, descargan un líquido tipo linfa que al secarse, dejan zonas circulares de color marrón
provistas de una capa córnea gruesa (hiperqueratoris). También puede presentarse lesiones
eczematoides, vesiculopustulares, éstas últimas generalmente contaminadas con bacterias. La
tinea pedis puede ser bilateral o unilateral; ser la única manifestación de tinea o coincidir con
onicomicosis o tinea cruris (Arango, 2003).
Ilustración 9. Tinea pedis con presencia descamativa
Fuente: (Arango, 2003).
d) Tinea manuum (tinea de manos)
Esta dermatofitosis es menos frecuente que la tinea pedís a la cual se asemeja en apariencia;
la forma más frecuente es la crónica en la que ocurre hiperqueratosis difusa de palmas, dedos
y dorso. (Ver Ilustración 10). En el dorso, las lesiones también pueden ser anulares como las
19
descritas para la tinea corporis; en la tinea manuum predomina la localización unilateral
(Arango, 2003).
Ilustración 10. Tinea manuum crónica
Fuente: (Arango, 2003).
e) Tinea unguium (onicomicosis)
Las infecciones micóticas de las uñas (onicomicosis), son responsables hasta del 50% de los
desórdenes ungueales. Pueden ser producidas por dermatofitos, levaduras o mohos de origen
ambiental o vegetal. En la onicomicosis de las manos, más prevalente en mujeres, son las
levaduras los agentes más implicados. Cuando se localizan en los pies son los hombres los
más afectados y los dermatofitos la causa más frecuente, por lo que puede hablarse de tinea
unguium (Arango, 2003).
La frecuencia de este tipo de tinea se incrementa con la edad, microtraumas repetidos,
oclusión, humedad y maceración, tinea pedís, alteraciones del drenaje linfático y venoso,
diabetes e inmunosupresión. Esta es la más crónica de las tineas y la de más difícil manejo
terapéutico. Según el sitio de implantación del dermatofito y la respuesta del hospedero, las
lesiones ungueales pueden ser clasificadas en cuatro categorías:
Onicomicosis subungueal distal: es la más frecuente y crónica; en ella el hongo invade la
zona distal del lecho ungueal comprometiendo la epidermis y, secundariamente, la parte
ventral de la lámina. La reacción inflamatoria resulta en hiperqueratosis, lo que provoca el
levantamiento y a veces, el desprendimiento de la uña. (Ver Ilustración 11). Inicialmente la
lámina se encuentra conservada, pero luego se torna opaca, pierde su textura y se pigmenta
20
(amarilla, café, negra, verdosa), a la vez que se engrosa, distorsiona o erosiona con estrías,
canales y excavaciones. El compromiso puede ser uni o bilateral y una o varias uñas pueden
estar infectadas. La lesión progresa lentamente hacia la zona proximal (Arango, 2003).
Onicomicosis proximal subungueal: rara vez producida por dermatofitos, se inicia con el
crecimiento del hongo en el estrato córneo de la piel del pliegue ungueal con invasión
posterior del lecho y la porción proximal ventral de la placa ungueal. (Ver Ilustración 11).
Hay edema y eritema de los pliegues y la lesión progresa lentamente hacia el área lateral y
distal de la uña (Arango, 2003).
Onicomicosis superficial blanca: es aquella en la cual el hongo invade directamente la
superficie de la uña, dando la apariencia de pequeños islotes blanquecinos sobre la placa
ungueal (Ver Ilustración 11) (Arango, 2003).
Ilustración 11. Tipos de Tinea unguium (onicomicosis)
Fuente: (Arango, 2003).
f) Tinea capitis
Es la variedad clínica más frecuente en la infancia y rara en el adulto. Se reconocen cuatro
presentaciones clínicas: placa gris, puntos negros, que guardan relación no sólo con la
respuesta inflamatoria del hospedero, sino también con la especie del hongo y el tipo de
invasión causada. Se adquiere por contacto con personas enfermas o animales (Arango,
2003).
21
En general, en el cuero cabelludo las artroconidias del hongo germinan y dan lugar a la
formación de hifas. Las lesiones se inician como una pápula eritematosa alrededor del
folículo piloso, con penetración del hongo al folículo e invasión posterior de la vaina del
cabello que llega hasta la corteza desde la zona queratinizada del bulbo y se extiende a lo
largo del cabello a medida que éste crece. Cuando la lesión permanece en el interior del
cabello se denomina endótrix y los límites externos del cabello se ven conservados. Muchos
de los agentes de tinea capitis pueden crecer desde el interior al exterior del pelo, causando el
tipo de invasión endo-ectótrix, alterando tanto el interior como el exterior del cabello. A
medida que el proceso avanza centrífugamente, en el cuero cabelludo se forman parches
desprovistos de cabello (Ver Ilustración 12), que son de bordes lisos o levantados y donde
pueden aparecer vesículas, pústulas y costras. El área afectada se torna descamativa y el
cabello pierde su brillo, se fractura a pocos milímetros de la superficie del folículo, dejando
áreas de calvicie (alopecia), generalmente transitoria (Ver Ilustración 13) (Arango, 2003).
Ilustración 12. Tinea capitis donde se aprecia descamación.
Fuente: (Arango, 2003).
Ilustración 13. Querion con su típica alopecia donde se aprecian pústulas y costras.
Fuente: (Arango, 2003).
22
Existe otra manifestación infrecuente de la tinea capitis conocida como favus, la que se
caracteriza por lesiones cubiertas con grandes costras amarillentas, alopecia permanente y
mal olor; este proceso es crónico, de años y afecta tanto a niños como a adultos (Arango,
2003)
g) Tinea barbae
Esta micosis se caracteriza por presentar descamación, eritema, foliculitis y en los casos más
agudos, por inflamación severa que lleva a la formación de nódulos eritematosos con
foliculitis pustulosa, exudativa y formación de costras; hay compromiso del vello. (Ver
Ilustración 14). Las lesiones son semejantes a las observadas en la tinea capitis inflamatoria
(Arango, 2003).
Ilustración 14. Tinea barbae con inflamación severa
Fuente: (Arango, 2003).
2.2.2.5 TIPOS DE HONGOS DÉRMICOS
En la micosis cutánea intervienen tres géneros de hongos:
Tricophyton puede infectar el pelo, la piel y las uñas,
Microsporum suele comprometer sólo el pelo y la piel.
Epidermophyton afecta sólo la piel y las uñas (Suárez, 2013).
23
Se detallarán únicamente el primer género ya que es el único que interviene en esta
investigación y dentro del cual los tipos: Trichopython rubrum y Trichophyton
mentagrophytes.
a) TRYCHOPHYTON
Los organismos de este género pueden infectar la piel, el pelo y las uñas. Las
enfermedades más comunes son tinea pedis (pie de atleta) y tinea unguium (infección de las
uñas), y menos comúnmente, tinea barbae (dermatofitosis de la piel de la cara en las
personas barbadas). Las principales especies son: Tricophyton mentagrophytes, Tricphyton
rubrum, Tricophyton tonsurans, Tricophyton schoenleiniti y Tricophyton violaceum (Suárez,
2013).
Tricophyton mentagrophytes es la causa más común del pie de atleta. También puede
infectar el pelo y producir luego artrosporas fuera del tallo capilar. Al microscopio se ven
numerosos microconidios pequeños, esbeltos, alargados, al lado de las hifas. Dependiendo de
la cepa, también se forman unos cuantos, o muchos, macroconidios de paredes delgadas y de
formas que varían entre la de un basto de naipes, hasta la de un huso, y septados. Tricphyton
mentagrophytes crece rápidamente, produciendo usualmente colonias blancas algodonosas,
pero también se presentan cepas rugosas o burdas granulares, especialmente de fuentes
animales. El micelio vegetativo es usualmente de color pardo claro, pero puede también ser
anaranjado claro o bien obscuro (Suárez, 2013).
Tricophyton rubrum es una causa menos común de micosis en la piel. Rara vez invade el
cabello, pero también permanece como Ectothrix (fuera del cabello) cuando lo hace. Pueden
verse microconidios del largo de las hifas, pero los macroconidios con forma peculiar de
basto de naipes, y extremo romo, son más característicos. Crecen lentamente, en colonias
planas o amontonadas, con una superficie blanca, algodonosa y un micelio vegetativo que va
desde el pardo rosáceo hasta un rojo profundo o púrpura obscuro (Suárez, 2013).
24
Ilustración 15. Especies representativas de Trichophyton
Fuente: (slideshare.net, 2015).
2.2.2.6 DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES MICÓTICAS
El diagnóstico se confirma mediante examen directo y cultivo de una muestra de la zona
afectada (Suárez, 2013).
El examen directo consiste en observar al microscopio la muestra obtenida del paciente en
búsqueda de hifas. En las tiñas de piel lampiña se debe realizar un raspado del borde activo
de la lesión, para la tiña de la cabeza se deben obtener pelos parasitados por medio del
raspado o con pinzas y en el caso de la onicomicosis se obtiene material de la hiperqueratosis
subungueal con ayuda de una hoja de bisturí (Vélez, et. al.,2009).
Una vez obtenida la muestra, se toma una porción de la misma, se coloca en un
portaobjetos y se añade hidróxido de potasio al 10% o 20%, se espera unos minutos a que se
clarifique (este proceso puede acelerarse calentando ligeramente la laminilla) y se coloca en
el microscopio. Las hifas se observan como estructuras tubulares de longitud variable, con
diámetro y borde regular, exhiben refringencia y pueden verse ramificadas o agrupadas. Para
facilitar su visualización puede agregarse un colorante llamado negro de clorazol que tiñe
parcialmente las hifas de color oscuro. Deben distinguirse de artefactos como hilos, cristales
o mosaicos originados por depósitos de lípidos entre las escamas (Vélez, et. al.,2009).
La identificación del agente causal depende de la morfología macro y microscópica de la
colonia a partir del cultivo. Desafortunadamente la tasa de crecimiento de los cultivos no es
muy alta (30-50%) por lo que la baja sensibilidad no permite excluir el diagnóstico a partir de
un cultivo negativo. El medio de cultivo ideal para las dermatofitosis es un agar de Sabouraud
al que se adiciona cloranfenicol para impedir el crecimiento de bacterias además de
25
cicloheximida que limita el crecimiento de hongos contaminantes. El medio DTM tiene un
colorante que vira a rojo ante la presencia de metabolitos de los dermatofitos, sólo indica su
presencia, mas no permite distinguir entre las diferentes especies. El agar papa estimula las
formas de reproducción y por ellos facilita posteriormente su identificación (Vélez, et.
al.,2009).
2.2.2.7 TRATAMIENTO DE LAS ENFERMEDADES MICÓTICAS
Aunque no hay consenso en cuanto a las pautas de tratamiento, suelen emplearse
antifúngicos tópicos en las tiñas del cuerpo con escasas lesiones y en el pie de atleta; en los
demás casos, conviene prescribir fármacos por vía oral (Suárez, 2013).
Los antimicóticos pueden ser utilizados tanto por vía tópica como sistémica. La decisión
de utilizar uno u otro depende del sitio y extensión de la afección, condición general del
paciente, adherencia al tratamiento e incluso la comodidad para el paciente y el costo (Vélez,
et. al.,2009).
2.2.2.8 ANTIMICÓTICOS
Introducción
Los antimicóticos se describen dentro de dos categorías principales: sistémicos y tópicos,
aunque esta distinción es bastante arbitraria (Goodman & Gilman, 2006).
En los últimos años el número de antimicóticos ha crecido notablemente. Los azoles han
dominado tanto el desarrollo de los antimicóticos como su aplicación clínica (Goodman &
Gilman, 2006).
El tratamiento local es útil en muchas micosis superficiales, es decir, las que se hallan
limitadas al estrato córneo y la mucosa plana estratificada (escamosa); las enfermedades en
cuestión incluyen dermatofitosis (tineas); candidiasis, tinea versicolor, tinea negra y
queratitis micótica. La aplicación local de los antimicóticos casi nunca brinda buenos
resultados en las micosis de las uñas (onicomicosis) y del cabello (tinea capitis), y no genera
utilidad alguna para combatir las micosis subcutáneas, como la esporotricosis y la
cromoblastomicosis. La eficacia de los compuestos de aplicación local en las micosis
26
superficiales depende no sólo del tipo de lesión y el mecanismo de acción del fármaco, sino
también de la viscosidad, el carácter hidrófobo y la acidez del preparado medicamentoso. Sea
cual sea la fórmula, suele ser pequeña la penetración de los productos de aplicación local en
lesiones hiperqueratósicas. A veces un complemento eficaz es eliminar la queratina gruesa
infectada (Goodman & Gilman, 2006).
Las pomadas son de difícil manejo y demasiado ocluyentes para lesiones intertriginosa
maceradas o con grietas. El empleo de polvos o talcos aplicados mediantes recipientes con
tapa con criba o aerosoles se limita más bien a los pies y lesiones húmedas de la ingle y otras
zonas intertriginosas (Goodman & Gilman, 2006).
2.2.2.8.1 TERBINAFINA
a) Descripción:
Es una alilamina sintética, similar desde el punto de vista estructural al fármaco que se
administra por vía tópica, naftifina (Goodman & Gilman, 2006).
b) Estructura:
La Terbinafina presenta la siguiente estructura:
Ilustración 16. Estructura funcional de Terbinafina
Fuente: (Goodman & Gilman, 2006).
27
c) Clasificación ATCC
D Dermatológicos
D01 ANTIFÚNGICOS PARA USO DERMATOLÓGICO
D01A ANTIFÚNGICOS PARA USO TÓPICO
D01AE Otros preparados antifúngicos para uso tópico
D01AE15 Terbinafina
Forma farmacéutica: Semisólido cutáneo
C*: 1%
Fuente: (CNMB, Ministerio de Salud Pública, 2013).
d) Mecanismo de acción
Probablemente su mecanismo de acción es inhibir a la epoxidasa de escualeno micótica,
bloqueando la biosíntesis de ergosterol (Goodman & Gilman, 2006).
Los antifúngicos con estructura de alilamina ejercen su efecto antimicótico, interfiriendo
con la biosíntesis del esterol al inhibir la enzima esqualeno-monooxigenasa. La acumulación
de esqualeno en la membrana de la célula debilita la membrana de los hongos sensibles.
Además, la inhibición de la monooxigenasa ocasiona una deficiencia de ergosterol, un
componente de la membrana de los hongos, necesario para su crecimiento (Flórez, 2008).
Es pues, una acción anterior a la de los imidazoles dentro de la misma cadena de síntesis
del ergosterol. A diferencia de éstos, tiene escasa afinidad por el citocromo P450, por lo que
no interfiere es la síntesis de hormonas esteroideas (Flórez, 2008).
28
Ilustración 17. Acción de Terbinafina al inhibir la síntesis de ergosterol del hongo.
Fuente: (Goodman & Gilman, 2006).
e) Constantes Farmacocinéticas:
Tabla 1. Constantes farmacocinéticas Terbinafina
Constante Valor
Biodisponibilidad oral Oral: 40%. Aumenta en 20% con comida.
Unión a proteínas 99%. Disminuye en 40% en hígado
Vida media de eliminación 36h
Clearance < 50 ml/min
Volumen de distribución > 2,00L/Kg
Concentración máxima 0.97 mg/mL después de 2h (oral)
Metabolismo hepático 10 – 15%
Excreción urinaria 70%
Realizado por: Viviana Carrillo
Fuente: (Goodman & Gilman, 2006).
f) Propiedades Farmacocinéticas
Aunque este antifúngico se une en gran medida a las proteínas del plasma, se distribuye
ampliamente por todo el organismo, incluyendo los cabellos, las uñas y el sistema nervioso
central. A las 24 horas de iniciarse un tratamiento la terbinafina ya es detectable en el estrato
29
córneo y después de 2 semanas de tratamiento, su acumulación es tal que se encuentran
concentraciones significativas del fármaco en la piel durante 2 o 3 meses (Goodman &
Gilman, 2006).
El fármaco puede encontrarse en el plasma durante cuatro a ocho semanas después de
tratamiento prolongado (Goodman & Gilman, 2006).
La terbinafina se puede administrar por vía oral y tópica. La absorción sistémica desde una
aplicación tópica es muy variable dependiendo del lugar de la aplicación y del estado de la
piel. En muchos de los pacientes, los niveles plasmáticos de terbinafina o de su metabolito
son indetectables después de una administración tópica. La absorción de la terbinafina a
través de la piel es entre 37 y 40 veces menos que después de una dosis oral (Goodman &
Gilman, 2006).
El fármaco se puede detectar en las uñas hasta 90 días después de interrumpir el
tratamiento. La mayor parte de la terbinafina es metabolizada por oxidación e hidrólisis,
conociéndose 5 metabolitos, todos ellos inactivos. El más importante es la N-
desmetilterbinafina que supone el 10-15% de la dosis (Goodman & Gilman, 2006).
g) Interacciones
Las formulaciones tópicas de terbinafina se absorben muy poco a través de la piel, no
siendo de temer interacciones significativas con otros fármacos (Goodman & Gilman, 2006).
Tabla 2. Interacciones de la Terbinafina
Fármaco o sistema
de interacción
Interacción
Isoenzima CYP2D6 Inhibe su sistema enzimático hepático y el aclaramiento de
fármacos que se metabolizan por este sistema.
Cafeína y Teofilina Reducción de aclaramiento en 19% y 14% respectivamente.
Ciclosporina Aumenta el aclaramiento
Galantamina Aumenta la biodisponibilidad y por ende el efecto colinérgico
(náuseas, vómitos)
Rifampicina Aumenta el aclaramiento en 100%
Cimetidina Reduce el aclaramiento en 33%
Realizado por: Viviana Carrillo
Fuente: (Katzung, 2004).
30
h) Reacciones adversas
Las formulaciones tópicas de terbinafina son bien toleradas. En los estudios clínicos
realizados, solo se detectaron reacciones adversa posiblemente asociadas a la terbinafina en el
2% de los casos. Los casos más frecuentes fueron irritación y urticaria, efectos secundarios
que se presentaron en un 1% (Katzung, 2004).
Después de la administración de la terbinafina oral, se han descrito reacciones adversas
hasta en el 17% de los pacientes. Las más frecuentes son las que tienen lugar a nivel intestinal
estando representadas por dolor abdominal, diarrea, náusea/vómitos y dispepsia. En el 2-3%
de los pacientes se han observado cefaleas y mareos y, en el mismo porcentaje, elevación de
las transaminasas, rash (inespecífico), urticaria y prurito (Katzung, 2004).
i) Contraindicaciones
Está contraindicada en pacientes que hayan mostrado hipersensibilidad al fármaco o a
alguno de los componentes de su formulación. El uso de la terbinafina ha estado
ocasionalmente asociado al síndrome de Stevens-Johnson. Si se observa irritación de la piel,
rash o hipersensibilidad durante un tratamiento con terbinafina, el fármaco debe ser
inmediatamente suspendido (Katzung, 2004).
No se recomienda la administración de terbinafina durante la lactancia. Después de la
administración oral, las concentraciones de este fármaco en la leche son 7 veces más elevadas
que en el plasma. Tampoco se aconseja el uso tópico de la terbinafina durante la lactancia,
dado que el fármaco puede concentrarse en la leche materna (Katzung, 2004).
j) Indicaciones
El tratamiento local es útil en muchas micosis superficiales, es decir, las que se hallan
limitadas al estrato córneo y la mucosa plana estratificada (escamosa); las enfermedades en
cuestión incluyen dermatofitosis (tinea corporis, tinea cruris, tinea manuum, tinea unguium);
candidiasis. La aplicación local de los antimicóticos casi nunca brinda buenos resultados en
las micosis de las uñas (onicomicosis) y del cabello (tinea capitis), y no genera utilidad
alguna para combatir las micosis subcutáneas, como la esporotricosis y la
cromoblastomicosis. La eficacia de los compuestos de aplicación local en las micosis
superficiales depende no sólo del tipo de lesión y el mecanismo de acción del fármaco, sino
también de la viscosidad, el carácter hidrófobo y la acidez del preparado medicamentoso
(Goodman & Gilman, 2006).
31
k) Posología y vías de administración
Administración tópica:
La crema o aerosol de terbinafina al 1% se aplica dos veces al día y es eficaz en las tiñas
corporal, crural y de los pies; es menos activa contra especies de Candida y Malassezia
furfur, pero la crema también puede utilizarse en candidiasis cutánea y tinea versicolor. En
estudios en Europa, al parecer la terbinafina oral pudo combatir la dermatofitosis y algunos
casos de onicomicosis (Goodman & Gilman, 2006).
Administración oral
• Se emplea por vía oral, a la dosis de 250 mg/día durante 2-4 semanas para tinea
corporis/cruris y candidiasis cutánea, 2- 6 semanas para tinea pedís, 1,5 – 12 meses para
micosis de uñas. Para el tratamiento de la tiña del cuero cabelludo, se han sugerido dosis de
250 mg una vez al IIa durante 1 a 4 semanas (Flórez, 2008).
2.2.3 ANÁLISIS FITOQUÍMICO
Un gran porcentaje de los principios activos de plantas está comprendido dentro de los
llamados Productos Naturales o Metabolitos Secundarios, que son compuestos químicos de
estructura relativamente compleja y de distribución más restringida y más característica de
fuentes botánicas específicas, que los llamados metabolitos primarios; estos están
universalmente distribuidos y participan en la actividad celular de todo ser viviente. De los
primeros, Productos Naturales o Metabolitos Secundarios, podemos decir que son
indispensables en las plantas; no intervienen o quizás, mejor dicho no se ha descubierto aún
una función metabólica en la cual ellos intervienen; son considerados artículos de lujo en la
planta (Taiz, et. al., 2006).
El análisis fitoquímico tiene como objetivo determinar los metabolitos secundarios
presentes en la especie vegetal a estudiar, por ejemplo en las plantas medicinales, aplicando
para ello una serie de técnicas de extracción, de separación y purificación y de determinación
estructural (Lock, 2000).
32
2.2.3.1 METABOLITOS SECUNDARIOS FRECUENTES EN LAS PLANTAS
El reconocimiento de metabolitos secundarios se realiza por medio de pruebas
fitoquímicas preliminares, las cuales son una prueba química de caracterización que consiste
en una reacción química que produce alteración rápida en la estructura molecular de un
compuesto, por ejemplo, la modificación de un grupo funcional, la apertura de un sistema
anular, la formación de un complejo, lo cual da por resultado una manifestación sensible
como el cambio de un color, la formación de un precipitado o el desprendimiento de un gas,
dándonos indicios de la presencia o ausencia de un metabolito secundario en particular (Taiz,
et. al., 2006).
Los constituyentes químicos que se agrupan según su origen biosintético común, y así
podemos mencionar a los terpenos y esteroides, flavonoides, cumarinas, quinonas, alcaloides,
entre otras (Taiz, et. al., 2006).
1. Alcaloides:
Constituyen un grupo muy heterogéneo de bases vegetales nitrogenadas, con acción
fisiológica más o menos intensa sobre los animales. Con escasas excepciones como la
efedrina y mezcalina (Ver Ilustración 18); tiene cuando menos un nitrógeno en un
heterociclo. Hay unos cuantos alcaloides de nitrógeno amídico que son neutros, como la
colchicina (Ver Ilustración 18). Sin considerar la cafeína y la teobromina (Ver Ilustración
18), las bases púricas y pirimidínicas están excluidas del grupo de alcaloides por carecer de
acción fisiológica notable y por sus relaciones bioquímicas con los ácidos nucleicos (Taiz, et.
al., 2006).
Se les atribuye propiedades medicinales como: antiespasmódico, estimulante, analgésico,
sedante hipnótico, expectorante, antipirético, diurético, etc (Lock, 2000).
33
Ilustración 18. Estructura química de algunos alcaloides
Fuente: (Taiz, et. al., 2006).
2. Flavonoides:
Son pigmentos vegetales que poseen un esqueleto carbonado C6-C3-C6 como se
encuentra en la flavonona: aurona, chalcona, flavona, flavanolol, flavonol, flavandiol-3,4
(leucoantocianidina), antocianidina, catequina, isoflavona, neoflavona (Ver Ilustración 19)
(Taiz, et. al., 2006).
Ilustración 19. Estructura química de algunos flavonoides
Fuente: (Taiz, et. al., 2006).
34
Se conocen unos 200 flavonoides naturales; se encuentran extensamente distribuidos entre
las plantas, tanto libres como glicósidos; estos últimos contribuyen a darle color a las flores,
frutos y hojas. Las agliconas son más frecuentes en los tejidos leñosos. Hay poco más de 40
C-glicosilflavonoides que también contribuyen a darle color a numerosos vegetales. Los
flavonoides presentan todos los matices de solubilidad, desde totalmente solubles en agua
hasta insolubles en ella pero solubles en éter etílico (las agliconas muy eterificadas), pasando
por los solubles en etanol (agliconas). Por regla general los flavonoides son insolubles en éter
de petróleo, lo que permite desengrasar un material antes de extraerlos (Taiz, et. al., 2006).
Los flavonoides son sintetizados por numerosos grupos de plantas y con excepción de
algunas flavonas localizadas en las alas de mariposa, probablemente por ingestión, se puede
decir que no se les encuentra en animales (Taiz, et. al., 2006).
Se emplean desde hace mucho tiempo como colorantes de lana, y actualmente se utilizan
en la conservación de grasas o jugos de frutas debido a sus propiedades antioxidantes. En la
actividad farmacológica también son bien conocidas como dilatadores, espasmolítico,
colerético y diurético. Asimismo se destaca la actividad antimicrobiana y fungicida (Lock,
2000).
3. Cardiotónicos:
Son sustancias amargas, derivadas de los esteroides, que actúan sobre el corazón. La
porción del azúcar contiene 3 – 5 moléculas de monosacáridos, por lo general, metilpentosas
y desoxiazúcares muy especiales. La glicona esteroidal, aunque tóxica, no afecta el corazón,
en ella hay varios hidroxilos, uno de ellos en el carbono 14 y otro en el C-3 al cual siempre va
unida la porción de azúcar. La cadena unida al carbono 17, por lo general corresponde a una
γ-lactona α insaturada; pero hay algunos en que es una δ-lactona α, β insaturada. Son solubles
en agua o alcoholes de bajo peso molecular; como las saponinas, disminuyen la tensión
superficial de agua y son insolubles en éter de petróleo, cloroformo y otros disolventes de
lípidos (Ver Ilustración 20) (Taiz, et. al., 2006).
Los glicósidos cardiotónicos se han encontrado en plantas de familias muy diversas,
apocinácea, asclepiadácea, liliácea, morácea, escrofulariácea, ranunculácea (Taiz, et. al.,
2006).
35
Ilustración 20. Estructura química de algunos cardiotónicos
Fuente: (Taiz, et. al., 2006).
4. Saponinas:
Se le da el nombre de saponinas (del latín sapon = jabón) a un grupo de glicósidos que se
disuelven en agua y disminuyen la tensión superficial de ésta, por lo tanto al sacudir sus
soluciones, se forma una espuma abundante y, relativamente estable. Por hidrólisis de las
saponinas se obtienen carbohidratos y una aglicona, llamada genéricamente sapogenina, la
cual puede tener un esqueleto esteroidal como en la esmilagenina, o de triterpeno tipo β-
esteroidal como en la chichipegenina (Ver Ilustración 21) (Taiz, et. al., 2006)
36
Ilustración 21. Estructura química de algunas saponinas
Fuente: (Taiz, et. al., 2006).
5. Cumarinas:
Constituyen un grupo importante de compuestos naturales, se los considera derivados de la
lactona del ácido o-hidroxicinámico, usualmente llamado cumarina (Taiz, et. al., 2006).
La mayoría de las cumarinas conocidas, se encuentran libres en las plantas; pero se
conocen glicósidos del psoroleno y otras cumarinas. La más abundante es la umbeliferina.
(Ver Ilustración 22). Se encuentran con frecuencia en los extractos de leguminosas:
Orchidaceae, Rutaceae y Umbeliferae y en cualquiera de los órganos vegetales, desde raíces
hasta frutos. Se caracterizan porque presentan fluorescencia bajo la luz ultravioleta a 365nm
(Taiz, et. al., 2006).
Las cumarinas han despertado un amplio interés debido a la actividad biológica que
presentan como: anticoagulante, antibacterial, astrogénica, insecticida, etc (Lock, 2000).
Ilustración 22. Estructura química de algunas cumarinas
Fuente: (Taiz, et. al., 2006).
6. Quinonas:
Son dicetonas insaturadas, que por reducción, se convierten en polifenoles, los que
fácilmente las regeneran por oxidación. Se han aislados unas 200 quinonas. Por sus colores
37
amarillo a violeta, contribuyen a la pigmentación de numerosos vegetales. Algunas como la
vitamina K, la ubiquinona (coenzima Q) y las plastoquinonas intervienen en los fenómenos
respiratorios, transportando electrones, por lo que se les encuentra en todos los seres vivos.
(Ver Ilustración 23). El principio purgante, de plantas como el ruibarbo son antraquinonas,
algunas además presentan propiedades como: catártica, antimicótica, bacteriostática, etc
(Taiz, et. al., 2006).
Ilustración 23. Estructura química de algunas quinonas
Fuente: (Taiz, et. al., 2006).
7. Taninos:
Una segunda clase de polímero fenólico vegetal con propiedades defensivas, además de la
lignina, son los taninos. El término tanino fue usado por primera vez para describir aquellos
compuestos que podían convertir la piel animal en cuero, el proceso conocido como curtido.
Los taninos se unen al colágeno de las pieles animales, aumentando su resistencia al calor, al
agua y los microorganismos. Químicamente son polímeros de polifenoles, sustancias con alto
peso molecular (Taiz, et. al., 2006).
Los taninos vegetales sirven como defensas contra microorganismos. Por ejemplo, la parte
central de muchos árboles contienen elevadas concentraciones de taninos que ayudan a
prevenir la podredumbre producida por hongos o bacterias (Taiz, et. al., 2006).
Se clasifican en hidrosolubles y no hidrosolubles (condensados) (Ver Ilustración 24) (Taiz,
et. al., 2006). :
a) Taninos hidrosolubles: son ésteres de ácidos fenólicos (ácido gálico y elágico), con
una azúcar (glucosa) o un polialcohol. Así pues se conocen a los galotaninos y
elagitaninos (Taiz, et. al., 2006).
38
b) Taninos no hidrosolubles (condensados): son unidades de flavan-3-ol unidas entre sí
por enlaces C-C en la posición 4-8 y 4-6. Así están por ejemplo: Catechin,
Epicatechin, Epigallocatechin (Taiz, et. al., 2006).
Ilustración 24. Estructura química de algunos taninos
Fuente: (Taiz, et. al., 2006).
8. Esteroles y/o Triterpenoides:
Son alcoholes sólidos con C27 a C29 átomos, de origen animal como el colesterol, aunque
reportado en algas rojas como el coprosterol, o vegetal como fitosteroles β-sitosterol,
ergosterol, estigmasterol, cuyo esqueleto fundamental corresponde al ciclopentano
perhidrofenantreno, común a todos los esteroides y una cadena lateral en la que pueden
insertarse radicales metilo o etilo, particularmente en C-24 se les denomina metilesteroles
(Taiz, et. al., 2006).
Tanino hidrosoluble
Taninos condensados
39
En los vegetales se pueden encontrar libres, como ésteres o como glicósidos, como el
ipuranol (glicósido del β-sitosterol). Se han encontrado en todos los órganos de las plantas,
principalmente en las semillas (Ver Ilustración 25) (Taiz, et. al., 2006).
Ilustración 25. Estructura química de algunos esteroles
Fuente: (Taiz, et. al., 2006).
2.2.4 PROCESO DE RECOLECCIÓN DE LA MATERIA PRIMA
Para cada planta medicinal existe un momento adecuado para realizar su recolección. La
determinación de los principios activos permite establecer con exactitud el tiempo correcto de
la recolección. Sin embargo, para las plantas cuyos principios activos todavía no se conocen,
pueden aplicarse algunas reglas generales (Sharapin, 2007).
Las cortezas deben ser recogidas en la primavera, en el inicio del verano o en el otoño. La
atmósfera húmeda facilita la separación de la corteza. Las cortezas deben ser retiradas
cuidadosamente y cortadas en segmentos verticales. Se debe tener en cuenta diversos
cuidados para no hacer en la corteza cortes horizontales alrededor del tronco, ya que este
procedimiento impide la circulación de la savia y produce la muerte de la planta (Sharapin,
2007).
Las plantas herbáceas y las hojas deben recolectarse cuando se inicia la floración. Algunas
plantas permiten más de un corte. A veces, cuando los períodos secos y lluviosos son muy
40
definidos, la recolección de hojas se hace durante el período seco, lo que permite que la
planta se regenere durante el período de las lluvias (Sharapin, 2007).
1. Procesamiento pos-cosecha
El procesamiento pos-cosecha tiene como objetivo la conservación de las características
físicas, químicas organolépticas y farmacológicas de la droga vegetal. Un tratamiento pos-
cosecha inadecuado da como resultado una materia prima de baja calidad, con pérdida de
principios activos, así como un aumento de la carga microbiana y una pésima presentación
comercial (Sharapin, 2007).
La primera etapa del procesamiento pos-cosecha involucra el examen y la separación
manual de las partes deterioradas, manchadas y con señales de ataques por insectos y/u
hongos (Sharapin, 2007).
2. Secado
La etapa más importante del procesamiento pos-cosecha es sin duda, el secado. La
industria utiliza plantas secas, lo cual facilita su conservación por períodos de tiempo
prolongados. Las excepciones son las plantas que son utilizadas para obtener aceites
esenciales, tinturas homeopáticas y algunos pocos extractos, como el de alcachofa, que son
procesadas frescas (Sharapin, 2007).
El contenido de humedad en las plantas frescas varía de 60% a 80%. El proceso de secado
reduce este contenido a 0,5-12%. El secado interrumpe los procesos de degradación causados
por enzimas o fermentos, impide el desarrollo de microorganismos y las reacciones de
oxidación y de hidrólisis. Sin embargo, como este proceso involucra calor, pueden
presentarse pérdidas de aceites esenciales y de sustancias volátiles, así como el riesgo de
degradación de las sustancias termolábiles. La mayoría de las plantas medicinales pueden ser
secadas a temperaturas que varían entre 30ºC y 60ºC, así mismo, debe garantizarse una buena
circulación de aire para facilitar el proceso de secado (Sharapin, 2007).
El proceso de secado puede ser realizado al sol o a la sombra, extendiendo la planta en
capas finas, en una superficie limpia. Sin embargo, este proceso no permite un control de la
temperatura y debe interrumpirse cuando comienza a anochecer, recogiendo las plantas y
guardándolas en un local cubierto, para impedir la absorción de la humedad durante la noche.
Los mejores resultados se obtienen utilizando secadores solares o secadores que operan con
aire caliente (Sharapin, 2007).
41
3. Almacenamiento
Por grandes que hayan sido los cuidados durante la recolección y el proceso de secado, las
plantas pierden principios activos por degradación durante el almacenamiento. Aunque el
período recomendado para almacenar las hojas y las sumidades floridas es de 12 a 18 meses y
para las cortezas y raíces de 12 a 36 meses, algunas plantas pierden sus principios activos
más rápidamente (Sharapin, 2007).
El material puede ser guardado en sacos de hilo o papel periódico. El uso de sacos de
plástico debe evitarse porque estos no permiten una ventilación apropiada. El lugar donde se
va a realizar el almacenamiento debe ser limpio, sin incidencia de la luz solar directa. Los
empaques que contienen las materias primas no deben colocarse directamente en el suelo,
deben colocarse en estantes o “pallets” (Sharapin, 2007).
4. Molienda
La molienda tiene como objetivo la disminución del tamaño de las partículas de la droga
vegetal para adecuarla a la etapa siguiente del proceso de extracción. La extracción de una
droga entera o dividida en fragmentos gruesos sería incompleta, debido a la pobre
penetración del solvente en el tejido vegetal, y sería igualmente muy lenta, una vez que las
membranas celulares actúan como verdaderas barreras que dificultan el proceso de
extracción. En el caso específico de la droga previamente dividida, tales membranas se
encuentran parcialmente destruidas, lo que facilita la disolución de los constituyentes
celulares en el líquido externo (Sharapin, 2007).
La droga molida se clasifica de acuerdo con el tamaño de las partículas, el cual debe ser
adecuado para el proceso de extracción. La molienda del material vegetal,
independientemente de su naturaleza y del tipo de molino usado, da como resultado la
producción de una cierta cantidad de partículas muy finas, las cuales deben ser separadas, por
lo cual la operación de molienda debe ser seguida por el tamizaje el material obtenido. Las
partículas que exceden el tamaño adecuado deben retornar al molino para ser reducidas aún
más, descartándose también el polvo muy fino (Sharapin, 2007).
42
5. Maceración
Este proceso consiste en poner en contacto la droga y el solvente, durante varios días. Se
trata de un proceso que da como resultado un equilibrio de concentración entre la droga y el
solvente, y depende de factores que están unidos a la droga, como por ejemplo, su naturaleza,
el tamaño de partícula, su contenido de humedad y factores que están relacionados con el
solvente, como por ejemplo, la selectividad y la cantidad (Sharapin, 2007).
El proceso clásico de maceración consiste en dejar la droga en contacto con el solvente
durante varios días, mínimo 2 – 3 días. Para nuestro estudio se utilizaron mezclas
hidroalcohólicas de diferentes proporciones: 70:30, 60:40 y 50:50. Para abreviar el tiempo de
operación, la droga y el solvente deben mantenerse en movimiento constante. Este
procedimiento es conocido como maceración dinámica (Sharapin, 2007).
Los materiales que se utilizan para la maceración deben ser cerrados, con tapa y por lo
general tratar de que el frasco sea ámbar ya que los principios activos presentes en la droga
pueden deteriorarse al tener contacto con la luz (Sharapin, 2007).
6. Obtención del extracto vegetal
Antes de empezar un proceso extractivo en una escala piloto o industrial, se debe definir la
selectividad del solvente a ser usado en el proceso. Normalmente se usa un solvente de
naturaleza general, de alta polaridad, como el alcohol etílico o el metanol (Sharapin, 2007).
En el proceso de escogencia de un solvente determinado es necesario considerar aspectos
relacionados con la selectividad, la facilidad de manipulación, el precio, la seguridad y los
riesgos en cuanto a una posible contaminación ambiental. Sin embargo, el aspecto más
importante a ser considerado es el grado de toxicidad del solvente. Por esta razón, los
productos fitoterapéuticos son elaborados, principalmente, con mezclas hidroalcohólicas
(Sharapin, 2007).
Entre los solventes generales, los más utilizados son los alcoholes alifáticos de hasta 3
carbonos o mezclas de estos con agua. Estos solventes logran extraer la gran mayoría de las
sustancias naturales de interés como los alcaloides, flavonoides, glicósidos cardiotónicos y
los terpenos. Debido a su poder extractivo, estos solventes son los indicados para los casos en
que los constituyentes activos de las plantas no son bien conocidos. El alcohol etílico y sus
43
mezclas con agua es el solvente por excelencia para la obtención de extractos y tinturas, por
estas razones se utiliza en nuestro estudio la mezcla agua – alcohol (Sharapin, 2007).
7. Proceso de reflujo
La destilación por reflujo es uno de los tipos más importantes de destilación. El vapor que
abandona la cabeza de la columna se condensa, y una fracción del líquido condensado se
devuelve a la columna, lo que constituye el reflujo; el resto se retira como producto destilado.
La condensación se suele hacer con un refrigerante con agua fría o con otras corrientes de
proceso más frías (Ver Ilustración 26) (Sharapin, 2007).
Principio del reflujo: En el interior de la columna se ponen en contacto el vapor
ascendente con el líquido descendente. En un nivel dado de la columna estas dos corrientes
no están en equilibrio entre sí, por lo que hay una transferencia de materia: pasan los
componentes más volátiles del líquido al vapor, y los componentes menos volátiles del vapor
al líquido, con lo que el vapor se enriquece en componentes volátiles a medida que asciende
por la columna (Sharapin, 2007).
Ilustración 26. Equipo de destilación por reflujo
Fuente: (Sharapin, 2007).
Para este estudio cada extracto de diferente proporción de solvente alcohol – agua (70:30,
60:40 y 50:50) se realiza un reflujo por aproximadamente 1 hora con el objetivo de obtener
un extracto y simular la preparación que la realizan los comuneros evitando la pérdida mayor
de volumen (Ver Anexo 1) (Sharapin, 2007).
44
2.2.5 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICÓTICA
2.2.5.1 CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI)
En publicaciones realizadas por Donoso (2009) y Bodero (2010) mencionan que la CMI es la
menor concentración de una gama de disoluciones de un antibiótico o antimicótico que
provoca la inhibición del crecimiento microbiano visible. Es el valor fundamental de
referencia que permite establecer una escala de actividad del antibiótico o antimicótico frente
a diferentes especies microbianas. (Castiñeiras M, et. al., 1998).
2.2.5.2 MÉTODO DE DILUCIÓN CON SUSPENSIÓN DE ESPORAS
Este método se utiliza para establecer las concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) de los
antimicrobianos. Dicho método sirve de referencia para los tests de sensibilidad
antimicrobiana y se usan principalmente para definir la actividad de los nuevos antifúngicos
y/o para confirmar la sensibilidad de los organismos que dan resultados equívocos o poco
fiables en las pruebas de rutina. En este método de dilución se prueba la capacidad de los
hongos de producir crecimiento visible en las placas de microdilución con medio de cultivo,
que contiene diluciones seriadas de los antimicrobianos (Castiñeiras M, et. al., 1998).
2.2.5.3 CONTEO DE ESPORAS EN CÁMARA DE NEUBAUER
La cámara de Neubauer consiste en un porta objetos modificado con una hendidura de
0,1mm de profundidad. Está dividida en 16 cuadrados y éstos a su vez divididos en 16 o 25
celdillas. Cada celdilla tiene una superficie de 0,0025mm2 y una profundidad de 0,1mm. Por
tanto el volumen de cada celdilla (Vc) es de 0,00025 mm3. Como hay 16 celdillas por
cuadrado, el volumen total de una celda (Vt) es de
Vc x 16= 0,004mm3. Como 1mm3= 10-3mL
V= 4x10-6 mL (volumen de una celda)
Se cuentan 6 celdas al azar, se calcula la media (x) de células por celda y se expresa la
concentración en células por ml:
45
X cel / 4x10-6 ml= X . 25 x 10-4 células/ml
(Castiñeiras M, et. al., 1998).
2.3 FUNDAMENTACION LEGAL
Se describe a continuación las consideraciones legales que competen a esta investigación
de acuerdo a los siguientes estatutos vigentes:
CONSTITUCIÓN DE LA REPÚBLICA DEL ECUADOR 2008
Decreto legislativo s/n
Estado: Vigente
Publicado en Registro Oficial 449
20 de Octubre de 2008
Capítulo Segundo
Derechos del Buen Vivir
Sección séptima
Salud
Art. 32.- La salud es un derecho que garantiza el Estado, cuya realización se vincula al
ejercicio de otros derechos, entre ellos el derecho al agua, la alimentación, la educación, la
cultura física, el trabajo, la seguridad social, los ambientes sanos y otros que sustentan el
buen vivir.
El Estado garantizará este derecho mediante políticas económicas, sociales, culturales,
educativas y ambientales; y el acceso permanente, oportuno y sin exclusión a programas,
acciones y servicios de promoción y atención integral de salud, salud sexual y salud
reproductiva. La prestación de los servicios de salud se regirá por los principios de equidad,
universalidad, solidaridad, interculturalidad, calidad, eficiencia, eficacia, precaución y
bioética, con enfoque de género y generacional.
46
Capítulo cuarto
Derechos de las comunidades, pueblos y nacionalidades
Art. 57.- Se reconoce y garantizará a las comunas, comunidades, pueblos y nacionalidades
indígenas, de conformidad con la Constitución y con los pactos, convenios, declaraciones y
demás instrumentos internacionales de derechos humanos, los siguientes derechos colectivos:
6. Participar en el uso, usufructo, administración y conservación de los recursos naturales
renovables que se hallen en sus tierras.
12. Mantener, proteger y desarrollar los conocimientos colectivos; sus ciencias,
tecnologías y saberes ancestrales; los recursos genéticos que contienen la diversidad
biológica y la agrobiodiversidad; sus medicinas y prácticas de medicina tradicional, con
inclusión del derecho a recuperar, promover y proteger los lugares rituales y sagrados, así
como plantas, animales, minerales y ecosistemas dentro de sus territorios; y el conocimiento
de los recursos y propiedades de la fauna y la flora.
LEY ORGÁNICA DE SALUD
(Ley No. 2006-67)
Registro Oficial Suplemento # 423
22 de Diciembre del 2006
Título Preliminar
Capítulo I
DEL DERECHO A LA SALUD Y SU PROTECCIÓN
Art. 1.- La presente Ley tiene como finalidad regular las acciones que permitan efectivizar el
derecho universal a la salud consagrado en la Constitución Política de la República y la ley.
Se rige por los principios de equidad, integridad, solidaridad, universalidad,
irrenunciabilidad, indivisibilidad, participación, pluralidad, calidad y eficiencia; con enfoque
en derechos, interculturalidad, de género, generacional y bioético.
47
Capítulo IV
DE LOS PRODUCTOS NATURALES PROCESADOS DE USO MEDICINAL
Art. 164.- Los productos naturales procesados de uso medicinal, se producirán,
almacenarán, comercializarán e importarán siempre que cuenten con registro sanitario
nacional, de conformidad con la ley y el reglamento correspondiente y bajo las normas de
calidad emitidas por la autoridad sanitaria nacional.
Libro Quinto
Título Único
INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA EN SALUD, GENÉTICA Y SISTEMA DE
INFORMACIÓN EN SALUD
Capítulo I
DE LA INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA EN SALUD
Art. 207.- La investigación científica en salud así como el uso y desarrollo de la
biotecnología, se realizará orientada a las prioridades y necesidades nacionales, con sujeción
a principios bioéticos, con enfoques pluricultural, de derechos y de género, incorporando las
medicinas tradicionales y alternativas.
Art. 208.- La investigación científica tecnológica en salud será regulada y controlada por la
autoridad sanitaria nacional, en coordinación con los organismos competentes, con sujeción a
principios bioéticos y de derechos, previo consentimiento informado y por escrito, respetando
la confidencialidad.
48
REGISTRO OFICIAL Nº 308
Lunes 11 de Agosto del 2014
ACUERDO MINISTERIAL 00004918
REGLAMENTO DE PRODUCTOS NATURALES PROCESADOS DE USO
MEDICINAL Y DE LOS ESTABLECIMIENTOS DONDE SE FABRICAN,
ALMACENAN, DISTRIBUYEN Y COMERCIALIZAN
Las disposiciones de este Reglamento se aplicarán a todos los productos naturales
procesados de uso medicinal, que se importan, fabrican, envasan o empacan, transportan,
almacenan, distribuyen y comercializan, en todo el territorio nacional y a los establecimientos
que se dedican a dichas actividades.
CAPÍTULO II
CLASIFICACIÓN DE PRODUCTOS NATURALES PROCESADOS DE USO
MEDICINAL
Art. 3.- Clasificación.- Los productos naturales procesados de uso medicinal se clasifican
en los siguientes:
1. Productos naturales procesados de uso medicinal tradicional.- Aquellos productos
que no presentan formas farmacéuticas definidas provenientes del recurso natural de
uso medicinal, obtenidos solo por procesos físicos tales como lavado, secado o
molienda, los mismos que no han sufrido transformaciones químicas; respaldado su
uso tradicional por referencias bibliográficas formales que demuestren su seguridad y
eficacia.
2. Productos naturales procesados de uso medicinal oficial o demostrado.- Aquellos
productos que tienen formas farmacéuticas definidas, cuya formulación se realiza a
partir de extractos y/o recursos naturales de uso medicinal estandarizados, que están
respaldados por estudios farmacológicos, toxicológicos experimentales preclínicos y
clínicos.
49
2.4 HIPÓTESIS
2.4.1 HIPÓTESIS NULA:
La concentración del extracto de la corteza de Aristolochia pilosa Kunth no influye en la
concentración mínima inhibitoria (CMI).
2.4.2 HIPÓTESIS ALTERNATIVA:
La concentración del extracto de la corteza de Aristolochia pilosa Kunth influye en la
concentración mínima inhibitoria (CMI).
2.5 SISTEMA DE VARIABLES
2.5.1 Variable dependiente.
La concentración mínima inhibitoria (CMI).
2.5.2 Variable Independiente.
Diferentes extractos obtenidos de la corteza de Aristolochia pilosa Kunth de proporción
de solventes 70:30, 60:40, 50:50.
50
CAPÍTULO III
3. METODOLOGÍA
3.1 DISEÑO DE INVESTIGACIÓN
3.1.1 De campo
Se trata de una investigación de campo ya que se efectuó la recolección de las cortezas
(bejucos) de Aristolochia pilosa Kunth (Amarun Waska) en la Provincia de Orellana,
comunidad de “San Roque”, en donde se nos facilitó la respectiva información a través de
gente de la comunidad que conoce sobre la vegetación y sus beneficios, entre ellos el Sr.
Cirilo Capinoa como conocedor de las propiedades de las plantas de la zona, además de los
comuneros quienes nos ayudaron con la movilización, estadía y alimentación durante los días
de recolección. Posteriormente se realizó la extracción y determinó su actividad antimicótica.
3.1.2 Experimental
Es una investigación de tipo experimental de nivel exploratorio ya que se realizó en los
laboratorios de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad
Central del Ecuador (la obtención del extracto fluido de diferentes proporciones y el tamizaje
fitoquímico) y en el Laboratorio de Microbiología de la Empresa PRIMS LABORATORIOS
(actividad antimicótica de los extractos vegetales), para determinar la CMI (concentración
mínima inhibitoria) del extracto de Aristolochia pilosa Kunth (Amarun Waska) frente a 2
cepas diferentes de hongos: Trichopyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes.
3.2 POBLACIÓN Y MUESTRA
3.2.1 Población
Son las diferentes especies de Aristolochia que pueden existir en la naturaleza.
3.2.2 Muestra
La muestra se refiere a la especie Aristolochia pilosa Kunth que es la que se utilizó en
este caso para la evaluación de la actividad antimicótica.
51
3.3 MATERIALES Y REACTIVOS:
3.3.1 Materiales de recolección del material vegetal
Machete
Guantes
Costales de yute
Papel periódico y de empaque
Bolsas de papel
Cartones.
3.3.2 Materiales de laboratorio
Molino
Frascos ámbar
Cajas Petri
Pipetas
Asas de siembra
Papel filtro
Papel aluminio
Tubos de ensayo
Sacabocados
3.3.3 Equipos de laboratorio
Equipo de reflujo
Balanza analítica y granataria
Cámara de revelado UV
Microscopio
Vortex
Cámara de Neubauer
Autoclave
Cámara de flujo laminar
52
3.3.4 Reactivos
Agua
Etanol
Medio de cultivo Sabouraud
Reactivo de Mayer, Dragendorff y Wagner
Anhídrido acético
H2SO4 (c)
(FeCl3) 20 %
HCl 1:1
Limaduras de magnesio
KOH en etanol al 5%
NH4OH
NaOH
Gelatina salada
NaCl
Metanol
3.4 MATERIAS PRIMAS
Material vegetal (corteza) de Aristolochia pilosa Kunth (Amarun Waska)
2 tipos de hongos dérmicos (Trichopyton rubrum ATCC® 28188 y Trichophyton
mentagrophytes ATCC® 9533)
Terbinafina crema al 1%
3.5 MÈTODOS:
3.5.1 OBTENCIÓN DEL EXTRACTO VEGETAL DE Aristolochia pilosa Kunth
(Amarun Waska)
1. Macerar 30g de la planta seca y triturada en 400ml de las diferentes mezclas de etanol
– agua para lograr las concentraciones a estudiar: 70:30 (E1), 60:40 (E2), 50:50 (E3),
en un recipiente adecuado, se agita y se deja reposar 48h.
53
2. Filtrar (filtrado 1), se exprime la droga y agregar nuevamente 400ml de las mezclas
etanol-agua respectivo y llevar a reflujo durante una hora.
3. Filtrar y el extracto obtenido incorporar al filtrado 1, concentrar en rotavapor para
eliminar el alcohol que pudiera estar presente y guardar en un recipiente adecuado.
4. Calcular la concentración para cada extracto (C1, C2, C3) tomando en cuenta la
cantidad de planta y el volumen de solvente utilizados (Ver Anexo 1) (Sharapin N.,
2007).
3.5.2 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICÓTICA
3.5.2.1 Activación de las cepas de hongos
Se adquirieron cepas de hongos T. rubrum y T. mentagrophytes de Marca KWIK-STIK TM
de la Empresa Microbiologics®.
Se trata de microorganismos liofilizados para propósitos de cultivo y aplicaciones de
control de calidad.
Proceso:
1. Sin abrir la bolsa, dejar KWIK-STIK TM se equilibre a temperatura ambiente. Abrir
con fuerza en la muesca y retirar la unidad KWIK-STIK TM.
2. Arrancar la parte desprendible de la etiqueta (Pull-tab) y adjuntarla a la placa de
cultivo primario o registro de control de calidad. No desmontar el dispositivo durante la
hidratación.
3. Presionar (una sola vez) en la ampolla en la parte superior de la KWIK-STIK TM
(justo por debajo del meñisco del fluido de la ampolla.
4. Mantener verticalmente y tocar una superficie dura para facilitar el flujo de fluido a
través del eje en la parte inferior de la unidad que contiene una esfera.
5. Usando una acción de apretón en la parte inferior de la unidad, aplastar el sedimento
en el fluido hasta que la suspensión sea homogénea.
6. INMEDIATAMENTE en gran proporción saturar el hisopo con el material hidratado
y transferir al medio de cultivo agar.
54
7. Inocular la placa de cultivo primario rodando suavemente el hisopo en más de un
tercio de la placa.
8. Utilizar un asa estéril, para facilitar el aislamiento consecutivo de colonias.
9. Usando un método apropiado de eliminación de desechos biológicos, descartar el
KWIK-STIK TM.
10. Inmediatamente incubar la placa de cultivo primaria inoculada(s) a temperatura y
condiciones adecuadas para el microorganismo (Ver Anexo 2) (Microbiologics, 2016).
3.5.2.2 MÉTODO DE DILUCIÓN CON SUSPENSIÓN DE ESPORAS
Finalmente con los extractos obtenidos se evaluó la actividad antimicótica frente a 2 cepas
diferentes de hongos: Trichopyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, se midió su halo
de crecimiento y se determinó el porcentaje del mismo (Castiñeiras, et. al., 1998).
1. Cultivar los hongos en estudio (Trichophyton rubrum y Trichophyton
mentagrophytes), en medio de cultivo Agar Sabouraud en cajas Petri e incubar de 2 a
3 semanas a 27ºC (Ver Anexo 3).
2. Luego de este tiempo agregar 1ml de agua estéril y levantar cuidadosamente con una
varilla de vidrio todo el crecimiento,
3. Pasar a un tubo estéril y agitar 1-2min en un Vortex.
4. Contar las esporas en una Cámara de Neubauer, diluir con agua estéril a una
concentración de 100 esporas/ml y guardar en viales estériles a 4ºC.
5. Mezclar 2ml del extracto hidroalcohólico obtenido con 15ml de agar Sabouraud a
50ºC, verter en cajas Petri, incubar por 24 horas para descartar contaminación.
6. Realizar en el agar cuatro agujeros equidistantes con sacabocados (6mm de diámetro
aprox.), sembrar en cada agujero 10uL de la suspensión de esporas e incubar a 27ºC
por 14 días. (Ver Anexo 4)
7. Después de este tiempo medir el halo de crecimiento en mm y comparar con el
medicamento control (terbinafina) (Ver Anexo 5 y 6) (Castiñeiras, et. al., 1998).
55
Ecuación 1. Porcentaje de crecimiento del hongo
˂ 25% Inhibición positiva;
> 25% Inhibición negativa.
3.5.3 MARCHA FITOQUÍMICA
Se realiza una marcha fitoquímica para establecer los metabolitos secundarios existentes
en el material vegetal (Ver Ilustración 27) (Sharapin N., 2007).
56
Ilustración 27. Marcha fitoquímica preliminar
Fuente: (Sharapin N., 2007).
3.5.3.1 DROGA SECA Y PULVERIZADA
Pesar 30g
Adicionar 60mL de etanol
Macerar por 24 horas.
Filtrar al vacío, el residuo concentrar a la mitad de su volumen en presión reducida
(rotavapor).
Residuo adicionar un volumen de etanol suficiente para cubrir la droga y llevar a reflujo
cerrado hasta la tercera parte de su volumen y unir al extracto anterior obtenido.
Descartar el residuo. El extracto obtenido se denominará EXTRACTO ETANOLICO
TOTAL (EET) (Sharapin N., 2007).
57
3.5.3.2 INVESTIGACION DE ALCALOIDES:
a) Extracción:
Tomar la cantidad del EET correspondiente a 9g de planta.
Añadir HCl 5% y llevar a pH ácido (2 a 3) comprobar con papel pH.
Adicionar NaOH al 20% y llevar a pH básico (10 a 12).
Transferir el extracto alcalinizado a un embudo de separación, extraer con cloroformo
utilizando un volumen igual al del extracto.
Separar el extracto clorofórmico.
Realizar una segunda extracción utilizando cloroformo etanol (3:2).
Separar el extracto clorofórmico.
Unir los extractos clorofórmicos, concentrar hasta eliminar el solvente, a presión
reducida.
Este extracto se denominará Extracto clorofórmico alcalinizado (ECALC).
Del residuo se toma una alícuota, se acidifica y se realiza las pruebas de precipitación
para identificación de alcaloides (Sharapin N., 2007).
b) Identificación
1. Se acidifica con HCl 5%, dividir en 6 alícuotas iguales, en las cuales se realiza las
pruebas de precipitación (Ver Tabla 3):
Tabla 3. Identificación de alcaloides
REACTIVO ESPECIFICACIONES
Mayer: 3 gotas del reactivo Precipitado blanco
Wagner: 3 gotas del reactivo Precipitado café
Dragendorff: 3 gotas del reactivo Precipitado rojo ladrillo
Elaborado por: Viviana Carrillo
Fuente: (Sharapin N., 2007).
58
3.5.3.3 IDENTIFICACIÓN DE: ESTEROLES, FLAVONOIDES, ANTRAQUINONAS,
TANINOS Y SAPONINAS.
3.5.3.3.1 Esteroles
a) Extracción:
Tomar una cantidad de EET correspondiente a 9g de planta y colocar en un embudo de
separación.
Adicionar una cantidad igual de éter de petróleo, separar el extracto etéreo.
Realizar una segunda extracción con la mitad de la cantidad anteriormente utilizada.
Unir los extractos etéreos y concentrar a presión reducida.
A este se denominará Extracto etanólico EES
En la fracción acuosa se hará la extracción de flavonoides, taninos, saponinas y
antraquinonas y lo denominaremos FET (Sharapin N., 2007).
b) Identificacion
Tabla 4. Identificación de esteroles
REACCIÓN ESPECIFICACIONES
Lieberman – Buchard: Gotas de anhídrido acético +
gotas de ácido sulfúrico concentrado (H2SO4)
Formación de un anillo de color
azul en el punto de contacto
Zack: Gotas de ácido acético + gotas de ácido
sulfúrico concentrado (H2SO4) + gotas de
Cloruro férrico (FeCl3) 20 %
Coloración verde
Elaborado por: Viviana Carrillo
Fuente: (Sharapin N., 2007).
59
3.5.3.4 FLAVONOIDES, ANTRAQUINONAS, ANTOCIANOS TANINOS Y
SAPONINAS
El residuo etanólico FET, tratarlo con una mezcla de etanol/agua (1:7). Calentar. (Ver Tabla
5).
a) FLAVONOIDES:
Tabla 5. Identificación de Flavonoides
REACCIÓN ESPECIFICACIONES
Shinoda: Ácido clorhídrico
concentrado (HCl) + limaduras de
magnesio
Espuma abundante y/o coloración
roja intensa
Cianidina: Etanol (C2H5OH) + ácido
clorhídrico (HCl) + limaduras de
magnesio
Coloración roja o rosa
En medio alcalino: Gotas de hidróxido
de potasio (KOH) en etanol al 5 %
Coloración amarillo anaranjado y al
añadir gotas Cloruro férrico (FeCl3)
2 % coloración azul verdosa
Elaborado por: Viviana Carrillo
Fuente: (Sharapin N., 2007).
b) REACCIÓN PARA ANTOCIANOS:
Tabla 6. Identificación de Antocianos
REACCIÓN ESPECIFICACIONES
Gotas de ácido clorhídrico
concentrado (HCl) agitar y
dejar reposar
Coloración roja (en caso de
este resultado) al colocar
amoniaco (NH3) cambia a
azul
Elaborado por: Viviana Carrillo
Fuente: (Sharapin N., 2007).
60
c) ANTRAQUINONAS:
Tomar una alícuota del extracto FET y se procede a realizar las siguientes reacciones (Ver
Tabla 7):
Tabla 7. Identificación de Antraquinonas
REACCIÓN ESPECIFICACIONES
Bomtrager: 5 mL de ácido sulfúrico 1N
(H2SO4), llevar a ebullición por 10 min,
filtrar y adicionar 5 mL de benceno sobre el
filtrado agitar y dejar en reposo, separar la
fase orgánica y adicionar 1 mL de hidróxido
de amonio (NH4OH)
Coloración roja en la
capa acuosa
Elaborado por: Viviana Carrillo
Fuente: (Sharapin N., 2007).
d) TANINOS:
Se toma una alícuota del extracto FET y se procede a las siguientes reacciones (Ver Tabla 8):
Tabla 8. Identificación de Taninos
REACCIÓN ESPECIFICACIONES
Cloruro férrico (FeCl3): Gotas
Cloruro férrico (FeCl3) 5% *Color azul no hidrolizables
*Color verde hidrolizables
Gelatina salada: Solución al
1% de gelatina y cloruro de
sodio (NaCl) al 10 %
Precipitado blanco gelatinoso
Elaborado por: Viviana Carrillo
Fuente: (Sharapin N., 2007).
* Diferenciación de taninos hidrolizables de los no hidrolizables, si el resultado es positivo el
tanino es hidrolizable.
61
Tabla 9. Diferenciación taninos hidrolizables de no hidrolizables
REACCIÓN ESPECIFICACIONES
Stiasny: Solución de ácido
clorhídrico (HCl) y formol en
porción de 1:1
Taninos no hidrolizables
precipitan en grandes copos
Ácido clorhídrico
concentrado (HCl): Gotas
del reactivo
Taninos condensados (PAC)
precipitado y/o color rojo
Elaborado por: Viviana Carrillo
Fuente: (Sharapin N., 2007).
e) SAPONINAS
Se toma una alícuota del extracto FET y se procede a las siguientes reacciones (Ver Tabla
10):
Tabla 10. Identificación de saponinas
REACCIÓN ESPECIFICACIONES
Agua: 2mL Presencia de espuma que
dura más de 1 minuto
Elaborado por: Viviana Carrillo
Fuente: (Sharapin N., 2007).
3.5.3.5 HETERÓSIDOS CARDIOTÓNICOS:
a) Extracción:
Tomar una alícuota del EET correspondiente a 9g de planta.
Precipitar con una solución de acetato de plomo al 5%, filtrar y el filtrado extraer con
cloroformo.
El extracto clorofórmico tratarlo con sulfato de sodio anhidro, filtrar y concentrar.
A este extracto obtenido se le denomina ESCC (Sharapin N., 2007).
62
b) Identificación:
Se toma una alícuota de ESCC y se realizan las siguientes reacciones (Ver Tabla 11):
Tabla 11. Identificación de Cardiotónicos
REACCIÓN ESPECIFICACIONES
Baljet: 0,5ml de reactivo de
Baljet y gotas de hidróxido de
potasio 10% en etanol.
Color rojo naranja
estable.
Kedde: 0,5mL de Reactivo de
Kedde + 10 gotas de KOH
10% en etanol
Color rojo púrpura
Elaborado por: Viviana Carrillo
Fuente: (Sharapin N., 2007).
3.6 TECNICAS DE PROCESAMIENTO Y ANÁLISIS DE DATOS
3.6.1 DISEÑO DE BLOQUES COMPLETAMENTE AL AZAR (DBCA)
Para el análisis de los resultados se utiliza el Diseño de Bloques Completamente al Azar
(DBCA), donde se utiliza como Bloques los 2 tipos de hongos (Trichopyton rubrum,
Trichophyton mentagrophytes) y como tratamientos las diferentes concentraciones de
extracto obtenido, se realizan 3 repeticiones para cada tratamiento, de aquí se obtiene
diferentes mediciones del halo de crecimiento para determinar la CMI (Barragán R., 2013).
Este diseño es utilizado en todos los campos de la investigación, siendo una característica
importante que es la de incluir a los bloques como una fuente de variación, en los cuales es
necesario que los tratamientos se encuentren en condiciones de máxima homogeneidad
aunque la variación entre los bloques sea alta (Barragán R., 2013)
Modelo Matemático
xij= µ + τ i + β j + Ɛ i j Donde:
xij= cualquier observación µ= media general
τ i= efecto de los tratamientos
63
β j= efecto de los bloques
Ɛ i j= error experimental
3.6.2 ESQUEMA DEL ANÁLISIS DE VARIANZA
Tabla 12. Esquema de ADEVA
FV SC GL CM F.cal
Total 𝛴𝑥2𝑖𝑗 − 𝐹𝐶 (t * r) -1
Bloques
r-1 SCB / GLB CMB / CME
Tratamientos t-1 SCt / GL.t CMt / CME
Error Dif. (r-1) (t-1) SCE / G.L.E.
Elaborado por: Viviana Carrillo
Fuente: (Barragán R., 2013).
r= repeticiones t= tratamientos
Hipótesis: Ho: C1 = C2 = C3
Ha: C1 ≠ C2 ≠ C3
3.6.3 PRUEBA DE TUKEY
Esta prueba permite hacer todas las posibles comparaciones de tratamientos de dos en dos,
y por eso se considera la más completa.
Se le considera como una prueba estricta, debido a que para declarar como significativas a
las medias de los tratamientos necesita valores más grandes (Barragán R., 2013).
𝑉. 𝑇 = (𝑝 ∗ 𝑓)(𝛼)(𝑆�̅�)
Ecuación 2. Valor teórico para Tukey
Fuente: (Barragán R., 2013).
64
Dónde: Donde p, número de tratamientos f, grados de libertad
α, nivel de significancia, al 5% en la tabla de Tukey
(̅𝑆�̅� ̅̅), Error estándar de las medias
Ecuación 3. Error estándar de las medias
Fuente: (Barragán R., 2013).
Donde:
CME= promedio de los cuadrados dentro de los grupos r= número de repeticiones
3.6.4 DECODIFICACIÓN GENERAL DEL ESTUDIO
Tabla 13. Decodificación general
Hongos Proporción
solvente
Repeticiones Concentraciones extracto
Trichopyton rubrum: Thr E1 (70:30) R1 C1
Trichophyton mentagrophytes: Thm E2 (60:40) R2 C2
E3 (50:50) R3 C3
C4 (Terbinafina)
Elaborado por: Viviana Carrillo
65
CAPÍTULO IV
4. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1 MATERIAL VEGETAL
Se montó un voucher (como se muestra en la ilustración 28) de la planta, de la cual se
recolectaron las cortezas (bejucos) para el trabajo de investigación. La muestra se encuentra
depositada en los archivos correspondientes del Laboratorio de Productos Naturales de la
Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador.
Ilustración 28. Voucher de Amarun Waska (Aristolochia pilosa Kunth)
Elaborado por: Viviana Carrillo
66
Con la ayuda del Dr. Carlos Cerón DIRECTOR AD-HONOREM DEL HERBARIO
ALFREDO PAREDES (QAP), se realizó la identificación botánica (Ver Ilustración 29) de
dicha planta. En esta identificación se demostró que el material vegetal corresponde a
Aristolochia pilosa Kunth.
Ilustración 29. Certificado de identificación botánica del Aristolochia pilosa Kunth
(Amarun Waska)
Elaborado por: HERBARIO ALFREDO PAREDES – UNIVERSIDAD CENTRAL
DEL ECUADOR
67
4.2 RESULTADOS
4.2.1 OBTENCIÓN DE CONCENTRACION DE CADA EXTRACTO
HIDROALCOHÓLICO
Tabla 14. Datos peso planta y volumen solución
Peso planta
(g)
Vol. Agua
(ml)
Vol. Alcohol
(ml)
Vol. Extracto final
(ml)
E1 (70:30) 100 120 180 125
E2 (60:40) 100 140 160 110
E3 (50:50) 100 150 150 100
Elaborado por: Viviana Carrillo
𝐶 = 𝑃𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑎 (𝑚𝑔)
𝑉𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 (𝑚𝑙)
Ecuación 4. Concentración extracto
Donde:
C= Concentración extracto
P= peso de planta en miligramos
V= volumen final del extracto en ml
Tabla 15. Resultados concentración extractos
Concentración
(mg/ml)
E1 (70:30) 0,80 (C1)
E2 (60:40) 0,91 (C2)
E3 (50:50) 1,00 (C3)
Elaborado por: Viviana Carrillo
68
4.2.2 OBTENCIÓN DE CONCENTRACION FINAL DE TERBINAFINA (C4)
Basado en un estudio de la Determinación de la actividad antifúngica in vitro de la
terbinafina frente a T. rubrum y T. mentagrophytes, donde se determinó que a los 15 días la
CMI del medicamento estaba comprendida en un rango entre 0,02 y 0,0975 µg/ml, se obtuvo
una media de 0,058 µg/ml que sirvió como dato teórico para obtener la concentración de
crema a ser incubada para la inhibición de los hongos (Fernández B., et. al., 1998).
Concentración Terbinafina: 1%
1g → 100g crema
5,8 x 10-8 g → x
x= 5,8 x 10-4 g → 0,58mg (a pesar)
Peso real= 0,57 mg → 570 µg
570 µg se disolvieron en 100ml de agua estéril obteniendo una concentración de 5,7 µg/ml
Dilución: 1: 100
Concentración final (C4): 0,057 µg/ml
4.2.3 MEDIDA DEL HALO DE CRECIMIENTO DEL HONGO en mm EN
EXTRACTO VEGETAL (�̅�)
Trichopyton rubrum: Thr
Tabla 16. Medida del halo de crecimiento Thr
Bloques
Tratamientos
R1 (mm) R2 (mm) R3 (mm)
C1 (0,80 mg/ml) 9,8 10,0 11,0
C2 (0,91 mg/ml) 8,3 8,5 8,3
C3 (1,00 mg/ml) 6,8 7,0 6,3
Elaborado por: Viviana Carrillo.
69
Trichopyton mentagrophytes: Thm
Tabla 17. Medida del halo de crecimiento Thm
Bloques
Tratamientos
R1 (mm) R2 (mm) R3 (mm)
C1 (0,80 mg/ml) 10,8 11,8 11,4
C2 (0,91 mg/ml) 9,7 9,2 9,5
C3 (1,00 mg/ml) 8,8 8,0 7,7
Elaborado por: Viviana Carrillo.
4.2.4 MEDIDA DEL HALO DE CRECIMIENTO DEL HONGO en mm DEL
MEDICAMENTO CONTROL – TERBINAFINA (�̅�)
Trichopyton rubrum: Thr
Tabla 18. Medida del halo de crecimiento Thr - Terbinafina
Bloques
Tratamientos
R1 (mm) R2 (mm) R3 (mm) Media (mm)
C4 (0,057µg/ml) 11,3 13,3 11,5 12,0
Elaborado por: Viviana Carrillo.
Trichopyton mentagrophytes: Thm
Tabla 19. Medida del halo de crecimiento Thm - Terbinafina
Bloques
Tratamientos
R1 (mm) R2 (mm) R3 (mm) Media (mm)
C4 (0,057µg/ml) 16,0 16,0 14,5 15,5
Elaborado por: Viviana Carrillo.
70
4.2.5 PORCENTAJE DE CRECIMIENTO DEL HONGO POR
CONCENTRACIÓN DE EXTRACTO VEGETAL
Trichopyton rubrum: Thr
Tabla 20. Porcentaje de crecimiento de hongo Thr
Bloques
Tratamientos
R1 (%) R2 (%) R3 (%)
C1 (0,80 mg/ml) 86,67 75,47 95,65
C2 (0,91 mg/ml) 73,33 64,15 71,74
C3 (1,00 mg/ml) 60,00 52,83 54,35
Elaborado por: Viviana Carrillo.
(Anexo 5).
Trichopyton mentagrophytes: Thm
Tabla 21. Porcentaje de crecimiento de hongo Thm
Bloques
Tratamientos
R1 (%) R2 (%) R3 (%)
C1 (0,80 mg/ml) 67,19 73,44 78,28
C2 (0,91 mg/ml) 60,31 57,50 65,52
C3 (1,00 mg/ml) 55,16 49,84 53,10
Elaborado por: Viviana Carrillo.
(Anexo 6)
4.3 DISEÑO ESTADÍSTICO
Se realizó un Diseño de Bloques Completamente al Azar (DBCA), para poder
determinar la existencia de diferencias significativas con un nivel de confianza del 95% entre
las medias de los tratamientos utilizando como variables de comparación la proporción de
concentración del extracto, teniendo en cuenta a 2 bloques que son los 2 tipos de hongos
(Trichopyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes), con 3 tratamientos y 3 repeticiones
para cada tratamiento, de aquí se obtiene diferentes mediciones del halo de crecimiento para
determinar la CMI. Y como análisis funcional se utilizó la prueba de Tukey al 5%
71
4.3.1 DISEÑO ESTADÍSTICO PARA T. rubrum
Obtención del porcentaje de crecimiento de T. rubrum
Tabla 22. Porcentaje de Crecimiento T. rubrum
Repeticiones
Tratamientos C (mg/ml) R1 (%) R2 (%) R3 (%)
C1 0,80 86,67 75,47 95,65
C2 0,91 73,33 64,15 71,74
C3 1,00 60,00 52,83 54,35
Promedio 85,93 69,74 55,73
Elaborado por: Viviana Carrillo.
4.3.1.1 ANÁLISIS DE VARIANZA PARA % CRECIMIENTO - SUMA DE
CUADRADOS TIPO III
Tabla 23. Resultados ANOVA T. rubrum
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Razón-
F
Valor
tabulado F
Valor-P
(95%)
A:Concentracion 1376,53 2 688,263 27,04 6,944 0,0047
B:BLOQUE 179,087 2 89,5433 3,52 6,944 0,1314
RESIDUOS 101,807 4 25,4517
TOTAL
(CORREGIDO)
1657,42 8
Elaborado por: Viviana Carrillo.
Interpretación:
Debido a que el valor P (0,0047) es menor que 0,05 al 95% de confianza y que el valor de
F calculado (27,04) es mayor a la F tabulada (6,94), la Concentración del extracto vegetal
tiene un efecto estadísticamente significativo sobre el Porcentaje de Crecimiento de T.
rubrum. Lo que significa que se acepta la hipótesis alternativa entre los tratamientos, la
misma que establece que la concentración del extracto de la corteza de Aristolochia pilosa
influye en la concentración mínima inhibitoria (CMI).
72
Sucede lo contrario entre bloques (repeticiones) ya que debido a que la P (0,1314) es
mayor que 0,05 al 95% de confianza y la F calculada (3,52) menor que la F tabulada (6,94)
no existe una diferencia significativa entre repeticiones.
4.3.1.2 PRUEBA DE TUKEY
Pruebas de Múltiple Rangos para Porcentaje Crecimiento por Concentración
Tabla 24. Prueba de Tukey para % Crecimiento T. rubrum
Concentración Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
C1 (0,80mg/ml) 3 55,7 2,91271 X
C2 (0,91mg/ml) 3 69,7333 2,91271 X
C3 (1,00mg/ml) 3 85,9667 2,91271 X
Contraste Sig. Diferencia +/- Límites
C3 – C2 Ns -14,0333 14,6782
C3 – C1 S -30,2667 14,6782
C2 – C3 S -16,2333 14,6782
Elaborado por: Viviana Carrillo.
Interpretación:
El método empleado actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de
diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey, según esta prueba se establece que
entre la C3 y C2 no existe una diferencia significativa comparado con las demás
concentraciones de C1 y C2 que si presentan diferencia significativa. Con este método hay un
riesgo del 5,0% al decir que uno o más pares son significativamente diferentes, cuando la
diferencia real es igual a 0.
En la Ilustración 30 se muestran intervalos de confianza del 95,0% para cada una de las
medias. De acuerdo a esto se han identificado 2 grupos homogéneos, es decir la C3, donde su
límite superior es prácticamente superponible al límite inferior de la C2, lo que
estadísticamente significaría homogeneidad entre estos tratamientos.
73
Ilustración 30. Prueba de Tukey % Crecimiento vs. Conc. T. rubrum
4.3.2 DISEÑO ESTADÍSTICO PARA T. mentagrophytes
Obtención del porcentaje de crecimiento de T. mentagrophytes
Tabla 25. Resultados % Crecimiento T. mentagrophytes
Repeticiones
Tratamientos C (mg/ml) R1 (%) R2 (%) R3 (%)
C1 0,80 67,19 73,44 78,28
C2 0,91 60,31 57,50 65,52
C3 1,00 55,16 49,84 53,10
Promedio 72,97 61,11 52,70
Elaborado por: Viviana Carrillo.
74
4.3.2.1 ANÁLISIS DE VARIANZA PARA %CRECIMIENTO - SUMA DE
CUADRADOS TIPO III
Tabla 26. Resultados ANOVA T. mentagrophytes
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Razón-F Valor
tabulado F
Valor-P
(95%)
A:Concentración 622,261 2 311,13 21,63 6,944 0,0072
B:BLOQUE 51,7963 2 25,8981 1,80 6,944 0,2770
RESIDUOS 57,5405 4 14,3851
TOTAL (CORREGIDO) 731,597 8
Elaborado por: Viviana Carrillo.
Interpretación:
Debido a que el valor P (0,0072) es menor que 0,05 al 95% de confianza y que el valor de
F calculado (21,63) es mayor a la F tabulada (6,94), la Concentración del extracto vegetal
tiene un efecto estadísticamente significativo sobre el Porcentaje de Crecimiento de T.
mentagrophytes. Lo que significa que se acepta la hipótesis alternativa entre los tratamientos,
la misma que establece que la concentración del extracto de la corteza de Aristolochia pilosa
influye en la concentración mínima inhibitoria (CMI).
Sucede lo contrario entre bloques (repeticiones) ya que debido a que la P (0,2770) es
mayor que 0,05 al 95% de confianza y la F calculada (1,80) menor que la F tabulada (6,94)
no existe una diferencia significativa entre repeticiones.
4.3.2.2 PRUEBA DE TUKEY
Pruebas de Múltiple Rangos para %Crecimiento por Concentración
Tabla 27. Prueba de Tukey para %Crecimiento T. mentagrophytes
Concentración Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
C1 (0,80mg/ml) 3 52,7 2,18976 X
C2 (0,91mg/ml) 3 61,11 2,18976 X
C3 (1,00mg/ml) 3 72,97 2,18976 X
75
Contraste Sig. Diferencia +/- Límites
C3 – C2 Ns -8,41 11,035
C3 – C1 S -20,27 11,035
C2 – C1 S -11,86 11,035
Elaborado por: Viviana Carrillo.
Interpretación:
El método empleado actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de
diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey, según esta prueba se establece que
entre la C3 y C2 no existe una diferencia significativa comparado con las demás
concentraciones de C1 y C2 que si presentan diferencia significativa. Con este método hay un
riesgo del 5,0% al decir que uno o más pares son significativamente diferentes, cuando la
diferencia real es igual a 0.
En la Ilustración 31 se muestran intervalos de confianza del 95,0% para cada una de las
medias. De acuerdo a esto se han identificado 2 grupos homogéneos, es decir la C3, donde su
límite superior es prácticamente superponible al límite inferior de la C2, lo que
estadísticamente significaría homogeneidad entre estos tratamientos.
Ilustración 31. Prueba de Tukey % Crecimiento vs. Conc. T. mentagrophytes
76
4.4 RESULTADOS MARCHA FITOQUIMICA
Tabla 28. Resultados Marcha Fitoquímica Extracto Vegetal
METABOLITO REACCIÓN RESULTADO OBSERVACIONES
ALCALOIDES
MAYER -
DRAGENDORFF -
WAGNER -
ESTEROLES
LIEBERMAN
BUCHARD
- NO ANILLO AZUL
ZAK - NO COLOR VERDE
FLAVONOIDES
SHINODA +++ ESPUMA
ABUNDANTE
CIANIDINA ++
REACCION EN
MEDIO ALCALINO
++
ANTOCIANOS CON HCl -
ANTRAQUINONAS BOMTRAGER + COLORACION
LIGERAMENTE
ROSA
TANINOS
CON FeCl3 + LIGERAMENTE
VERDE
GELATINA
SALADA
+ PRECIPITADO
LIGERAMENTE
BLANCO Y POCA
CANTIDAD
SAPONINAS CON AGUA +++ ESPUMA
ABUNDANTE
CARDIOTONICOS
REACCION BALJET +++ ABUNDANTE COLOR NARANJA
ESTABLE
KEDDE ++ LIGERAMENTE
ROJO
Elaborado por: Viviana Carrillo (Ver Anexo 7).
Interpretación:
De acuerdo a los resultados obtenidos de la marcha fitoquímica del extracto vegetal de
Aristolochia pilosa Kunth se ha establecido la presencia de Flavonoides, Taninos, Saponinas,
Antraquinonas y Cardiotónicos como metabolitos secundarios presentes en los bejucos de
Amarun Waska. Lo que significa que los metabolitos posiblemente responsables de la
actividad antimicótica son: Antraquinonas, Flavonoides y Saponinas.
77
CAPITULO V
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1 CONCLUSIONES
Se colectó e identificó botánica y científicamente los bejucos de Amarun Waska
originarios de la Comunidad San Roque – Provincia de Orellana, determinándose que se
trata de la especie Aristolochia pilosa Kunth.
En el tamizaje fitoquímico realizado al extracto de Aristolochia pilosa Kunth (Amarun
Waska) se comprobó la presencia de flavonoides, taninos, saponinas y cardiotónicos.
Se obtuvo la concentración para cada extracto hidroalcohólico de Aristolochia pilosa
Kunth (Amarun Waska) de proporciones de solvente 70:30 (E1), 60:40 (E2), 50:50 (E3)
dando como resultado 0,80mg/ml (C1), 0,91mg/ml (C2), 1,00mg/ml (C3),
respectivamente, y de los cuales se evaluó la actividad antimicótica frente a los hongos: T.
rubrum y T. mentagrophytes, determinándose que la planta no posee una actividad frente
a hongos dérmicos ya que el % de crecimiento es mayor al 25% para todas las
concentraciones del extracto.
Se estableció la concentración mínima inhibitoria (CMI) de cada extracto hidroalcohólico
de Aristolochia pilosa Kunth (Amarun Waska) frente a los hongos T. rubrum y T.
mentagrophytes y se determinó que a pesar de que la inhibición es negativa, la
concentración de 1,00mg/ml (C3) perteneciente a la proporción de solvente 50:50(E3) es
el que muestra una inhibición mayor frente a las concentraciones C2 y C3, para los dos
hongos.
De acuerdo a lo obtenido estadísticamente tanto para el hongo T. rubrum como para el T.
mentagrophytes, existe una diferencia significativa entre concentraciones, lo que da a
entender que la proporción de alcohol – agua y por ende la concentración del extracto
influye en la inhibición del hongo y que es la de 1,00mg/ml (C3) la que posee mayor
actividad antimicótica frente a los dos hongos al obtener una media de 55,726% y 52,70%
de crecimiento, respectivamente.
Se comparó la medida del halo de crecimiento obtenido con el extracto de concentración
1,00mg/ml (C3) el cual es el que poseía la mejor CMI frente a los dos tipos de hongos,
con el medicamento tópico en crema Terbinafina de donde se determinó que la
78
formulación sintética tiene mayor actividad antimicótica por presentar menor medida en
su halo de crecimiento 12,0 mm y 15,5 mm, respectivamente.
5.2 RECOMENDACIONES
- En base a la investigación realizada se sugiere el uso de la cocción de bejucos de Amarun
Waska en personas que sufran de infecciones micóticas dérmicas como paliativo mas no
como alternativa del tratamiento medicamentoso.
- Se recomienda repetir el estudio in vivo, recolectando muestras de personas infectadas para
poder comparar con los resultados obtenidos in vitro y determinar la efectividad de
Aristolochia pilosa Kunth (Amarun Waska), así como tiempos de tratamiento y CMI
dependiendo de la gravedad de la enfermedad y estado del paciente.
- Se recomienda que al realizar nuevamente un estudio in vitro se utilice un método como por
ejemplo el Dilución en Caldo, donde se utiliza un número estandarizado de microorganismos,
para que de esta manera las diluciones sean más efectivas y se garanticen los resultados en el
estudio.
- De acuerdo a los resultados obtenidos, es recomendable utilizar la concentración de 50:50 ya
que con ella se obtienen mejores resultados y los insumos a utilizar en cuanto a alcohol y
agua serán proporcionales así como los gastos de materia prima.
- Utilizar un método para eliminar en mayor parte las posibles resinas que puedan existir en la
muestra de Aristolochia pilosa Kunth (Amarun Waska), ya que al momento de utilizar una
proporción mayor de agua que de alcohol, ésta se vuelve viscosa y dificulta el estudio.
79
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82
ANEXOS
Anexo 1. Proceso de Obtención del Extracto Vegetal
Secado del material vegetal Pesado del material vegetal
Maceración
83
Anexo 2. Método de activación de cepas de hongos
Presentación del Kwik-Stik
Proceso de Reflujo Filtración al vacío Extracto final
84
KWIK-STIK™ Instructions for Use
Please add the packaging option to the catalog number when placing an order: P = KWIK-STIK™ 2 Pack,
Presentación del Kwik-Stik
85
r
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Anexo 3. Método de dilución con suspensión de esporas
T. rubrum T. mentagrophytes
Agitación en Vortex Dilución hasta obtención de 100 esporas/ml
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Anexo 4. Siembra de la suspensión de esporas en extracto vegetal
Anexo 5. Crecimiento T. rubrum para cada concentración
T. rubrum concentración 70:30 T. rubrum concentración 60:40 T. rubrum concentración 50:50
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Anexo 6. Crecimiento T. mentagrophytes para cada concentración
Anexo 7. Reacciones Marcha Fitoquímica
Flavonoides Taninos
T. mentagrophytes conc . 70:30 T. mentagrophytes conc . 60:40 T. mentagrophytes conc . 50:50
Shinoda Cianidina Medio alcalino Con FeCl 3 Gelatina salada
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Saponinas Cardiotónicos
Con agua Baljet Kedde
